本發明涉及一種組織粘合劑的制備方法，特別是一種透明質酸組織粘合劑的制備方法，屬于生物材料的制備
技術領域：
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背景技術：
：組織粘合劑是一種用于局部組織粘合、毛細血管止血等軟組織損傷封閉與修復的生物醫學材料，其使用可替代傳統復雜耗時的外科手術縫合，起到快速封閉創面、避免創面感染、有效減輕瘢痕的效果。理想的組織粘合劑一般具備以下條件：生物相容性好；粘合速度快、粘合強度高；粘合時熱量小，避免灼傷組織；在組織內可降解、吸收等。目前，臨床上使用較多的是氰基丙烯酸酯類粘合劑、纖維蛋白類粘合劑等。中國專利公開號為cn104958781a，公開日為2015年10月7日，發明名稱為“一種化學醫用粘合劑組合物及其制備方法”公開了氰基丙烯酸酯粘合劑的制備方法；中國專利公開號為cn103272263b，公開日為2014年10月22日，發明名稱為“一種醫用粘合劑”公開了氰基丙烯酸酯粘合劑。然而，氰基丙烯酸酯類粘合劑雖然能在常溫下迅速固化，但是膠層脆性大，易受溫度、強度、生理環境因素影響導致粘固不牢。此外，氰基丙烯酸酯類粘合劑在儲存、使用過程中會產生甲醛，對生物體組織產生副作用。再者，使用過程中因聚合反應產生的熱量會對機體組織造成一定程度的灼傷。這些不足之處大大限制了氰基丙烯酸酯類粘合劑在醫療領域的應用。中國專利公開號為cn101352581a，公開日為2009年1月28日，發明名稱為“關節軟骨修復移植物固定用粘合劑及人纖維蛋白原在制備該粘合劑中的應用”等公開了纖維蛋白類粘合劑的制造方法。然而，纖維蛋白類粘合劑雖然具有良好的生物相容性和可降解性，但是因其來源為異體的人或動物血清而可能存在潛在的病毒感染風險，其臨床使用的安全性受到廣泛關注。技術實現要素：針對上述問題，本發明的目的在于提供一種安全、生物相容好、粘結強度高、可降解吸收的組織粘合劑的制備方法。為了實現上述目的，本發明的技術方案為：一種透明質酸組織粘合劑的制備方法，所述制備方法按以下步驟進行：a.馬來酰化透明質酸鈉的制備將透明質酸鈉和馬來酸酐置于二甲基甲酰胺中，透明質酸鈉與二甲基甲酰胺質量體積比為1：4～100，透明質酸鈉分子鏈上羥基與馬來酸酐的酸酐基摩爾比為1：0.01～0.1，室溫下攪拌均勻，在25～80℃條件下反應，反應時間為12～48小時，在反應結束后的透明質酸鈉、馬來酸酐、二甲基甲酰胺的混合溶液中加入1mol/l的堿溶液，調整混合溶液的ph值至7-8，將調整ph值后的混合溶液進行透析，透析時間為2天，形成馬來酰化透明質酸鈉溶液，將馬來酰化透明質酸鈉溶液在溫度為-50℃、壓強為1～20pa條件下，冷凍干燥24～72小時，得到馬來酰基摩爾取代度為0.05～0.2的馬來酰化透明質酸鈉。b.醛基化馬來酰化透明質酸鈉的制備將由步驟a得到的馬來酰化透明質酸鈉置于去離子水中，馬來酰化透明質酸鈉與去離子水質量體積比為1：20～100，室溫下攪拌10小時，形成馬來酰化透明質酸鈉水溶液，在馬來酰化透明質酸鈉水溶液中加入高碘酸鈉，馬來酰化透明質酸鈉分子鏈上羥基與高碘酸鈉的摩爾比為1：0.1～10，室溫下攪拌均勻，在25～60℃條件下反應，反應時間為1～24小時，將反應結束后的馬來酰化透明質酸鈉、高碘酸鈉的混合溶液進行透析，透析時間為2天，形成醛基化馬來酰化透明質酸鈉溶液，將醛基化馬來酰化透明質酸鈉溶液在溫度為-50℃、壓強為1～20pa條件下，冷凍干燥48小時，得到醛基摩爾取代度為0.2～0.5的醛基化馬來酰化透明質酸鈉。c.多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉的制備將由步驟b得到的醛基化馬來酰化透明質酸鈉置于去離子水中，醛基化馬來酰化透明質酸鈉與去離子水質量體積比為1：20～1000，室溫下攪拌5小時，形成醛基化馬來酰化透明質酸鈉水溶液，在醛基化馬來酰化透明質酸鈉水溶液中加入鹽酸多巴胺，醛基化馬來酰化透明質酸鈉分子鏈上醛基與鹽酸多巴胺摩爾比為1：0.1～10，室溫下攪拌均勻，在25～60℃條件下反應，反應時間為1～24小時，將反應結束后的醛基化馬來酰化透明質酸鈉、鹽酸多巴胺的混合溶液進行透析，透析時間為2天，形成多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉溶液，將多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉溶液在溫度為-50℃、壓強為1～20pa條件下，冷凍干燥48小時，得到多巴胺摩爾取代度為0.1～0.6的多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉。