專利名稱：凝固酶陰性葡萄球菌的多肽及多核苷酸的制作方法
技術領域：
本發明的領域本發明涉及微生物學及分子生物學領域，具體地涉及預防，治療或診斷人或動物的凝固酶陰性葡萄球菌感染的生物學制品。
本發明的背景葡萄球菌是革蘭氏陽性球狀細胞，通常以葡萄狀不規則簇排列。一些葡萄球菌是人類粘膜和皮膚的正常菌群成員，而其他的會引起化膿，膿腫，及多種化膿感染，甚至會引起致命的敗血癥。致病的葡萄球菌常常使紅細胞溶解，血漿凝固并產生大量細胞外酶和毒素。最常見的食物中毒是由熱穩定的葡萄球菌腸毒素引起的。葡萄球菌至少有30種。臨床上很重要的三個主要品種是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(atephylococcus epidermidis)，腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)。金黃色葡萄球菌是凝固酶陽性的，這一點使它與其他品種區分開來。金黃色葡萄球菌是人類主要的致病菌。一生中幾乎每個人都會經歷一些種類的金黃色葡萄球菌感染，其嚴重程度包括食物中毒或輕度皮膚感染到嚴重危及生命的感染。
凝固酶陰性葡萄球菌是常見的有時引起感染的人類菌群，并常常與植入裝置有關，特別在很年輕，年老及免疫系統損害的患者中。由凝固酶陰性葡萄球菌引起的感染中約75％是由表皮葡萄球菌引起的。由Staphylococcus warneri,Staphylococcushominis及其他品種引起的感染較少見。在年輕的婦女中腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)是相對常見的尿道感染病因。葡萄球菌產生過氧化酶，這一點使其與鏈球菌區別開來。
金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌都有在修復醫療裝置部位，包括血管內導管，腦脊髓液體分流管，血液透析分流器，血管移植，及長期配戴的隱形眼鏡處入侵皮膚和相鄰組織的特征性傾向。在48到72小時內，在這些外源物插入部位可鑒定到相當大量的葡萄球菌[Archer,G.L.,Remington,J.S.，等人，“在傳染疾病中最新臨床課題”，McGraw-Hill,NY,25-46,1986)。
表皮葡萄球菌是人類皮膚上無致病力的共生生物體，是外周及中心靜脈導管，修復心臟瓣膜，人造關節和其他修復裝置感染的主要病因介質。已經得到論證是，表皮葡萄球菌細胞附著并在導管內或外表面增殖-與導管的組成無關-無論是它們是聚乙烯，聚氯乙烯，聚氟乙烯還是聚酯基的。
留置醫療裝置的初始定位感染會引發更嚴重的入侵性感染如敗血癥，骨髓炎和心內膜炎。當微生物進入到這些裝置，然后其就進入血流，通過由皮膚表面向下移動到導管的經皮部分時，導管就可認為被感染了。在涉及醫療裝置的感染中，在移植后很短時間中塑料和金屬表面被宿主血漿和基質蛋白質覆蓋，如血纖蛋白原，玻連蛋白，纖連蛋白。表皮葡萄球菌菌血癥會導致額外8天的住院，這是相當昂貴的。
盡管凝固酶陰性葡萄球菌的致病力在存在外源物時被增強了，但使得這些正常皮膚共生物變成疾病病原體的微生物因素還沒有很好地被進行說明。凝固酶陰性表皮葡萄球菌附著這些蛋白質的能力是初始感染的重要因素。因為認為附著是凝固酶陰性葡萄球菌外源物感染的發病機理中重要的第一步，注意力已集中在可能調節對聚合物修復物質的附著并集落化的這些生物體的表面特性上。
有很多因素影響生物體附著修復物質的能力。這些因素包括微生物和生物物質的特性和周圍環境的性質。生物體和宿主之間的初始吸引作用受到非特異力的影響，如表面電荷，極性，范德華力和疏水作用。附著作用的重要階段包括細胞表面附著因子和固定宿主蛋白質之間的特異作用。目前，有關表皮葡萄球菌對生物物質的附著作用的研究已首先涉及了細胞外多糖或胞外被多糖，也稱為粘液的作用。然而，盡管進行了集中研究，被提議的疾病的發病機理中粘液的作用或其組成仍然有爭論(Drewry等人，臨床微生物學28:1292-1296,1990)。目前所認為的是，在感染的持續及附著的晚期階段中細胞外粘液起著作用。其可能作為離子交換樹脂而優化局部營養環境，阻止抗生素滲入到大型集落中或保護細菌不受噬菌宿主防衛細胞的影響。Peters等人通過電子顯微鏡研究已發現，細胞外多糖出現在附著作用的晚期階段，在附著作用的初始階段并不存在(J.Infect.Dis.,65146:479-482,1982)。Hogt等人認為通過反復沖洗除去細胞外粘液層沒有消除表皮葡萄球菌對生物物質的附著能力(J.Gen.Microbiol.129:2959-2968,1983)。
迄今，對細胞外多糖的研究對預防細菌的初始附著作用沒有什么幫助。幾種其他研究已確定了表皮葡萄球菌其他可能的附著因子，包括有Tojo等人(J.Infect.Dis.,157:317-722,1988)觀察到的多糖附著因子(PS/A)和Christensen等人(Infect.Immun.,58:2906-2911,1990)發現的粘液伴隨抗原(SAA)。
已論證的是PS/A是阻斷PS/A附著產生表皮葡萄球菌菌株的單糖附著因子的復合混合物。在對抗PS/A的心內膜炎抗體的動物模式中是保護性的。然而，這種保護性作用是否是特異性的，是否涉及抗體的抗附作用，或是否由于血液生細菌的調理噬菌作用的效率的更廣泛的增加還不清楚。已假設認為，每種附著因子在有著一種或多種決定初始吸引作用的這些附著因子的附著過程的不同階段中起著作用，而其他的是大型集落中聚集作用必需的。
盡管進行了許多研究，對涉及表皮葡萄球菌對生物物質的初始附著作用的因素仍然沒有很多了解。進一步不為人所知的是對預防感染的第一步，即附著或粘著有實際應用意義的方法。因此，需要對細菌附著因子蛋白質和編碼蛋白質的基因進行發現和描述。
因此，本發明的一個目的是提供凝固酶陰性葡萄球菌的細胞壁伴隨胞外基質結合蛋白質。
本發明的另一個目的是提供凝固酶陰性葡萄球菌表面蛋白，其能夠抑制葡萄球菌與固定化的胞外基質的粘著或抑制植入生物物質表面存在的宿主細胞。
本發明的另一個目的是提供凝固酶陰性葡萄球菌疫苗，產生對凝固酶陰性葡萄球菌蛋白質的抗血清和抗體，分離凝固酶陰性葡萄球菌的抗體。
本發明的另一個目的是提供在臨床和實驗室設置中檢測及區別凝固酶陰性葡萄球菌生物體的改進物質和方法。
本發明的另一個目的是提供針對凝固酶陰性葡萄球菌的核酸探針和特異性引物。
本發明的另一個目的是提供對凝固酶陰性葡萄球菌敏感及特異的細菌感染的檢測，診斷，治療或監測治療進展的方法。
看過下列對公開實施方案的詳細描述及所附權利要求書后，本發明的這些及其他目的，特性及優點會變得明顯可見。
本發明的概述本發明提供了從凝固酶陰性葡萄球菌分離的蛋白質和它們相應的氨基酸和核酸序列。蛋白質稱為SdrF,SdrG和SdrH。SdrF的DNA序列和蛋白質SdrF的氨基酸序列(粗體)以及它們的側翼序列在圖2中給出。SdrG的DNA序列和蛋白質SdrG的氨基酸序列(粗體)以及它們的側翼序列在圖3中給出。最后，SdrH編碼區域包括DNA和氨基酸序列在圖4中給出。
已經發現的是，在SdrF和SdrG的A區域中有高度保留的氨基酸序列，能用來衍生共有序列TYTFTDYVD基元。該基元能用在多組分疫苗中以產生對細菌感染的廣譜免疫，并且也可用來產生具有廣譜被動免疫的單克隆或多克隆抗體。在一個可替換的實施方案中，從Sdr蛋白質家族中衍生出的可變序列的任何組合，(T)(Y)(T)(F)(T)(D/N)(Y)(V)(D)，可用來產生免疫性或用來誘導保護性抗體。蛋白質或其抗原部分被用來制備診斷凝固酶陰性葡萄球菌細菌感染的抗體，或用來為主動或被動免疫作用制備發展抗-凝固酶陰性葡萄球菌疫苗。當給傷口服用或在體內及體外用來覆蓋聚合生物物質時，蛋白質和其抗體都可用作阻斷劑，以預防或抑制凝固酶陰性葡萄球菌與傷口部位或與任何生物物質的結合。SdrF,SdrG和SdrH蛋白質可進一步用作科學研究工具，以了解細菌病理學的機理和抗細菌治療的發展。
SdrF,SdrG和SdrH基因序列可用作核酸探針，以檢測及鑒別凝固酶陰性葡萄球菌細胞表面蛋白質。核酸序列還可插入到載體中并置于微生物中以制備重組SdrF,SdrG和SdrH蛋白質。這些Sdr蛋白質的氨基酸序列在制備合成的SdrF,SdrG和SdrH蛋白質或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元中也是有用的。
本發明也提供了培養的抗SdrF,SdrG和SdrH蛋白質或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的抗血清和抗體，和含蛋白質的疫苗或其他藥物組合物。
此外，本發明也提供了含核酸分子，蛋白質，培養的抗SdrF,SdrG和SdrH或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的抗體或抗血清的工具，以及與樣品反應的適當的試劑的診斷試劑盒。
在本發明第一個實施方案中，多核苷酸包括編碼含圖2中所示序列的SdrF多肽的區域或其變體。
根據本發明的這個方面，提供了編碼表達表皮葡萄球菌菌株9491的成熟多肽的分離核酸分子。
在本發明第二個實施方案中，多核苷酸包括編碼含圖3中所示序列的SdrG多肽的區域或其變體。
根據本發明的這個方面，提供了編碼表達表皮葡萄球菌菌株K28的成熟多肽的分離核酸分子。
在本發明第三個實施方案中，多核苷酸包括編碼含圖4中所示序列的SdrH多肽的區域或其變體。
根據本發明的這個方面，提供了編碼表達表皮葡萄球菌菌株9491的成熟多肽的分離核酸分子。
在本發明第四個實施方案中，有從含如圖2中所示的SdrF氨基酸序列的表皮葡萄球菌獲得的新型蛋白質或其變體。
在本發明第五個實施方案中，有從含如圖3中所示的SdrG氨基酸序列的表皮葡萄球菌獲得的新型蛋白質或其變體。
在本發明第六個實施方案中，有一種從含如圖4中所示的SdrH氨基酸序列的表皮葡萄球菌獲得的新型蛋白質或其變體。
根據本發明的第四，第五和第六個實施方案，提供了編碼SdrF,SdrG或SdrH蛋白質，特別是表皮葡萄球菌蛋白質的分離核酸分子，包括mRNA,cDNA，基因組DNA。本發明這個方面的其他實施方案包括其在生物學，診斷學，預防學，臨床學，或治療學上有用的變體，以及包括這些變體的組合物。
在本發明第七個實施方案中，提供了本發明的多核苷酸在以治療或預防為目的方面的應用，特別是基因免疫接種應用。
在本發明第八個實施方案中是SdrF,SdrG和SdrH多肽或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的變體，由SdrF,SdrG或SdrH基因的自然產生的等位基因編碼。
根據本發明的這個實施方案，提供了表皮葡萄球菌的新型多肽，本文稱為SdrF,SdrG或SdrH或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元，以及其生物學，診斷學，預防學，臨床學或治療學上有用的變體，和含有這些變體的組合物。
在本發明第九個實施方案中，提供了制備前面提及的SdrF,SdrG或SdrH多肽或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的方法。
在本發明第十個實施方案中，提供了抗SdrF,SdrG或SdrH多肽或多核苷酸或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元或編碼這些基元核酸的抗體。
在本發明第十一個實施方案中，提供了與SdrF,SdrG或SdrH多核苷酸序列或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元雜交的多核苷酸，特別是在嚴謹嚴格條件下。
在本發明第十二個實施方案中，提供了給細胞或給多細胞生物體服用的含有SdrF,SdrG或SdrH多核苷酸或SdrF,SdrG或SdrH多肽或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的組合物。
在本發明公開的精神和范圍內的各種變化和修正對閱讀下列描述及閱讀本公開的其他部分的此領域中的技術人員將是明顯可見的。
本發明附圖的簡述
圖1表示表皮葡萄球菌菌株K28的SdrG蛋白質。區域沿著構建的頂部標記，所公開的蛋白質的每個區域中發現的氨基酸數目在示圖中相應區域下標記。
圖2是SdrF的DNA序列和SdrF蛋白質的氨基酸序列(粗體)以及它們的側翼序列。
圖3是SdrG的DNA序列和SdrG蛋白質的氨基酸序列(粗體)以及它們的側翼序列。
圖4是SdrH編碼區域的DNA序列和SdrH蛋白質的氨基酸序列。
圖5表示金黃色葡萄球菌的Sdr蛋白質和表皮葡萄球菌的Sdr蛋白質之間的關系。圖5A是前面描述的金黃色葡萄球菌Sdr蛋白質的示意圖；圖5B是SdrF,SdrG和SdrH的示意圖，表示它們的信號序列(S)，區域As(A)，區域B重復(Bn),SD-重復區域(SD)，區域C(C)(只對SdrH)，和壁/膜跨越區域(WM)的相對位置和/或大小；圖5C表示SdrF,SdrG和SdrH的C-端氨基酸序列，表示SD重復序列，LPXTG基元(下劃線)，疏水膜-跨越區域(粗體)，和帶電終端殘基的位置。
圖6給出了表皮葡萄球菌菌株的Sdr基因，并演示了含有與編碼(A)SD-重復區域；(B)SdrH區域A；(C)SdrG區域A；(D)SdrG和SdrF區域As的DNA探針雜交的表皮葡萄球菌基因組DAN的Southern印跡。菌株如下1道，ATCC14990；2道，KH11；3道，K28；4道，RP62a；5道，TU3298；6道，9142；7道，1457；8道，8400；9道，N910308；10道，N910160；11道，N910102；12道，N910173；13道，N910191；14道，N910231；15道，N950249；菌株9491沒有演示。千堿基(kb)大小標記在A-D圖面左邊顯示。
圖7顯示了重組Sdr區域A蛋白質和它們分別的抗血清的特異性，如下(A)用來培養兔多克隆抗血清的純蛋白質的考馬斯染色SDS-PAGE。1道和2道，分別為組氨酸標記的SdrFA和SdrGA；3道，GST標記的SdrHA；(B)左圖面混合抗-SdrFA,-SdrGA和-SdrHA抗血清對表達GST-標記的SdrFA(1道)，SdrGA(2道)，SdrHA(3道)的E.coli溶胞物的反應性。中間和右圖面抗-SdrFA，和-SdrGA抗血清分別對相同蛋白質的反應性；(C)左圖面抗-組氨酸單克隆抗體對表達組氨酸-標記的SdrFA(1道)，SdrGA(2道)和全長SdrH(3道)的E.coli溶胞物的反應性。右圖面抗-SdrHA抗血清對相同蛋白質的反應性。千道爾頓(kDa)大小標記在A,B和C圖面左邊顯示。
