哮喘和氣管疾病的治療的制作方法

專利名稱：哮喘和氣管疾病的治療的制作方法
技術領域：
本發明涉及治療慢性和急性氣管炎癥包括哮喘病的方法。本發明還涉及用于上述治療中的甾體或甾體類似物，以及包含這些化合物作為活性成分的藥物組合物。在優選實施方案中，活性成分抑制氣管壁中的炎癥以及平滑肌細胞的增殖。它還可具有至少一種選自抗血管生成、抗氧化和破壞微管形成中的其他活性。發明背景在治療哮喘中目前有兩類截然不同的藥物。使用支氣管舒張劑可提供對癥緩解，所述支氣管舒張劑包括β2-腎上腺素受體激動劑如舒喘寧(salbutamol)和沙美特羅(salmeterol)。其他具有支氣管舒張劑性質的藥物包括毒覃堿受體拮抗劑、異丙托溴銨、和磷酸二酯酶抑制劑如茶堿(theophylline)。
第二類藥物是預防性的，包括糖皮質激素如氯地米松二丙酸鹽。也可使用色甘酸二鈉和萘多羅米(nedocromil)鈉，但是這些藥物比糖皮質激素的效用低。
然而，以上藥物中沒有一個可以完全反轉氣管的高應答性或者防止所有病人的哮喘災害性致命和致死期。這些病癥普遍存在而且有時是致死原因的事實說明以上藥物的作用并不是最佳的。
現在認為哮喘是一種慢性氣管炎癥疾病，其特征是嗜曙紅性支氣管炎(Frigas等人，1991)。與其他慢性炎癥疾病一樣，哮喘中的炎癥也誘發組織改變，這已被記載于氣管的尸體解剖研究(Dunnill等人，1969)中以及活供體的支氣管活體解剖(Brewster等人，1990；Bai和Pare,1995)中。該組織改變包括上皮脫落；嗜曙紅細胞明顯過濾至粘膜中；肥大細胞和淋巴細胞的活化；粘液腺的增大；外傷型膠原立即沉降至上皮的真基膜以下并存在與粘膜中；以及肌成纖細胞(myofibroblast)數量的增加。另外，在哮喘氣管中血管的體積和數量也增加，這表明該組織改變中還伴隨著血管生成(Kuwano等人，1993)。氣管壁的總體積隨著氣管平滑肌體積的增加也增加(Kuwano等人，1993)，這是肥大性和增生性應答的結果(Ebina等人，1993)。
氣管高應答性(AHR)是哮喘患者對各種刺激產生過度的支氣管縮肌應答。氣管壁增厚是AHR發展的中心這一概念在最近10年已被接受。氣管增厚已用放大平滑肌縮短之后果的數學模型研究來表現，即計算一定量的平滑肌縮短以與健康受試者相比在哮喘病患者中產生更大的氣管阻力(例如40％縮短在健康受試者中產生15倍的增加，但在哮喘患者中產生290倍的增加)(James等人，1989)。氣管壁面積增加50-250％，在更大的氣管中可觀察到更多的增加(James等人，1989)。肌肉體積增加2-3倍，而且其增加的幅度與哮喘的嚴重程度有關(Kuwano等人，1993)。變化的本質尚未進行廣泛的研究，但其包括增生和肥大(Ebina等人，1993)。過敏性哮喘患者中延長對過敏原的回避，證明氣管中的應答性降低至在健康受試者中所觀察到的水平，而且伴隨著癥狀的緩解(Platts-Mills等人，1987)。以上這些研究與哮喘氣管中結構的改變也是可逆的這一概念是相一致的。
哮喘氣管中此等長期變化為治療性介入提供了新目標(Stewart等人，1993)。因此，主要的興趣集中在鑒別出該氣管壁組織變化應答的機理以及現存的抗哮喘藥物對這些過程的影響。許多因子已被確認為各種來源包括人的經培養的平滑肌的有絲分裂因子(參考Stewart等人，1995a)。正如所希望的，屬于生長因子族的刺激，包括基本成纖維細胞生長因子(bFGF)、血小板衍生的生長因子(PDGFBB)和表皮生長因子(EGF)，是最有效的增殖劑(Hirst等人，1992；Stewart等人，1995a)。凝血酶也是有效的生長因子(Tomlinson等人，1994)，其中如內皮素-1和血栓烷A2模擬物、U46619的支氣管收縮劑，其活性較弱，而且一些其他收縮劑如組胺和神經激肽是完全無活性的(Stewart等人，1995a)。
在經培養的人氣管平滑肌中，連續地暴露在β-腎上腺素受體激動劑可降低對寬范圍之有絲分裂因子的增殖性應答，所述有絲分裂因子包括凝血酶、EGF和血栓烷A2類似物、U46619(Tomlinson等人，1994；1995)。而且，地塞米松和其他抗炎甾體藥物也具有抗經培養之氣管平滑肌增殖的作用(Stewart等人，1995b)，但是抑制作用的幅度取決于首先刺激增殖作用的有絲分裂因子。還應注意的是，通過吸入抗炎甾體藥物進行的長期治療僅中等程度地降低AHR(Sotomayor等人，1984；Lungren等人，1988)，其中據報道β2-激動劑既沒有作用也不能增加AHR(Wahedna等人，1993)。因此，兩類最經常使用而且最有效的治療哮喘的藥物對AHR具有亞最佳作用，而且因此不可能有效地調節與氣管組織改變有關的結構變化，所述氣管組織改變對病癥的前進和發展有作用。
我們已研究了使組織改變過程停止或者調節該過程的潛在方式，并已令人驚奇地發現適用于該目的的甾體及其類似物。發明簡述2-甲氧基雌二醇是人生理雌激素——17β-雌二醇的天然代謝物。
該物質是分兩步產生的，其涉及雌激素的羥基化，產生兒茶酚雌激素，然后通過可誘導的細胞色素p450通路進行甲氧基化，產生相應的甲氧基雌激素(Spink等人，1994)。目前認為是無生理活性的(Rosner等人，1991)，但在細胞培養研究中已確認2-甲氧基雌二醇抑制某些變形細胞系的增殖作用(Lottering等人，1992)，并抑制活動性內皮細胞和成纖維細胞的活性增殖(Fotsis等人，1994)。Fotsis等人還表明給藥2-甲氧基雌二醇可通過抑制腫瘤誘導的血管生成來抑制腫瘤的生長，但它并不是直接抑制腫瘤細胞的增殖。有人提出該化合物可減少基膜損壞，因此可防止細胞遷移至細胞外基質中，并使其具有潛在的抗血管生成藥物的作用，用于治療實體瘤或血管生成疾病。在Klauber等人，1997中證實了對腫瘤新血管形成的抑制作用。
