N?甲基野靛堿作為治療潰瘍性結腸炎病的制藥用途的制作方法

本發明涉及n-甲基野靛堿的應用，特別涉及n-甲基野靛堿作為治療潰瘍性結腸炎藥物的用途。

背景技術：

潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis,uc)又稱特發性潰瘍性結腸炎，是一種常見的、多因素、多層次的慢性非特異性炎癥的腸道疾病。臨床表現為腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重等，并伴有腸外表現，病程遷延不愈，輕重不等，甚至有癌變的傾向，這不僅給患者帶來身體上的痛苦,嚴重影響其生活質量和工作能力,更產生了巨大的醫療資源及社會經濟負擔。據國內外流行病學統計數據顯示，uc的發病率和和患病率均呈現明顯的增高趨勢。被世界衛生組織列為現代難治病之一。

有關潰瘍性結腸炎的病因和發病機制尚未完全闡明，研究認為與免疫異常、遺傳、環境、感染、精神等因素有關。近年來，隨著對uc發病機制免疫學的不斷深入研究，認為腸道炎癥主要是由免疫系統的激活，釋放炎性細胞因子，損傷腸道粘膜。因此調節免疫系統和抑制腸道慢性的炎癥反應在潰瘍性結腸炎發病機制中發揮著重要作用，也是研究uc的熱點。目前治療uc的有效藥物為非甾體抗炎藥、免疫抑制劑、糖皮質激素和生物制劑。但由于其嚴重的不良反應受到限制，尋求安全、有效、副作用小的植物藥成為研究的重點。

n-甲基野靛堿(n-methylcytisine)為豆科植物金蓮花、苦豆草的種子中分離純化的一種金雀花型生物堿。研究已經發現n-甲基野靛堿具有抗炎、鎮痛和降低血糖的作用。但其對潰瘍性結腸炎的保護作用目前尚未見報道。而潰瘍性結腸炎不同于一般的微生物感染性炎癥，其更應視為一種免疫性疾病，免疫性因素在潰瘍性結腸炎的發病中更為關鍵，潰瘍性結腸炎患者也常伴有自身免疫性疾病。雖然目前臨床上治療潰瘍性結腸炎也采用一些常規抗炎藥物或免疫抑制劑，但是它們均有較大的毒副反應，療效有限，存在較大的臨床局限性，仍需要開發針對性潰瘍性結腸炎的特異性藥物。本發明人通過對多種來自中藥的活性成分尤其是生物堿類活性成分進行試驗和篩選，發現n-甲基野靛堿在針對潰瘍性結腸炎的治療中表現優異，可以開發為有前景的臨床藥物用于潰瘍性結腸炎的治療。

技術實現要素：

本發明的目的是通過對n-甲基野靛堿的藥理作用研究，提供n-甲基野靛堿作為治療潰瘍性結腸炎藥物的用途。

本發明通過以下技術方案來實現發明目的：

本發明提供n-甲基野靛堿作為治療潰瘍性結腸炎藥物的用途，所述n-甲基野靛堿的結構式如式(1)所示：

具體地，所述潰瘍性結腸炎為急性、慢性或反復發作的潰瘍性結腸炎。

進一步地，所述n-甲基野靛堿單次應用劑量為1～16mg/kg.

優選地，所述n-甲基野靛堿單次應用劑量為1mg/kg。

優選地，所述n-甲基野靛堿單次應用劑量為4mg/kg。

優選地，所述n-甲基野靛堿單次應用劑量為16mg/kg。

本發明的藥物被配制為適于胃腸道或腸胃外給予的劑型。

具體地，所述藥物的劑型為藥劑學上允許的口服劑型或注射劑。

本發明提供的n-甲基野靛堿作為治療潰瘍性結腸炎藥物的用途具有以下有益效果：

本發明通過建立潰瘍性結腸炎模型從而探究n-甲基野靛堿對潰瘍性結腸炎的保護作用及可能的機制。n-甲基野靛堿能顯著改善疾病活動指數、結腸長度和組織病理損傷，同時也能能顯著降低促炎細胞因子的產生以及nf-κb信號通路的激活。實驗結果表明n-甲基野靛堿對潰瘍性結腸炎具有良好的保護作用，可用于制備潰瘍性結腸炎的治療藥物。

