抑制移植物抗宿主病的新型PKCθ的小分子抑制劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥領域的一種抑制移植物抗宿主病（GVHD)的新型PKC0的小 分子抑制劑，尤其涉及一種對體細胞抗原受體（TCR)的信號傳遞具有強烈抑制作用的小分 子化合物，用于預防同種異體CAR-T治療過程中所產生的可能致命的GVHD。
【背景技術】
[0002] 嵌合抗原受體T細胞免疫療法（CAR-T療法）代表當今腫瘤免疫細胞治療技術的 最前沿，在急性淋巴細胞白血病的臨床試驗中獲得極大的成功。它的基本原理就是利用病 人自身的T細胞，嵌合抗原受體修飾后，可以特異性地識別腫瘤相關抗原，使效應T細胞的 靶向性、殺傷活性和持久性均較常規應用的免疫細胞高，并可克服腫瘤局部免疫抑制微環 境并打破宿主免疫耐受狀態。CAR-T治療分以下五步：1)從癌癥病人身上分離免疫T細胞。 2)利用基因工程技術給T細胞加入一個能識別腫瘤細胞，并且同時激活T細胞殺死腫瘤細 胞的嵌合抗體（CAR)，使T細胞變成CAR-T細胞。它不再是一個普通的T細胞，它是一個帶 著GPS導航，隨時準備找到癌細胞，并發動自殺性襲擊。3)體外培養，大量擴增CAR-T細。 4)把擴增好的CAR-T細胞輸回病人體內。5)嚴密監護病人，尤其是控制前幾天身體的劇烈 反應。
[0003] 目前的CAR-T療法是一種"個性化"的療法，細胞制品來自于患者自身，無法"現 貨供應"，只能"現做現用"，不僅操作復雜，不可控因素多，關鍵問題在于90%的患者由于自 身T細胞缺陷，尤其是在CAR-T治療前往往接受過化療和免疫抑制劑治療，T細胞數量和質 量達不到CAR-T制備的要求，因而無法接受CAR-T治療。鑒于這一問題，多個中心嘗試開發 通用型CAR-T，即采用正常異體來源的T細胞制備CAR-T，用于腫瘤患者的治療。同種異體 CAR-T治療的主要風險是移植物抗宿主病（GVHD)。鑒于T細胞受體（TCR)及其介導的信號 通路是產生GVHD的關鍵因素，目前普遍采用的技術是通過敲除內源性TCR基因以排除同種 異體TCR導致的GVHD。這種策略顯著拓寬了CAR-T的細胞來源，避免因患者自體T細胞因 數量低、功能不足、擴增能力差等限制應用。第三方細胞來源的CAR-T還具備易于操作、重 復性好等優勢，更有利于大批量臨床應用。但是，通過敲除TCR制備同種異體CAR-T目前遇 到敲除效率低等技術瓶頸，預計在若干年內都不能用于臨床。
[0004] TCR的信號傳遞需要關鍵的蛋白激酶。PKC0是TCR信號的關鍵調節分子，在免疫 學領域被認為是T細胞激活的"突觸"，與CARMA和Bcl-IO-起，通過誘導NF-kB、NF-AT、 AP-I等轉錄因子而介導T細胞活化。研究表明，PKC0缺失的T細胞不產生GVHD，但保留 腫瘤殺傷功能。因此，PKC0抑制劑具有抑制同種異體CAR-T所引起的GVHD而不影響其抗 腫瘤的功能，具有良好的應用價值。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于克服現有技術存在的以上問題，提供一種抑制移植物抗宿主病 的新型PKC0的小分子抑制劑，旨在開發PKC0的小分子抑制劑，抑制TCR的信號傳遞而不 影響T細胞的抗腫瘤功能，從而克服同源異體CAR-T治療過程中所引起的致命的GVHD。
[0006] 為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現： 一種新型PKC0小分子抑制劑，所述的PKC0小分子抑制劑為FL-1507,其分子式為：
[0007] 進一步的，所述的PKC0的特異性小分子抑制劑為FL-1507的衍生物。
[0008] 進一步的，所述的PKC0的特異性小分子抑制劑抑制TCR信號及T細胞活化，用于 制備同種異體CAR-T，避免其產生GVHD。
[0009] 進一步的，所述的PKC0的特異性小分子抑制劑抑制TCR信號及T細胞活化，用于 預防同種異體骨髓抑制所產生的GVHD。
[0010] 本發明的有益效果是： 本發明的PKC0的特異性小分子抑制劑通過抑制PKC0使T細胞上的TCR受體信號轉 導抑制，進而抑制TCR介導的GBHD的產生。所發明的PKC0的特異性小分子抑制劑可抑制 同源異體CAR-T治療所引起的GVHD，促進同源異體CAR-T的推廣和產業化。同時，這類化合 物也可用于預防同種異體骨髓抑制所引起的GVHD。
[0011] 本發明用高通量篩選法從化合物庫中篩選到對TCR信號具有高強度選擇性抑制 作用的小分子化合物，包括其藥學上可接受的鹽和前體藥。該化合物是蛋白激酶Cq亞型 (PKC0 )的選擇性抑制劑，在體外試驗中能抑制CAR-T細胞內TCR的信號傳遞，但不影響 CAR-T的增殖和腫瘤殺傷功能。此類化合物可以有效地抑制同種異體CAR-T治療過程中所 產生的GVHD，促進同種異體CAR-T的臨床應用。
[0012] 上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段， 并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。 本發明的【具體實施方式】由以下實施例及其附圖詳細給出。