2-甲氧基雌二醇對經培養之兔主動脈平滑肌細胞的抗增殖作用(Nishigaki等人，1995)也表明該化合物可用于防止動脈粥樣硬化的發展，該疾病中的細胞變化與哮喘和AHR中的不同。
抗增殖作用的機理尚未確定。Lottering等人(1992)提出環腺苷一磷酸(cAMP)的升高可解釋2-甲氧基雌二醇對DNA合成的抑制作用，其中在有絲分裂的紡錘體形成期間對微血管形成的抑制作用可用于解釋對細胞分裂的抑制作用(Fotsis等人，1994)。2-甲氧基雌二醇的其他生理作用沒有被廣泛表征。在豬子宮內膜細胞培養物中，2-甲氧基雌二醇抑制PGF2α的合成(Zhang和Davis,1992)。2-甲氧基雌二醇的非基因組作用包括通過在秋水仙素位點處與微管素的結合產生的微管破裂作用(D′Amato等人，1994；Aizu-Yokota等人，1995)以及血管平滑肌的松弛作用(Goyache等人，1995)。
在國際專利申請公開WO 95/04535中，描述了通過抑制微管素在體外的聚合作用而具有抗有絲分裂作用的雌二醇衍生物。在該體外研究中可推導出，所述化合物抑制內皮細胞增殖。
本發明涉及2-甲氧基雌二醇的作用以及對炎性細胞活化的抑制。其特別是涉及對如哮喘的氣管疾病進行治療或預防。
沒有一份文獻提到上述設想或公開了本發明。例如，在氣管中抑制平滑肌細胞增殖和炎性細胞的活化并不能經由WO 95/04535的體外觀察而被預測到，而且這些活性的機理似乎與對微管形成的作用無關。
2-甲氧基雌二醇對兔血管平滑肌的抗增殖作用(Nishigaki等人，同上)也不能外推至氣管平滑肌，這是因為這兩種來源的細胞的應答性不同。
一些增加內皮細胞增殖的藥物如肝素，實際上抑制氣管平滑肌細胞的增殖。因此，2-甲氧基雌二醇在內皮細胞中的抗增殖作用(Fotsis等人，WO 95/04535，同上)不能說明平滑肌以相同的方式進行應答。
我們發現2-甲氧基雌二醇抑制髓過氧化酶從人外周血之多形核白細胞中的釋放以及對這些細胞的細胞吞噬活性。在這些細胞中降低細胞吞噬活性可證明其抗炎性質。這是非常令人驚奇的，特別是因為已知2-甲氧基雌二醇對糖皮質激素或者雌激素受體沒有明顯的親和性(Merriam等人，1980)。
這些性質使2-甲氧基雌二醇以及相關化合物有利于治療包括但不限于哮喘、慢性阻塞性氣管疾病和其他以炎癥為特征的氣管疾病。適合于本發明方法治療的其他疾病包括例如肺氣腫、肺炎或以增殖性和炎性病癥如中性白細胞過濾為特征的氣管疾病、或者其癥狀或后遺癥導致殘留炎性細胞活化的肺感染疾病。
還可治療如過敏性鼻炎的病癥，這是因為發現2-甲氧基雌二醇抑制與肥大細胞有關的細胞系——RBL2H3的脫粒。2-甲氧基雌二醇的抑制作用對抗原刺激的釋放是選擇性的，因為對蛋白激酶C刺激劑、PMA以及對鈣離子載體A23187的應答不受影響。因此，對抗原釋放的作用不是由于對微管依賴性的顆粒擠壓作用產生非特異性作用的結果。我們實驗的結果表明2-甲氧基雌二醇和具有這些活性的相關甾體可用于治療過敏性疾病，該疾病包括但不限于鼻炎和特異反應性的皮膚疾病。不希望受限于任何具體的作用機理，這些數據表明與涉及受體的特異性信號傳導機理有關，而且該機理對抑制氣管炎癥是有作用的。
我們進一步發現2-甲氧基雌二醇抑制DNA合成以及用寬范圍之包括FCS和bFGF的生長因子刺激的氣管平滑肌中的細胞分裂。另外，血清素刺激的蛋白合成速率增加被2-甲氧基雌二醇抑制，除抑制細胞增殖外，還提高了抗肥大作用的可能性。與2-甲氧基雌二醇的抗血管生成活性一起，我們的觀察表明該化合物及其相關化合物在治療以炎癥為特征的上述氣管疾病中有治療價值，特別是治療慢性哮喘，其對氣管壁組織改變有特別的作用并因而對氣管高應答性產生影響。還測試了2-甲氧基雌二醇的類似物抑制DNA合成的作用，其結果表明這些化合物也是有治療價值的。
在第一方面中，本發明提供治療以慢性或急性氣管炎癥為特征的疾病的方法，其包括向需要此等治療的哺乳動物給藥具有調節氣管組織改變之活性的甾體或甾體類似物。優選的是，所述哺乳動物是人、貓、馬或牛，更優選的是人。甾體2-甲氧基雌二醇特別優選用于本發明方法中。在本發明所用劑量水平時沒有有效糖皮質激素活性的甾體或其類似物是特別希望的。
在第二方面中，本發明提供治療以慢性或急性氣管炎癥為特征的疾病的方法，其包括向需要此等治療的哺乳動物給藥甾體或甾體類似物，其中，所述甾體或類似物抑制多形核白細胞的細胞吞噬作用。優選的是，髓過氧化酶從白細胞中的釋放也被抑制。還抑制巨噬細胞的活化。
在一個實施方案中，根據本發明的方法進一步通過抑制平滑肌細胞的增殖和炎癥來調節氣管壁的組織改變。所述組織改變進一步通過抑制以下一種或多種活性來調節氣管壁中血管生成、氧化劑的形成和微管功能的形成。
在一個特別優選的實施方案中，本發明的方法用于治療以下疾病哮喘、氣管高應答性、支氣管收縮、肺氣腫、肺炎、特異反應性疾病如過敏性鼻炎和肺感染。
在第三方面中，本發明提供通過抑制氣管壁的炎癥來調節氣管組織改變的甾體或甾體類似物。優選的是，所述化合物還具有抑制氣管平滑肌細胞增殖的活性、特別是應答有絲分裂因子刺激的活性。
在第四方面中，本發明涉及通過抑制細胞吞噬活性來調節氣管組織改變的甾體或甾體類似物，在一個優選實施方案中，用2-甲氧基雌二醇抑制多形核白細胞的細胞吞噬活性。在另一個實施方案中，還抑制髓過氧化酶從多形核白細胞中的釋放。在一個特別優選的實施方案中，所述甾體或甾體類似物不具有糖皮質激素活性。
在第五方面中，本發明提供的上述甾體或甾體類似物進一步具有抗血管生成活性和/或抗氧化活性。在一個特別優選的實施方案中，本發明的甾體或甾體類似物還具有破裂氣管壁中的微管的活性。
