紫草素在制備治療肺癌藥物中的應用的制作方法

技術領域：

本發明涉及含有機有效成分的醫藥配制品，具體涉及來紫草科紫草屬植物的酮類化合物的抗腫瘤藥物制劑。

背景技術：
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腫瘤特別是惡性腫瘤是嚴重威脅人類生命健康的重大疾病之一，其對人類殺傷力僅次心腦血管病，位于全球第二，是目前世界各國仍然面臨的重大疾病難題。據資料統計，我國癌癥發病率在不到20年的時間里上升了69％，死亡率上升了29.4％；另有資料表示，自2010年后，癌癥已成為我國死亡的主要原因和主要的公共健康問題。因此，尋找有效的癌癥治療藥物，進一步完善臨床治療腫瘤體系，已成為當前迫切需要研究的問題。我國作為中草藥大國，從中草藥中提取分離獲得有效抗腫瘤成分具有得天獨厚的優勢，相比于化學合成抗癌藥物，從動植物中提取獲得的天然抗腫瘤化合物往往具有高效、低毒、穩定、種類多等特點。

紫草屬紫草科多年生草本植物。紫草最早記載于《神農本草經》，為防治麻疹的中藥。作為傳統中藥材，紫草使用歷史悠久，它具有消炎、解熱和收斂功效，藥用其根，已應用于臨床，療效確切。近年來，基于中藥現代藥理學發展研究，發現紫草具有抗腫瘤活性，能夠抑制多種腫瘤細胞的生長。

紫草素是從紫草中提取的酮類化合物，其化學名稱為5,8-二羥基-2-[(1r)-1-羥基-4-甲基戊-3-烯基]萘-1,4-二酮，分子量為288.31；紫草素是紫紅色帶有金屬光澤的針狀晶體，微溶于水，易溶于二甲基亞砜、乙醇、乙醚等有機溶劑。紫草素具有抗炎、抗菌、抗病毒等方面的生物活性。但目前尚未見紫草素可誘導癌細胞衰老發揮抗腫瘤作用的報道。

技術實現要素：
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本發明要解決的技術問題是提供紫草素的新用途，即在制藥中的新用途。

上述紫草素的新用途是，紫草素在制備治療肺癌藥物中的應用，其中所述的紫草素的化學結構式如下式(ⅰ)所示，

上述應用中，所述的藥物由紫草素和醫學上可接受的輔料組成。

上述應用中，所述的藥物為片劑、顆粒劑或噴霧劑。

本發明所述應用中的紫草素可有效激活癌細胞內p53通路，誘導癌細胞衰老，發揮治療肺癌的功效。

附圖說明：

圖1為肺癌細胞活力與紫草素的濃度關系曲線。

圖2為紫草素上調肺癌細胞內p53蛋白表達水平的電泳圖。

圖3為不同濃度的紫草素誘導肺癌細胞衰老的顯微照片。

圖4為紫草素抑制移植瘤生長的效果圖，其中，左圖為裸鼠體重變化曲線，右圖為不同給藥方式移植瘤大小變化曲線。

圖5為紫草素上調移植瘤中p53蛋白表達水平的顯微照片。

圖6為紫草素誘導移植瘤細胞衰老的顯微照片。

具體實施方式：

實驗例1：紫草素對肺癌細胞活力的抑制效果

細胞生長狀態較好時，以2000個/孔接種于96孔板中，過夜培養，待細胞貼壁狀態較好時，棄去原來的培養基，接著按照設計的藥物濃度：紫草素濃度0,1,2,4,6,8μm進行換液給藥作用于a549細胞72h后終止培養，吸走培養基，加入100μl0.5mg/ml的mtt溶液，37℃培養4～6小時，棄mtt溶液，最后加入150μl的dmso震蕩混勻，置于酶標儀中，于490nm測定波長處檢測吸光度值。結果如圖1所示，紫草素可明顯抑制肺癌細胞a549的生長。

實驗例2：紫草素上調肺癌細胞內p53蛋白表達水平

取對數生長期a549細胞，以6×104個/孔接種于6孔培養板中，過夜培養，待細胞貼壁狀態較好時，棄去培養基，加入含不同濃度紫草素(0、1、2μm)的新鮮培養基繼續培養72h后，消化、收集細胞、離心、pbs洗滌2次，洗掉上清，然后加入適量ripa和1％的蛋白酶抑制劑pmsf，裂解細胞45min后，收集上清液并測定蛋白含量，使用westernblotting的方法檢測p53蛋白的表達情況。結果如圖2所示，紫草素作用于a549細胞后可明顯上調細胞內p53蛋白表達水平。