d.透明質酸組織粘合劑的制備將由步驟c得到的多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉與紫外光引發劑、磷酸鹽緩沖溶液按照質量百分比分別為：多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉2～20％光引發劑0.05～0.1％磷酸鹽緩沖溶液79.9～97.95％的比例，室溫下混合均勻，得到粘度為1000～100000cps的透明質酸生物粘合劑。所述堿溶液為碳酸鉀或碳酸氫鈉溶液或碳酸氫鉀溶液或碳酸鈉溶液中的一種。所述光引發劑為2-羥基-2-甲基-1-對羥乙基醚基苯基丙酮或1-羥基環己基苯基甲酮或2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮中的一種。所述磷酸鹽緩沖溶液為ph值為7.0～7.4的na2hpo4-nah2po4緩沖溶液或k2hpo4-kh2po4緩沖溶液中的一種。由于采用以上技術方案，本發明的一種透明質酸組織粘合劑的制備方法其有益技術效果是：(1)本發明的制備方法中通過透明質酸醛基化的工藝，大大提高接枝多巴胺的含量，顯著增強透明質酸組織粘合劑的粘結強度。此外，分子鏈上殘留的醛基能與組織中的氨基發生作用，協同增強透明質酸組織粘合劑的粘結強度。(2)本發明的制備方法中采用二甲基甲酰胺溶劑中馬來酰基修飾透明質酸鈉的工藝，實現馬來酰化透明質酸鈉分子鏈上碳碳雙鍵的低含量接枝，使得透明質酸組織粘合劑在后續紫外光照射下，完成粘結的同時，避免了紫外光固化體系體積收縮導致的組織粘結面封閉不完全、組織液滲漏的缺陷。(3)本發明的制備方法中采用的是自然界中廣泛存在的天然高分子化合物，使得制得的生物粘合劑具備安全、生物相容、可降解吸收的特點。本發明制備方法簡單、成本低，易工業化生產。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明一種透明質酸組織粘合劑作進一步詳細描述。一種透明質酸組織粘合劑的制備方法，所述制備方法按以下步驟進行：a.馬來酰化透明質酸鈉的制備將透明質酸鈉和馬來酸酐置于二甲基甲酰胺中，透明質酸鈉與二甲基甲酰胺質量體積比為1：4～100，透明質酸鈉分子鏈上羥基與馬來酸酐的酸酐基摩爾比為1：0.01～0.1，室溫下攪拌均勻，在25～80℃條件下反應，反應時間為12～48小時，在反應結束后的透明質酸鈉、馬來酸酐、二甲基甲酰胺的混合溶液中加入1mol/l的堿溶液，調整混合溶液的ph值至7-8，將調整ph值后的混合溶液進行透析，透析時間為2天，形成馬來酰化透明質酸鈉溶液，將馬來酰化透明質酸鈉溶液在溫度為-50℃、壓強為1～20pa條件下，冷凍干燥24～72小時，得到馬來酰基摩爾取代度為0.05～0.2的馬來酰化透明質酸鈉。所述堿溶液為碳酸鉀或碳酸氫鈉溶液或碳酸氫鉀溶液或碳酸鈉溶液中的一種。透明質酸鈉是一種由d-葡糖醛酸和n-乙酰-d-氨基葡糖為雙糖單元組成的直鏈型高分子多糖，具有良好的生物相容性與生物可降解性。作為人體組織細胞外基質的主要成分之一，透明質酸鈉能與多種細胞受體相互作用，以此促進細胞的黏附、遷移與生長，且在體內可被透明質酸酶降解為氨基葡萄糖被人體吸收，從而使得透明質酸在皮膚、軟骨、神經等組織工程支架領域具有廣泛的應用前景。透明質酸鈉分子鏈上具有自由羧基和羥基，可以按照分子設計用途進行各種接枝反應。透明質酸鈉在二甲基甲酰胺作為溶劑的體系中，室溫下攪拌24小時以上，透明質酸鈉可完全溶解于二甲基甲酰胺中，形成均相溶液。二甲基甲酰胺是該酰化反應的促進劑，可促進該反應的進行。