在第六方面中，本發明提供包括上述甾體或甾體類似物、任選一種或多種藥物學上可接受的載體和賦形劑的組合物。所述載體和賦形劑的例子包括但不限于干燥的微粉化粉末和乳糖或者最近研制出的氫氟烷烴。本發明的組合物可成型為通過在治療氣管疾病或哮喘中所用的常規途徑例如局部、口服、鼻腔給藥或吸入給藥的制劑。這些制劑可為任何常規的劑型，如膠囊劑、扁囊劑、片劑、氣霧劑、粉末顆粒劑、微粉化顆粒劑或溶液劑。任選地，所述甾體或甾體類似物可與環糊精復合，也可為與藥物學上可接受的酸形成酯的形式，所述酸例如是硫酸、乙酸、苯甲酸等。本領域普通技術人員可參考標準教材，如Remington′s Pharmaceutical Sciences 17th版，來確定制劑所采用的劑型以及如何給藥。
甾體或甾體類似物的給藥劑量取決于待治療的病癥和給藥途徑，而且這對普通住院醫生或獸醫來說這是顯而易見的。此類普通技術人員可容易地確定合適的給藥劑量、方式和頻率。本發明的組合物可用于治療慢性或急性氣管炎癥，包括哮喘、氣管高應答性(AHR)或支氣管收縮。
在本發明的一個特別優選實施方案中，通過給藥包含2-甲氧基雌二醇的組合物可抑制哮喘病人之氣管壁平滑肌細胞的炎癥和增殖。
雖然具體參考2-甲氧基雌二醇來描述本發明，但可理解的是也可在本發明中使用具有所需生理活性的該化合物的類似物。這些類似物包括但不限于2-羥基雌二醇、2-甲氧基雌二醇-3-甲基醚和4-甲氧基雌二醇。
已鑒別出許多雌二醇衍生物的化合物在其他組織中具有抗增殖和/或抗血管生成活性。例如見WO 95/04535，其整個內容在此并入作為參考。
此等化合物也是適用于本發明中的候選藥物，并在本發明的甾體、甾體類似物或甾體類似化合物的意思范圍內。優選的化合物在甾體骨架的2位上具有甲氧基。
另外，可設想到目前尚未知曉的其他化合物也有可能具有與本發明之2-甲氧基甾體或甾體類似化合物相似的結構，并具有本發明范圍內的生理活性。在本發明說明書中，術語“甾體”、“甾體類似物”或“甾體類似化合物”可理解為包括2-甲氧基雌二醇、2-羥基雌二醇、2-甲氧基雌二醇-3-甲基醚、4-甲氧基雌二醇以及其他基于具有與本發明目的相關生理活性的甾核的化合物。其他化合物可具有與2-甲氧基雌二醇足夠的結構和/或電(電荷分布)相似性，并具有本發明范圍內的生理活性，而不被限制具有甾核，此等化合物可被認為是本發明的甾體類似物，例如WO 95/04535中的化合物。具有此等活性的化合物可容易地通過使用能夠指示本發明說明書中其他處所描述類型的活性的試驗來鑒別出來。例如，可通過測定氣管平滑肌細胞增殖作用來測試化合物對慢性呼吸阻塞性疾病的作用；通過確定對炎性細胞活化的抑制來測試對過敏性鼻炎和感染性疾病的作用，對鼻炎測試肥大細胞，而對感染性疾病測試中性白細胞。
本領域技術人員還可利用其他測試，并容易地篩選出適合于本發明的化合物。本發明詳細描述現參考附圖并根據實施例來詳細描述本發明，圖中

圖1顯示2-甲氧基雌二醇對辣根過氧化酶介導的四甲基聯苯胺氧化沒有作用。
圖2顯示2-甲氧基雌二醇(0.3-10μM,30分鐘預處理)對有絲分裂因子誘導的[3H]-胸甙插入經培養之人氣管平滑肌細胞中的作用。測試的有絲分裂因子是0.3U/ml的凝血酶、1％的FCS、300pM的bFGF(圖2a)和10％的FCS、3nM的EGF(圖2b)。進行與圖2a和2b相同設計的附加實驗，并且在圖2c中顯示的是該后一個結果與圖2a和2b中的結果組合的圖。還研究了2-甲氧基雌二醇(3μM)對凝血酶(0.3U/ml)誘導的DNA合成隨時間的作用(圖2d)。數據以3個不同培養基中的3個實驗的平均值及平均值的標準誤差來表示，并以在未經預處理的細胞中[3H]-胸甙插入的百分數來表示。
圖3顯示2-甲氧基雌二醇(0.3-10μM,30分鐘預處理)對有絲分裂因子誘導的[3H]-白氨酸插入的作用。數據以3個不同培養基中的3個實驗的平均值及平均值的標準誤差來表示，并以在未經預處理的細胞中[3H]-白氨酸插入的百分數來表示。
圖4顯示2-甲氧基雌二醇(0.3-10μM,30分鐘預處理)在(a)FCS(1％)或(b)bFGF(300pM)存在時對細胞數量的作用。數據以3個不同培養基中的3個實驗的平均值及平均值的標準誤差來表示，并以在未經預處理的細胞中細胞數量增加的百分數來表示。
圖5顯示甾體受體拮抗劑——RU486(1μM)對2-甲氧基雌二醇(3μM)抑制FCS(1％)誘導DNA合成的作用。數據以3個不同培養基中的3個實驗的平均值及平均值的標準誤差來表示，并以在未經預處理的細胞中[3H]-胸甙插入的百分數來表示。RU 486在2-甲氧基雌二醇前30分鐘加入，而2-甲氧基雌二醇在FCS前30分鐘加入。
圖6顯示17β-雌二醇和2-羥基雌二醇(0.3-1μM,30分鐘預處理)對FCS(1％)誘導的[3H]-胸甙插入的作用。數據以3個不同培養基中的3個實驗的平均值及平均值的標準誤差來表示，并以在未經預處理的細胞中[3H]-胸甙插入的百分數來表示。有關2-甲氧基雌二醇的數據從圖1中復制以易于對比。
圖7顯示2-甲氧基雌酮和2-甲氧基雌三醇(0.3-10μM,30分鐘預處理)對凝血酶(0.3U/ml)誘導[3H]-胸甙插入的作用。數據以3個不同培養基中的3個實驗的平均值及平均值的標準誤差來表示，并以在未經預處理的細胞中[3H]-胸甙插入的百分數來表示。有關2-甲氧基雌二醇的數據從圖2a中復制以易于對比。
圖8顯示2-甲氧基雌二醇對豚鼠腹膜巨噬細胞中超氧化物陰離子釋放的作用。該化合物完全阻斷巨噬細胞對酵母多糖的超氧化物陰離子應答，并降低對fMLP的應答。
圖9顯示2-甲氧基雌二醇對豚鼠腹膜巨噬細胞中前列環素釋放的作用。結果表明該雌二醇完全阻斷對fMLP的巨噬細胞應答，并抑制對PMA的應答50％。
圖10是顯示各種濃度的卵白蛋白(DNP-OA)對肥大細胞(RBL2H3)脫粒的作用、以及2-甲氧基雌二醇的抑制作用的圖。
