一種荷載藥物及脂肪來源間充質干細胞的多肽水凝膠支架及其制備方法
【技術領域】：
[0001] 本發明涉及一種多肽水凝膠支架，尤其涉及一種荷載藥物及脂肪來源間充質干細 胞的多肽水凝膠支架及其制備方法。
【背景技術】：
[0002] 與2D單層細胞培養相比，3D培養模型能更好地模仿天然組織中細胞的微環境，因 此該技術在研宄疾病進展及細胞對藥物反應中更有價值。在眾多材料中，以多肽為基本組 成單元，依靠多肽分子天然自組裝得到的新穎支架材料具有納米級纖維組成、簡單的氨基 酸成分和充分的含水量，更接近天然細胞外基質，可為細胞提供理想的三維環境，同時多肽 作為一種生物物質，具有生物利用度高，毒性小和特異靶向等良好的生理功能越來越受到 藥物創新研宄者的青睞。近年來，隨著多肽化學的快速發展，多肽作為釋藥載體的功能應用 逐漸成為了新藥研制的熱點之一。但目前還沒有利用多肽水凝膠支架同時荷載脂肪來源間 充質干細胞及抗癌藥物他莫昔芬的研宄。
【發明內容】
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[0003] 本發明的目的是提供一種荷載藥物及脂肪來源間充質干細胞的多肽水凝膠支架 及其制備方法。
[0004] 本發明的荷載藥物及脂肪來源間充質干細胞的多肽水凝膠支架，其制備方法包括 以下步驟：
[0005] (1)、用超純水配置濃度為1. 836 X KT5M~2. 651 X KT5M的枸櫞酸他莫昔芬溶液；
[0006] (2)、在培養板中形成含有1.836 X KT5M~2. 651 X KT5M枸櫞酸他莫昔芬的1 %多 肽水凝膠；
[0007] (3)、含有1.836X KT5M~2. 651 X KT5M的枸櫞酸他莫昔芬溶液換洗步驟（2)中多 肽水凝膠中的溶液至PH為7. 0 ;
[0008] (4)、取人脂肪來源間充質干細胞加入培養板中，培養后即得到荷載藥物及脂肪來 源間充質干細胞的多肽水凝膠支架。
[0009] 所述的培養板，優選為24孔培養板。
[0010] 步驟⑵所述的形成含有1. 836 X KT5M~2. 651 X KT5M枸櫞酸他莫昔芬的多肽水 凝膠，優選按照 Sigma Aldrich HydroMatrix? Peptide Cell Culture Scaffold說明書的 步驟形成多肽水凝膠。
[0011] 步驟（4)所述的取人脂肪來源間充質干細胞加入培養板中，優選，1.0 X IO5個/ml 每孔加入500 μ 1。
[0012] 步驟⑷所述的培養，優選在37°C，5% CO2孵箱中培養3d。
[0013] 本發明的荷載藥物及脂肪來源間充質干細胞的多肽水凝膠支架，既含有抗癌藥物 枸櫞酸他莫昔芬又含有人脂肪來源間充質干細胞，能作為種子細胞載體的同時對抗腫瘤藥 物他莫昔芬起到緩釋作用，可用于構建活體組織，填補目前多肽水凝膠培養支架同時荷載 藥物-細胞的技術空白，構建能具有治療效果與組織再生功能的3D培養支架。
【附圖說明】：
[0014] 圖1是不同濃度TAM對MCF-7和ADSCs的抑制率趨勢圖；
[0015] 圖2是水凝膠外觀（1 % w/v)。
【具體實施方式】：
[0016] 以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0017] 實施例1 :
[0018] 荷載藥物及脂肪來源間充質干細胞的多肽水凝膠支架的制備：
[0019] (1)、用超純水配置濃度為1. 836 X KT5M~2. 651 X KT5M的枸櫞酸他莫昔芬溶液；
[0020] (2)、按照 Sigma Aldrich HydroMatrix? Peptide Cell Culture Scaffold 使用 說明書在24孔培養板中形成含有I. 836X KT5M~2. 651 X KT5M枸櫞酸他莫昔芬的I %多 肽水凝膠；
[0021] 步驟如下：
[0022] 在水凝膠表面鋪展細胞
[0023] 1、用蒸餾水將濃度為1% (w/v)儲備液稀釋至所需濃度，所得的工作液在使用前 要在冰上放置；
[0024] 2、將工作液加入到培養孔中，工作液的推薦體積詳如表1所示，沿著孔壁加入1-2 倍體積的培養基使凝膠開始形成；
[0025] 表1.工作液的推薦體積
[0026]
[0027] 3、將加入工作液的培養板置于37°C環境中孵育1小時使凝膠形成，然后1-2小時 內小心地換液2次并讓其在這段時間內保持37°C孵育，孵育后8小時內需使用；
[0028] 4、在水凝膠頂部加入所需數量細胞的培養基混懸液。
[0029] (3)、含有1.836X KT5M~2. 651 X KT5M的枸櫞酸他莫昔芬溶液換洗步驟（2)中多 肽水凝膠中的溶液至PH為7. 0 ;
[0030] (4)、取人脂肪來源間充質干細胞以1.0 X IO5個/ml每孔加入500 μ 1，培養3d后 即得到荷載藥物及脂肪來源間充質干細胞的多肽水凝膠支架。
[0031] 應用試驗數據：
[0032] -、篩選藥物濃度
[0033] 1、乳腺癌細胞（MCF-7)與不同濃度他莫昔芬（TAM)溶液平面培養3day
[0034] 表2.不同濃度TAM溶液對MCF-7活力的影響