通過酰化反應，透明質酸鈉分子鏈上引入了光活性基團烯酰基，可以使得水溶性的馬來酰化透明質酸鈉在紫外光的照射下能發生光交聯反應，得到交聯的凝膠。此時，如果分子鏈上參與光聚合的c＝c含量較高時，就特別容易發生明顯的體積收縮，導致需要粘合的組織與凝膠界面結合差，出現空隙，導致封閉效果差，當用于體內血管的止血時，甚至會出止不住血的嚴重問題。體積收縮是光固化過程中常見的問題，尤其是參與光聚合的丙烯酸酯c＝c含量高時。其原因一般認為是，單體或預聚物分子之間的范德華作用力距離，被聚合后的共價鍵長度所取代，導致聚合過程中收縮的產生；另外一方面光固化過程中分子間的交聯限制了鏈段的運動，自由體積變小，在一定程度上也造成了固化收縮。步驟a中，通過控制透明質酸的羥基與馬來酸酐的酸酐基的摩爾比以及反應條件，來實現透明質酸的羥基上定位取代，且實現馬來酰化基團的取代度在0.05～0.2范圍內，保證馬來酰化透明質酸具有足夠的雙鍵含量，保證透明質酸組織粘合劑后續在紫外光照下具有較高的交聯速率，能迅速凝膠的同時，體積收縮率低或者完全不發生體積收縮，完成粘結的同時，避免了紫外光固化體系體積收縮導致的組織粘結面封閉不完全、組織液滲漏的缺陷。因此，選擇合適的摩爾比為：1：0.01～0.1；選擇合適的反應條件為：溫度25～80℃，反應時間12～48小時。通過透明質酸在低碳碳雙鍵含量條件下的紫外光固化工藝，完成粘結的同時，避免了紫外光固化體系體積收縮導致的組織粘結面封閉不完全、組織液滲漏的缺陷。b.醛基化馬來酰化透明質酸鈉的制備將由步驟a得到的馬來酰化透明質酸鈉置于去離子水中，馬來酰化透明質酸鈉與去離子水質量體積比為1：20～100，室溫下攪拌10小時，形成馬來酰化透明質酸鈉水溶液，在馬來酰化透明質酸鈉水溶液中加入高碘酸鈉，馬來酰化透明質酸鈉分子鏈上羥基與高碘酸鈉的摩爾比為1：0.1～10，室溫下攪拌均勻，在25～60℃條件下反應，反應時間為1～24小時，將反應結束后的馬來酰化透明質酸鈉、高碘酸鈉的混合溶液進行透析，透析時間為2天，形成醛基化馬來酰化透明質酸鈉溶液，將醛基化馬來酰化透明質酸鈉溶液在溫度為-50℃、壓強為1～20pa條件下，冷凍干燥48小時，得到醛基摩爾取代度為0.2～0.5的醛基化馬來酰化透明質酸鈉。本發明中，利用透明質酸鈉分子鏈上鄰二醇結構可被特殊氧化劑氧化開環，得到等摩爾量的醛基這一反應，制備得到部分醛基化馬來酰化透明質酸鈉。這里，醛基的引入有兩個目的。第一，為了和后續的多巴胺反應，將更多量的多巴胺接枝到馬來酰化透明質酸鈉分子鏈上。一般而言，透明質酸上引入多巴胺都是基于透明質酸分子鏈上的羧基與多巴胺分子上的氨基，在n-羥基琥珀酰亞胺/(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)(nhs/edc)體系催化下，發生縮合反應而得到的。nhs/edc體系催化該反應，副產物較多，產品得率低，接枝率也比較低，一般在10％。多巴胺的含量直接與凝膠的粘結強度相關，多巴胺含量較低的凝膠的粘結強度較弱。本發明中，利用醛基與氨基之間的schiff快速縮合反應原理，引入足夠量的醛基，來保證后續更多量多巴胺的引入，以此來提高凝膠的粘結強度。第二，未參與后續與多巴胺反應的醛基，可以和組織中的氨基發生反應，提高凝膠與組織之間界面作用，對于粘結強度的提高提供協同作用。步驟b中，通過控制馬來酰化透明質酸鈉的羥基與馬高碘酸鈉的摩爾比以及反應條件，來實現醛基的摩爾取代度在0.2～0.5范圍內，保證后續大量多巴胺的引入。醛基摩爾取代度低于0.2時，后續多巴胺量引入會少；醛基摩爾取代度高于0.5時，未參與后續多巴胺反應的醛基(即殘留的醛基)量較多，會對組織修復和傷口愈合造成影響。。因此，選擇合適的摩爾比為：1：0.1～10；選擇合適的反應條件為：溫度25～60℃，反應時間1～24小時。c.