圖11顯示2-甲氧基雌二醇降低卵白蛋白(DNP-OA)刺激的[3H]-5HT從豚鼠腹膜巨噬細胞中的釋放，但對PMA的應答沒有作用。縮寫本發明所用縮寫如下AHR氣管高應答性bFGF基本成纖細胞生長因子DNP-OA經二硝基-苯酚處理的卵白蛋白EGF表皮生長因子fMLP甲酰基甲硫氨酰亮氨酰苯丙氨酸PDGF血小板衍生的生長因子PMA佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸鹽5HT血清素常規方法細胞培養從Alfred醫院(Melbourne)的肺移植供體或受體的宏觀正常肺切除樣品中得到人支氣管平滑肌。按以前所述具體制備培養物(Tomlinson等人，1994)。簡言之，在37℃下將組織部分消化在包含3mg/ml膠原酶的Dulbecoo改良Eagle培養基(DMEM)(補充有2mM L-谷酰胺、100μg/ml鏈霉素、100U/ml青霉素G、2μg/ml兩性霉素B、和0.25w/v％牛血清白蛋白(BSA))中30分鐘，然后在0.5mg/ml彈性蛋白酶中溫育2小時進一步消化約0.5g平滑肌，接著于37C在膠原酶(3mg/ml)中溫育18小時。離心細胞懸浮液(10分鐘，100×g,25℃)，在經補充的DMEM中洗滌三次，重新懸浮在25ml包含10％(v/v)經熱滅活的胎牛血清(FCS)的DMEM中，接種在25cm2Falcon培養燒瓶中，并溫育(37℃,5％CO2)7-10天，直至達到單層融合。通過10分鐘接觸0.5％肝素和1mM EDTA來每周收集細胞，并按1∶3分流比在75cm2Falcon培養燒瓶中傳代。在實驗中使用第3-15代的細胞。免疫細胞化學將細胞次代培養在8孔室式組織培養玻片(Labtek)中，并在DMEM(10％FCS)中培養至100％融合。在冰冷丙酮中固定20秒前，在PBS中洗滌三次玻片，在染色前于4℃下儲存最多至4周。在PBS/BSA(0.25％)中再水化20分鐘，然后在0.5％Triton X-100(于PBS)中溫育，由此使細胞滲透，接著在22℃下與原發抗體溫育至少60分鐘。用0.25％BSA之PBS溶液洗滌3次，由此除去原發抗體，然后于22℃使細胞與次生抗體接觸至少60分鐘(辣根過氧化酶(HRP)-綴合的羊抗鼠；Ig F(ab′)2片段或羊抗兔IgG)。用PBS/BSA(0.25％)代替原發抗體，由此制備對照溶液。用光顯微鏡(連接在VideoPro 32影象分析系統上的Olympus BH2,Faulding Imaging,Clayton,Victoria)分析經固定細胞的染色。用于在培養基中鑒別平滑肌的抗體的特征建立在天然氣管壁樣品上。所用的抗體可對抗α-肌動蛋白、肌凝蛋白、calponin(對平滑肌都是特異性的)、細胞發育素(cytokeratin)(上皮細胞)和PECAM-1(CD31，其是內皮細胞標記物)。
在所有用于本研究的培養基中都觀察到平滑肌α-肌動蛋白、肌凝蛋白和calponin的表達。這些培養基沒有表達可檢測到的PECAM-1染色，而且少于5％的細胞對于用抗細胞發育素的單克隆抗體的染色是陽性的。用于產生培養物的氣管附近的包埋石蠟的氣管部分正性染色僅在氣管平滑肌和血管束中的平滑肌α-肌動蛋白以及肌凝蛋白。抗PECAM-1的抗體染色血管內皮，而抗細胞發育素的抗體僅染色上皮，這證明這些抗體對靶抗原的特異性。DNA和蛋白質的合成按1∶3的比例將細胞次代培養在24孔板中，并在37℃下于5％CO2的大氣環境下培養72-96小時至單層融合。用無血清的DMEM替換含血清的培養基24小時，產生生長停止。在某些實驗中，在添加有絲分裂因子前用2-甲氧基雌二醇對細胞進行預處理30分鐘。在適當的孔中加入刺激劑(有絲分裂因子)以及包含胰島素、轉鐵蛋白和硒(Monomed A,1％v/v)的補充液。加入Monomed A是為了提供前進因子，這些因子對如凝血酶、表皮生長因子(EGF)和基本成纖細胞生長因子(bGF)的生長因子的有絲分裂活性是最基本的(Stewart等人，1995a)。在添加時使有絲分裂因子和抑制劑與細胞相接觸，直至實驗結束，除非另有說明。根據以前的研究(Stewart等人，1995)，在用[3H]-胸甙(1μCi/ml,4小時)脈沖以測定放射標記插入新合成之DNA前，溫育細胞24小時(37℃,5％CO2)。放射活性的插入通過在脈沖-標記階段結束時的過濾來確定。抽出包含放射活性的培養基，通過添加200μl的0.1M NaOH使細胞溶解。在結合收集器(PackardFiltermate 196)中于玻璃纖維過濾器(Packard，標準)上進行過濾，由此固定DNA，用3×3ml體積的蒸餾水和單次1ml體積的100％乙醇洗滌該過濾器。經干燥的過濾器在Packard Topcount液體閃爍計數器中計數。蛋白質合成速率在與上述實驗類似的實驗中確定，但是在4小時的脈沖溫育中[3H]-白氨酸代替[3H]-胸甙。而且，在確定有絲分裂因子和2-甲氧基雌二醇對蛋白質合成速率的作用的實驗中，與有絲分裂因子的溫育進行48小時。這些實驗需要持續更長的時間，以便有足夠的時間使細胞分裂發生。細胞計數測量與上述DNA合成類似的實驗中細胞數量的變化，由此確定氣管平滑肌細胞通過細胞循環至有絲分裂的前進過程，不同的是繼續與有絲分裂因子溫育48小時。曝露在200μl的0.5％胰蛋白酶之PBS溶液中30-45分鐘，該PBS包含1Mm EDTA，以確保細胞完全地相互分開，并與培養板分開，以便能夠進行精確的計數，由此將細胞從實驗所用的6孔培養板的各孔中移出。在該時間段終止后，進一步添加200μl的PBS(20％FCS)，以防止細胞被胰蛋白酶溶解，然后在血細胞計數器中直接計數細胞。統計學分析對于DNA和蛋白質合成實驗，每個實驗的各項處理重復4次。各實驗至少在從3個不同的個體中得到的3個不同培養基中進行。