附圖說明：

圖1：n-甲基野靛堿對小鼠潰瘍性結腸炎的dai和結腸長度的影響(與正常組比較：##p<0.01，與模型組比較：*p<0.05，**p<0.01(n＝10))

圖2：n-甲基野靛堿對小鼠潰瘍性結腸炎的結腸組織病理變化影響的he染色圖和病理學評分圖(與正常組比較：##p<0.01，與模型組比較：*p<0.05，**p<0.01(n＝10))

圖3：n-甲基野靛堿對小鼠潰瘍性結腸炎的結腸中mpo活性的影響(與正常組比較：##p<0.01，與模型組比較：*p<0.05，**p<0.01(n＝10))

圖4：n-甲基野靛堿對小鼠潰瘍性結腸炎的結腸中tnf-ɑ、il-6、il-1β的影響(與正常組比較：#p<0.05，##p<0.01，與模型組比較：*p<0.05，**p<0.01(n＝6))

圖5：n-甲基野靛堿對小鼠潰瘍性結腸炎的結腸組織中ikb蛋白表達水平的影響(與正常組比較：#p<0.05，與模型組比較：*p<0.05(n＝6))

圖6：n-甲基野靛堿對小鼠潰瘍性結腸炎的結腸組織中nf-κbp65蛋白表達水平的影響(與正常組比較：#p<0.05，與模型組比較：*p<0.05(n＝6))

圖7：n-甲基野靛堿對小鼠潰瘍性結腸炎的結腸組織中p-ikb蛋白表達水平的影響(與正常組比較：##p<0.01，與模型組比較：*p<0.05(n＝6))

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步詳細的說明，實施例1-3中所用的n-甲基野靛堿為前述式(1)所示的化合物。

實施例1

潰瘍性結腸炎為急性、慢性或反復發作的潰瘍性結腸炎，n-甲基野靛堿單次應用劑量為小鼠1mg/kg，藥物的劑型為注射液劑型。

實施例2

潰瘍性結腸炎為急性、慢性或反復發作的潰瘍性結腸炎，n-甲基野靛堿單次應用劑量為小鼠4mg/kg，藥物的劑型為粉劑型。

實施例3

潰瘍性結腸炎為急性、慢性或反復發作的潰瘍性結腸炎，n-甲基野靛堿單次應用劑量為小鼠16mg/kg，藥物的劑型為針劑型。

下面的動物實驗進一步說明了上述實施例1至3的效果：

一、實驗材料

1.1動物處理

健康的雄性icr小鼠，20～22g,購自寧夏醫科大學實驗動物中心，動物生產許可證號：ncxk(寧)2013-0005。喂養條件包括標準飼料，自來水，室溫保持在(24±2)℃，濕度50-60％，每日光照與黑暗時間各12h。實驗前，將動物置于實驗環境適應3天。

1.2實驗藥品及儀器

n-甲基野靛堿(購自北京中科質檢生物技術有限公司)，溶解在生理鹽水中。dss(購自sigma公司)，mpo試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)，elisa試劑盒(購自raybiotech,inc)，兔抗nf-κb、iκb、p-iκb多克隆抗體(購自proteinch、cellsignal、sab公司)，酶標儀(1510，thermofisher公司)，電泳儀、電轉儀(powerpacbasic,美國bio-rad公司)，凝膠成像分析儀(js-860b,上海培清公司)。

