抑制PCSK9基因表達的藥物組合物的制作方法

本發明涉及一種藥物組合物，尤其涉及一種抑制pcsk9基因表達的藥物組合物。

背景技術：

高脂血癥(hyperlipidemia，hl)是指血脂高于正常參考值的上限的現象，是由多種原因導致脂蛋白合成與清除平衡紊亂所致。越來越多的研究發現，一些基因缺陷或表達失衡，使參與脂蛋白合成、轉運和代謝的受體、酶或載脂蛋白異常，導致血脂升高。高脂血癥是引起動脈粥樣硬化、腦中風等心腦血管疾病的重要原因，利用藥物控制血脂水平，可以減少心腦血管疾病的發病率，具有重要的臨床意義。

前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9，pcsk9)基因是近十年來發現的一種新的致病基因，該基因編碼一種前蛋白轉化酶，名為神經細胞凋亡調節轉化酶1(neuralapoptosis-regulatedconvertasel，narc-1)，可介導低密度脂蛋白受體(low-densitylipoproteinreceptor，ldlr)降解，升高血漿中低密度脂蛋白膽固醇(lowdensitylipoproteincholesterol，ldl-c)的水平，該基因的各種突變會導致異常膽固醇血癥。他汀類是目前臨床上最常用的降脂藥物，降脂效果得到認可，但也存在部分副作用。新近的研究發現，他汀類藥物在降脂的同時，能增強pcsk9表達，從而增強ldlr降解，從而導致ldlr數量減少，進而影響到循環中ldl-c的清除，導致ldl-c水平升高，使他汀類藥物降脂效果受到抑制。

黃芪性甘，微溫，是傳統中藥材，以玉屏風散、防己黃芪湯等經典方劑為代表，黃芪在我國的使用有著悠久的歷史，有補氣、利尿、生肌、脫毒等功效。黃芪的主要藥學活性物質基礎為皂苷類、黃酮類及多糖類，另外含有有機酸類、微量元素、氨基酸、葉酸、甜菜堿等化學成分。黃酮類及異黃酮類成分是黃芪屬植物中重要的藥理性成分，其中黃酮類成分主要促進細胞增殖活性，以及顯著的抗氧化特性；異黃酮類具有抗菌、降血脂、抗氧化性、類雌激素樣作用等作用。

二硝酸異山梨醇酯可通過擴張外周血管，特別是增加靜脈血容量，減少回流量，降低心臟前后負荷，而減少心肌耗氧量。主要藥理作用是松弛血管平滑肌，釋放一氧化氮，一氧化氮與內皮釋放的舒張因子相同，激活鳥苷酸環化酶，使環鳥苷酸增加，肌酸蛋白輕鏈去磷酸化，從而松弛血管平滑肌，擴張冠狀動脈，增加冠脈血流量；擴張外周動脈，降低外周血管阻力，降低血壓。

針對高脂血癥的治療，為了在獲得顯著降脂效果的同時取得有效預防或改善其他心血管疾病的療效，發明人根據高血脂臨床治療的最新研究進展情況和高血脂患者的疾病發展趨勢，創造性地將黃芪異黃酮提取物與二硝酸異山梨醇酯聯用治療高血脂，協同降低血脂，目前未見報道。

技術實現要素：

針對現有技術中存在的技術問題，本案提供一種抑制pcsk9基因表達的藥物組合物。

為實現上述目的，本案通過以下技術方案實現：

一種藥物組合物，其中，所述的藥物組合物包括黃芪異黃酮提取物及二硝酸異山梨醇酯。

優選的是，所述的藥物組合物，其中，所述的黃芪異黃酮提取物中異黃酮總含量為20～95％。

優選的是，所述的藥物組合物，其中，所述的黃芪異黃酮提取物包括毛蕊異黃酮-7-o-β-d-葡萄糖苷、芒柄花素-7-o-β-d-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素。

優選的是，所述的藥物組合物，其中，所述的黃芪異黃酮提取物中異黃酮總含量為20～95％，其中毛蕊異黃酮的含量為5～16％。

優選的是，所述的藥物組合物，其中，所述黃芪異黃酮類提取物和二硝酸異山梨醇酯的重量比為10-35：1。

優選的是，所述的藥物組合物，其中，所述的藥物組合物中還含有可藥用載體或賦形劑，如羧甲基纖維素、淀粉、β-環糊精的一種或多種。

優選的是，所述的藥物組合物，其中，所述的藥物組合物為膠囊劑、片劑、顆粒劑或溶液劑。

一種藥物組合物在pcsk9基因表達抑制劑中的應用。

本發明的有益效果是：

(1)該藥物組合物能夠抑制肝臟pcsk9基因表達，增加ldlr表達量。

(2)該藥物組合物顯示了優異的降低血中總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的作用，因此作為用于降低血中ldl膽固醇的藥物是有用的。