在細胞計數時，在3個培養基中進行單獨的溫育。結果以從多個培養基中得到的分組數據表示，然后以n個培養基的平均值±SE來表示。經處理細胞的應答除以在相同24孔板上的對照的應答，由此計算出增加度。在對數轉化進行回歸后，通過成對t-檢驗來分析分組數據。在必要時使用多重比較的Bonferroni調節。如果p＜0.05，則認為差異顯著。材料所用的化學品都是分析級的或者更高級別的。所用的化合物及其來源如下2-甲氧基雌二醇(1,3,5-[10]-雌三烯-2,3,17-三醇2-甲基醚，商品編號83H4065)；17β-雌二醇(1,3,5[10]-雌三烯-3,17β-二醇，商品編號E8876)；2-甲氧基雌三醇(1,3,5-雌三烯-2,3,16α,17β-四醇，商品編號26F 4038)；2-甲氧基雌酮(2,3-二羥基-1,3,5[10]-雌三烯-17-酮，商品編號110F4003)；2-羥基雌二醇(1,3,5[10]-雌三烯-2,3,17β-三醇商品編號75H0853)；L-谷酰胺、基本上無脂肪酸的牛血清白蛋白部分V(BSA)、凝血酶(牛血漿)，得自于Sigma公司，美國；兩性霉素B(Fungizone)、人重組基本FGF(bFGF)，得自于Promega公司，美國；CLS l型膠原酶、彈性蛋白酶，得自于Worthington Biochemical公司，美國；Dulbecco ‘A’磷酸鹽緩沖鹽水(RBS)，得自于Oxoid公司，英國；胰蛋白酶、依地酸、青霉素-G、鏈霉素、Monomed A,得自于CSL，澳大利亞；胎牛血清(FCS)，得自于Flow Laboratories，澳大利亞；Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)，得自于FlowLaboratories，蘇格蘭。[6-3H]-胸甙(185 GBq/mmol,5Ci/mmol),得自于Amersham，英國；Microscint-O閃爍體，得自于Canberra-Packard，澳大利亞。用于免疫細胞化學中的抗體是抗平滑肌α-肌動蛋白(鼠單克隆)(Dako M851)、單克隆鼠抗PECAM-1(DAKO-CD31,JC/70A)(Dako M823)，得自于Dako公司，美國；抗細胞發育素(鼠單克隆CY90,Sigma，美國)抗鼠IgF(ab′)2片段FITC-綴合物(宿主羊)、羊抗兔Ig HRP-綴合物(Silenus DDAF)，得自于Silenus公司，澳大利亞，以及抗平滑肌myosin(兔多克隆)，由M Sparrow教授(Perth,WA)提供。實施例12-甲氧基雌二醇對白細胞活性的作用白細胞激活是哮喘病理學的一個特征。2-甲氧基雌二醇與微管素上的秋水仙素結合位點的結合產生該化合物干擾白細胞功能如細胞吞噬作用和移動作用的可能性。
2-甲氧基雌二醇的功能作用在由人外周血中得到的多形核白細胞(PMN)和粘性單核細胞上進行檢查。超氧化物陰離子的產生通過超氧化物歧化酶敏感性還原細胞色素C來確定(Stewart和Harris,1992)。髓過氧化酶的釋放通過四甲基-聯苯胺的氧化反應來確定(Menegazzi等人，1992)。細胞吞噬作用通過酵母多糖顆粒的放射性碘化來確定(Shelton和Hosking,1975)。
根據我們以前的研究收集并培養豚鼠腹膜巨噬細胞(Stewart和Phillips,1989)。細胞與刺激劑在有或沒有2-甲氧基雌二醇(10μM)存在時溫育30分鐘，所述刺激劑包括向化性的三肽、甲酰基甲硫氨酰亮氨酰苯丙氨酸(fMLP,100nM)、酵母多糖(400μg/ml)或佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸鹽(PMA,100nm)，而2-甲氧基雌二醇在刺激劑前15分鐘加入。通過超氧化物歧化酶敏感的細胞色素C還原來確定超氧化物陰離子(Stewart和Harris,1992)，而前列環素的穩定代謝物——6-氧-PGF1通過放射性免疫測定法來測定(Stewart和Phillips,1989)。所有的單獨培養重復進行兩次，并在來自于5只豚鼠的巨噬細胞中進行實驗。
RBL2H3細胞在包含10％FCS的RPMI 1640培養基中培養，并在24孔板中傳代用于實驗。與從分泌抗DNP卵白蛋白抗體的淋巴細胞系中得到的50％(v/v)調理的培養基一起溫育48小時，由此致敏化細胞。在該溫育的最后24小時中，在各孔中加入[3H]-5HT(1μCi/ml)，以標記粒狀胺儲存。在溫育結束后，抽出培養基，在RPMI 1640中洗滌兩次細胞，在有或沒有2-甲氧基雌二醇存在下在RPMI 1640(0.25％BSA)中培養15分鐘，然后用經DNP處理的卵白蛋白、A23187或PMA刺激30分鐘，此時收集上清液，離心上清液(100×g,4℃,5分鐘)，并取樣以確定[3H]-5HT的釋放量。所有實驗重復4次。
結果表明，如表1所示，2-甲氧基雌二醇(3μM)降低用酵母多糖(400μg/ml)或fMLP刺激的白細胞中四甲基-聯苯胺的氧化。通過四甲基-聯苯胺氧化反應測定出，從經fMLP刺激的白細胞中得到的無細胞的上清液仍包含髓超氧化酶活性。但是該活性僅被最高濃度的2-甲氧基雌二醇(10μM)降低。另外，用經純化的辣根過氧化酶進行實驗，以檢查2-甲氧基雌二醇對四甲基聯苯胺的氧化反應是否有直接作用。2-甲氧基雌二醇(10μM)在該測定中沒有作用。結果見圖1。表1人多形核白細胞的四甲基聯苯胺氧化反應
數據以吸收值的變化來表示。測定使用2×106PMN在0.5ml緩沖液中進行。
在PMN中，最高至10μM的2-甲氧基雌二醇沒有降低在fMLP(100nm)或酵母多糖(400μg/ml)應答中超氧化物陰離子的產生。在細胞吞噬作用試驗中，2-甲氧基雌二醇降低了以PNM對酵母多糖顆粒的放射性碘化，在3和10μM時都觀察到顯著的作用，見表2。表2人多形核白細胞對125I的吸收