圖8顯示了表皮葡萄球菌Sdr蛋白質表達的免疫印跡分析，包括(A)抗SdrFA抗血清對表皮葡萄球菌9491溶胞物的反應性。1道，免疫抗血清；2道，免疫前抗血清；3道，SdrFA吸收的免疫抗血清；(B)抗SdrGA免疫(1道)，免疫前(2道)，和SdrGA吸收的免疫(3道)抗血清對表皮葡萄球菌菌珠K28溶胞物的反應性；(C)抗SdrHA免疫(1道)和SdrHA吸收的免疫(2道)抗血清對表皮葡萄球菌9491溶胞物的反應性。kDa大小標記在A,B和C圖面左邊顯示。
圖9顯示了表皮葡萄球菌中SdrH蛋白質大小變異的基因分析。包括(A)抗SdrHA抗血清對不同表皮葡萄球菌菌株的在SdrH分子團中顯示菌珠變異的溶胞物的反應性。1-3道分別為菌株9491,9400，和KH11；(B)PCR產物，表示編碼SdrH SD-重復區域(1-3道)或相同菌珠區域Cs(4-6道)的DNA。kDa和kb大小標記分別在A和B圖面顯示。
圖10顯示了在細胞壁提取物和原生質體中對Sdr蛋白質的分析，包括(A)抗-SdrFA抗血清對表皮葡萄球菌菌株9491溶胞物(1道)，細胞壁提取物(2道)，和純原生質體(3道)的反應性；(B)和(C)分別是抗-SdrGA和-SdrHA抗血清對相同樣品的反應性。kDa大小標記分別在A,B和C的左圖面顯示。
圖11顯示了從表皮葡萄球菌感染中逐漸康復的患者獲取的IgG對涂覆在ELISA微量滴定板中的重組SdrFA(空白柱),SdrGA(灰色柱)和SdrHA(黑色柱)的反應性。從兩歲大兒童獲取的混合IgG用作對照物。誤差柱表示標準偏差。
本發明的詳細描述本文描述了分離的Sdr蛋白質和它們相應的氨基酸和核酸序列。蛋白質稱為SdrF,SdrG和SdrH。SdrF的DNA序列和蛋白質SdrF的氨基酸序列(粗體)以及它們的側翼序列在圖2中演示。SdrG的DNA序列和蛋白質SdrG的氨基酸序列(粗體)以及它們的側翼序列在圖3中演示。最后，SdrH編碼區域包括DNA和氨基酸序列在圖4中演示。
SdrF,SdrG和SdrH蛋白質在初級序列和結構組織方面與從金黃色葡萄球菌獲取的胞外基質-結合Sdr蛋白質家族有關，并位于細胞表面。SdrF,SdrG和SdrH蛋白質是與細胞壁相關的蛋白質，帶有在N端的信號序列和LPXTG基元，疏水域和C端的正電荷殘基。每種還有SD重復區，其包括使配體結合域區域A在細胞表面有效表達的足夠長的R區域。由于SdrF,SdrG和SdrH蛋白質的A區域位于細胞表面，蛋白質可與血漿，細胞外基質或與宿主細胞的表面分子相互作用。如，SdrG結合血纖蛋白原N端的一半β鏈。
公開的細胞外基質結合蛋白質共有獨特的二肽重復區域(區域R)，主要包括天冬氨酸和絲氨酸殘基。這種DS重復區域由18個帶有共有序列GAY TCN GAY TCN GAY AGY的核苷酸重復單元編碼，TCN作為第一個和第二個絲氨酸密碼子，AGY作為第三個絲氨酸密碼子。R區域鄰近蛋白質的C端，通常含有40到300個DS殘基，或更具體地，含多于60,80,100,120,150,200或250個重復單元，其中大于90,95或98％的重復單元是氨基酸D或S。R區域DS重復單元的長度隨著蛋白質的不同而變化，而且雖然區域R本身不結合細胞外基質蛋白質，但R區域能使蛋白質結合區域在金黃色葡萄球菌的細胞表面存在。這樣，編碼DS重復單元的共有序列DNA的探針(參閱上述)能用來鑒別其他編碼不同結合蛋白質的基因，特別是使金黃色葡萄球菌附著宿主組織的結合蛋白質。R區域的抗體也可用來鑒別其他這樣的結合蛋白質。
已經發現的是，在SdrF和SdrG的A區域中有高度保留的氨基酸序列，能用來衍生共有序列TYTFTDYVD基元。該基元能用在多組分疫苗中獲得對細菌感染的廣譜免疫性，并且也可用來產生廣譜被動免疫的單克隆或多克隆的抗體。在一個可替換的實施方案中，從Sdr蛋白質家族中衍生出的可變序列的任何組合，(T)(Y)(T)(F)(T)(D/N)(Y)(V)(D)，可用來產生免疫性或用來誘導保護性抗體。
還發現，SdrG有一個編碼有913個氨基酸殘基的蛋白質的2736個核苷酸的開放讀框。蛋白質有一個30個氨基酸的信號序列，542個氨基酸的配體結合A區域，和兩個重復基元稱為B區域。B1有113個氨基酸，B2有110個氨基酸，R區域有77個氨基酸。B區域含有表示Ca++結合的EF手基元，與在其他Ca++結合蛋白質如調鈣蛋白和中肌鈣蛋白中發現的相似。另一個更退化形式的EF手基元在SdrG的A區域中殘基459-471之間發現。在EDTA存在的情況下，可注意到SdrG A與血纖蛋白原的結合顯著減少，這說明結合對金屬離子有依賴。Ⅰ．定義本文定義的“SdrF蛋白質”，“SdrG蛋白質”和“SdrH蛋白質”包括SdrF,SdrG和SdrH亞域和SdrF,SdrG和SdrH的活性或抗原片段，如共有序列或可變序列氨基酸基元。
本文所使用的“pg”是微微克，“ng”是毫微克，“ug”或“μg”是微克，“mg”是毫克，“ul”或“μl”是微升，“ml”是毫升，“l”是升。
本文所定義的SdrF,SdrG和SdrH蛋白質的“活性片段”，是能阻斷凝固酶陰性葡萄球菌與固定或可溶宿主蛋白質結合的肽或多肽。
本文所使用的“附著因子”包括自然產生及合成的或重組蛋白質及肽，它們能與細胞外基質蛋白質結合和/或調節與宿主細胞的附著。
本文所使用的“氨基酸”包括自然產生及合成的氨基酸，包括但不限于丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯基丙氨酸，色氨酸，蛋氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺酸，谷氨酸，天冬氨酸，賴氨酸，精氨酸和組氨酸。
“抗體”是任何與特異抗原表位結合的免疫球蛋白，包括其抗體和片段。本文所使用的該術語包括單克隆抗體，多克隆的，嵌合的，單鏈的，雙特異性的，猴類的和人類的抗體以及Fab片段，包括Fab免疫球蛋白表達文庫的產品。
本文所使用的各種表達方式的“抗體分子”包括完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。
本文所定義的SdrF,SdrG和SdrH蛋白質的“抗原片段”是能產生免疫反應的肽或多肽。
本文所使用的“抗體功能等同物”蛋白質或肽是摻合一個與一個或多個公開的具體蛋白質的抗原表位免疫交叉反應的抗原表位的蛋白質或肽。抗原功能等同物，或抗原表位序列可被首先設計或預定然后檢測，或可簡單地直接進行交叉反應性檢測。
“細胞種系”是能在體外穩定生長許多代的無性繁殖系原代細胞。
“無性繁殖系”是通過有絲分裂從單細胞或普通祖細胞衍生的細胞群。
DNA“編碼序列”是雙鏈DNA序列，當置于適當的調節序列的控制下時，其在體內可轉錄及翻譯多肽。序列的邊界由5’(氨基)端的起始密碼子和3’(羧基)端的的翻譯終止密碼子確定。編碼序列包括但不限于原核序列，從真核MRNA獲取的cDNA，從真核(如哺乳動物)DNA獲取的遺傳DNA序列，和合成DNA序列。聚腺苷酸化信號和轉錄終止序列通常位于編碼序列的3’端。
“DNA分子”是指單鏈形式或雙鏈螺旋狀的脫氧核糖核苷酸(腺嘌呤，鳥嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶)的聚合物形式。這個術語僅指分子的一級基二級結構，不限于任何具體的三級結構。這樣，此術語包括發現的雙鏈DNA分子，特別是線性DNA分子(如限制性片段)，病毒，質粒，和染色體中發現的雙鏈DNA分子。討論具體雙鏈DNA分子結構時，本文按照常用慣例描述序列，僅以5’到3’方向沿著DNA的非轉錄鏈(即含有與mRNA同源的序列的鏈)給出序列。
轉錄和翻譯控制序列是“DNA調節序列”，如啟動子，增強子，聚腺苷酸化信號，終止子等等，提供在宿主細胞中編碼序列的表達。
“表達控制序列”是控制及調節另一個DNA序列轉錄和翻譯的DNA序列。當RNA聚合酶將編碼序列轉錄到mRNA中時，編碼序列是在細胞中轉錄及翻譯控制序列的控制下的，然后編碼序列被翻譯成有編碼序列編碼的蛋白質。
本文所使用的“細胞外基質蛋白質”，或ECM，是指大型分子的四個常見家族，膠原質，糖蛋白，蛋白多糖，彈性蛋白，包括纖連蛋白，血纖蛋白原，提供支持及調節分子行為。
本文所使用的“宿主細胞”是已被轉化或轉染的細胞，或能被外源多核苷酸序列轉化或轉染的細胞。
“一致性”，如在此領域中已知的，是兩個或多個多肽序列或兩個或多個多核苷酸序列之間的關系，如通過對比序列確定的關系。在此領域中，“一致性”也指多肽或多核苷酸之間的序列相關程度，如情況可能，是通過這些序列之間的匹配確定。
“一致性”和“相似性”可通過已知的方法(計算分子生物學，Lesk,A.M.，編輯，牛津大學出版社，紐約，1988；生物學計算信息學及基因組測序計劃，Smith,D.W，編輯，學術出版社，紐約，1993)方便地計算。雖然有很多計算兩個序列間的一致性和相似性的方法，這兩個術語對本領域技術人員是眾所周知的。通常用來確定序列間一致性或相似性的方法包括但不限于在Carillo,H.，和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)中所公開的。確定一致性的較好的方法設計給出測試序列間的最大匹配。確定一致性和相似性的方法可編成公眾可購到的計算機程序。確定兩個序列間一致性和相似性的較好的計算機程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux等人，核酸研究12(1):387,1984),BLASTP,BLASTN，和FASTA(Atschul等人，J.分子生物學，215:403-410,1990)。BLASTX程序是公眾可從NCBI和其他途徑(BLAST手冊，Altschul等人，NCBI NLM NIH Bethesda,Md,20894；Altschul等人，J.分子生物學，215:430-410,1990)購到的程序。
“免疫有效量”意指肽組合物的量能在受體動物中產生免疫反應。這包括產生抗體反應(B細胞反應)，和/或刺激細胞毒素免疫反應(T細胞反應)。產生這樣的免疫反應即能用來制備有用的生物試劑如CTL，更具體地是使用在診斷實施方案中的活性抗體，也能用在多種預防或治療實施方案中。
本文所使用的“體內疫苗”是指用蛋白質給動物免疫以產生保護以后不受病原體的影響的體液和細胞反應。
本文所定義的“分離的”是指從至少一些和其一起自然產生的組分中分離出來。本文所使用的“分離的”還指“通過人的手”從其自然狀態中改變，即，如果它產生在自然界中，它已被從其原生環境中改變或移出，或改變和移出。如，自然存在于有生命的生物體中的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但從其自然狀態共存物質中分離出的相同的多核苷酸或多肽是“分離的”，如本文所使用的這個術語。
本文所使用的“配體”包括分子，包括在宿主組織內的致病細菌附著的分子。
本文所使用的各種表達形式的“單克隆抗體”是指僅含一種能與具體抗原免疫反應的抗體結合位點的抗體。
本文所使用的“寡核苷酸”是指包括有兩個或多個核苷酸，較好的是多于三個核苷酸的分子。其精確大小取決于很多因素，這些因素進而又取決于寡核苷酸的最終作用和應用。
如本文所使用的“藥物可接受的”是指當給人類服用時，分子實體和組合物是生理學上可忍受的，并且通常不產生不可接受的過敏或類似不好的反應。
“多核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，其可能是未經修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA。“多核苷酸”沒有限制地包括單鏈或雙鏈DNA，單鏈和雙鏈區域混合物，或單鏈、雙鏈及三鏈區域混合物DNA，單鏈和雙鏈RNA，和單鏈和雙鏈區域混合物RNA，含有可能是單鏈或，更常見的，雙鏈，或三鏈，或單鏈和雙鏈區域混合物的DNA和RNA的雜交分子。此外，本文所使用的“多核苷酸”是指含有RNA或DNA、或RNA和DNA的三鏈區域。這種區域中的鏈可以來自相同分子或來自不同分子。區域可包括所有一個或多個分子，但更常見的是包括一些分子的僅一個區域。三鏈-螺旋區域分子中的一個常常是寡核苷酸。如本文所使用的，“多核苷酸”包括上面描述的含有一個或多個修飾堿基的DNA或RNA。這樣，帶有為穩定性或為其他原因修飾的主鏈的DNA或RNA是本文所描述的“多核苷酸”。并且，包含不常見堿基如次黃嘌呤核苷，或修飾的堿基如三苯甲基化堿基(僅是指出的兩個實施例)的DNA或RNA也是本文所定義的多核苷酸。應該理解的是，許多為多種有用目的對DNA和RNA作出的修飾對本領域技術人員是已知的。本文所使用的“多核苷酸”也包括多核苷酸這種化學上的，酶催化的或代謝的修飾形式，以及有病毒和細胞特點的DNA和RNA的化學形式，包括如簡單細胞及復合細胞。“多核苷酸”還包括常常稱為寡核苷酸的短的多核苷酸。
“多肽”是指含有兩個或多個通過肽鍵或修飾的肽鍵彼此連接的氨基酸。“多肽”即指短鏈，常常稱為肽、寡肽和寡聚體，而長鏈常常稱為蛋白質。多肽可以包括除了20個遺傳編碼氨基酸以外的氨基酸。“多肽”還包括通過自然過程修飾的多肽，如加工及其他翻譯后修飾，也包括通過本領域已知的化學修飾技術修飾的多肽。這樣的修飾過程在基礎課本中，在更詳細的專論中以及在多數研究著作中作了詳細的描述。應該理解的是，同樣類型的修飾能以相同或不同程度存在于給定的多肽中的不同位點。同樣，給定的多肽可含有多種修飾。修飾可發生在多肽的任何部位，包括肽的主鏈，氨基酸側鏈及氨基酸或羧基端。修飾包括乙酰基化作用，酰基化作用，ADP-核糖基化作用，酰胺化作用，四羥酮醇的共價附著作用，亞鐵血紅素組成的共價附著作用，核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著作用，脂質或脂質衍生物的共價附著作用，磷脂酰肌醇的共價附著作用，交聯作用，環化作用，二硫化物鍵形成，脫甲基作用，共價交聯形成，半胱氨酸形成，焦谷氨酸形成，公式化，γ-羧酸化作用，糖基化作用，GPI-錨形成，羥基化作用，碘化作用，甲基化作用，豆蔻酰化作用，氧化作用，蛋白水解過程，磷酸化作用，異戊二烯化作用，外消旋化作用，糖基化作用，脂質附著作用，用硫酸處理，谷氨酸殘基的γ-羧酸化作用，羥基化作用和ADP-核糖基化作用，硒化作用，用硫酸處理，氨基酸與蛋白質的轉運RNA調節加成作用如精氨酰化作用，遍在蛋白化作用。參閱，如Seifter等人的Meth.Emzymol.182:624-646,1990和Rattan等人的Ann.N.Y Acad.Sci.663:48-62,1992。多肽可以是支鏈的或環狀的，有或沒有支鏈。環狀，支鏈及支鏈環狀多肽可從翻譯后自然過程得到，也可完全通過合成方法制備。