多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉的制備將由步驟b得到的醛基化馬來酰化透明質酸鈉置于去離子水中，醛基化馬來酰化透明質酸鈉與去離子水質量體積比為1：20～1000，室溫下攪拌5小時，形成醛基化馬來酰化透明質酸鈉水溶液，在醛基化馬來酰化透明質酸鈉水溶液中加入鹽酸多巴胺，醛基化馬來酰化透明質酸鈉分子鏈上醛基與鹽酸多巴胺摩爾比為1：0.1～10，室溫下攪拌均勻，在25～60℃條件下反應，反應時間為1～24小時，將反應結束后的醛基化馬來酰化透明質酸鈉、鹽酸多巴胺的混合溶液進行透析，透析時間為2天，形成多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉溶液，將多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉溶液在溫度為-50℃、壓強為1～20pa條件下，冷凍干燥48小時，得到多巴胺摩爾取代度為0.1～0.6的多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉。多巴胺，帶有鄰苯二酚(兒茶酚)官能團，大量的存在于貽貝黏附蛋白中，其基團中兒茶酚結構可以氧化形成鄰醌基團而發生交聯作用并產生固化，實現貽貝在各種不同基材表面的超強粘結。一般而言，多巴胺含量越高，對于基材的粘結效果越強。步驟c中就是利用醛基與氨基之間的schiff快速縮合反應原理，來保證大量多巴胺的引入，賦予透明質酸組織粘合劑高的粘結強度。傳統而言，在nhs/edc體系催化下，多巴胺也可以引入到透明質酸分子鏈上，但是接枝量有限，一般只能達到10％左右。而本發明，通過引入醛基的方式來接枝多巴胺，可以大量的引入多巴胺基團。步驟c中，通過控制醛基化馬來酰化透明質酸鈉分子鏈上醛基與鹽酸多巴胺摩爾比以及反應條件，來實現多巴胺摩爾取代度大于0.1的目標，得到含量最多可達0.6的多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉。因此，選擇合適的摩爾比為：1：0.1～10；選擇合適的反應條件為：溫度25～60℃，反應時間1～24小時。d.透明質酸組織粘合劑的制備將由步驟c得到的多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉與紫外光引發劑、磷酸鹽緩沖溶液按照質量百分比分別為：多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉2～20％光引發劑0.05～0.1％磷酸鹽緩沖溶液79.9～97.95％的比例，室溫下混合均勻，得到粘度為1000～100000cps的透明質酸生物粘合劑。所述光引發劑為2-羥基-2-甲基-1-對羥乙基醚基苯基丙酮或1-羥基環己基苯基甲酮或2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮中的一種。所述磷酸鹽緩沖溶液為ph值為7.0～7.4的na2hpo4-nah2po4緩沖溶液或k2hpo4-kh2po4緩沖溶液中的一種。本專利中制備的生物粘合劑，是粘度為1000～100000cps的溶液，溶液粘度過高，流動性較差，不便于擠出使用；溶液粘度過低，塑型困難，不便于在傷口處集中固化。該生物粘合劑在波長為320-480nm、光強為5～20mw/cm2紫外光下照射1～15min，可迅速由液態形成凝膠態。凝膠粘結強度達到10.0mpa以上。該凝膠能完全降解吸收，當其用于組織時，無需去除，避免給受創組織造成二次損傷。具體實施例實施例1稱取透明質酸4g、馬來酸酐0.04g，加入到16ml二甲基甲酰胺中，室溫下攪拌均勻，在25℃條件下反應12小時，反應結束后，加入1mol/l的nahco3溶液，調整混合溶液的ph至7-8，將混合溶液進行透析，透析時間為2天，將透析液在溫度為-50℃、壓強為1pa條件下，冷凍干燥24小時，得到馬來酰基摩爾取代度為0.05的馬來酰化透明質酸鈉。