附圖說明

圖1為藥物組合物對高血脂模型大鼠肝臟pcsk9和ldlr的mrna表達

與空白對照組比較，^*p＜0.02；與高脂模型組比較，^&p＜0.02；與聯合用藥組比較，^#p＜0.02。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。

實施例1：黃芪異黃酮提取物的制備

取黃芪藥材，粉碎，以80％乙醇回流提取兩次(2小時，1小時)過濾，合并兩次乙醇提液，減壓回收溶劑，濃縮至含0.8g生藥/ml，再以2ml/min速度通過20gh-107型大孔樹脂，上樣量不超過3g生藥/ml樹脂，依次用6倍柱體積純水，6倍柱體積30％乙醇，8倍柱體積80％乙醇洗脫，收集80％乙醇洗脫部分，洗脫液減壓回收溶劑，60℃干燥，粉碎，即得。

共制備3批樣品，其黃芪異黃酮總含量(以毛蕊異黃酮計算)及毛蕊異黃酮的含量分別見表1：

表1黃芪異黃酮提取物的制備結果

將3批樣品混合得到黃芪異黃酮提取物，作為下面的生物學試驗的樣品。

實施例2：黃芪異黃酮提取物和二硝酸異山梨醇酯組合物對高脂血癥大鼠模型pcsk9基因表達的影響

1、分組及模型建立

spf級雄性sd大鼠60只，體重(150±20)g，分籠喂養于室溫下明暗各24h的動物飼養室內，飲水不限。大鼠適應性喂養(喂食普通飼料)1周后，隨機分為空白對照組、高脂模型組、二硝酸異山梨醇酯組、黃芪異黃酮組和黃芪異黃酮與二硝酸異山梨醇酯聯合用藥組5組。根據人體實驗劑量和成人與大鼠的體重折算系數折算成大鼠用藥量。造模同時灌胃給黃芪異黃酮和二硝酸異山梨醇酯，黃芪異黃酮劑量為每天100mg/kg，二硝酸異山梨醇酯劑量為每天5mg/kg，聯合用藥組以兩者聯合劑量給藥；空白對照組和高脂模型組每天灌服0.1％的羧甲基纖維素鈉，每周稱重1次用以調整灌胃量，連續給藥10周。

2、動物處置及標本采集

實驗末次給藥后，禁食24h，不禁水，稱體重，7％水合氯醛皮下麻醉，腹主動脈采血10ml。將大鼠處死后，迅速剝取其全部肝臟，用預冷5℃的生理鹽水反復沖洗，直到未見淤血，用濾紙吸干，做好標記并稱重、拍照。標本采集完后，所剩動物尸體按有關要求進行處置。

3、大鼠血脂的測定

將采集的大鼠血液5℃、3500r/min離心10min，分離血清，全自動生化分析儀測定tc(總膽固醇)和ldl-c。

4、real－timepcr檢測大鼠肝臟pcsr9和ldlr的mrna表達

在冰上將肝臟組織用trizol試劑勻漿至無明顯組織顆粒，并按trizol試劑盒操作要求提取肝臟總rna，按rt－pcr試劑盒操作進行反轉錄。擴增的cdna加入至20μl的反應體系中。pcsk9的上游引物序列為5’-acgatgcctgcctcactcc-3’，下游引物序列為5’-gcctgtgatgtcccactctgt-3’；ldlr的上游引物序列為5’-gattggctatgagtgcctatgtc-3’，下游引物序列為5’-gtgaagagcagaaaccctatgg-3’；gapdh的上游引物序列為5’-caaggtcatccatgacaactttg-3’，下游引物序列為5’-gtccaccaccctgttgctgtag-3’，以gapdh作為內參照，目的基因pcsk9的表達根據經real－timepcr儀器檢測的ct值，通過公式2^-△△ct計算相對表達量。