*PHS=儲存的人血清數據以在可玻璃纖維過濾的材料中125I插入的百分數來表示。測定使用1×106PMN來進行。
在粘性單核細胞中，10μM的2-甲氧基雌二醇對相應于佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸鹽(1μM)PMA或酵母多糖(400μg/ml)的應答的四甲基-聯苯胺氧化反應沒有作用。而且，該細胞類型中在對PMA應答中超氧化物陰離子的產生沒有作用。但是，在至少某些供體的單核細胞中，酵母多糖刺激的超氧化物陰離子產生明顯被2-甲氧基雌二醇(10μM)抑制。
如圖8所示，豚鼠巨噬細胞對酵母多糖或fMLP的超氧化物陰離子應答被2-甲氧基雌二醇降低。但是，對PMA(100nM)的應答未被影響。另外，fMLP(100nM)誘導的6-氧-PGF1α產生增加完全被2-甲氧基雌二醇阻斷，而對PMA的誘導僅被降低50％，而且如圖9所示，酵母多糖沒有刺激前列環素代謝物水平的增加。
卵白蛋白(DNP-OA)誘導濃度依賴性的[3H]-HT釋放，如圖10所示，該釋放可被10μM的2-甲氧基雌二醇降低。但是，如圖11所示，[3H]-HT的基線釋放以及應答PMA(100nM)或鈣離子載體A23187(10μM)中的釋放未被2-甲氧基雌二醇影響。
2-甲氧基雌二醇對PMN髓過氧化酶釋放和活性的抑制作用以及對細胞吞噬作用的降低表明，該化合物具有體內抗炎作用。對經酵母多糖刺激的超氧化物陰離子產生的選擇性抑制作用說明對該吞噬刺激物的特異性作用。這些現象和我們說明對巨噬細胞功能的抑制作用的試驗都提供了有益于哮喘和其他慢性阻塞性氣管疾病、特別是那些明顯有PMN參與的氣管疾病的抗炎作用的證據。實施例22-甲氧基雌二醇對DNA合成的作用在添加有絲分裂因子前使經培養的人氣管平滑肌細胞于0.3-10μM的2-甲氧基雌二醇溫育30分鐘，并如圖2a所示，在剩余的28小時實驗期間使凝血酶刺激的[3H]-胸甙插入產生濃度依賴性的降低。在2-甲氧基雌二醇的最高濃度(10μM)時，對凝血酶的應答被降低至大約為對照水平的10％。2-甲氧基雌二醇對DNA合成的抑制作用不限于凝血酶的存在，因為在DNA合成被胎牛血清(FCS,1％v/v)或基本成纖細胞生長因子(bFGF,300pM)刺激的細胞中(圖2a和2b)，觀察到了2-甲氧基雌二醇類似的濃度相關性抑制作用。但是，EGF(3nM)或10％FCS存在時的DNA合成被顯著抑制，其程度更甚于對凝血酶、bFGF或更低濃度的FCS的應答(圖2c)。10％FCS應答中的DNA合成(比未經刺激的[3H]-胸甙插入水平高27.2±7.8倍)顯著大于(p＜0.05，成對Student′t-檢驗)對0.3U/ml凝血酶(8.4±3.1倍)、3nm EGF(4.5±0.7)或1％FCS(12.7±0.4)的應答，但是與對300pM的bFGF(22.5±0.4)的應答沒有顯著差異。
還進行了隨時間的研究，以確定在與有絲分裂因子接觸后添加2-甲氧基雌二醇是否仍抑制DNA的合成。當在凝血酶后最多4小時添加2-甲氧基雌二醇(3μM)時，凝血酶(0.3U/ml)刺激的DNA合成被抑制，在添加凝血酶后2小時觀察到最大抑制作用。在凝血酶后4-14小時之間添加2-甲氧基雌二醇產生較小的抑制作用(約20％)，而如圖2d所示，在18小時或更后的添加對該有絲分裂因子存在時的DNA合成沒有作用。隨后檢查另外的時間點，這些研究表明在凝血酶的同時或在其后1小時添加2-甲氧基雌二醇時可觀察到最高水平的活性，但是顯著的抑制作用可持續至凝血酶添加后的6小時(圖2d)。實施例32-甲氧基雌二醇對蛋白質合成和細胞數量的作用為確定對DNA合成的抑制作用是否也導致細胞循環發展的停止以及對有絲分裂的抑制，在與有絲分裂因子溫育48小時后進行蛋白質合成和細胞數量的測定。在凝血酶(0.3U/ml)、FCS(1％v/v)或bFGF(300pM)存在時，抑制[3H]-白氨酸插入的閾濃度是1μM，而且與抑制[3H]-胸甙插入的結果類似。大約30％應答時的最大百分降低低于DNA合成時觀察到的值，并發生在3μM。在10μM時，如圖3所示，在凝血酶或bFGF存在時，沒有顯著的抑制作用。2-甲氧基雌二醇單獨在0.3μM時對[3H]-白氨酸插入產生小的刺激作用。更高的濃度(1和3μM)具有小的抑制作用，而在10μM時沒有作用。這些結果見表3。相反地，應答FCS(1％,v/v)或bFGF(300pM)時細胞數量的增加對2-甲氧基雌二醇的抑制作用更敏感，超過對蛋白質或DNA合成的作用，如圖4a和4b所示，在3μM觀察到增殖應答被完全抑制。表3:2-甲氧基雌二醇對未經刺激的平滑肌細胞中蛋白質合成速率的作用
>*p＜0.05成對Student′st-檢驗，與100％相比(無預處理)實施例4血清素刺激的[3H]-白氨酸在平滑肌細胞中的插入濃度為0.1nM-10μM的血清素(5HT)對[3H]-胸甙的插入沒有作用，但是10nM的5HT可增加[3H]-白氨酸的插入。與0.3-10μM的2-甲氧基雌二醇預先溫育可按照濃度依賴性方式降低5HT(10nM)刺激的蛋白合成的增加，結果見表4。表4:2-甲氧基雌二醇對經5HT刺激的平滑肌細胞中蛋白質合成速率的作用