稱取馬來酰化透明質酸鈉4g，加入到80ml去離子水中，室溫下攪拌10小時，加入高碘酸鈉0.86g，室溫下攪拌均勻，在25℃條件下反應，反應時間為1小時，反應結束后，將混合溶液進行透析，透析時間為2天，將透析液在溫度為-50℃、壓強為1pa條件下，冷凍干燥48小時，得到醛基摩爾取代度為0.2的醛基化馬來酰化透明質酸鈉；稱取醛基化馬來酰化透明質酸鈉4g，加入到80ml去離子水中，室溫下攪拌5小時，加入鹽酸多巴胺0.15g，室溫下攪拌均勻，在25℃條件下反應，反應時間為1小時，反應結束后，將混合溶液進行透析，透析時間為2天，將透析液在溫度為-50℃、壓強為1pa條件下，冷凍干燥48小時，得到多巴胺摩爾取代度為0.1的多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉；稱取多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉2g、2-羥基-2-甲基-1-對羥乙基醚基苯基丙酮0.05g，加入到97.95gph為7.0的na2hpo4-nah2po4緩沖溶液中，室溫下混合均勻，得到粘度為1000cps的透明質酸生物粘合劑。實施例2稱取透明質酸4g、馬來酸酐0.4g，加入到400ml二甲基甲酰胺中，室溫下攪拌均勻，在80℃條件下反應48小時，反應結束后，加入1mol/l的khco3溶液，調整混合溶液的ph至7-8，將混合溶液進行透析，透析時間為2天，將透析液在溫度為-50℃、壓強為20pa條件下，冷凍干燥72小時，得到馬來酰基摩爾取代度為0.2的馬來酰化透明質酸鈉。稱取馬來酰化透明質酸鈉4g，加入到400ml去離子水中，室溫下攪拌10小時，加入高碘酸鈉72.21g，室溫下攪拌均勻，在60℃條件下反應，反應時間為24小時，反應結束后，將混合溶液進行透析，透析時間為2天，將透析液在溫度為-50℃、壓強為20pa條件下，冷凍干燥48小時，得到醛基摩爾取代度為0.5的醛基化馬來酰化透明質酸鈉；稱取醛基化馬來酰化透明質酸鈉4g，加入到4000ml去離子水中，室溫下攪拌5小時，加入鹽酸多巴胺32.01g，室溫下攪拌均勻，在60℃條件下反應，反應時間為24小時，反應結束后，將混合溶液進行透析，透析時間為2天，將透析液在溫度為-50℃、壓強為20pa條件下，冷凍干燥48小時，得到多巴胺摩爾取代度為0.6的多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉；稱取多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉20g、1-羥基環己基苯基甲酮0.1g，加入到79.9gph為7.4的k2hpo4-kh2po4緩沖溶液中，室溫下混合均勻，得到粘度為100000cps的透明質酸生物粘合劑。實施例3稱取透明質酸4g、馬來酸酐0.2g，加入到40ml二甲基甲酰胺中，室溫下攪拌均勻，在60℃條件下反應24小時，反應結束后，加入1mol/l的na2co3溶液，調整混合溶液的ph至7-8，將混合溶液進行透析，透析時間為2天，將透析液在溫度為-50℃、壓強為10pa條件下，冷凍干燥48小時，得到馬來酰基摩爾取代度為0.1的馬來酰化透明質酸鈉。稱取馬來酰化透明質酸鈉4g，加入到200ml去離子水中，室溫下攪拌10小時，加入高碘酸鈉8.12g，室溫下攪拌均勻，在40℃條件下反應，反應時間為12小時，反應結束后，將混合溶液進行透析，透析時間為2天，將透析液在溫度為-50℃、壓強為10pa條件下，冷凍干燥48小時，得到醛基摩爾取代度為0.3的醛基化馬來酰化透明質酸鈉；稱取醛基化馬來酰化透明質酸鈉4g，加入到400ml去離子水中，室溫下攪拌5小時，加入鹽酸多巴胺2.16g，室溫下攪拌均勻，在40℃條件下反應，反應時間為12小時，反應結束后，將混合溶液進行透析，透析時間為2天，將透析液在溫度為-50℃、壓強為10pa條件下，冷凍干燥48小時，得到多巴胺摩爾取代度為0.3的多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉；稱取多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉10g、2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮0.07g，加入到89.93gph為7.2的na2hpo4-nah2po4緩沖溶液中，室溫下混合均勻，得到粘度為60000cps的透明質酸生物粘合劑。