本文使用的“引物”是指寡核苷酸，不論是以純的限制性酶切消化形式自然產生的或合成制備的，當其置于引物延伸產物的合成被誘導的條件下時，即在存在核苷酸和誘導試劑如DNA聚合酶，及適當的溫度和PH條件下，其能作為合成啟動的點，其中引物延伸產物是核酸鏈的互補。引物可以是單鏈或雙鏈的，并且必須足夠長以在存在誘導試劑的條件下引導所需延伸產物的合成。引物的確切長度取決于許多因素，包括溫度，引物來源和使用的方法。如對于診斷應用，根據靶序列的復雜性，寡核苷酸引物通常含有15-25個或更多個核苷酸，盡管其可能含有較少的核苷酸。
本文的引物的選取要充分地與不同鏈的具體靶DNA序列互補。這意味著引物必須是充分地互補以與其各自的鏈雜交。因此，引物序列不需要反映模板確切的序列。如非互補核苷酸片段可能附著在引物的5’端，引物序列的剩余部分與鏈互補。或者，非互補堿基或較長序列可以散布到引物中，只要引物序列同與其雜交的鏈的序列有充分的互補性，并從而形成延伸產物的合成用模板。
“啟動子序列”是DNA調節區域，能在細胞內結合RNA聚合酶并啟動下游(3’方向)編碼序列的轉錄。為了定義本發明，啟動子序列以其3’端轉錄起始位點為界，向上游(5’方向)延伸，包括在背景以上可檢測到的水平上啟動轉錄所需的最小量的堿基或元素。在啟動子序列內可發現轉錄啟動位點(可用核酸酶S1制圖來方便地定義)，以及具有結合RNA聚合酶功能的蛋白質結合域(共有序列)。真核啟動子常常，但不總是，含有“TATA”框和“CAT”框。原核啟動子除了含有-10和-35共有序列外還有Shine-Dalgarno序列。
“復制子”是遺傳元素(如質粒，染色體，病毒)，用作體內DNA復制的自主單元，即能在其自身控制下復制。
本文所使用的“限制性內切核酸酶”和“限制性酶”是指細菌酶，每種酶在或鄰近特異回文核苷酸序列上切斷雙鏈DNA。
“信號序列”可包括在編碼序列前。這個序列編碼信號肽，多肽的N-端，其給宿主細胞傳達信息以指導多肽到細胞表面或將其分泌到介質中。在蛋白質離開細胞前，這種信號肽被宿主細胞剪去。這種信號序列被發現常與真核細胞和原核細胞自身的多種蛋白質有關。
當外源或同源DNA被引入到細胞中時，細胞已被外源或同源DNA“轉化”。轉化DNA可以被或不被整合(共價結合)到組成細胞基因組的染色體DNA中。例如，在原核細胞、酵母、和哺乳動物細胞中，轉化DNA可以保持在附加型元素上如質粒上。對于真核細胞，穩定轉化的細胞是其中轉化DNA已經整合到染色體中的細胞，這樣其通過染色體復制而被其子代細胞繼承。這種穩定性由真核細胞建立由含轉化DNA的子代細胞群組成的細胞種系或集落的能力來說明。
本文所使用的“變體”是多核苷酸或多肽，與參比多核苷酸或多肽不同，但保持有重要的特性。多核苷酸的典型變體在核苷酸序列上與別的多核苷酸，參比多核苷酸不同。變體核苷酸序列上的變化可能有或沒有改變由參比多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。核苷酸變化可能導致在由參比序列編碼的多肽中氨基酸的取代、加成、缺失、融合或截斷，如下所述。多肽的典型變體在氨基酸序列上與別的，參比多肽不同。通常，區別是有限的，這樣參比多肽和變體的序列總體是很接近的，在很多區域是一致的。變體和參比多肽可能在氨基酸序列的任何組合形式的一個或多個取代、加成或缺失上不同。取代的或插入的氨基酸殘基可能是或不是由遺傳密碼編碼的氨基酸。多核苷酸或多肽的變體可以是自然發生的如等位基因變體，或它可能是自然發生的變體內所不了解的變體。多核苷酸和多肽的非自然發生變體可由誘變技術，通過直接合成，及通過本領域技術人員已知的重組方法制成。
“載體”是另一個DNA片段可附著的以促使附著片段復制的復制子，如質粒，噬菌體或粘粒。Ⅱ．核酸和氨基酸序列編碼SdrF,SdrG和SdrH(分別在圖2-4中給出)或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的核酸序列，可用來制備重組蛋白質或用在有高度敏感性和特異性的樣品或試驗物中作為檢測凝固酶陰性葡萄球菌蛋白質的核酸探針。探針可用來檢測樣品中凝固酶陰性葡萄球菌的存在，診斷疾病的感染，確定樣品中凝固酶陰性葡萄球菌的量，或監測用來治療感染的治療過程的進展。核酸和氨基酸序列也可用作實驗室研究工具以研究生物體和監測疾病或發展對疾病的治療。
本領域的技術人員應該理解的是，SdrF,SdrG或SdrH蛋白質也可由與序列清單中提供的核酸序列基本上相同的序列編碼。當約70％或更多的(較好的至少約為80％，最好至少約為90或95％)核苷酸在DNA序列限定長度上匹配時，兩個DNA序列基本上相同。基本上相同的序列可通過比對序列確定，使用序列數據庫的標準軟件，或在如具體系統所限定的嚴緊條件下Southern雜交試驗中確定。限定適當的雜條件在此領域的技術范圍內，參看如Maniatis等人的分子克隆實驗室手冊，1982；DNA克隆，Ⅰ&Ⅱ卷，supra；核酸雜交，[B.D.Hames&S.J.Higgins編輯，(1985)]。“基本上相似的”還指由于遺傳密碼的簡并，DNA序列與在圖2-4中所示的任何序列不同，但其仍然編碼相同的氨基酸序列；或者，由于一個氨基酸被相似的氨基酸替代，或由于改變(不論其是取代，加成，缺失還是插入)沒有影響蛋白質的活性位點，DNA序列編碼不同的但保持蛋白質活性的氨基酸序列。當約70％或更多的(較好的至少約為80％，最好至少約為90或95％)氨基酸在序列限定長度上匹配時，兩個氨基酸序列或兩個核酸序列是“基本上相似的”。
在本發明的肽和編碼肽的DNA片段的結構中可進行修飾或改變并可獲得編碼具有所需特性的蛋白質或肽的功能分子。下面是根據改變蛋白質的氨基酸而產生等同物，或甚至產生改進的第二代分子的討論。依據表1，氨基酸的改變可通過改變DNA序列的密碼子獲得。本領域技術人員應理解的是，表1中的說明的密碼子是RNA序列的。相應的DNA密碼子將以T替換U。為與標準術語統一(J.Biol.Chem.,243:3552-3559,1996)。氨基酸殘基的縮寫也在表1中列出。
表1氨基酸 密碼子丙氨酸 Ala A GCA GC GCG GCU半胱氨酸Cys C UGC UGU天冬氨酸Asp D GAC GAU GAC GAU谷氨酸 Glu E GAA GAG苯基丙氨酸 Phe F UUC UUU甘氨酸 Gly G GGA GCG GGG GGU組氨酸 His H CAC CAU異亮氨酸Ile I AUA AUC AUU賴氨酸 Lye K AAA AAG亮氨酸 Leu L UUA UUG CUA CUC GUG GUU蛋氨酸 Met M AUG天冬酰胺Asn N AAC AAU脯氨酸 Pro P CCA CCC CCG CCU谷氨酰胺Gln Q CAA CAG精氨酸 Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU絲氨酸 Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU蘇氨酸 Thr T ACA ACC ACG ACU纈氨酸 Val V GUA GUC GUG GUU色氨酸 Trp W UGG酪氨酸 Tyr Y UAC UAU
例如，在與結構如抗體的抗原結合區域或底物分子上的結合位點的相互作用的結合能力沒有可感知的損失的情況下，在蛋白質結構中某些氨基酸可以被其他氨基酸取代。因為正是蛋白質性質和相互作用能力定義著蛋白質生物功能活性，所以某些氨基酸序列取代可在蛋白質序列中進行，當然也可在其根本的DNA編碼序列中進行，并且仍然獲得具有相同性質的蛋白質。這樣，發明者考慮認為，在公開組合物的肽序列中，或在編碼所說的肽的相應的DNA序列中，可進行多種改變，并且不發生其生物活性或用途的可感知的損失。
在進行這些改變時，可考慮氨基酸的親水指數。在探察蛋白質的相互作用生物功能中氨基酸親水指數的重要性方面，本領域已經有了廣泛的理解(Kyte和Doolittle,J.Mol.Biol.,157(1):105-132,1982，通過在此引證而合并于本文)。已經接受的是，氨基酸相對的親水特征與結果蛋白質的二級結構有關，其進一步限定蛋白質與其他分子的相互作用，如酶，底物，受體，DNA，抗體，抗原，等等。根據其疏水性和電荷特性，每種氨基酸都賦值了親水指數(Kyte和Doolittle,supra,1982)，具體有異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯基丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本領域中已知的是，某些氨基酸可被其他具有相似親水指數或評定值的氨基酸取代，并仍產生具有相似生物活性的蛋白質，即仍獲得生物功能等同物蛋白質。在進行這樣的改變時，其親水指數在±2內的氨基酸的取代是較好的，其親水指數在±1內的氨基酸的取代是更好的，其親水指數在±0.5內的氨基酸的取代是最好的。在本領域中還應該理解的是，相似氨基酸的取代可依據親水性而有效地進行。美國專利4,554,101中說明了蛋白質的最大局部平均親水性指數，取決于其鄰近的氨基酸的親水性指數，與蛋白質的生物特性有關，該專利通過在此引述而合并于本文。
如在美國專利4,554,101中所描述的，下列氨基酸殘基賦值了親水性指數精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+1.0)；天冬氨酸(+3.0+1)；谷氨酸(+3.0+1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯基丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。還應該理解的是，氨基酸可被另一個具有相似親水性指數的氨基酸取代，并仍獲得生物等同物，具體地是免疫等同物蛋白質。在進行這樣的改變時，其親水性指數在±2內的氨基酸的取代是較好的，其親水性指數在±1內的氨基酸的取代是特別推薦的，其親水性指數在±0.5內的氨基酸的取代是更好的。
如上面所列出的，因此，氨基酸取代通常是根據氨基酸側鏈取代基的相對相似性，如，它們的疏水性，親水性，電荷，大小，等等。考慮了多種前述特性的示范取代對本領域技術人員是眾所周知的，包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸。
本發明的多肽可通過化學合成。合成的多肽可使用已熟知的固相，液相技術，或肽縮合技術，或它們的任何組合來制備，合成多肽可包括自然的或非自然的氨基酸。用來合成肽的氨基酸可以是標準Boc(Na-氨基保護的Na-叔-丁氧基羰基)氨基酸樹脂，使用Merrifield(J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2154,1963)的固相技術的標準脫保護，中和，偶聯和沖洗方案，或由Carpino和Han(J.Org.Chem.,37:3403-3409,1972)首先描述的堿基-易發生變化的Na-氨基保護的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)氨基酸。Fmoc和Boc Na-氨基保護的氨基酸都可從Fluka,Bachem,Advanced Chemtech,Sigma,Cambridge ResearchBiochemical,Bachem，或Peninsula Labs或其他從事本領域的人所熟悉的化學公司獲得。此外，本發明的方法可與其他本領域技術人員熟悉的Na-氨基保護基團一起使用。固相肽合成可使用本領域中技術人員熟悉的技術實施，如在Stewart和Young的《固相合成》中提供的，第二版，Pierce化學公司，Rochford,IL,1984；和Field和Noble 1990年Int.J.Pept.Protein Res.35:161-214中提供的，或使用自動合成器，如ABS所售的。這樣，本發明的多肽可含有D-氨基酸，D-和L-氨基酸的組合，和多種“設計者”氨基酸(如β-甲基氨基酸，Cα-甲基氨基酸，和Nα-甲基氨基酸)以轉達具體屬性。合成氨基酸包括鳥氨酸合成賴氨酸，氟代苯基丙氨酸合成苯基丙氨酸，正亮氨酸合成亮氨酸或異亮氨酸。此外，在特殊偶聯步驟排布特殊氨基酸，可制備α-螺旋，β-轉角，β-折疊，γ-轉角，及環狀肽。
在另一個實施方案中，選取了提供有用的化學和結構屬性的肽的亞基。如含D-氨基酸的肽在體內會對L-氨基酸-特異蛋白酶有抗性。此外，本發明預想制備具有更好的限定結構屬性的肽，使用肽模擬學和肽模擬鍵，如酯鍵，制備具有新型屬性的肽。在另一個實施方案中，可制備摻入了還原的肽鍵即R1-CH2-NH-R2的肽，其中R1和R2是氨基酸殘基或序列。還原的肽鍵可作為二肽亞基引入。這樣的分子會對肽鍵水解如蛋白酶活性有抗性。這樣的肽會提供具有獨特功能和活性的配體，如由于對代謝衰弱或蛋白酶活性的抗性而在體內延長半衰期。并且，眾所周知的是，在某些系統中約束肽表現出增強的功能活性(Hruby,生命科學，31:189-199,1982；Hruby等人，Biochem.J.,268:249-262,1990)。
下列非典型氨基酸可摻入到肽中以引入特殊的構象基元1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸酯(Kazmierski等人，J.Am.Chem.Soc.,113:2275-2283,1991)；(2S,3S)-甲基-苯基丙氨酸，(2S,3R)-甲基-苯基-丙氨酸，(2R,3S)-甲基-苯基丙氨酸和(2R,3R)-甲基-苯基丙氨酸(Kazmierski和Hruby,Tetrahedron Lett.,1991)；2-氨基四氫萘-2-羧酸(Landis,Ph.D.Thesis，亞利桑那大學，1989)；羥基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-羧酸酯(Miyake等人，J.Takeda Res.Labs.,43:53-76,1989)；β-咔啉(D和L)(Kazmierski,Ph.D.Thesis，亞利桑那大學，1988)；HIC(組氨酸異喹啉羧酸)(Zechel等人，Int.J.Pep.Protein Res.,43,1991)；和HIC(組氨酸環脲)(Dharanipragada)。