實驗例3：紫草素誘導肺癌細胞衰老

取對數生長期a549細胞，以6×104個/孔接種于6孔板中，過夜培養，待細胞貼壁狀態較好時，加入含不同濃度紫草素(0、1、2μm)的新鮮培養基繼續培養72h后，棄去舊的培養基，用pbs洗滌兩遍每孔加入1xfixativesolution固定液固定10min后棄去，然后再用pbs洗滌兩次，接著加入β-半乳糖苷酶染色液，孵育過夜，在熒光倒置顯微鏡下檢測細胞衰老程度，藍色細胞越多，細胞藍色程度越深，細胞衰老程度越嚴重。結果如圖3所示，紫草素作用后，細胞衰老程度呈現劑量依賴性增加。

實驗例4：紫草素抑制移植瘤的生長

建立人a549移植瘤模型：選用4到6周齡的雌性裸鼠，將a549細胞制成懸液，然后按照細胞數2x106/只接種到裸鼠右側腋下窩。每周稱量2～3次體重，用游標卡尺測量腫瘤體積大小，按照以下公式計算腫瘤體積：tumorvolume(tv)＝1/2x(lxw2)，其中l是腫瘤縱軸的長度，w是腫瘤橫軸的長度，并繪制裸鼠腫瘤生長曲線。當腫瘤的平均體積達到約100mm3時，將小鼠隨機分成4組，每組10只。按照以下方案給藥：空白對照組(玉米油)；紫草素劑量給藥組(5、10mg/kg)；陽性對照組(afatinib，5mg/kg)，每天固定時間口服灌胃給藥1次，持續給藥30天，期間每3天稱量小鼠體重1次，監測腫瘤重量與大小。給藥結束后，處死小鼠，取腫瘤組織并保存。結果如圖4所示，紫草素能抑制a549移植瘤的生長，具有體內抗腫瘤活性。

實驗例5：紫草素上調移植瘤中p53蛋白表達水平

取上述實驗例4中獲得的腫瘤組織，用4％多聚甲醛固定后用石蠟包埋，然后切成厚度為3-4μm厚的切片，這些切片經過脫蠟、復水、滅活內源酶以及透膜和微波修復等一系列過程處理后，用5％的bsa封閉液室溫封閉20min，然后用來按比例稀釋的p53一抗，于4℃孵育過夜，次日用pbs洗滌5minx3次后，室溫孵育相應的二抗1h，然后用dba顯色劑顯色，蘇木精染色，染色后用中性樹脂封片，將染好色的切片放置顯微鏡下觀測拍照。結果如圖5所示，紫草素能顯著升高移植瘤組織中的p53蛋白水平，并且呈現劑量依賴性。

實驗例6：紫草素誘導移植瘤細胞衰老

取上述實驗例4中獲得的新鮮腫瘤組織，剪切成3-4mm厚的小塊，小塊用包埋劑包埋，于冰凍切片機中切成5μm厚度的切片并沾附到載玻片上，用β-半乳糖苷酶衰老染色試劑盒中固定液充分覆蓋切片組織，室溫固定組織15min。pbs洗滌組織3次，每次5分鐘。吸除pbs，加入適當量的染色工作液(覆蓋組織)。37℃孵育過夜，然后在熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。結果如圖6所示，紫草素能抑制體內腫瘤細胞衰老，并且細胞衰老程度呈現劑量依賴性增加。

實驗例7：藥物制劑的制備例

例1(片劑)

取紫草素30g，加入淀粉30g、糊精10g、蔗糖8g和適量的65％乙醇混合均勻以后，制粒，干燥得到顆粒，過篩整粒后加入微粉硅膠0.5g混合均勻，壓制成普通片劑。

例2(顆粒劑)

取紫草素30g，加入糖粉20g、糊精16g、乳糖14g、甘露醇1.5g、木糖醇1.4g和適量的65％乙醇制軟材，過篩網，60℃干燥得到顆粒，過篩整粒后，采用包裝設備將其包裝成顆粒劑，制備成顆粒劑。

例3(噴霧劑)

取紫草素30mg，加入冰片0.2mg，混合均勻，加入7.5ml乙醇中攪拌溶解，加入已溶解對羥基苯甲酸乙酯的體積比為4:1的1,2-丙二醇和聚乙二醇600混和液1ml，充分攪拌，加入已溶解亞硫酸氫鈉的純化水至10ml，搖勻過濾，在室溫下灌入容器內，再將閥門裝上并軋緊，然后通過壓裝機壓入二氟甲烷拋射劑即得。