1.3實驗動物模型的建立、分組及給藥

實驗分為正常組、潰瘍性結腸炎(uc)模型組，n-甲基野靛堿不同劑量組。5-氨基水楊酸(5-asa)陽性藥物組。小鼠每天飲用5％dss(葡聚糖硫酸鈉)連續7天誘導成潰瘍性結腸炎，小鼠在造模期間按0.1ml/10g劑量灌胃給藥，正常組和模型組給予等量的生理鹽水。在第8天，頸椎脫臼處死小鼠，取出結腸組織進行組織病理與形態學改變、分子生物學表達變化等藥效學評價。

二、實驗過程

(一)疾病活動指數(dai)和結腸長度測定

1.1實驗方法：

在造模的7天中，每天測定各組小鼠的體重，同時用鄰聯甲苯胺法檢測糞便中是否含血，同時觀察小鼠的大便性狀。并對小鼠體重的變化、糞便隱血、大便性狀按copper進行評分。評分標準如下：①體重下降情況：體重不變為0分；下降1％～5％為1分；5％～10％為2分；10％～20％為3分；大于20％為4分。②大便性狀：正常為0分；松散為2分；稀水樣為4分。③大便出血：正常為0分；潛血陽性為2分；肉眼血便4分。dai為體重變化、大便性狀和糞便隱血的總和。于造模的第8天處死小鼠，剖開腹腔，取出結腸，測量各組小鼠結腸的長度并記錄。

表1.n-甲基野靛堿對潰瘍性結腸炎小鼠dai和結腸長度的影響(n＝10)

(與正常組比較：^##p<0.01；與模型組比較：*p<0.05,**p<0.01)

1.2實驗結果：

由表1和圖1可以看出，n-甲基野靛堿(4,16mg/kg)組和5-asa組降低潰瘍性結腸炎小鼠的dai,同時也抑制小鼠結腸長度的縮短(與模型組對比^*p﹤0.05或^**p﹤0.01)，而低劑量的n-甲基野靛堿對小鼠的dai和結腸長度的縮短沒有作用(^*p>0.05)。

(二)he染色觀察組織結構病理變化

2.1實驗方法：

在遠端結腸處取大約1cm的結腸組織，放在10％中性福爾馬林溶液中固定，然后進行脫水，石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosinstaining，hestaining)，在將石蠟切片于65℃烘箱中烘烤20min，之后將玻片依次浸泡于二甲苯ⅰ(10min)，二甲苯ⅱ(5min)，無水乙醇ⅰ(1min)，無水乙醇ⅱ(1min)，95％乙醇30s)，80％乙醇(30s)和70％乙醇(30s)，水洗3次，之后于蘇木素中浸泡5min，水洗3次，在1％的鹽酸酒精溶液中浸泡20s，水洗，伊紅溶液中浸泡2min，水速洗，之后石蠟切片繼續依次浸泡于80％乙醇(30s)，95％乙醇(30s)，無水乙醇ⅰ(1min)，無水乙醇ⅱ(3min)，二甲苯ⅰ(2min)和二甲苯ⅱ(2min)，最后用中性樹膠封片。每組小鼠結腸組織切片置顯微鏡下，在100×視野下觀察組織形態的變化并作出相應的評分，選3～5個區域進行拍照記錄。

表2.n-甲基野靛堿對潰瘍性結腸炎小鼠組織學評分的影響(n＝10)

(與正常組比較：^##p<0.01；與模型組比較：*p<0.05,**p<0.01)

2.2實驗結果：

由表2和圖2可以看出，在光顯微鏡下，n-甲基野靛堿(4,16mg/kg)和陽性藥5-asa能夠明顯改善小鼠結腸組織的病理變化，結腸粘膜完整連續，無明顯的充血水腫，局部有少量的炎性細胞浸潤，腺體排列基本規則，結構清楚，且組織學評分低于模型組。而給予1m/kgn-甲基野靛堿不能減輕小鼠結腸的炎癥程度，組織學評分也沒有降低。