下列氨基酸類似物和肽模擬物可摻入到肽中以誘導或促成特異二級結構LL-Acp(LL-3-氨基-2-propenidone-6-羧酸),β-轉角誘導二肽類似物(Kemp等人，J.Org.Chem.,50:5834-5838,1985),β-折疊誘導類似物(Kemp等人，Tetrahedron Lett.,29:5081-5082,1988)；β-轉角誘導類似物(Kemp等人，Tetrahedron Lett.,29:5057-5060,1988)；α-螺旋誘導類似物(Kemp等人，Tetrahedron Lett.,29:4935-4938,1988)；γ-轉角誘導類似物(Kemp等人，J.Org.Chem.,54:109-115,1989)；由下列參考文獻提供的類似物Nagai和Sato,Tetrahedron Lett.,26:647-650(1985)；DiMaio等人，J.Chem.Soc.Perkin.Trans.,p.1687(1989)；以及Gly-Ala轉角類似物(Kahn等人，Tetrahedron Lett.,30:2317,1989)；酰胺鍵等排體(Jones等人，Tetrahedron Lett.,29:3853-3856,1989)；四氮雜茂(Zabrocki等人，J.Am.Chem.Soc.,110:5875-5880,1988)；DTC(Samanen等人，Int.J.Protein Pep.Res.,35:501:509,1990)；和在Olson等人(J.Am.Chem.Sci.,112:323-333,1990)和Garvey等人(J.Org.Chem.,56:436,1990)中公開的類似物。β-轉角和β-凸起，和含它們的肽的構象限制模擬物在1995年8月8日授予Kahn的美國專利No.5,440,013中公開。
本文還提供了凝固酶陰性葡萄球菌細菌如本文所描述的表皮葡萄球菌的與編碼血纖蛋白原-結合蛋白質或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的核酸分子選擇性雜交的核酸分子序列，或它們的互補序列。“選擇性”或“選擇地”是指不與其他核酸雜交的序列。這樣促進了SdrF,SdrG或SdrH的特異檢測。因此，在設計雜交核酸時，選擇性將取決于存在于樣品中的其他組成。雜交核酸應與和其雜交的核酸片段有至少70％的互補性。如本文用來描述核酸的術語“選擇地雜交”不包括偶然隨機地雜交核酸，因此，與“特異雜交”含有相同的意義。本發明的選擇性雜交核酸與和其雜交的序列片段可有至少70％,80％,85％,90％,95％,97％,98％和99％的互補性。
本發明考慮到了選擇性地與本文具體提供的編碼DNA或DNA的互補鏈，或相對應鏈雜交的序列，探針和引物。只要功能種類-特異雜交能力保持，與核酸的特異雜交可與核酸內小的修飾或取代一起發生。“探針”是在為了檢測或擴增互補序列進行的與互補活性序列選擇性雜交中能用作探針或引物的核酸序列，其探針長度可從約5個核苷酸到100個核苷酸變化，或較好地從約10個到50個核苷酸變化，或更好地從約18到24個核苷酸變化。因此，本文所使用的“探針”或“探針們”包括“引物”。本文提供了分離的核酸，其與種類-特異核酸在嚴緊條件下選擇性雜交，并且應含有至少5個核苷酸與有興趣的序列互補，如Sambrook等人在分子克隆實驗室手冊中所描述的，1989第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約。
如果用作引物，組合物較好地包括至少兩個與靶分子的不同區域雜交的核酸分子以擴增所需區域。根據探針或引物的長度，靶區域范圍可以在70％互補堿基到全部堿基互補之間并仍在嚴格條件下雜交。如為了診斷存在表皮葡萄球菌，雜交核酸(探針或引物)和與雜交核酸雜交的序列(如從樣品獲取的凝固酶陰性葡萄球菌DNA)之間的互補性程度至少應足以將核酸的雜交從其他細菌中區別開來。
編碼SdrF,SdrG或SdrH蛋白質或其部分，如共同序列或可變序列氨基酸基元的核酸序列可插入到載體中，如質粒，或重組表達在有生命的生物體中以制備重組SdrF,SdrG或SdrH蛋白質或其片段。例如，制備重組SdrF,SdrG和SdrH的DNA分子已依據本發明在質粒中制備。
重組蛋白質可用本領域技術人員已知的方法制備。克隆載體，如質粒或噬菌體DNA用限制性酶切開，將編碼SdrF,SdrG或SdrH蛋白質或其片段，如共同序列或可變序列氨基酸基元插入到切口部位并連接。然后將克隆載體插入到宿主中以制備由SdrF,SdrG或SdrH編碼DNA編碼的蛋白質或其片段。適當的宿主包括細菌宿主如大腸桿菌，枯草芽胞桿菌，酵母及其他細胞培養物。可使用已知的分子生物學技術實施及增強基因產品的制備和提純。Ⅲ．Sdr核酸的應用本文提供了使用本文所描述的核酸檢測及鑒別存在凝固酶陰性葡萄球菌的方法。這些方法可用于診斷凝固酶陰性葡萄球菌感染和其他相關疾病如與導管相關的感染，與生物物質相關的感染，上呼吸道感染(如耳炎，氣管炎，會厭炎，甲狀腺炎，)，下呼吸道感染(如肺氣腫，肺膿腫)心臟感染(如感染性心內膜炎)，胃腸感染(如分泌器官痢疾，脾膿腫，腹膜后膿腫)，中樞神經系統感染(如腦膿腫)，眼睛感染(如眼瞼炎，結膜炎，角膜炎，內眼炎，preseptal及眼窩蜂窩織炎，darcryocystitis)，腎及尿道感染(如附睪炎，腎內和腎周膿腫，毒性休克癥)，皮膚感染(如膿包病，毛囊炎，皮膚膿腫，蜂窩織炎，傷口感染，細菌肌炎)，骨及關節感染(如膿毒性關節炎，骨髓炎)，牛乳腺炎，犬齒膿皮病。
該方法包括獲取可能含有凝固酶陰性葡萄球菌樣品步驟。樣品可從個體中獲取，如從個體的血液，唾液，組織，骨，肌肉，軟骨，或皮膚中獲取。然后可將細胞裂解，提取，沉淀并擴增DNA。從凝固酶陰性葡萄球菌中檢測DNA可通過將擴增的DNA與探針雜交來實施，凝固酶陰性葡萄球菌探針選擇性地與DNA雜交，如在本發明的詳細描述部分中所描述的。雜交檢測指示存在凝固酶陰性葡萄球菌。
較好地，使用可檢測的組成促進核酸(如探針或引物)雜交檢測。如探針可用生物素標記并使用在鏈霉抗生物素蛋白涂覆的微量滴定板測試中。其他可檢測的組成包括放射性標記，酶標記，和熒光標記。
DNA可直接進行檢測，或可在分析前使用聚合酶鏈反應(PCR)或其他擴增技術進行酶促擴增。RNA或cDNA可進行相似的檢測。SdrF,SdrG或SdrH表達的增加或減少可使用任何本領域中眾所周知的定量核酸分子的技術測定，如擴增，PCR,RT-PCR,RN酶保護，Northern印跡，及其他雜交技術。
對SdrF,SdrG或SdrH蛋白質或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元，或抗-SdrF,SdrG或SdrH抗體的診斷檢測也可用來測定表皮葡萄球菌感染的存在。在樣品中鑒別蛋白質或抗體含量的檢測技術對本領域技術人員是已知的，包括方法如放射免疫測定，Western印跡分析及ELISA測定。Ⅳ．Sdr蛋白質或抗體的應用分離的，重組的或合成的蛋白質，或其抗原部分(包括帶有抗原表位片段)，或其融合蛋白質可給動物服用作為免疫原或抗原，單獨服用或與輔劑組合服用，以制備與SdrF,SdrG或SdrH蛋白質或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元反應的抗體。此外，蛋白質可用來篩查從中可獲取對蛋白質有很高親和力的特異抗體的超免疫患者的抗體或抗血清。
可用來傳遞被動免疫的SdrF,SdrG或SdrH或其片段，如共有序列或可變序列氨基酸基元的抗體可用來預防凝固酶陰性葡萄球菌感染，用來治療正在進行的感染或用來作為研究工具。本文所使用的“抗體”包括包括單克隆，多克隆，嵌合的，單鏈的，雙特異性的，猴類的和人類的抗體以及Fab片段，包括Fab免疫球蛋白表達文庫的產品。制備任何這些類型抗體或抗體片段對本領域技術人員是已知的。
單克隆抗體可通過本領域技術人員熟知的方法制備。較好的方法是Kearney等人J.Immunol.123:1548-1558(1979)的方法的修訂版，該文獻通過在此引述而合并于本文。簡單地講，將動物如鼠或兔子用在輔劑中的免疫原接種，收獲脾細胞并與骨髓瘤細胞種系混合，如P3X63Ag8,653。通過加入聚乙烯乙二醇誘導細胞融合。通過將細胞鋪排在含次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的選擇性培養基中以化學方法選擇雜種細胞。隨后對雜種細胞進行制備抗-SdrF,SdrG或SdrH單克隆抗體能力的篩查。將制備抗體的雜種細胞克隆，擴展及冷凍保存作將來制備使用。
制備單鏈抗體的技術是本領域技術人員熟知的，在美國專利No.4,946,778中作了描述，可用來制備本文所描述的蛋白質的單鏈抗體。噬菌體展示技術可用來從進行SdrF,SdrG或SdrH或原初文庫抗體篩查的人的淋巴細胞的PCR擴增基因中，選擇對SdrF,SdrG或SdrH，或其抗原部分如共有序列或可變序列氨基酸基元具有結合活性的抗體基因。雙特異抗體含有兩個抗原結合域，其中每個域對著不同的抗原表位。
任何上述抗體都可用在鑒別及定量凝固酶陰性葡萄球菌中可檢測的標記直接標記。在免疫測定中使用的標記對本領域技術人員是已知的，通常包括酶，放射性同位素，熒光物質，發光酶和顯色物質，包括著色顆粒如膠體金或乳膠珠。適當的免疫測定法包括酶聯免疫吸附測定法(ELISA)。
或者，抗體可通過與對免疫球蛋白有親和力的標記物質反應間接標記。抗體可與第二物質綴合，用標記的對與抗體綴合的第二物質有親和力的第三物質檢測。如，抗體可與生物素綴合，然后使用標記的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白檢測抗體-生物素綴合物。同樣地，抗體可以與半抗原綴合，然后使用標記的抗-半抗原抗體檢測抗體-半抗原綴合物。標記抗體和測定綴合物的這些和其他方法對本領域中的技術人員是眾所周知的。
細胞外基質-結合蛋白質SdrF,SdrG或SdrH或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的抗體，也可用在生產設施或實驗室中以分離附加量的蛋白質，如通過親和層析。如，血纖蛋白原-結合蛋白質SdrG的抗體可用來分離附加量的血纖蛋白原。
蛋白質，或其活性片段，及蛋白質的抗體可用在凝固酶陰性葡萄球菌細菌感染的治療和診斷中，如上面描述的有關診斷方法，或用來發展主動或被動免疫的抗-凝固酶陰性葡萄球菌疫苗。并且，當在體內或體外作為藥物組合物給傷口服用戶用來覆蓋醫療設備或聚合生物物質時，蛋白質和抗體都用作阻斷劑，與預防或抑制凝固酶陰性葡萄球菌與傷口或生物物質的結合。較好地，抗體是修飾的，這樣在服用抗體的患者體內其具有較小的免疫原性。如果患者是人，抗體可通過將雜種細胞衍生的抗體的互補體決定區域移植到人的單克隆抗體中“人化”，如在Jones等人，自然321:522-525(1986)中或Tempest等人生物技術9:266-273(1991)中所描述的及在本文上面所提及的。
用本文所描述的抗體，蛋白質及活性片段覆蓋的醫療設備或聚合生物物質包括但不限于U形釘，縫合線，替換心臟瓣膜，助心設備，硬質及軟質隱形眼鏡，眼內晶體移植(室前或室后)，其他移植如角膜鑲嵌，角膜-假體，脈管擴張器，epikeratophalia設備，青光眼分流器，視網膜U形釘，虹膜扣，假牙，甲狀腺整形設備，喉部整形設備，脈管移植體，軟質和硬質組織假體，包括但不限于泵，電動設備如刺激器，記錄器，耳假體，起博器，人造喉，牙齒移植，乳房移植，陰莖移植，頭部/面部腱，人造關節，腱，韌帶，半月板和盤，人造骨，人造器官包括人造胰腺，人造心臟，人造肢，和人造瓣膜；擴張器，金屬線，導引金屬線，靜脈內和靜脈中心導管，激光和球形血管成形術設備，脈管及心臟設備(管，導管，球)，心室助器，血液透析組成，血液充氧器，尿道/輸尿管/泌尿器設備(Foley導管，擴張器，管和球)，通風導管(氣管內和氣管造口術管和套箍)，腸飼食管(包括鼻飼，胃內和空腸管)，傷口倒流管，用于體腔排放的管如胸腔，腹腔，顱腔，心包腔排放管，血液袋，測試管，血液收集管，vacutainers，耳咽管，針頭，吸液管，吸液管頭和血液管。
本領域中的技術人員應該理解的是，本文所使用的“覆蓋的”或“覆蓋”是指將蛋白質，抗體或活性片段涂在設備的表面，較好地涂在會經歷凝固酶陰性葡萄球菌感染的外表面。設備表面沒有必要全部由蛋白質，抗體或活性片段覆蓋。Ⅴ．藥物組合物免疫組合物，包括疫苗，和其他含SdrF,SdrG或SdrH蛋白質或其片段，如共有序列或可變序列氨基酸基元的藥物組合物包括在本發明的范圍內。使用疫苗領域中技術人員已知的物料和方法，一種或多種SdrF,SdrG或SdrH蛋白質，或活性或抗原片段，單獨地或與其他抗原一起制成配方或包裝。免疫反應可作治療或預防應用，并能提供抗體免疫或分子免疫，如由T淋巴細胞提供。
免疫組合物如疫苗，和其他藥物組合物可單獨使用或與其他阻斷劑一起使用，以保護人或動物不得由凝固酶陰性葡萄球菌引起的或加劇的感染。具體地，組合物可用來保護人不得心內膜炎，毒性休克癥，骨髓炎，附睪炎，蜂窩織炎或許多其他感染。組合物也可保護人或反芻動物不得由凝固酶陰性葡萄球菌感染引起的乳腺炎。疫苗可進一步用來保護其他種類動物如犬科和馬科動物不得類似的凝固酶陰性葡萄球菌感染。
為了增強免疫原性，蛋白質抗原可與載體分子綴合。適當的免疫原性載體包括蛋白質，多肽或肽如清蛋白，血藍蛋白，甲狀腺球蛋白和它們的衍生物，具體地有牛血清清蛋白(BSA)和匙孔嘁血藍蛋白(KLH)，多糖，碳水化合物，聚合物，和固相。其他蛋白質衍生或非蛋白質衍生的物質對本領域中的技術人員是已知的。免疫原性載體通常分子量至少1,000道爾頓，較好地大于10,000道爾頓。載體分子常常含有活性基團以便于與半抗原綴合。羧酸基團或氨基酸的氨基基團或糖蛋白的糖基團常常以這種方式應用。缺少這些基團的載體可與適當的化學物質反應制備。較好地，當將免疫原注入動物如鼠，兔子，山羊，田鼠，綿羊，豚鼠，雞或其他動物中時，最好是鼠和兔子，免疫反應產生。或者，在沒有使用載體時，含多種蛋白質或多肽，或抗原性或免疫性等同物多肽的多抗原肽，可具有充分抗原性以改善免疫原性。
