一種聚乙二醇修飾的鐵離子螯合劑的制作方法

本發明屬于化學改性的縮聚物領域，具體涉及一種去鐵胺接枝聚乙二醇，還涉及其作為鐵離子螯合劑的應用。

背景技術：

鐵離子過載與許多臨床疾病有關，比如地中海貧血，中風，阿茨海默、帕金森病等神經退變性疾病。

去鐵胺是臨床上通用的一種鐵離子螯合劑，對鐵離子過載相關的疾病具有治療作用。但是其具有明顯的缺陷：1、血液中的去鐵胺會被體內的酶快速降解，其體內半衰期不足30分鐘，導致藥效不佳，需要加大用藥劑量或者延長用藥時間；2、具有毒性，會引起許多不良反應，如，低血壓和心動過速(參見俞天驥，去鐵胺——老藥新毒性，國外醫學：藥學分冊，1991.p249,)，特別是在高劑量的時候，其不良反應特別明顯。為了兼顧藥效和安全，目前通常的治療方式低劑量長時間的靜脈注射，以維持體內濃度以達到一定效果，但是該種治療方法十分不便，患者依從性差。

因此，急需對去鐵銨進行改進，提高其半衰期，降低其毒性。

技術實現要素：

本專利的目的在于提供一種具有長效低毒的聚乙二醇衍生物修飾的去鐵胺螯合劑。

本發明公開了一種鐵離子螯合劑，它是由聚乙二醇衍生物和去鐵胺通過酰胺鍵共價連接得到。

進一步地，本發明的鐵離子螯合劑具有下述式(ⅰ)所示的結構：

rn-dfo

(i)

其中，rn表示聚乙二醇衍生物主鏈，dfo表示去鐵胺基，dfo結構如下：

進一步地，所述聚乙二醇衍生物為羧基化的聚乙二醇單甲醚或醛基化的聚乙二醇單甲醚。

進一步地，所述聚乙二醇衍生物主鏈的分子量為2kda～20kd。

本發明化合物制備方法為如下兩種制備方法之一：

(1)將羧基化的聚乙二醇單甲醚溶于溶劑中，按比例加入去鐵胺、二環己基碳二亞胺(dcc)/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，調節ph值，反應結束后分離純化即得；

(2)將醛基化的聚乙二醇單甲醚溶于溶劑中，按比例加入去鐵胺和硼氫化試劑，調節ph值，反應結束后分離純化即得。

進一步地，反應條件為避光反應24～48h，反應溫度為0～25℃，反應的ph值為6.8～8.2。

進一步地，反應的ph值通過4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液或者通過加入三乙胺進行調節。

進一步地，所述聚乙二醇單甲醚與去鐵胺的摩爾配比范圍為：1:1.2～1:2。

進一步地，所述溶劑選自水、甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷、四氫呋喃、二甲亞砜、n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺，優選為甲醇或者水。

進一步地，制備方法(1)所述聚乙二醇單甲醚：去鐵胺：edc/dcc：nhs的摩爾比為1:1.2:1.2:1.2～1:2:2:2。

進一步地，制備方法(2)所述硼氫化試劑為氰基硼氫化鈉或硼氫化納。

進一步地，制備方法(2)所述聚乙二醇單甲醚：去鐵胺：硼氫化試劑的摩爾比為1:1.2:2-1:2:20。

進一步地，所述提純方法為經硅膠柱和/或陽離子交換柱提純。

本發明提供了所述化合物作為鐵離子螯合劑的應用。

與去鐵銨相比，本發明鐵離子螯合劑的半衰期顯著延長、毒性大大降低，而且其螯合鐵離子的能力沒有變化，因此，將其注入體內，藥效會明顯提高，同時毒性大大減小，安全性明顯提升，臨床應用前景優良。

顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。

附圖說明

圖1.鐵離子螯合劑合成示意圖。

圖2.實施例1產物的紅外譜圖。

圖3.實施例3產物的核磁譜圖。

圖4.去鐵胺和實施例1和2的螯合鐵離子紫外吸收光譜。

圖5.去鐵胺和實施例1、3、5和6化合物的半衰期。

圖6.不同濃度去鐵胺和實施例1、3、5和6化合物的細胞毒性測試結果

具體實施方式

本發明所用原料和試劑均來自于市售的商品。

羧基化聚乙二醇單甲醚、醛基化聚乙二醇單甲醚購自廈門賽諾邦格生物科技有限公司；去鐵胺、edc、nhs購自sigma，dcc、硼氫化鈉和氰基硼氫化鈉購自阿拉丁。

edc：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽

nhs：n-羥基琥珀酰亞胺

dcc：二環己基碳二亞胺

本發明所使用的儀器型號為：紅外(nicolet6700，核磁(brukeravii-400mhz)，紫外-可見光譜儀(bioteckeon)。

本發明鐵離子螯合劑的合成步驟如圖1所示。

實施例1

1克羧基化聚乙二醇單甲醚(分子量2kda)溶于10毫升hepes(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)緩沖溶液中，按照1:2:2:2(羧基化聚乙二醇單甲醚中的羧基摩爾比為1)的摩爾比例加入去鐵胺、edc和nhs，避光攪拌24小時后，反應溶液經過硅膠柱和陽離子交換柱提純，得到產物聚乙二醇單甲醚修飾的去鐵胺鐵離子螯合劑mpeg2k-dfo。

紅外光譜測試：kbr壓片法，測試結果如圖2所示。特征峰歸屬為：3445cm^-1(聚乙二醇單甲醚分子中的o-h伸縮振動)；3300cm^-1(去鐵胺分子中的n-h伸縮振動)；2878cm^-1(聚乙二醇單甲醚和去鐵胺分子中的ch2對稱伸縮振動)；1650cm^-1(酰胺ⅰ帶，c＝o伸縮振動)；1551cm^-1(去鐵胺分子中的n-h彎曲振動)；1467cm^-1(聚乙二醇單甲醚和去鐵胺分子中的ch2彎曲振動)；1100cm^-1(聚乙二醇單甲醚分子中的c-o-c伸縮振動)。

以上紅外檢測結果表明：聚乙二醇單甲醚成功對去鐵胺進行了化學修飾。

實施例2

1克羧基化聚乙二醇單甲醚(分子量2kda)溶于10毫升甲醇溶液中，置于冰浴中，按照1:1.2:1.2:1.2(羧基化聚乙二醇單甲醚中的羧基摩爾比為1)的摩爾比例分別加入去鐵胺、dcc和nhs，最后滴加三乙胺調節ph至7～8，避光攪拌24小時后，反應溶液先經乙醚沉淀后旋轉蒸發得到粗產物，然后經過硅膠柱和陽離子交換柱提純，得到產物聚乙二醇單甲醚修飾的去鐵胺鐵離子螯合劑mpeg2k-dfo-2。

實施例3

1克醛基化聚乙二醇單甲醚(分子量5kda)溶于10毫升超純水中，按照1:2:2(醛基化聚乙二醇單甲醚中的醛基摩爾比為1)的摩爾比例分別加入去鐵胺和氰基硼氫化鈉，在10℃避光攪拌48小時后，反應溶液經過硅膠柱提純，得到產物聚乙二醇單甲醚修飾的去鐵胺鐵離子螯合劑mpeg5k-dfo。

核磁氫譜測試：將40mg樣品溶于1mld2o中，25℃檢測，結果如圖3所示。

特征峰歸屬為：3.6和3.3ppm分別對應聚乙二醇單甲醚中甲氧基和亞甲基中的氫；3.4ppm對應去鐵胺分子中的h-5,h-12和h-19；3.1ppm對應去鐵胺分子中的h-1,h-8和h-15；2.8ppm對應去鐵胺分子中的h-6和h-13；2.3和2.4ppm對應去鐵胺分子中的h-14和h-7；2.0ppm對應–ch3；1.5ppm對應去鐵胺分子中的h-2,h-4，h-11和h-18；1.4ppm對應去鐵胺分子中的h-9和h-16；1.2ppm對應去鐵胺分子中的h-3,h-10和h-17。

以上核磁氫譜結果表明聚乙二醇單甲醚對去鐵胺成功進行了化學修飾。

實施例4

1克醛基化聚乙二醇單甲醚(分子量5kda)溶于10毫升甲醇溶液中，按照1:2:2(醛基化聚乙二醇單甲醚中的醛基摩爾比為1)的摩爾比例加入去鐵胺和氰基硼氫化鈉，在室溫25℃避光攪拌24小時后，反應溶液先經乙醚沉淀后旋轉蒸發得到粗產物，然后經過硅膠柱提純，得到產物聚乙二醇單甲醚修飾的去鐵胺鐵離子螯合劑mpeg5k-dfo-2。