實施例4稱取透明質酸4g、馬來酸酐0.2g，加入到40ml二甲基甲酰胺中，室溫下攪拌均勻，在60℃條件下反應24小時，反應結束后，加入1mol/l的k2co3溶液，調整混合溶液的ph至7-8，將混合溶液進行透析，透析時間為2天，將透析液在溫度為-50℃、壓強為10pa條件下，冷凍干燥48小時，得到馬來酰基摩爾取代度為0.1的馬來酰化透明質酸鈉。稱取馬來酰化透明質酸鈉4g，加入到200ml去離子水中，室溫下攪拌10小時，加入高碘酸鈉44.04g，室溫下攪拌均勻，在45℃條件下反應，反應時間為18小時，反應結束后，將混合溶液進行透析，透析時間為2天，將透析液在溫度為-50℃、壓強為10pa條件下，冷凍干燥48小時，得到醛基摩爾取代度為0.4的醛基化馬來酰化透明質酸鈉；稱取醛基化馬來酰化透明質酸鈉4g，加入到400ml去離子水中，室溫下攪拌5小時，加入鹽酸多巴胺14.41g，室溫下攪拌均勻，在45℃條件下反應，反應時間為18小時，反應結束后，將混合溶液進行透析，透析時間為2天，將透析液在溫度為-50℃、壓強為10pa條件下，冷凍干燥48小時，得到多巴胺摩爾取代度為0.5的多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉；稱取多巴胺接枝醛基化馬來酰化透明質酸鈉10g、2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮0.07g，加入到89.93gph為7.2的na2hpo4-nah2po4緩沖溶液中，室溫下混合均勻，得到粘度為50000cps的透明質酸生物粘合劑。實施例5我們將馬來酰基摩爾取代度為0.3的馬來酰化透明質酸鈉形成的透明質酸粘合劑作為對比樣。其制備方法如下：稱取透明質酸4g、馬來酸酐1g，加入到60ml二甲基甲酰胺中，室溫下攪拌均勻，在80℃條件下反應48小時，反應結束后，加入1mol/l的khco3溶液，調整混合溶液的ph至7-8，將混合溶液進行透析，透析時間為2天，將透析液在溫度為-50℃、壓強為20pa條件下，冷凍干燥72小時，得到馬來酰基摩爾取代度為0.3的馬來酰化透明質酸鈉。稱取馬來酰化透明質酸鈉20g、1-羥基環己基苯基甲酮0.1g，加入到79.9gph為7.4的k2hpo4-kh2po4緩沖溶液中，室溫下混合均勻，得到粘度為90000cps的透明質酸生物粘合劑。分別測定本發明實施例制備的透明質酸組織粘合劑性能：(1)粘結強度。取透明質酸組織粘合劑0.1ml，滴加在長5cm、寬2.5cm的豬皮樣條表面，迅速附上另一條同樣大小的豬皮樣條，讓兩個樣條重合面積為1cm×2.5cm，在波長為320-480nm、光強為5mw/cm2紫外光下照射10min，得到試驗樣品。按照yy/t0729.1組織粘合劑粘結性能試驗方法第1部分：搭接-剪切拉伸承載強度進行試驗。(2)體積收縮率。精密量取透明質酸組織粘合劑1.5ml，移入12孔培養板的孔中，在波長為320-480nm、光強為5mw/cm2紫外光下照射10min，形成凝膠。取出凝膠，用游標卡尺測量凝膠的尺寸，計算體積v。體積變化率＝[(1.5-v)/1.5]×100％。(3)體外降解性能。取透明質酸組織粘合劑5.0ml，在波長為320-480nm、光強為5mw/cm2紫外光下照射10min，形成凝膠，凍干得到干凝膠。將重量為m0的干凝膠置于100u/ml透明質酸酶溶液中，降解試驗在溫度為37℃，震蕩速度為100rpm的氣浴震蕩箱中進行。每隔一段時間，取出樣品，冷凍干燥后，稱取重量為m1。然后更換新的降解液。至(m0-m1/m0)大于0.99，認為其完全降解。記錄其完全降解時間。(3)體外細胞毒性。取透明質酸組織粘合劑3.0ml，在波長為320-480nm、光強為5mw/cm2紫外光下照射10min，形成凝膠。按照iso10993-5標準測試方法進行試驗。測試結果見附表。附表實施例粘結強度(mpa)體積收縮率(％)降解時間(days)細胞毒性110.20.047一級225.10.093一級314.70.074一級418.90.064一級51.58.117一級當前第1頁12