SdrF,SdrG或SdrH蛋白質或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元，或蛋白質組合物可以有效量與輔劑一起服用，以增強對綴合物的免疫原反應。這個時候，被廣泛使用在人類中的唯一的輔劑是明磯(磷酸鋁或氫氧化鋁)。皂苷和其提純組分Quil A,Freund的完全輔劑和其他使用在研究中和醫獸用輔劑含有限制其在人類疫苗中應用的毒性。然而，化學定義的制備品如胞壁酰二肽，單磷酰基脂質A，磷脂綴合物如在Goodman-Snitkoff等人的J.Immunol.147:410-415(1991)中所描述的，和蛋白磷脂體內封包的綴合物如在Miller等人的J.Exp.Med.,176:1739-1744(1992)中所描述的，和在脂質囊中封包的蛋白質如Novasome脂質囊(微脈管系統有限公司，Nashua,NH)也可使用，這些文獻通過在此引述而合并于本文。
本文所使用的“疫苗”包括給患者服用的藥物組合物中的DNA疫苗，其中核酸分子編碼SdrF,SdrG或SdrH，或其抗原片段，如任何共有序列或可變序列氨基酸基元。為了基因免疫接種，本領域技術人員已知的適當的給藥方法包括直接將質粒DNA注射到肌肉中(Wolff等人，Hum.Mol.Genet.1:363,1992)，將DNA與特異蛋白質載體混合給藥(Wu等人，J.Bio.Chem.264:16985,1989)，用磷酸鈣共沉淀DNA(Benvenisty和Reshef,Proc.Natl.Acad.Sci.83:9551,1986)，將DNA封包在脂質體中(Kaneda等人，科學243:375,1989)，粒子轟擊(Tang等人，自然，356:152,1992和Eisenbraun等人，DNA分子生物學，12:791,1993)，及使用克隆的逆轉錄病毒載體體內感染(Seeger等人Proc.Natl.Acad.Sci.81:5849,1984)。
在另一個實施方案中，本發明是多核苷酸，其包括在體內將所說的多核苷酸引入到真核組織中時能表達制備基因產品的鄰接核酸序列。編碼的基因產品較好地用作免疫刺激劑或作用能產生免疫反應的抗原。這樣，在這個實施方案中的核酸序列編碼免疫原抗原表位，是細胞因子或T-細胞共同刺激因子，如蛋白質B7家族中的成員。
用基因而不是用其基因產品免疫接種有幾種優勢，首先是相對簡單，天然或接近天然的抗原可被引入到免疫系統中。哺乳動物蛋白質重組表達在細菌，酵母中，甚至哺乳動物細胞常常需要廣泛的治療與確保適當的抗原性。用DNA免疫接種的第二個優勢是免疫原可能進入到MHC-Ⅰ類途徑中，并刺激細胞毒性T細胞反應。使用編碼流感A核蛋白質(NP)的DNA免疫接種鼠產生對NP的CD8+反應，保護鼠不受異類流感菌株的影響(Montgomery,D.L.等人，細胞分子生物學，43(3):285-92,1997和Ulmer等人，疫苗，15(8):792-794,1997)。
細胞調節免疫對控制感染是很重要的。因為DNA免疫接種可刺激體液和細胞-調節免疫反應，所以其大的優點是，它提供了相對簡單的方法測定了大量表皮葡萄球菌基因的疫苗潛能。Ⅵ．服用方法及藥物組合物劑量含SdrF,SdrG或SdrH蛋白質或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元，或核酸分子，抗體，或它們的片段的藥物組合物可調配在藥物載體中，如鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇，其他治療用化合物，和它們的組合。配方應適于服用方式。組合物可用來干擾，調節，或抑制凝固酶陰性葡萄球菌和宿主細胞上的血纖蛋白原之間的結合。
可表達DNA或引入到疫苗受體中的可轉錄RNA的量有很大的劑量范圍，并取決于使用的轉錄和翻譯啟動子的強度。此外，免疫反應的大小取決于蛋白質表達的量及表達的基因產品的免疫原性。通常，可直接給肌肉組織服用的DNA的有效劑量范圍在約1ng到5mg,100ng到2.5mg,1μg到750μg，較好地約為10μg到300μg。皮下注射，真皮內引入，皮膚壓入，及其他服用方式如腹腔內，靜脈內，或吸入給藥也是適用的。本發明還考慮提供了推進器接種疫苗。下列用多核苷酸免疫原接種疫苗，用蛋白質免疫原如SdrH基因產品推進也考慮在本發明中。
多核苷酸可能是“裸的”，即不與影響受體免疫系統的任何蛋白質，輔劑或其他試劑結合。在這種情況下，需要多核苷酸在生理上可接受的溶液中，如但不限于，無菌鹽水或無菌緩沖鹽水。或者，DNA可與脂質體結合，如卵磷脂脂質體或此領域中已知的其他脂質體，成為DNA-脂質體混合物，或DNA可與本領域中已知的輔劑結合以促進免疫反應，如蛋白質或其他載體。對細胞吸收DNA有幫助的試劑，如但不限于鈣離子也可使用。這些試劑本文通常稱為轉染促進試劑或藥物可接受的載體。用多核苷酸涂覆微粒的技術在本領域中是眾所周知的，也可用在本發明中。對于應用于人類的DNA，可將最終DNA產物置于藥物可接受的載體或緩沖液中。藥物可接受的載體或緩沖液在本領域中眾所周知，包括在多種課本中所描述的，如Remington藥物科學。
本領域中的技術人員應該認識到，對于DNA疫苗接種用藥法最理想的劑量方案包括5到6個之多，但較好的有3到5個，更好的1個到3個免疫實體用藥法，間隔少的兩到四周，長的五到十年，或甚至更長的間隔。
本申請中公開的任何藥物組合物的適當的用藥方法包括，但不限于局部用藥，口服用藥，肛門用藥，陰道用藥，靜脈內用藥，腹腔內用藥，肌肉內用藥，皮下用藥，鼻內用藥，真皮內用藥。
對于局部用藥，組合物配制成藥膏，霜劑，凝膠，洗劑，滴劑(如眼睛滴劑和耳滴劑)，或溶液(如漱口液)。傷口或外科敷裹物，縫合線，和汽霧劑也可充滿組合物。組合物可含有傳統的添加劑，如防腐劑，促進滲透的溶劑，和柔和劑。局部用藥配方還可含有傳統的載體如乳脂或軟膏基質，乙醇，或油烯基醇。
在一個較好的實施方案中，疫苗以對注射用藥(即肌肉內注射，真皮內注射，皮下注射)或鼻因用藥(即鼻內用藥)免疫接種為一次劑量的形式包裝。疫苗最好通過肌肉注射到三角肌肌肉中。疫苗較好地與藥物可接受的載體混合以便于服用。載體通常是水或緩沖鹽水，含或不合防腐劑。疫苗也可是凍干的，在服用時重新懸浮或溶解。
蛋白質的微囊化作用會產生控釋。很多因素影響微囊化作用的具體聚合物的選擇。必須考慮到的所有因素有聚合物合成的再現性，微囊化作用方法，微囊化作用的物料和方法的成本，毒物學分布，可變釋放動力學的要求，聚合物和抗原的生理學相容性。可使用的聚合物實例有聚碳酸酯，聚酯，聚亞胺酯，聚原酸酯，聚酰胺，聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和其他生物可分解的聚合物。在抗原的控釋中使用PLGA由Eldridge等人在微生物學和免疫學的當前課題，146:59-66(1989)中作了評述。
對于人類用藥，較好的劑量為從0.01毫克/公斤到10毫克/公斤，推薦劑量為約1毫克/公斤。根據這個范圍，對于較重體重的等同劑量可以確定。劑量應調節以適應給服組合物的個體，并且隨著個體的年齡，體重和新陳代謝的不同而變化。疫苗可另外含有穩定劑或藥物可接受的防腐劑，如thimerosal[乙基(巰基安息香酸鹽-S)汞鈉鹽](Sigma化學公司，St.Louis,MO)。Ⅶ．蛋白質標記綴合物當用可檢測的生物分子或化化學物質標記時，本文所描述的血纖蛋白原結合蛋白質可用來如在體內和體外診斷葡萄球菌感染，或檢測凝固酶陰性葡萄球菌。通過使用這樣的Sdr蛋白質標記綴合物也可促進實驗室研究。多種標記和將標記與蛋白質綴合的方法對本領域中的技術人員是已知的。下面列出幾種特異標記。當與蛋白質如抗體或受體綴合時這些標記特別有用。
例如，蛋白質可與放射性標記如，但不限于32P,3H,14C,35S,125I,或131I綴合。對標記的檢測可使用如閃爍計數法，γ射線光譜測定法，放射自顯影法。
生物熒光標記，如螢火蟲蟲熒光素的衍生物也可使用。通過傳統方法將生物熒光物質與蛋白質共價結合，當酶如熒光素酶催化與ATP的反應時，產生生物熒光分子發出光子，標記的蛋白質被檢測出來。
熒光團也可用來標記蛋白質熒光團的實例包括熒光素及衍生物，藻紅蛋白，藻青蛋白，同分異構藻青蛋白，玫瑰精，和Texas紅。熒光團通常有熒光檢測器檢測。
另外，蛋白質也可用顯色物質標記以提供酶或親和標記。如蛋白質可被生物素化，這樣蛋白質可用在生物素-抗生物素蛋白反應中，其也可與標記如酶或熒光團偶聯。如蛋白質可用過氧化物酶，堿性磷酸酶或其他酶標記，在加入的底物上產生顯色或熒光團反應。添加劑如5-氨基-2,3-二氫-1,4-phthalazinedione(也稱為發光氨)(Sigma化學公司，St.Louis,MO)和速度增強劑如p-羥基二苯基(也稱p-苯基苯酚)(Sigma化學公司，St.Louis,MO)也可用來通過發光反應擴增酶如山葵過氧化物酶；酶底物的發光或熒光團的dioxetane衍生物也可使用。這樣的標記可用酶聯免疫測定法(ELISA)或通過分光光度計檢測顏色改變來測定。此外，依據本領域中技術人員熟知的方法，蛋白質可用膠體金標記以使用在免疫電鏡術中。
細胞中配體的定位可通過標記抗體(如上所述)及檢測標記來鑒別，依據本領域中的技術人員熟知的檢測標記的方法，如使用由Warren和Nelson所描述的方案(分子細胞生物學，7:1326-1337,1987)的免疫熒光顯微鏡法。Ⅷ．治療應用除了上面描述的治療組合物和方法外，SdrF,SdrG或SdrH蛋白質或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元，核酸分子或抗體可用來干擾病原體和哺乳動物宿主之間的引發感染的初始物理相互作用，如細菌，特別是革蘭氏陰性細菌對在留置設備上的哺乳動物細胞外基質蛋白質或傷口中細胞外基質蛋白質的附著；用來阻斷SdrF,SdrG或SdrH蛋白質調節的哺乳動物細胞入侵；用來阻斷用來阻斷哺乳動物細胞外基質蛋白質和調節組織損失的細菌SdrF,SdrG或SdrH蛋白質或其片段，如共有序列或可變序列氨基酸基元之間的細菌附著；用來阻斷不是由留置設備的植入或外科技術引發的感染病理的正常進展。Ⅸ．篩查方法SdrF,SdrG或SdrH蛋白質，或其片段，如共有序列或可變序列氨基酸基元可用在篩查化合物以確定抑制凝固酶陰性葡萄球菌與宿主分子結合的化合物的方法中。根據這種方法，將有興趣的化合物與一種或多種SdrF,SdrG或SdrH蛋白質或其片段結合，測定或觀察蛋白質與血纖蛋白原或其他細胞外基質蛋白結合程度。如果存在的蛋白質產生對蛋白質-血纖蛋白原結合的抑制作用，那么該化合物可用來在體內或體外抑制凝固酶陰性葡萄球菌。該方法可同樣用來鑒別促進凝固酶陰性葡萄球菌與宿主分子相互作用的化合物。
該方法特別可用來鑒別具有抑制細菌或殺菌屬性的化合物。
如，為了篩查凝固酶陰性葡萄球菌激動劑，或拮抗劑，將合成反應混合物，細胞區室(如膜，細胞外膜或細胞壁)含有一種或多種SdrF,SdrG或SdrH蛋白質，或其片段，如共有序列或可變序列氨基酸基元，和蛋白質的標記的底物或配體，在存在或不存在所研究的化合物的情況下溫育。化合物激動或拮抗蛋白質的能力由標記配體結合現象的減少或底物產物的產量減少顯示。結合好的并且增加底物產物形成速度的化合物是激動劑。對底物產物生產量或速度的檢測可通過使用報道基因系統來增強，如轉變成產物的比色標記底物，對SdrF,SdrG或SdrH核酸或蛋白質活性的改變敏感的報道基因，和本領域中技術人員熟知的結合測定法。也可使用競爭性抑制測定法。
可能的拮抗劑包括小型有機分子，肽，多肽，和與SdrF,SdrG或SdrH核酸分子或蛋白質或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元結合，從而抑制它們的活性的抗體，或與結合分子(如血纖蛋白原)結合抑制SdrF,SdrG或SdrH核酸分子或蛋白質與其配體結合的抗體。如，抑制SdrF,SdrG或SdrH活性的化合物可以是與SdrF,SdrG或SdrH蛋白質結合并占據結合位點從而阻止與細胞結合分子的結合抑制正常生物活性的小型分子。小型分子的實例包括但不限于，小型有機分子，肽或類肽分子。其他可能的拮抗劑包括反義分子。較好的拮抗劑包括與SdrF,SdrG或SdrH蛋白質，或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元有關的化合物，以及SdrF,SdrG或SdrH蛋白質，或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元的變體或衍生物。
本文所描述的核酸分子也可用來篩查抗細菌活性的化合物。Ⅹ．凝固酶陰性葡萄球菌的檢測試劑盒本發明進一步涉及含有一種或多種SdrF,SdrG或SdrH-特異核酸探針的試劑盒，它能用來在樣品中檢測凝固酶陰性葡萄球菌或凝固酶陰性葡萄球菌Sdr蛋白質或其部分，如共有序列或可變序列氨基酸基元，或用來診斷凝固酶陰性葡萄球菌的感染。這種試劑盒也可含有適當試劑用來將探針與樣品雜交并檢測結合探針。
在一個可替換的實施方案中，試劑盒含有對一種或多種SdrF,SdrG或SdrH蛋白質，或其片段，如共有序列或可變序列氨基酸基元特異的抗體，它可用來檢測凝固酶陰性葡萄球菌。
在另一個實施方案中，試劑盒含有一種或多種SdrF,SdrG或SdrH蛋白質，或其活性片段，它可用來檢測樣品中凝固酶陰性葡萄球菌生物體或凝固酶陰性葡萄球菌Sdr蛋白質的抗體。
本文所描述的試劑盒可另外含有用來安全地獲取樣品的設備，存放試劑的容器，計時裝置，稀釋樣品的緩沖液，比色計，放射計，或測定顏色變化的對比標準。
在一個較好的實施方案中，試劑，包括蛋白質或抗體是凍干的，最好放在單一容器中。向容器中加入水溶樣品產生凍干試劑的溶液，使它們起作用。最好的是，依據本領域中的技術人員熟知的方法，將試劑順序地在單一容器中凍干，以使加入樣品前試劑的反應最小化。