5、westernblot法檢測大鼠肝臟pcsk9和ldlr蛋白的表達

在冰上將肝臟組織用細胞裂解液勻漿至無明顯組織顆粒，靜置充分裂解，離心后取上清，用bca法測定蛋白濃度，蛋白定量100μg，煮沸10min，上樣于5％sds－page膠電泳2h，全濕式電轉將分離膠上的蛋白轉移到pvdf膜上。室溫下用含5％脫脂奶粉封閉2h。加入i抗(兔抗鼠pcsk9，1：1000；兔抗鼠β－actin抗體，1：5000)及ⅱ抗(1：5000)，化學發光檢測目的條帶，在凝膠成像系統上觀察分析并拍照。用目的蛋白與內參蛋白的灰度值之比計算蛋白的相對表達量。

6、統計學處理

實驗數據以均值±標準差(mean±sd)表示，采用spss17.0軟件進行統計分析，資料經正態性及方差齊性檢驗后，進行單因素方差分析，組間兩兩比較，采用snk-q檢驗法，以p＜0.02表示差異有統計學顯著性。

7、結果

7.1藥物組合物對高血脂模型大鼠血清血脂水平的影響

各組大鼠血脂水平見表2，結果顯示與正常對照組比較，高脂模型組大鼠血清tc和ldl-c水平均明顯升高，差異有統計學顯著性(p＜0.02)，與模型組大鼠比較，二硝酸異山梨醇酯組、黃芪異黃酮組和黃芪異黃酮與二硝酸異山梨醇酯聯合用藥組tc、ldl-c水平均明顯下降，差異有統計學顯著性(p＜0.02)，二硝酸異山梨醇酯組、黃芪異黃酮組比較，以上指標差異均無統計學顯著性；而與兩者單獨用藥比較，黃芪異黃酮與二硝酸異山梨醇酯聯合用藥組大鼠血清tc、ldl-c水平均明顯降低(p＜0.02)。

表2各組大鼠血脂水平對比(n＝12)

注：與空白對照組比較，^*p＜0.02；與高脂模型組比較，^&p＜0.02；與聯合用藥組比較，^#p＜0.02。

7.2藥物組合物對高血脂模型大鼠肝臟pcsk9和ldlr的mrna表達的影響

各組大鼠肝臟pcsk9和ldlr的mrna表達見圖1，與正常對照組比較，高脂模型組pcsk9的mrna表達明顯升高，ldlr的mrna表達明顯降低，差異均有統計學顯著性(p＜0.02)。與高脂模型組比較，二硝酸異山梨醇酯組pcsk9和ldlr的mrna表達升高，差異有統計學顯著性(p＜0.02)；黃芪異黃酮組pcsk9的mrna表達降低不明顯，差異有統計學顯著性(p＜0.02)，ldlr的mrna表達升高不明顯，差異有統計學顯著性(p＜0.02)；聯合用藥組pcsk9的mrna表達明顯降低，ldlr的mrna表達則明顯升高，差異均有統計學顯著性(p＜0.02)。

7.3藥物組合物對高血脂模型大鼠肝臟pcsk9和ldlr蛋白表達的影響

各組大鼠肝臟pcsk9和ldlr蛋白的表達見表3，結果顯示與正常對照組比較，高脂模型組pcsk9的蛋白表達明顯升高，ldlr的蛋白表達明顯降低，差異有統計學顯著性(p＜0.02)。與高脂模型組比較，二硝酸異山梨醇酯組的pcsk9蛋白表達差異無統計學顯著性，ldlr蛋白表達明顯升高，差異有統計學顯著性(p＜0.02)；黃芪異黃酮組的pcsk9蛋白表達明顯降低，ldlr蛋白表達明顯升高，差異均有統計學顯著性(p＜0.02)；聯合用藥組的pcsk9蛋白表達明顯降低，ldlr蛋白表達明顯升高，差異均有統計學顯著性(p＜0.02)。聯合用藥組pcsk9蛋白表達均低于單獨黃芪異黃酮組合和二硝酸異山梨醇酯組的蛋白表達值差異有統計學顯著性(p＜0.02)；聯合用藥組ldlr蛋白表達均高于黃芪異黃酮組和二硝酸異山梨醇酯組的蛋白表達值，差異有統計學顯著性(p＜0.02)。

表3各組大鼠pcsk9和ldlr蛋白表達水平(n＝12)

注：與空白對照組比較，^*p＜0.02；與高脂模型組比較，^&p＜0.02；與聯合用藥組比較，^#p＜0.02。

盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的圖例。