*p＜0.05成對Student′s t-檢驗，與100％相比(無預處理)實施例52-甲氧基雌二醇的形態學作用濃度為3和10μM的2-甲氧基雌二醇可觀察到包括顯示正常紡錘形細胞的圓形外觀的形態學變化。形狀變化在開始時相對較快，在6小時內即可觀察到，而且在溫育期間都保持。這些形狀變化與用微管解聚劑——秋水仙素(0.1-10μM)溫育細胞時誘導的形狀變化類似。甾體受體拮抗劑——RU 486(Stewart等人，1995b)降低應答秋水仙素或2-甲氧基雌二醇時產生的形狀變化，但是對2-甲氧基雌二醇抑制DNA合成沒有作用。這些結果如圖5所示。實施例62-甲氧基雌二醇類似物的作用檢查幾種與2-甲氧基雌二醇有關的化合物對經FCS(1％,v/v)刺激的DNA合成的抑制作用，包括母體化合物——17β-雌二醇和立即的前體化合物——2-羥基雌二醇。如圖6所示，較低濃度的這些化合物都可增加經FCS(1％)刺激的DNA合成。在更高濃度時，增加作用被反轉，并在10μM的這些化合物濃度時觀察到抑制作用。2-羥基雌二醇(10μM)的抑制作用等于2-甲氧基雌二醇(10μM)。用包括2-甲氧基雌酮和2-甲氧基雌三醇的類似物觀察到雙相作用，這些化合物在最高至3μM的濃度時增加經凝血酶刺激的DNA合成，但是在10μM時增加水平下降，參見圖7。17β-雌二醇和2-羥基雌二醇對蛋白質合成的作用見表5。表5:2-甲氧基雌二醇對未經刺激的平滑肌細胞中蛋白質合成速率的作用
*p＜0.05成對Student′s t-檢驗，與100％相比(無預處理)我們發現2-甲氧基雌二醇具有抗炎活性并抑制DNA合成和隨后的從人支氣管培養出來的氣管平滑肌細胞的分裂，2-甲氧基雌二醇是17β-雌二醇的天然代謝物，而以前認為17β-雌二醇是無活性的。
抗炎活性使該化合物及其類似物可用于炎性疾病的治療，如哮喘和其他慢性阻塞性氣管疾病、特別是具有明顯PMN參與的那些疾病的治療。
對DNA合成的抑制作用不是細胞毒性的結果，這是因為細胞與最高濃度的2-甲氧基雌二醇(10μM)一起溫育時蛋白質合成速率沒有被改變，而且在該濃度時沒有觀察到細胞從培養板上脫落。不希望使觀察到的優點囿于任何機理的限制，可能的情況是，甾體在細胞循環的G1階段(有絲分裂因子后2小時)即早期抑制細胞，產生最大的DNA合成抑制作用。尚未確定有絲分裂因子后添加2-甲氧基雌二醇是否仍可維持其抗增殖作用。2-甲氧基雌二醇以相同的效力抑制對bFGF、凝血酶和FCS(1％)的應答，這說明對任何有絲分裂因子沒有特異性抑制作用。該觀察的結果暗示2-甲氧基雌二醇作用在使用各有絲分裂因子的早期分子內發送信號步驟中。然而，對DNA合成的抑制作用是可克服的，用2-甲氧基雌二醇預先溫育，較高濃度的FCS(10％)被明顯地較少抑制。該耐受性可用對高濃度FCS的更大應答來解釋，但是當有絲分裂因子是EGF時，類似的理由不能用于對抑制作用的耐受，因為該EGF誘導小的應答，低于凝血酶、FCS 1％或bFGF誘導的應答。但是，EGF和10％FCS的增殖作用可被2-甲氧基雌二醇抑制。我們尚未發現任何將對DNA合成的抑制作用與對細胞增殖的抑制作用聯系在一起的證據。然而，在較低濃度的2-甲氧基雌二醇時觀察到的后期作用說明2-甲氧基雌二醇除對DNA合成的抑制作用外的其他作用對抗增殖作用也是有貢獻的。
檢查了幾種2-甲氧基雌二醇的類似物，以確定它們是否具有相同的抗增殖作用。母體化合物17β-雌二醇和立即的前體化合物2-羥基雌二醇在較低濃度時增加應答FCS(1％)的DNA合成，但在3和10μM時抑制DNA合成。尚未確定DNA合成中的這些變化是否導致相應的細胞增殖的變化。2-甲氧基雌酮和2-甲氧基雌三醇對經凝血酶刺激的DNA合成的增加顯示出鈴形的濃度應答曲線，在較高濃度時具有較低的作用。總而言之，我們觀察的結果表明2-甲氧基雌二醇是所有已檢查化合物中效力最高的，這與以前對內皮細胞的增殖應答的觀察結果一致(Fotsis等人，1994)。
還有可能的是與誘導代謝至活性化合物的藥物一起給藥母體化合物17β-雌二醇。例如，可使用p450細胞色素以及兒茶胺甲基轉移酶的誘導劑。芳基硫酸酯酶的抑制劑也可考慮。
2-甲氧基雌二醇的抗增殖作用及其降低5HT誘導的蛋白質合成增加表明其同時具有抗增生和抗肥大的作用。在哮喘氣管中有許多增生和肥大現象(Ebina等人，1993)，它們是AHR現象的主要部分(James等人，1989)。降低AHR與完全緩解某些哮喘病患者中的癥狀有關(Platts-Mills等人，1987)。而且，在所有哮喘氣管壁組織改變應答時的結構變化中，氣管平滑肌的增加是最重要的(Pare和Bai,1995)。如2-甲氧基雌二醇的化合物可防止氣管平滑肌的生長應答，因此可降低AHR并緩解哮喘癥狀。另外，2-甲氧基雌二醇的抗血管生成活性(Fotsis等人，1994)也有可能限制氣管組織改變應答，這是因為已經確定在組織改變中有血管生成發生(Kuwano等人，1993)。看來需要用血管生成作用來支持組織質量增加的代謝需求。因此，防止血管生成作用可使組織改變應答停止，這與2-甲氧基雌二醇對平滑肌和其他細胞類型的任何直接抑制作用是不相關的。
2-甲氧基雌二醇的許多其他性質對于治療哮喘也是有益的，這包括其已知的破壞微管形成的作用(D′Amato等人，1994)，該作用可降低炎性介質從肥大細胞、巨噬細胞和嗜曙紅細胞中的細胞排粒性釋放。
我們的數據表明2-甲氧基雌二醇抑制抗原誘導的肥大細胞脫粒作用。該活性支持在更廣范圍的過敏性疾病中使用2-甲氧基雌二醇，所述過敏性疾病包括過敏性鼻炎和特異反應性皮膚疾病。fMLP對豚鼠腹膜巨噬細胞活化的抑制作用表明2-甲氧基雌二醇的作用可增加至與肌肉骨架有關的情況中，這是因為fMLP活化與G-蛋白質有關的受體，而不是細胞吞噬作用。
另外，2-甲氧基雌二醇的抗氧化活性也是有益的，因為在氣管炎癥中涉及的三種關鍵的炎性細胞類型都具有產生大量氧自由基的能力，而且與氧化氮一起可導致明顯的氧化劑損壞。這些活性還支持2-甲氧基雌二醇在治療慢性阻塞性氣管疾病中的應用，在該疾病中已確定了氧自由基的主要作用而且有氣管壁組織改變的證據(Kuwano等人，1993)。最后，幾個研究表明2-甲氧基雌二醇和相關化合物可減少鈣向平滑肌中的流入(Goyache等人，1995)，如果該現象也在氣管平滑肌中得到證實，這將對抗哮喘中的支氣管痙攣。