實施例下列實施例用來演示本發明較好的實施方案。本領域中的技術人員應理解的是，遵循發明者發現的技術的在實施例中公開的技術，在實施發明中起到很好的作用，因此，實施例中公開的技術可以認為組成了實施發明的較好模式。然而，本領域中的技術人員應理解的是，根據本篇公開內容，在公開的具體實施方案中可以作出許多改變，在沒有背離本發明精神和范圍的情況下，仍然可以獲得相同或相似的結果。實施例Ⅰ在凝固酶陰性葡萄球菌中識別Sdr編碼基因在含有二肽天冬氨酸和絲氨酸(DS)的金黃色葡萄球菌中已識別出五種基因(clfA,clfB,sdrC,sdrD,sdrF)，由18kb重復基元GAY TCN GAY TCN GAY AGY編碼，其中Y=嘧啶，N=任何堿基。這個家族的蛋白質因絲氨酸-天冬氨酸重復單元已經被命名為Sdr蛋白質。所有5種金黃色葡萄球菌sdr基因編碼蛋白質都含有使它們在革蘭氏陽性細菌中成為表面相關蛋白質的屬性；即在N-端有分泌信號，在C-端有(ⅰ)作為蛋白質分泌終止信號的幾個正電荷殘基，(ⅱ)疏水跨膜區域，(ⅲ)細胞壁中精確分類及修正蛋白質取向所需的帶有LPXTG基元的壁-跨越區域。為了在凝固酶陰性葡萄球菌中鑒別編碼細胞表面蛋白質的新型基因，我們使用clfA的DS編碼區域作為基因探針來鑒別是否在不同種類的凝固酶陰性葡萄球菌中存在同系物。我們描述的凝固酶陰性葡萄球菌菌種有(1)S.Lugdunensis,(2)S.Haemolyticus,(3)S.Schleiferi，(4)表皮葡萄球菌。每種菌在下面列出。
從Jerome Etienne(里昂，法國)獲取S.Lugdunensis,S.Haemolyticus,S.Schleifri和表皮葡萄球菌每種十個菌株。此外，Timothy Foster博士的菌株收集中含其他研究者捐助的表皮葡萄球菌。使用從所有凝固酶陰性葡萄球菌菌株中分離出的基因組DNA實施Southern雜交分析。將染色體DNA用HindⅢ酶切，clfA的DS編碼區域進行DIG標記(Boehringer)并用作探針。對全部十個S.Lugdunensis菌株的Southern雜交分析顯示9kb的單一HindⅢ片段與clfA的DS編碼區域雜交。用clfA的DS編碼序列對S.Haemolyticus菌株的分析顯示了不同大小的片段。在測試的十個菌株之中，有6個菌株在18kb到10kb之間表現出強烈雜交帶。在HindⅢ片段上存在不止一個DS編碼區域的可能性是存在的。放射自顯影圖長時間曝光后，四個保留菌株顯示與clfA的DS編碼區域較弱雜交。clfA探針沒有在從S.Schleiferi獲取的基因組DNA中檢測到DS編碼區域。所有測試的表皮葡萄球菌菌株顯示出在至少兩個HindⅢ片段上與clfA的DS編碼區域雜交。
測試菌株S.Lugdunensis菌株1．S.Lugdunensis N9401132．S.Lugdunensis N9401643．S.Lugdunensis N9401354．S.Lugdunensis N9502325．S.Lugdunensis N9201436．S.Lugdunensis N9304327．S.Lugdunensis N9400848．S.Lugdunensis N9400259．S.Lugdunensis N91031910．S.Lugdunensis N910320表皮葡萄球菌菌株1．表皮葡萄球菌ATCC1499O(Kloos)2．表皮葡萄球菌KH113．表皮葡萄球菌K284．表皮葡萄球菌TU3298
5．表皮葡萄球菌91426．表皮葡萄球菌14577．表皮葡萄球菌84008．表皮葡萄球菌RP62a9．表皮葡萄球菌N91010210．表皮葡萄球菌N91017311．表皮葡萄球菌N91019112．表皮葡萄球菌N91023113．表皮葡萄球菌N91024914．表皮葡萄球菌N91027515．表皮葡萄球菌N95019016．表皮葡萄球菌N95032917．表皮葡萄球菌N91030818．表皮葡萄球菌N910160S.haemolyticus菌株1．S.Haemolyticus N970612．S.Haemolyticus N9605123．S.Haemolytieus N9101064．S.Haemolyticus N910245．S.Haemolyticus N9201606．S.Haemolyticus N9102877．S.Haemolyticus N92018
8．S.Haemolyticus N9301009．S.Haemolyticus N95025210．S.Haemolyticus N93016S.Schleiferi菌株1．S.Schleiferi JCM74302．S.Schleiferi N9202473．S.Schleiferi N9102454．S.Schleiferi N9100175．S.Schleiferi N9605186．S.Schleiferi N9502427．S.Schleiferi N9201628．S.Schleiferi N920179．S.Schleiferi N93004710．S.Schleiferi N920260在其他表皮葡萄球菌菌株中的sdrF同系物通過Southern雜交測定17個表皮葡萄球菌菌株是否存在sdrF基因。個體菌株的染色體DNA用HindⅢ酶切，并用sdrF的區域A編碼序列作為探針探測。這種DNA探針通過PCR使用pC5(在實施例2中作進一步描述)作為模板進行DIG-標記。sdrF基因存在于HindⅢ片段上，從4到10kb變化，并且在測試的16個菌株中的12個中存在。使用clfA的區域R編碼序列作為探針也鑒別出相同大小的帶，說明在其他表皮葡萄球菌菌株中的sdrF同系物也含有區域R編碼序列。在其他表皮葡萄球菌菌株中的sdrG同系物測試16個表皮葡萄球菌菌株是否存在sdrG基因，使用設計探測sdrG的區域A編碼序列的探針。Southern雜交分析顯示sdrG存在于16kb的HindⅢ片段上，并且在全部測試的表皮葡萄球菌中存在。用作sdrG的區域A編碼序列擴增的引物序列如下F1-sdrG:5’GATGATGAATTATCAGAC3’R.-sdrG:5’CAGGAGGCAAGTCACCTTG3’(包含sdrG的配位點195到1795)在表皮葡萄球菌菌株中的DS-編碼區域同系物用HindⅢ酶切染色體DNA，將clfA的DS-編碼區域進行DIG標記(Boehringer)并用作探針。Southem雜交分析顯示至少兩個HindⅢ片段與clfA的DS-編碼區域雜交。十個菌株與三個HindⅢ片段雜交。實施例2研究凝固酶陰性葡萄球菌中的Sdr基因，并鑒別，分離，測序及表達SdrF,SdrG和SdrH總述表皮葡萄球菌菌株可表達三種不同的含絲氨酸-天冬氨酸二肽重復單元的與細胞表面相關蛋白質。蛋白質SdrF和SdrG在序列上和結構組織上與金黃色葡萄球菌的Sdr蛋白質相似。它們在它們的N-端分別包括625和548個殘基獨特區域A，接著可變數量的110-119個殘基區域B，一個SD重復區域，以及與肽聚糖共價錨定的C-端的LPXTG基元和表面蛋白質特有的疏水域。相對照，SdrH包括在N-端的較短的60個殘基區域A，接著一個SD重復區域，一個獨特的277個殘基區域C，和C-端疏水域。SdrH缺少LPXTG基元。編碼SdrF,SdrG和SdrH的每個區域A的DNA克隆到E.Coli的表達載體中，表達并提純重組蛋白質。在兔子中培養特異抗血清并用來鑒別用表皮葡萄球菌表達的Sdr蛋白質。從生長到指數期的細胞的溶-葡萄球菌酶產生的原生質體中只釋放出SdrF。SdrG和SdrH保持與原生質體部分結合，因此沒有分類并與肽聚糖結合。在Southern雜交分析中，SdrG和SdrH在測試的全部十六個菌株中都存在，而SdrF只在十二個菌株中存在。從已經從表皮葡萄球菌感染恢復的十五個患者中獲取的抗血清含有與SdrF,SdrG和SdrH的重組區域A反應的抗體，這說明這些蛋白質在感染期間被表達了。背景表皮葡萄球菌是人類皮膚常見的居住者并是外源物感染的常見病因。由于生物體能與留置設備先附著，接著形成生物膜而促使致病，留置設備有如人造瓣膜，整形外科設備和靜脈內和腹膜內導管。設備相關感染危及治療的成功并大大增加了患者的發病率(11)。
表皮葡萄球菌對合成表面的附著作用與表面的疏水性和細胞表面蛋白質有關(2,13)。表皮葡萄球菌的蛋白酶治療已顯示降低了疏水性和附著作用(24)，與表皮葡萄球菌的220kDa細胞表面蛋白質反應的單克隆抗體能部分阻斷細菌對聚苯乙烯的附著作用(30)。由ica操縱子表達的多糖對形成生物膜是至關重要的。一種觀點認為，多糖附著因子(PS/A)同時影響附著作用和與生物膜形成的累積時期有關的細胞與細胞間的相互作用。另一種觀點認為，附著作用是由表面相關蛋白質調節，而多糖只影響積累時期(5,12,19)。
如同表皮葡萄球菌一樣，金黃色葡萄球菌也可與醫療植入設備附著，但這種附著作用主要由對植入后短時間覆蓋生物物質表面的宿主血纖蛋白原和纖連蛋白原特異的細菌受體調節。調節這些相互作用的金黃色葡萄球菌附著因子包括血纖蛋白原結合蛋白質，ClfA和ClfB，纖連蛋白原結合蛋白質，FnbpA和FnbpB[在(3)中作了評述]。盡管表皮葡萄球菌有可能與血纖蛋白原，纖連蛋白原，玻連蛋白，層粘連蛋白(6,25,29)，但對有關調節這些相互作用的特異附著因子及這些相互作用如何影響細菌對由宿主蛋白質覆蓋的生物物質附著作用了解很少。
金黃色葡萄球菌的血纖蛋白原結合從生因子蛋白質(或ClfA)(如圖1A)特點在于存在絲氨酸-天冬氨酸(SD)二肽重復區域(在以前的研究中稱為區域R)，位于配體結合區域A和C-端序列之間，并與對細胞壁的附著作用有關(16,17)。SD-重復區域預計跨越細胞壁并從細菌表面延伸到配體結合區域(4)。ClfA是在金黃色葡萄球菌中發現的SD-重復(Sdr)蛋白質家族的前體。其他成員包括ClfB(第二血纖蛋白原結合從生因子),SdrC,SdrD和SdrE(圖5A)(8,21)。SdrC,SdrD和SdrE蛋白質含有其他重復單元，稱為區域B重復單元，位于區域A和SD重復單元之間。每個B重復單元長度為110-113個氨基酸并含有推定的Ca2+結合，EF-手基元。Ca2+結合已經顯示是區域B重復單元結構完整所需的(9)。SdrC,SdrD和SdrE的功能還不了解，但蛋白質假定通過它們的區域A與宿主基元分子相互作用。
這個實施例描述了由表皮葡萄球菌表達的三種Sdr蛋白質。兩種含有與金黃色葡萄球菌的Sdr蛋白質相同的結構組織及相似的序列，而SdrH是不同的。編碼這些蛋白質的基因在表皮葡萄球菌菌株中是普遍的。在康復期患者中存在對每種Sdr區域A反應的抗體說明在感染期間蛋白質被表達。材料和方法細菌菌株和生長條件E.coli XL-1藍或JM109用作為重組宿主菌株。菌株XL-1藍或TOPP3(Stratagene,La Jolla,CA)細胞用作蛋白質表達。細菌在補充有100μg/ml的氨卡青霉素(USB,Cleveland,OH)的Luria肉湯或瓊脂(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)中常規生長。表皮葡萄球菌菌株(表2)在胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)或瓊脂(TSA)(Difco,Detroit,MI)中生長。Sdr基因的克隆和測序從表皮葡萄球菌菌株9491中克隆SdrF基因。長度范圍為6.5到7.5kb的HindⅢ-DNA片段從瓊脂糖凝膠中分離并連接到用HindⅢ消化的pBluescript SK+克隆載體(Stratagene)中，用小牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)(Promega,Madison,WI)處理。使用朝向ClfA的編碼SD-重復區域的DNA的引物(P3和P4引物，表3)，通過PCR篩查(27)確定一個重組質粒，pC5。
從用已用Sau3A部分消化并連接到入Gem-11(Promega)的半位點XhoI臂中的DNA制備的表皮葡萄球菌菌株K28的入Gem-11文庫克隆SdrG基因。包裝后，通過表示ClfA SD-重復單元區域的DNA探針的雜交作用鑒別陽性噬菌體，稱為E6-2。然后將從E6-2中獲取的SacI-KpnⅠ DNA片段亞克隆到E.Coli質粒載體，pZero(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。然后將克隆用限制性內切核酸酶定位，將含與編碼SD-重復單元氨基酸序列的DNA相同的DNA的3.5kb的EcoRⅠ-KpnⅠ片段亞克隆pUC18(Amersham Pharmacia Biotech,piscataway,NJ)中以制備pE6-2。
下面克隆SdrH基因。從表皮葡萄球菌菌株9491基因組DNA中獲取的HindⅢ片段按大小分級在5-20％蔗糖梯度上。將從含1.5-2.5kb片段的組分中獲取的DNA連接到用HindⅢ消化及用CIAP(Promega)脫磷酸化的pBluescript中。通過集落印跡雜交，使用制作用來探測編碼ClfA SD-重復單元區域DNA的DIG標記(Boehringer,Mannheim,Indianapolis,IN)探針篩查含連接產物的E.Coli轉化體。
在兩條克隆的DNA鏈上實施自動雙脫氧-DNA測序。在大多數情況中，使用引物行走實施DNA序列在給定克隆體上的延伸。然而，這種方法不能覆蓋編碼SdrF的SD-重復單元的重復DNA的長度。因此，DNA的這個區域用Sau3A從pC5中切除，并連接到pBluescript中，用作構建核酸外切酶缺失衍生物(Erase-a-base,Promega)。兩條鏈上的適當缺失(未顯示)通過PCR篩查和選擇性制圖確定。
表2使用在這項研究中的表皮葡萄球菌菌株 注釋和屬性 來源或參比□□9491□SdrF和SdrH原型菌株□ATCC菌株□□ATCC14990□參比菌株KH11 P.VaudauxK28SdrG原型菌株 P.VaudauxRP62a可轉化菌株TU3298生物膜模型 F.Gotz9142D.Mack1457D.Mack8400N910308參比菌株，法國，里昂J.EtienneN910160參比菌株，法國，里昂J.EtienneN910102參比菌株，法國，里昂J.EtienneN910173參比菌株，法國，里昂J.EtienneN910191參比菌株，法國，里昂J.EtienneN910231參比菌株，法國，里昂J.EtienneN910249參比菌株，法國，里昂J.Etienne