實施例5

1克羧基化聚乙二醇單甲醚(分子量10kda)溶于20毫升hepes(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)緩沖溶液中，按照1:2:2:2(羧基化聚乙二醇單甲醚中的羧基摩爾比為1)的摩爾比例加入去鐵胺、edc和nhs，在室溫25℃避光攪拌24小時后，反應溶液經過硅膠柱和陽離子交換柱提純，得到產物聚乙二醇單甲醚修飾的去鐵胺鐵離子螯合劑mpeg10k-dfo。

實施例6

1克醛基化聚乙二醇單甲醚(分子量20kda)溶于20毫升二氯甲烷溶液中，按照1:2:20(醛基化聚乙二醇單甲醚中的醛基摩爾比為1)的摩爾比例加入去鐵胺和硼氫化鈉，在室溫25℃避光攪拌48小時后，反應溶液先經乙醚沉淀后旋轉蒸發得到粗產物，然后經過硅膠柱提純，得到產物聚乙二醇單甲醚修飾的去鐵胺鐵離子螯合劑mpeg20k-dfo。

本發明通過以下試驗說明本發明的有益效果。

試驗例1鐵離子螯合能力檢測

鐵離子螯合能力采用紫外吸收光譜法檢測(tian,etal.,rscadvances,2016,6,32471–32479)。如圖4所示，去鐵胺螯合鐵離子的特征吸收峰在429nm。實施例1和例2的產品螯合鐵離子后的吸收峰也在429nm，并根據去鐵胺濃度-吸光度標準曲線計算實施例1和例2產品中的去鐵胺含量，結果表明與其分子結構式中的理論含量是一致的。上述結果表明，實施例1和實施例2制備的螯合劑與相同摩爾濃度的去鐵胺螯合鐵離子的能力相同，去鐵胺接枝上聚乙二醇并不影響其對鐵離子的螯合能力。

試驗例2半衰期檢測

半衰期采用代謝實驗檢測(meyer-brunot&keberle，biochem.pharmaco.l,1967,16,527-535)。步驟為：樣品采用實施例1、3、5和6中得到的產品，分別為mpeg2k-dfo，mpeg5k-dfo，mpeg10k-dfo和mpeg20k-dfo。樣品和去鐵胺對照(dfo)分別溶于10毫升krb(krebs-ringerbicarbonate,克-林二氏重碳酸鹽)緩沖液后加入2毫升新鮮血漿，然后在37℃，95％氧氣和5％二氧化碳氣氛中震蕩，每隔一定時間吸出1毫升反應液，經處理后采用紫外-可見光譜在429nm檢測吸光度。對應標準曲線計算出孵化不同時候后孵化液中的有效去鐵胺濃度。然后將時間和對應濃度作圖，曲線經擬合后計算半衰期。

根據圖5所示，去鐵胺的半衰期僅為0.8小時，而螯合劑的半衰期分別為18.2、27.8、36.9和42.2小時。本發明制備的乙二醇修飾的鐵離子螯合劑大幅度延長了去鐵胺的半衰期。

試驗例3細胞毒性

采用mtt法檢測細胞毒性。樣品采用實施例1、3、5和6中得到的產品，分別為mpeg2k-dfo、mpeg5k-dfo、mpeg10k-dfo和mpeg20k-dfo。各樣品分別溶于磷酸緩沖液pbs中配制成含10mm等效dfo濃度的溶液，用于細胞試驗時，再用培養基稀釋成含0.5、0.2、0.1、0.05、0.01和0.005mm等效dfo濃度的溶液。對照組采用等體積的pbs加入培養基。人臍靜脈內皮細胞按3×10³的密度種于96孔板，24小時后吸棄培養基，加入上述含不同濃度的螯合劑培養基，繼續培養48小時，然后采用mtt法檢測人臍靜脈內皮細胞毒性(tian,etal.,carbohydratepolymers,2010,79,137-144)。

細胞存活率mtt測試結果依次如圖6所示。

去鐵胺具有劑量依賴性的細胞毒性，從圖中看出當dfo的濃度高于0.05mm時培養48小時后細胞活率低于60％。相對比，各產品組的等效dfo濃度在0.5mm下均表現出大于80％的細胞活率。

以上結果表明：螯合劑的細胞毒性明顯小于對照組去鐵胺的細胞毒性。

本發明公開的聚乙二醇衍生物鍵接去鐵胺制備的鐵離子螯合劑具有長效低毒的作用。具體地，本發明通過將去鐵胺與乙二醇鏈鏈接，克服了去鐵胺在體內半衰期短的問題，同時，等效去鐵胺濃度的鐵離子螯合劑細胞毒性比去鐵胺的細胞毒性小，降低了去鐵胺的毒副作用，明顯優于單獨的去鐵胺。