雖然為清除和理解的目的已具體地描述了一些實施例，但它們僅是指導性的。本領域普通技術人員應認識到，在不偏離本發明范圍的情況下還可對在此描述的實施方案進行各種的改進和變化。
本文中所引用的文獻如下。Aizu-Yokotta,E.,Susaki,A.和Sato,Y.(1995)，天然雌激素誘導對培養基中中國倉鼠V79細胞之微管的調節(Natural estrogens inducemodulation of microtubules in chinese hamster V79 cells in culture),CancerResearch,55,1863。Brewster,C.E.P.,Howarth,P.H.,Djukanovic,R.,Wilson,J.,Holgate,S.T.和Roche,W.R.(1990)，支氣管哮喘中的肌成纖細胞和上皮下的變性(Myofibroblasts and subepithelial fibrosisin bronchial asthma),Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.3,507。Goyache,F.M.,Gutierrez,M.,Hidalgo,A.和Cantabrana,B.(1995)，兒茶酚雌激素在體內鼠子宮收縮中的非基因組作用(Non-genomic effects ofcatecholestrogens in the in vivo rat uterine contraction),GeneralPharmacology,26,219。D′Amato,R.J.,Lin,C.M.,Flynn,E.,Folkman,J.和Hamel,E.(1994),2-甲氧基雌二醇，—種內源性哺乳動物代謝物，通過在秋水仙素位點處的相互作用抑制微管素的聚合(2-Methoxyoestradiol,an endogenousmammalian metabolite,inhibits tubulin polymerization by interacting at thecolchicine site),Proceedings of the National Academy of Sciences(美國),91,3964。Dunhill,M.S.,Massarella,G.R.,Anderson,J.A.(1969)，正常受試者、哮喘病患者、慢性支氣管炎和肺氣腫中的支氣管定量解剖比較(Acomparision of the quantitative anatomy ofthe 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權利要求
1.治療以慢性或急性氣管炎癥為特征的疾病的方法，其包括向需要如此治療的哺乳動物給藥有效量的甾體或甾體類似物，所述甾體或甾體類似物通過抑制氣管壁的炎癥和/或抑制平滑肌細胞的增殖作用來調節氣管組織改變。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述甾體或甾體類似物抑制白細胞的細胞吞噬作用。
3.如權利要求2所述的方法，其中，所述甾體或甾體類似物抑制髓過氧化酶從白細胞中的釋放。
4.如權利要求1-3之一所述的方法，其中，所述甾體或甾體類似物抑制巨噬細胞的活化。
5.如權利要求1-4之一所述的方法，其中，所述甾體或甾體類似物不具有糖皮質素活性。
6.如權利要求1-5之一所述的方法，其中，通過抑制以下活性的一種或多種來進一步調節氣管的組織改變，所述活性選自氣管壁中血管生成、氧化劑以及微管功能的形成。
7.如權利要求1-6之一所述的方法，其中，所述甾體或甾體類似物選自2-甲氧基雌二醇、2-羥基雌二醇、2-甲氧基雌酮、2-甲氧基雌二醇-3-甲基醚和4-甲氧基雌二醇。
8.如權利要求7所述的方法，其中，所述甾體是2-甲氧基雌二醇。
9.如權利要求1-8之一所述的方法，其中，所述待治療的疾病選自哮喘、氣管高應答性、支氣管收縮、肺氣腫、肺炎、特異反應性疾病和肺感染。
10.如權利要求9所述的方法，其中，所述特異反應性疾病是過敏性鼻炎。
11.一種通過抑制氣管壁的炎癥和/或抑制平滑肌細胞的增殖作用來調節氣管組織改變的甾體或甾體類似物。
12.如權利要求11所述的甾體或甾體類似物，其抑制多形核白細胞的細胞吞噬作用。
13.如權利要求12所述的甾體或甾體類似物，其抑制髓過氧化酶從白細胞中的釋放。
14.如權利要求11-13之一所述的甾體或甾體類似物，其中，所述甾體或甾體類似物抑制巨噬細胞的活化。
15.如權利要求11-14之一所述的甾體或甾體類似物，其中，所述甾體或甾體類似物沒有糖皮質激素的活性。
16.如權利要求11-15之一所述的甾體或甾體類似物，其進一步具有以下活性抗血管生成活性、抗氧化活性以及抑制微管功能。
17.如權利要求11-16之一所述的甾體或甾體類似物，其選自2-甲氧基雌二醇、2-羥基雌二醇、2-甲氧基雌二醇-3-甲基醚和4-甲氧基雌二醇。
18.如權利要求17所述的甾體或甾體類似物，其包括2-甲氧基雌二醇。
19.一種組合物，其包括如權利要求11-18之一的甾體或甾體類似物以及藥物學上可接受的載體。
20.如權利要求19的組合物，其通過吸入給藥。
全文摘要
本發明涉及載體或載體類似物在治療慢性和急性氣管炎癥、特別是哮喘中的應用。還涉及調節氣管組織改變的化合物和組合物。在優選實施方案中,所述甾體是2－甲氧基雌二醇。
文檔編號A61K31/565GK1218401SQ97194505
公開日1999年6月2日 申請日期1997年5月9日 優先權日1996年5月9日
發明者阿拉斯泰爾·喬治·斯圖加特 申請人:阿姆瑞德手術有限公司