表3使用在DNA探針和蛋白質表達構建的PCR擴增中的引物擴增區 序列 指定 模板域 載體 DNAClfA SD F:GCCGGATCCCCAATTCCAGAGGATTCANa PCF重復 R:GCCAAGCTTATTGTTAGAACCTGACTC 48SD重復 P3:GATTCAGATAGCCATTC Na SdrP4:CTGAGTCACTGTCTGAG克隆SdrF區 F:CCCGGATCCGCTGAAGACAATCAATTAG PQE菌株域AR:CCCAAGCTTAATTATCCCCCTGTGCTG30 9491SdrG區 F:CCCGGATCCGAGGAGAATACAGTACAAGA PQE菌株域ACG 30 K28R:CCCGGTACCTAGTTTTTCAGGAGGCAAGTCACCSdrH全 F:CCCGGATCCGAAGGTAATCATCCTATTGAC PQE菌株長 R:CCCAAGCTTACTTTTTTCTAAAGATATATA 30 9491GTCCSdrF區 F如上 PGE菌株域A R:CCCGAATTCAATTATCCCCCTGTGCTGTTG X- 94912TSdrG區 F如上 PGE菌株域AR:CCCGAATTCTAGTTTTTCAGGCAAGTCACC X- K282TSdrH區 F:GGCGGATCCGAAGGTAATCATCCTATTG PGE菌株域A X- 9491R:GGCAAGCTTCTAAATATGTGTCATTTTC KGNa不可適用下劃線用來克隆的限制性內切核酸酶位點Southern雜交其他地方已經對Southern印跡轉移和雜交進行了描述(8)。DNA探針從編碼ClfAd SD重復區域或編碼SdrF,SdrG和SdrH的每個區域A(表3)的PCR產物制備。使用Taq DNA聚合酶(Gibco BRL)制備PCR產物，探針是異羥基洋地黃毒苷配基(Boehringer Mannheim)或熒光素(Amersham)標記的。蛋白質表達和提純以制備抗血清使用適當的引物(表3)，通過從表皮葡萄球菌菌株9491或K28中獲取的基因組模板DNA的PCR擴增，獲得編碼重組SdrF,SdrG或SdrH區域A的DNA。SdrF區域A構建缺少末端殘基，脯氨酸。PCR使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)；說明書中已作了描述(7)。PCR產物用適當的限制性內切核酸酶消化，并連接到表達載體PQE30(Qiagen,Valencia,CA)中以制備組氨酸-標記蛋白質，或連接到PGEX-2T(Pharmacia)或PGEX-KG中以制備GST-標記蛋白質。通過培養4升重組生物體到光學密度(OD600)到0.5并用0.3mM異丙基-1-硫βD-半乳糖苷(IPTG)(Gibco BRL)誘導兩個小時，將蛋白質表達到E.Coli中。將細胞收獲在PBS(150mM氯化鈉，4.3mMNa2HPO4,1mM NaH2PO4)中并在-80℃冷凍。E.coli流經French濾紙，這些裂解物的上清液通過0.45μm的膜過濾。存在于上清液中的溶解的組氨酸-標記蛋白質通過金屬螯合色譜法進行初始提純。將上清液加在5毫升帶Ni2+-電荷的HiTrap螯合柱(Pharmacia Biotech有限公司)中，用200毫升線性梯度的0-200mM咪唑的4mM Tris-鹽酸，100mM氯化鈉溶液，pH7.9，以流速5毫升每分鐘洗脫結合蛋白質。含重組蛋白質的組分通過SDS-PAGE(如下)確定，混合，并用25mM Tris-鹽酸，pH8.0透析。將透析蛋白質濃縮，并用離子交換色譜法通過將樣品加到5毫升HiTrap Q柱(Pharmaeia Biotech有限公司)中，用200毫升線性梯度的0-0.5M氯化鈉的25mM Tris-鹽酸，pH9.0，以流速5毫升每分鐘洗脫結合蛋白質進一步提純。含重組蛋白質的組分通過SDS-PAGE確定。從如上獲得的E.Coli溶胞物中提純GST標記的蛋白質。在重力作用流動下，溶胞物流經10毫升的谷胱甘肽-瓊脂糖柱，并用五倍柱體積的PBS沖洗。用新鮮制備的5mM還原的谷胱甘肽(Sigma)的50mM Tris-鹽酸溶液，pH8.0從柱上將蛋白質洗脫。提純的蛋白質用來在新西蘭白兔中培養抗血清，使用由HTI Bioproducts(Romano,CA)或由愛爾蘭國立大學生物學核心實驗室(愛爾蘭，都柏林)公開的標準方案。SDS-PAGE和Western印跡轉移SDS-PAGE使用含10％丙烯酰胺的trycine凝膠(28)。使用半干轉移細胞(Bio-Rad，實驗室，Hercules,CA)，將分離的蛋白質轉移到PVDF膜(Immobilon-P.Millipore,Bedford,MA)上。在還原條件下將所有蛋白質加熱變性。提純的蛋白質(每種1ug)用SDS-PAGE處理并用Coomassie亮藍染色。獲取E.Coli溶胞物或溶胞物組分，如下IPTG誘導，重組E.Coli培養到OD600為2.0，沖洗并重新懸浮到初始體積量的PBS中，制備SDS-PAGE。將10μl的每種制備物裝入各自的含丙烯酰胺的培養皿中。表皮葡萄球菌菌株在含有1.25U每10毫升內切蛋白酶抑制劑α2-巨球蛋白(Boehringer Mannheim)的TSB中培養到早期穩定期。將細胞調節到OD600為2.0，沖洗并重新懸浮到一半初始體積量中。在溶葡萄球菌酶(100μg/ml)和溶解酵素(100μg/ml)前加入蛋白酶抑制劑(4mM苯基甲基磺酰氟，1mM N-乙基-順丁烯二酰亞胺，和25mM氨基己酸)和DNA(10μg/ml)。在37℃搖晃下實施酶促消化30分鐘。使用相同的條件，在存在30％蜜三糖的情況下從原生質體中分離細胞壁蛋白質。用如處理E.Coli的方式處理表皮葡萄球菌溶胞物或溶胞物組分。將30μl等分樣品置于含丙烯酰胺的培養皿中。免疫測定法如下實施Western免疫測定法將Western印跡在含有1％無脂肪干奶的PBS中溫育1小時。然后用抗血清(稀釋在PBS-奶中)將印跡溫育1小時。單克隆，抗組氨酸抗體(Clonetech,Palo,Alto,CA)稀釋到1∶3000。抗SdrFA抗血清(免疫，預免疫，和抗原吸收的)稀釋到1∶30,000；抗-SdrGA抗血清稀釋到1∶2000，抗-SdrHA抗血清稀釋到1∶1000。抗血清吸收已作了描述(14)。簡單地講，抗-SdrFA和抗-SdrGA抗血清分別被存在于已被超聲波降解然后離心的誘導E.coli不溶組分中的GST標記的SdrGA和SdrFA蛋白質廣泛地吸收。這種方法用來除去存在于每種抗血清中可能的交叉反應抗體。通過使用分別含有GST標記的SdrFA,SdrGA和SdrHA的E.coli溶胞物吸收每種抗血清來除去免疫反應的抗-SdrFA,-SdrGA和-SdrHA抗體。接著溫育抗血清，用PBS沖洗Western印機三次，并用與堿性磷酸酶(Bio-Rad實驗室)綴合的山羊，抗-兔或抗-鼠IgG的1∶2000稀釋液溫育30分鐘。沖洗印跡，然后在顯色底物(150μg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯p-甲苯胺鹽和300μg/ml的p-硝基藍四唑氯的重碳酸鹽緩沖液)中顯影10到15分鐘。
康復期患者IgG對重組蛋白質的反應性已有描述(1)。收集從表皮葡萄球菌感染恢復的15名個體的抗血清，使用蛋白質-A瓊脂糖凝膠層析法提純IgG。酶聯免疫吸附測定法(ELISA)用來演示IgG(每個培養皿2μg)對涂覆在微量滴定板上的重組蛋白質(每個培養皿1μg)的反應性。結果SdrF,SdrG和SdrH基因的鑒另對表皮葡萄球菌的初步Southern雜交分析顯示存在幾個與編碼金黃色葡萄球菌Sdr蛋白質家族(未公開觀察結果)的SD重復單元的DNA雜交的位點。為了進一步描述這些位點，我們克隆了從表皮葡萄球菌菌株9491和K28獲取的三個DNA片段。通過直接將HindⅢ-DNA片段連接到E.Coli質粒載體中從菌株9491獲得兩個克隆體，pC5和pC28。第三個克隆體，E6-2從由菌株K28制備的入Gem-11基因組文庫中獲得。E6-2插入DNA的片段亞克隆到E.coli質粒載體中形成pE6-2。pC5,pE6-2和pC28發現分別有6.8,6.0，和2.0kb的DNA插入(未顯示)。
DNA序列分析顯示在每個質粒中存在單一開放讀框(ORF)。ORP，稱為SdrF,SdrG和SdrH，分別有5199,2793和1461個堿基對。亮氨酸，而不是蛋氨酸，密碼子預計作為SdrG的翻譯起始密碼子。可能的核糖體結合位點(GGAG)確定為每個ORF5’的7到12個堿基對。drF,SdrG和SdrH ORF的側翼500到1000個堿基對的DNA序列不同，說明它們不象金黃色葡萄球菌的SdrC,SdrD和SdrE基因那樣銜接結合(數據未顯示)。SdrF,SdrG和SdrH的推導氨基酸序列表皮葡萄球菌SdrF和SdrG蛋白質的氨基酸結構組織與金黃色葡萄球菌的Sdr蛋白質的相似，因此具有典型的共價錨定革蘭氏陽性細菌的肽聚糖的細胞表面蛋白質的特性。這些細胞表面特性包括在疏水膜跨越區域后C端盡頭的正電荷殘基，LPXTG基元。SD重復區域位于LPXTG基元的N-端并認為貫穿細胞壁(4,10)。SdrF和SdrG在它們的N-端含有預定的信號序列(分別為52和50個殘基)，在它們的C-端含有與細胞壁連接有關的殘基(圖5B和5C)。SdrF和SdrG的SD重復區域(如下)分別終止7個和13個殘基，最接近LPXTG基元。SdrF和SdrG的SD重復區域分別含有558和56個殘基(圖5B)。SdrG的二肽組合物沒有從絲氨酸和天冬氨酸偏離，而在SdrF中，在SD重復區域內出現26個丙氨酸。成熟蛋白質(損失信號序列)的預計分子量對于SdrF為179kDa，對于SdrG為97.6kDa。
金黃色葡萄球菌的Sdr蛋白質每種具有結構性特點，在它們的N-端有已知的或推定的配體結合域，稱為區域A(8,16,21)。成熟SdrF和SdrG的N-端分別有625和548個氨基酸區域A。成對地比較顯示SdrF和SdrG區域A的氨基酸序列彼此有22％相同，與金黃色葡萄球菌的Sdr蛋白質的區域A有20-35％(平均23％)相同。
在金黃色葡萄球菌Sdr蛋白質的區域A內已報道有氨基酸序列基元，這些基元包括在ClfB內的推定的Ca2+結合EF-手基元，在ClfB內的陽離子調整MIDAS基元，和常見的Sdr蛋白質基元，TYTFDYVD，不了解功能(8,23)。SdrF和SdrG區域A都含有TYTFDYVD基元，在SdrG的區域A中發現EF-手基元(DYSEYEDVTNDDY)。
金黃色葡萄球菌的三種Sdr蛋白質(SdrC,SdrD和SdrE)含有可變數量的110-113個氨基酸的片段，稱為區域B(圖5A)，每個重復單元含有推定的Ca2+結合EF-手基元(8,9)。同樣地，SdrF含有四個區域B重復單元(119,110,111和111個殘基)，SdrG含有兩個區域B重復單元(113和111個殘基)(圖5B)。每個重復單元含有推定EF-手基元，帶有共有序列DX(N/D)X(D/N)GXX(D/N/G)XX(E/D)。SdrF和SdrG區域B重復單元彼此有43-58％相同，與在金黃色葡萄球菌Sdr蛋白質中發現的區域B有39-73％(平均54％)相同。
SdrH的結構組織與SdrF和SdrG的結構組織在氨基酸序列量上相當不同。在其N-端的可能的30殘基信號序列后，SdrH有獨特的60殘基鏈(區域A)，接著120-殘基SD重復區域和277-殘基片段，區域C，在其C-端含有疏水序列，但缺少適當定位的LPXTG基元。然而，在疏水區域內出現LGVTG序列(圖1B,1C)。SdrH不含區域B重復單元。SdrH的區域A和區域C不含與其他已知的Sdr蛋白質或各種數據庫中的蛋白質相同的氨基酸序列。與其他Sdr蛋白質相同的基元也沒有發現。SdrH的成熟分子量預計為50.5kDa。
總之，這些結果說明表皮葡萄球菌能表達兩種與金黃色葡萄球菌Sdr蛋白質家族有關的蛋白質，并且能表達具有新型結構的第三中Sdr蛋白質。表皮葡萄球菌菌株中SdrF,SdrG和SdrH的分布在Southern雜交分析中，表現ClfA的SD重復單元編碼區域的DNA探針與幾種基因組HindⅢ片段在十六個表皮葡萄球菌菌株中雜交(如圖6A)。在大多數菌株中觀察到三個雜交片段，推測為SdrF,SdrG和SdrH基因。為了證實推測并確定在這些菌株中基因的頻率，用對編碼每個區域A的DNA特異的探針實施其他分析測定法。SdrH探針在全部菌株內與1.8-6.5kb片段雜交(圖6B)。SdrG探針在全部菌株內與16kb片段雜交(圖6C)。此外，在16個菌株的4個(KH11,K28,RP62a,和N910102)中探針與3.4kb的HindⅢ片段雜交。然而，同樣的3.4kb片段不與對編碼SD重復單元的DNA特異的探針雜交(圖6A)，說明存在的與SdrG區域A相同的基因沒有SD重復區域。圖6D顯示了用SdrG和SdrF區域A DNA探測的Southern印跡。SdrF探針在16個菌株中的12個中與4.5kb-10kb間的HindⅢ-DNA片段雜交(菌株K28,RP62a,N910173，和N910191缺少雜交帶)。這些結果說明SdrF,SdrG和SdrH基因在表皮葡萄球菌中是普遍的。表皮葡萄球菌中SdrF,SdrG和SdrH的表達使用免疫法測定是否表皮葡萄球菌表達SdrF,SdrG和SdrH。培養特異兔抗血清重組表現不同區域A的融合蛋白質(稱為SdrFA,SdrGA和SdrHA)。將SdrFA和SdrGA與聚組氨酸(Hisn)融合，SdrHA與GST融合(圖7A)。通過一組含不同蛋白質融合物的重組蛋白質證實抗血清的單特異性。具體地，培養的Hisn-SdrFA和-SdrGA的抗血清分別不與GST-SdrGA和-SdrFA交叉反應(圖7B)。此外，這些相同的抗血清不與GST-SdrHA交叉反應(圖7B)。培養的Hisn-SdrHA抗血清與全長Hisn-SdrH蛋白質反應，但不與Hisn-SdrFA或-SdrGA蛋白質反應(圖7C)。