(三)mpo測定

3.1實驗方法：

將小鼠頸椎脫臼處死，迅速取出結腸，并在預冷的pbs溶液中徹底清洗結腸，然后放在-80℃液氮中待用。把組織放在玻璃勻漿器中，按按9：1(v/w)加入組織裂解液冰上操作，反復勻漿60次至肉眼不見組織塊，離心取上清液。然后嚴格按照試劑盒操作說明進行檢測。

表3.n-甲基野靛堿對潰瘍性結腸炎小鼠組織中mpo活性的影響(n＝10)

(與正常組比較：^##p<0.01；與模型組比較：*p<0.05,**p<0.01)

3.2實驗結果：

潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中mpo的活性越大，說明中性粒細胞的浸潤越多，組織損傷的越嚴重。由表3和圖3可以看出，與模型組相比，n-甲基野靛堿(4,16mg/kg)和陽性藥5-asa能降低小鼠結腸組織中的mpo活性，但1mg/kgnmc不能降低mpo的活性。

(四)tnf-ɑ、il-1β和il-6測定

4.1實驗方法：

取出冰凍的結腸組織，用玻璃勻漿器對其進行研磨，按9：1(v/w)加入組織裂解液冰上操作，反復勻漿60次至肉眼不見組織塊，離心取上清液。然后按照bca蛋白濃度測定試劑盒的要求測定蛋白濃度。在嚴格按照elisa試劑盒操作說明進行檢測。

表4.n-甲基野靛堿對潰瘍性結腸炎小鼠組織中tnf-ɑ、il-1β和il-6表達的影響(n＝6)

(與正常組比較：^#p<0.05，^##p<0.01；與模型組比較：*p<0.05,**p<0.01)

4.2實驗結果：

由表4和圖4可以看出,給予n-甲基野靛堿(16mg/kg)能夠減少小鼠結腸組織中的促炎細胞因子tnf-ɑ、il-1β、il-6的過量表達(與模型組對比^*p﹤0.05或^**p﹤0.01)。說明n-甲基野靛堿能夠抑制潰瘍性結腸炎中促炎介質表達的作用。

(五)westernblot檢測潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中nf-kbp65、ikb、p-ikb蛋白的表達

5.1實驗方法：

使用凱基全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，bca蛋白含量檢測試劑盒測定樣本總蛋白質濃度并標定蛋白統一濃度。sds—聚丙烯酰胺凝膠電泳，用將硝酸纖維素膜(nc膜)進行濕法轉膜。轉膜結束后取出硝酸纖維素膜，將膜置入5％脫脂奶粉封閉液中封閉2h。封閉結束孵育5％脫脂奶粉稀釋的一抗，4℃過夜，洗膜孵育二抗。用pbs洗nc膜3次，每次10min。滴加蛋白化學發光劑(ecl)，凝膠圖像分析成像系統(培清，js-860b)對膠片上每個目的條帶進行掃描和圖像分析。

5.2實驗結果：

如圖5至圖7所示，與模型組比較，n-甲基野靛堿(16mg/kg)給藥組ikb蛋白表達明顯增加，nf-kbp65、p-ikb蛋白表達明顯減少(^*p<0.05)；如圖6和圖7所示，與模型組比較，n-甲基野靛堿(16mg/kg)組潰瘍性結腸炎結腸組織中nf-kbp65、p-ikb蛋白表達明顯減少(^*p﹤0.05)；如圖5所示，與模型組比較，n-甲基野靛堿(16mg/kg)給藥組ikb蛋白表達明顯增加(^*p﹤0.05)。提示n-甲基野靛堿的保護作用可能通過上調ikb蛋白的表達，降低nf-kbp65、p-ikb的表達與活化，抑制nf-kb的激活，從而下調促炎細胞因子的表達，進而起到一定的保護作用。

以上所述的僅是本發明的一些實施方式。對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明創造構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。