[0040] 3、不同濃度TAM對MCF-7和ADSCs的抑制率如圖1所示。當TAM濃度大于5 μ mol/ L時，其對于MCF-7活力的影響開始有顯著性抑制，而當TAM濃度大于25 μ mol/L時，其對 ADSCs的活力影響才有顯著性抑制。由此我們推論在TAM濃度為25 μ mol/L~50 μ mol/L 時，可以控制TAM對ADSC活力影響的同時能有效地抑制MCF-7的活力。
[0041] 4、計算半數致死量最后確定藥物濃度
[0042] IC50(MCF-7) = 18. 36 ymol/L
[0043] IC50(ADSC) = 26. 51 ymol/L
[0044] 二、自組裝多肽支架基本數據及表征：
[0045] 1、水凝膠多肽支架的基本數據：
[0046] 供應商：Sigma Aldrich，外觀（顏色）：白色
[0047] 分子量：1526. 47g/mol，外觀（形態）：固體
[0048] 純度（HPLC) :94%
[0049] 2、水凝膠支架的表征：
[0050] 含水率：
[0051] WR(% ) = (mw-md)/md mw(干燥前重量）=0· 4964g
[0052] md(干燥后重量）=0· 02476g WR(% ) = 95. 01%
[0053] 三、平面培養與載藥支架培養條件下對MCF-7活力影響的比較：（培養5day，ΤΑΜ 濃度均為25ymol/L)
[0054] 表4.載藥支架培養條件下對MCF-7的抑制率
[0059] 抑制率= 80. 24%
[0060] 載藥支架培養條件下對MCF-7抑制率（81. 92% )高于平面培養條件下對MCF-7 的抑制率（80. 24% )，我們可以推論，3D培養環境有利于藥物與細胞的相互作用，在此前提 下，植入支架所用藥量可根據實際情況進行減量，可在不影響正常藥效的前提下，減少藥量 有利于其他正常細胞的生長。
[0061] 四、平面培養與載藥支架培養條件下對ADSCs活力影響的比較：（培養5day，TAM 濃度均為25ymol/L)
[0062] 表6 :載藥支架對ADSCs的抑制率
[0067] 抑制率= 44. 86%
[0068] 結論：載藥支架培養條件下對ASCs抑制率（25.40%)低于平面培養條件下對 ASCs的抑制率（44. 86% )，推測，ASCs在3D培養條件下，藥物對其的不利影響顯著少于3D 培養環境對其的有利影響。
[0069] 綜上，我們可以推斷，3D載藥培養支架在有效抑制MCF-7活力的同時，對ADSCs的 影響是有限的，可以抑制乳腺癌的增殖速度的同時，維持植入支架中的種子細胞ADSCs的 正常增殖，該支架在用于構建治療性活體組織方面具有可行性。
【主權項】
1. 一種荷載藥物及脂肪來源間充質干細胞的多肽水凝膠支架，其特征在于，是通過以 下方法制備的： (1) 、用超純水配置濃度為1. 836 X KT5M~2. 651 X KT5M的枸櫞酸他莫昔芬溶液； (2) 、在培養板中形成含有1. 836 X KT5M~2. 651 X KT5M枸櫞酸他莫昔芬的1 %多肽水 凝膠； (3)、含有1. 836 X KT5M~2. 651 X KT5M的枸櫞酸他莫昔芬溶液換洗步驟⑵中多肽水 凝膠中的溶液至PH為7.0 ; (4) 、取人脂肪來源間充質干細胞加入培養板，培養后即得到荷載藥物及脂肪來源間充 質干細胞的多肽水凝膠支架。2. 根據權利要求1所述的荷載藥物及脂肪來源間充質干細胞的多肽水凝膠支架，其特 征在于，所述的培養板為24孔培養板。3. 根據權利要求1所述的荷載藥物及脂肪來源間充質干細胞的多肽水凝膠支架，其特 征在于，步驟（2)所述的形成含有1. 836 X KT5M~2. 651 X KT5M枸櫞酸他莫昔芬的多肽水 凝膠，按照 Sigma Aldrich HydroMatrix?Peptide Cell Culture Scaffold 說明書的步驟 形成多肽水凝膠。4. 根據權利要求1所述的荷載藥物及脂肪來源間充質干細胞的多肽水凝膠支架，其特 征在于，步驟（4)所述的取人脂肪來源間充質干細胞加入培養板中，具體為=LOXlO 5個/ ml每孔加入500 y 1。5. 根據權利要求1所述的荷載藥物及脂肪來源間充質干細胞的多肽水凝膠支架，其特 征在于，步驟（4)所述的培養，具體為：在37°C，5% CO2孵箱中培養3d。
【專利摘要】本發明公開一種荷載藥物及脂肪來源間充質干細胞的多肽水凝膠支架及其制備方法。(1)用超純水配置濃度為1.836×10-5M～2.651×10-5M的枸櫞酸他莫昔芬溶液；(2)在培養板中形成含有1.836×10-5M～2.651×10-5M枸櫞酸他莫昔芬的多肽水凝膠；(3)含有1.836×10-5M～2.651×10-5M的枸櫞酸他莫昔芬溶液換洗步驟(2)中多肽水凝膠中的溶液至PH為7.0；(4)取人脂肪來源間充質干細胞以1.0×105個/ml每孔加入500μl，培養3d后即得到荷載藥物及脂肪來源間充質干細胞的多肽水凝膠支架。本發明的多肽水凝膠支架，既含有抗癌藥物枸櫞酸他莫昔芬又含有人脂肪來源間充質干細胞，可用于構建活體組織。
【IPC分類】A61L27/54, A61K31/138, A61K47/42, A61P35/00, A61L27/22, A61L27/52, A61L27/38
【公開號】CN104984403
【申請號】CN201510332362
【發明人】徐峰, 伍慧敏
【申請人】南方醫科大學珠江醫院
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年6月16日