通過Western免疫印跡法，區域A特異抗血清可用來在其同類表皮葡萄球菌的裂解物中確定原生SdrF,SdrG和SdrH。抗-SdrFA抗血清與菌株9491的230kDa帶反應(圖8A)。在用Western印跡與預免疫抗血清或與已經用表達GST-SdrFA融合蛋白質的E.coli溶胞物吸附的抗-SdrFA抗血清反應時，這條帶沒有出現(圖8A)。抗-SdrGA抗血清與表皮葡萄球菌菌株K28的裂解物中的170kDA帶反應。在與預免疫抗血清或與已經用表達GST-SdrGA融合蛋白質的E.coli溶胞物吸附的抗-SdrGA抗血清反應時，這條帶沒有出現(圖8B)。SdrHA的抗血清在菌株9491中識別出75kDa的帶，這種反應性可通過用存在于E.coli溶胞物中的重組SdrH吸附抗血清來除去(圖8C)。抗-SdrFA,-SdrGA和-SdrHA免疫反應帶的表觀分子量比從推導氨基酸序列推定的分子量(分別為179,97，和50kDa)要大。在SDS-PAGE上減少的移動已被解釋為兩種金黃色葡萄球菌Sdr蛋白質，ClfA和ClfB，其中觀察到多達50％-100％的預計分子量增加。Sdr蛋白質的酸性屬性建議用來解釋這些觀察結果。在表皮葡萄球菌中SdrH分子量的不同Western免疫印跡分析，不同菌株的表皮葡萄球菌含有具有不同表觀分子量的SdrH，表觀分子量在60到75kDa之間變化(圖9A)。ClfA分子量的不同認為與SD重復區域的長度有關(15)。對從上面使用的表皮葡萄球菌菌株獲取的SdrH基因的PCR分析顯示，編碼SD重復區域的DNA大小的不同與在Western印跡上SdrH蛋白質的分子量的不同有關。相反，編碼每個SdrF區域C的DNA的PCR產物大小是相似的(圖9B)。在細胞壁提取物和原生質體中分析SdrF,SdrG和SdrH在SdrF和SdrG中都存在LPXTG基元說明，這些蛋白質是錨定在細胞壁上的，因此這些蛋白質也存在于溶葡萄球菌酶處理的表皮葡萄球菌的細胞壁提取物中。在使用抗-SdrFA抗血清，進行穩定期早期的Western印跡分析中，溶葡萄球菌酶消化的表皮葡萄球菌菌株9491表現出，在完整細胞溶胞物和細胞壁提取物中都存在230kDa的SdrF帶，但在原生質體部分中不存在(圖10A)。相對照的是，在使用抗-SdrGA抗血清對同樣樣品進行的分析中表現出，在溶胞物和原生質體部分中存在著SdrG(170kDa)，但在細胞壁提取物中不存在(圖10B)。在使用含有溶葡萄球菌酶處理的菌株K28的印跡時可以觀察到相似的結果(未顯示)。使用抗-SdrHA抗血清對9491溶葡萄球菌酶部分進行進一步分析，在細胞壁裂解物和原生質體部分中都顯示出免疫活性帶(圖10C)。這些結果說明，在體外條件下，SdrF位于并錨定在細胞壁上，這些結果也說明SdrG(除了其LPXTG基元)和SdrH或者與細胞質膜相連或者位于細胞內部。康復期患者SdrF,SdrG和SdrH的抗血清的反應性目前，從金黃色葡萄球菌感染恢復的患者的IgG顯示與纖連蛋白結合蛋白質(FnbpA)反應，這說明在感染期間金黃色葡萄球菌表達FnbpA(1)。這里，通過ELISA法，使用重組SdrF,SdrG和SdrH區域A蛋白質，測試從不同的表皮葡萄球菌感染中恢復的15名患者的抗血清中提純的IgG的反應性。圖11表示與從混合的兒童抗血清中提純的IgG相比，患者抗血清的IgG具有對SdrFA,SdrGA和SdrHA較高的滴定度。患者的IgG常常對SdrGA和SdrHA比對SdrFA有更大的反應活性。這說明在表皮葡萄球菌感染期間Sdr蛋白質在人類中表達。討論人類表皮葡萄球菌的感染與當引入患者體內時很快被基質蛋白質覆蓋的外源體設備有關(26)。盡管已提出一些機理調節未被覆蓋的聚合物表面的附著作用和生物膜形成，但調節被宿主蛋白質覆蓋的表面的附著作用的具體因素還沒有確定。在表皮葡萄球菌中存在Sdr蛋白質說明，表皮葡萄球菌可以與金黃色葡萄球菌相似的方式結合蛋白質-覆蓋基質設備，即使用ClfA和ClfB調節與被血纖蛋白原覆蓋的整形設備的附著作用(21,31)。在這方面，克隆的表皮葡萄球菌DNA表達的并與SdrG相似的重組蛋白質，已顯示與血纖蛋白原結合(22)。
在不考慮初始附著的情況下，表皮葡萄球菌在致病過程中起到重要的作用。試驗顯示纖連蛋白結合的蛋白質，Fnbp從金黃色葡萄球菌的表面的蛋白酶解產生可溶的活性蛋白質，并切這種酶解作用已建議認為啟動了金黃色葡萄球菌從固-相纖連蛋白的釋放和分發(18)。類似地，在體外培養不存在蛋白酶抑制劑的條件下，天然的SdrF和SdrG經歷快速降解(未公開觀察結果)，這種蛋白酶解過程可提供細菌能從底物分離的機理。
通過溶葡萄球菌酶消化作用釋放的細胞壁錨定蛋白質SdrF部分化，說明其存在于細胞表面。相反，SdrG，其含有LPXTG-與SdrF相似的細胞壁分類基元，發現只存在于原生質體部分中。在細胞壁部分中明顯缺少SdrG可能受到細菌生長時期的影響，或受到蛋白酶在不同生長期期間表達的影響。如，在早期指數期中，在菌株K28的溶胞物中發現沒有或減少的SdrG。此外，在大量生長到晚期穩定期的表皮葡萄球菌中確實在細胞壁提取物中含有SdrG，而其他菌株(包括K28和9491)只含有SdrG可能的降解產物(未公開結果)。有必要進一步研究以細化有關SdrG對細胞壁的錨定和在細胞表面定位的規則。同樣地，也需要對有細胞壁蛋白質屬性但缺少明顯的LPXTG基元的SdrH的進行研究。
如上面所提及，與SdrG相似的蛋白質(稱為Fbe)已確定為能結合血纖蛋白原的表皮葡萄球菌蛋白質(22)。據報道，Fbe有直接與SD重復區域相鄰的區域A，但與其他B相似的結構沒有描述。我們發現Fbe含有兩個區域B重復單元，有99％的氨基酸與SdrG的區域B重復單元相同(未公開結果)。在報道的Fbe序列中，這些重復單元在氨基酸601開始在SD-重復單元開始處終止。Fbe的原始區域A報道在殘基269到599間含有最小的血纖蛋白原結合區域。有關新確定的區域B重復單元，最小的血纖蛋白原結合區域會位于區域A的C-端盡頭。這一點與在C-端含有最小血纖結合區域的ClfA相似(McDeitt,1995)。Fbe和SdrG的區域A在氨基酸序列上有93％相同，預計的最小結合區域有98％相同。
在八種所描述的Sdr蛋白質家族(金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)成員中SdrH是最獨特的，因為它具有趨異推定域組織。在N-端SD-重復區域的位置，新型區域C，和缺少確定的細胞壁相關序列說明這種蛋白質在功能上不同于已知的SdrMSCRAMM。對SdrH的細菌定位和配體結合可能的進一步研究在進行中。
SdrF和SdrG的SD-重復區域代表了八種已知Sdr蛋白質中最長和最短的SD重復區域(分別為558和56個殘基)。盡管SD-重復單元沒有參與血纖蛋白原的結合，但功能ClfA表達的野生型標準發現需要含多于40個殘基的SD重復區域(區域A末端的72個殘基到LPXTG基元)。氨基酸的區域假定跨越細胞壁并產生功能區域A。盡管SdrG含有從區域B重復單元的末端到LPXTG基元的73個殘基，但兩個區域B重復單元也可能影響配體結合區域A的結構和功能。在SdrF中存在極大SD重復區域的用途還不了解。給定SD重復區域與細胞壁間的相互作用，SdrF和SdrG之間SD重復區域長度的不同可能與在這些蛋白質的細胞壁部分中觀察到的定位的不同有關。在SdrH中SD重復單元長度的變化已作了描述。從KH11中獲取的SdrH蛋白質(觀察到最小的SdrH)通過DNA序列分析發現含有64個殘基(未公開結果)。在SdrH中SD重復單元的作用還不了解，但我們推測這個區域，象其他Sdr蛋白質一樣，可能部分地與細胞壁有關。
編碼表皮葡萄球菌的Sdr蛋白質的基因存在于大多數目前測試的臨床分離物中。這些菌株是從不同地理位置的患者中寬范圍的疾病中分離獲得。此外，從各種表皮葡萄球菌感染中恢復的患者在他們的抗血清中含有SdrF-,SdrG-和SdrH-反應性IgG。相似的特性也在報道的金黃色葡萄球菌的五種Sdr蛋白質中觀察到[(8,17)未公開結果]。這些研究說明Sdr蛋白質在表皮葡萄球菌感染性及生長方面是重要的要素。有趣的是，與編碼SD重復區域的DNA同源的位點在S.Haemolyticus,S.Lugdunensis,S.Intermedius和能在人類和其他動物中產生疾病的其他葡萄球菌菌株中也普遍存在(未公開結果)。
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權利要求
1．一種編碼血纖蛋白原結合蛋白質的分離的核酸分子，其中血纖蛋白原結合蛋白質是從凝固酶陰性表皮葡萄球菌中分離出來的。
2．依據權利要求1的分離的核酸，其中蛋白質由圖2中所示的氨基酸序列編碼。
3．依據權利要求1的分離的核酸，包括如圖2中所示的序列。
4．依據權利要求1的分離的核酸，包括與圖2中所示的序列選擇性雜交的序列。
5．權利要求1的分離的核酸在載體中。
6．依據權利要求5的載體，在有生命的生物體中表達分離的核酸。
7．一種編碼與細胞壁相關的，表現依賴-陽離子配體結合的，并含有其中共有序列是TYTFTDYVD的高度保留基元的血纖蛋白原結合蛋白質的分離的核酸分子，其中蛋白質是從凝固酶陰性表皮葡萄球菌中分離出來的。
8．依據權利要求7的分離的核酸，其中蛋白質是由從圖2-4中所示氨基酸序列組中選取的氨基酸序列編碼的。
9．依據權利要求7的分離的核酸，包括從圖2-4中所示核酸序列組中選取的序列。
10．依據權利要求7的分離的核酸，包括與從圖2-4中所示核酸序列組中選取的序列選擇性雜交的序列。
11．權利要求7的分離的核酸在載體中。
12．依據權利要求11的載體，在有生命的生物體中表達分離的核酸。
13．一種分離的，重組的或合成的Sdr蛋白質，其是與細胞壁相關的，與可溶及固定血纖蛋白原結合的，及與血纖蛋白原的α和β鏈都結合的蛋白質。
14．依據權利要求13的蛋白質，其中蛋白質含有包括圖2中所示序列的氨基酸序列。
15．依據權利要求13的蛋白質，其由包括圖2中所示序列的核酸序列編碼。
16．依據權利要求13的蛋白質，其由包括與圖2中所示序列選擇性雜交的序列的核酸序列編碼。
17．依據權利要求13的蛋白質，其在有生命的生物體中從載體表達，其中載體含有包括如圖2中所示序列的核酸序列。
18．一種分離的，重組的或合成的蛋白質，其是與細胞壁相關的，表現依賴-陽離子配體結合的，并含有其中共有序列是TYTFTDYVD的高度保留基元的蛋白質，其中蛋白質是從凝固酶陰性表皮葡萄球菌中分離出來的。
19．依據權利要求18的蛋白質，其中蛋白質含有包括從圖2-4中所示氨基酸序列組中選取的序列的氨基酸序列。
20．依據權利要求1 8的蛋白質，其由包括從圖2-4中所示核酸序列組中選取的序列的核酸序列編碼。
21．依據權利要求18的蛋白質，其由包括與從圖2-4中所示氨基酸序列組中選取的序列選擇性雜交的序列的核酸序列編碼。
22．依據權利要求18的蛋白質，其在有生命的生物體中從載體表達，其中載體含有包括從圖2-4中所示核酸序列組中選取的序列的核酸序列。
23．在藥物可接受的載體中的權利要求13的蛋白質。
24．在藥物可接受的載體中的權利要求18的蛋白質。
25．固定在固相上的權利要求13的蛋白質。
26．固定在固相上的權利要求18的蛋白質。
27．培養的抗Sdr蛋白質的抗體和抗血清，其中蛋白質是與細胞壁相關的，與可溶的和固定的血纖蛋白原都可結合的蛋白質。
28．培養的抗與細胞壁相關的，表現依賴-陽離子配體結合的，并含有其中共有序列是TYTFTDYVD的高度保留基元的蛋白質的抗體和抗血清，其中蛋白質是從凝固酶陰性表皮葡萄球菌中分離出來的。
29．一種包括Sdr蛋白質的診斷試劑盒，其中蛋白質是與細胞壁相關的，與可溶的和固定的血纖蛋白原都可結合的蛋白質。
30．一種包括與細胞壁相關的，表現依賴-陽離子配體結合的，并含有其中共有序列是TYTFTDYVD的高度保留基元的蛋白質的診斷試劑盒，其中蛋白質是從凝固酶陰性表皮葡萄球菌中分離出來的。
31．一種包括和與細胞壁相關的，與可溶的和固定的血纖蛋白原都可結合的蛋白質反應的抗體的診斷試劑盒。
32．一種包括和與細胞壁相關的，表現依賴-陽離子配體結合的，并含有其中共有序列是TYTFTDYVD的高度保留基元的蛋白質反應的抗體的診斷試劑盒，其中蛋白質是從凝固酶陰性表皮葡萄球菌中分離出來的。
33．一種包括編碼與細胞壁相關的，與可溶的和固定的血纖蛋白原都可結合的蛋白質的核酸的診斷試劑盒。
34．一種包括編碼與細胞壁相關的，表現依賴-陽離子配體結合的，并含有其中共有序列是TYTFTDYVD的高度保留基元的蛋白質的核酸的診斷試劑盒，其中蛋白質是從凝固酶陰性表皮葡萄球菌中分離出來的。
35．一種在患者中治療凝固酶陰性葡萄球菌感染的方法，包括給患者服用充分量的含有從SdrF,SdrG，和SdrH，以及它們的抑制血纖蛋白原結合的片段中選取的蛋白質的藥物組合物。
36．依據權利要求35的方法，其中的感染是敗血癥，骨髓炎或心內膜炎。
37．一種在患者中抑制凝固酶陰性葡萄球菌感染的方法，包括給患者服用充分量的含有從SdrF,SdrG，和SdrH，以及它們的抑制凝固酶陰性葡萄球菌與血纖蛋白原結合的片段中選取的蛋白質的藥物組合物。
38．一種在患者中抑制凝固酶陰性葡萄球菌素感染的方法，包括給患者服用充分量的含有從SdrF,SdrG，和SdrH，以及它們的抑制凝固酶陰性葡萄球菌與血纖蛋白原結合的片段中選取的蛋白質的藥物組合物。
39．一種減少留置醫療設備的凝固酶陰性葡萄球菌感染的方法，包括用含有從SdrF,SdrG，和SdrH，以及它們的片段中選取的蛋白質的藥物組合物涂覆醫療設備。
40．依據權利要求39的方法，其中醫療設備從脈管移植體，脈管擴張器，靜脈內導管，人造心臟瓣膜和助心設備中選取。
41．一種誘導免疫反應的方法，包括給患者服用含有從SdrF,SdrG，和SdrH，以及它們的片段，亞域和核酸分子中選取的蛋白質的藥物組合物。
42．一種鑒別抑制凝固酶陰性葡萄球菌化合物的方法，包括將化合物與含有從SdrF,SdrG，和SdrH蛋白質組中選取的蛋白質混合，測定蛋白質與結合分子的結合，其中如果與結合分子的結合被抑制那么化合物就抑制凝固酶陰性葡萄球菌。
全文摘要
提供了用來預防及治療由凝固酶陰性葡萄球菌如表皮葡萄球菌(S.epidermidis)引起的感染的分離的蛋白質，稱為SdrF,SdrG，和SdrH，以及它們相應的氨基酸和核酸序列。SdrF,SdrG，和SdrH蛋白質是與細胞壁相關的特異結合宿主蛋白質的蛋白質，每種含有其共有序列為TYTFTDYVD的高度保留基元。蛋白質，其抗原部分，和抗－SdrF，－SdrG，和－SdrH抗體也可用來鑒別和診斷凝固酶陰性葡萄球菌感染。具體地，由于蛋白質可用作疫苗組分或其抗體，所有它們是有價值的，它們可以給傷口服用或用來涂覆生物物質以作為阻斷試劑，預防或抑制凝固酶陰性葡萄球菌與傷口或生物物質的結合。
文檔編號A61P31/04GK1317043SQ99810487
公開日2001年10月10日 申請日期1999年8月31日 優先權日1998年8月31日
發明者蒂莫西·J·福斯特, 瑪紐斯·胡克, 斯塔西·戴維斯, 奧拉·哈特福德, 柯克·麥克伊, 迪艾爾·尼艾德欣 申請人:都柏林伊麗莎白女皇神學院, 得克薩斯藝術與音樂大學