【附圖說明】
[0013] 此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本申請的一部分，本發 明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中： 圖1為基于PKC0熒光極化的高通量篩選流程圖。
[0014] 圖2為本發明的FL-1507濃度依賴性地抑制PKC0的活性。PKC0的活性采用放 射性檢測法，所得的IC50值來自于三次實驗的結果(平均值土標準差)。
[0015] 圖3是本發明的FL-1507對T細胞PKC0的抑制作用。元代培養的T細胞與不同濃度 的卩1-1507反應45分鐘后再與？嫩（100 11]\〇反應20分鐘。如8丨6?1131〇丨檢測口-3916-PKC9 和p-S742 -PKC9 的強度。
[0016] 圖4A是PKC0酶活性放射分析法顯示FL-1507對PKC0無顯著抑制作用示意圖。
[0017] 圖4B是PKC0酶活性放射分析法顯示FL-1507對PKC0無顯著抑制作用示意圖。
[0018] 圖4C是PKC0酶活性放射分析法顯示FL-1507對PKC0無顯著抑制作用示意圖。
[0019] 圖4D是PKC0酶活性放射分析法顯示FL-1507對PKC0無顯著抑制作用示意圖。
[0020] 圖4E是PKC0酶活性放射分析法顯示FL-1507對PKC0無顯著抑制作用示意圖。
[0021] 圖5是本發明的FL-1507對TCR信號轉導的抑制作用。原代培養的T細胞經 anti-⑶3/28刺激TCR后引起的RelA和IL-2表達，這一作用被FL-1507抑制。
[0022] 圖6是本發明的FL-1507對GVHD的抑制作用。（A-E)BALB/c小鼠經致死劑量的 放射性同位素照射后接受來自于C57BL/6小鼠的經FL1507或助溶劑處理24小時后的T細 胞（0.5XlO6)。分別在第4天和第14天檢測脾臟細胞與移植T細胞的比值。TN，native T-cells,TE,effectorTcells。 （F)小鼠的生存曲線。
【具體實施方式】
[0023] 下面將參考附圖并結合實施例，來詳細說明本發明。
[0024] 參照圖1至圖3以及圖4A至圖4E所示，鑒于PKC0在TCR的信號轉導以及TCR 介導的GVHD過程中的關鍵作用，我們建立了基于PKC0熒光極化的高通量篩選平臺。通過 對PKC0其它亞型的反向篩選，獲得了PKC0選擇性抑制劑。將所得的化合物經TCR信號 轉導實驗進一步篩選，所獲得的PKC0選擇性抑制劑能顯著抑制TCR介導的GVHD。
[0025] 通過這一系列篩選，我們發現了一系列PKC0的選擇性抑制劑。其中包括 FL-1507。
[0026] 進一步的，所述的PKC0抑制劑為FL-1507的衍生物。
[0027] 優選的，所述FL-1507的衍生物為FL-1508,其分子結構如下：
進一步的，所述的PKC0選擇性抑制劑用于制備預防或治療GVHD的藥物。
[0028] 進一步的，所述的PKC0選擇性抑制劑用于預防同種異體CAR-T所引起的GVHD，也 可用于同種異體骨髓移植所引起的GVHD。
[0029] 實施例I:FL-1507對同種異體T細胞移植所引起的GVHD的抑制作用。我們將 C57BL/6小鼠的T細胞經FL1507或助溶劑處理24小時后（0. 5xlO6)，輸注于經致死劑量的 放射性同位素照射的BALB/c小鼠，并分別于第4天和14天觀察檢測脾臟細胞與移植T細 胞的比值并測定小鼠的生存曲線。結果顯示，經FL-1507處理的T細胞所引起的GVHD顯著 低于對照組。FL-1507組小鼠的生存率也顯著高于對照組，參照圖6所示。
[0030] 同時，參照圖5所示，FL-1507顯著抑制CD3/28激活TCR所引起的轉錄因子RelA 以及細胞因子IL-2表達。因此，通過抑制TCR的信號轉導，FL-1507對異體T細胞移植所致 的GVHD有優良的抑制作用，對于同種異體CAR-T治療以及骨髓抑制具有潛在的應用價值。
[0031] 以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技 術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修 改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種新型PKC0小分子抑制劑，其特征在于：所述的PKC0小分子抑制劑為 FL-1507,其分子式為：2. 根據權利要求1所述的新型PKC0小分子抑制劑，用于抑制同種異體CAR-T治療過 程中所引起的移植物抗宿主病。
【專利摘要】本發明公開了一種新型PKCθ小分子抑制劑，所述的PKCθ小分子抑制劑為FL-1507，其分子式為：本發明的PKCθ的特異性小分子抑制劑通過抑制PKCθ使T細胞上的TCR受體信號轉導抑制，進而抑制TCR介導的GBHD的產生。所發明的PKCθ的特異性小分子抑制劑可抑制同源異體CAR-T治療所引起的GVHD，促進同源異體CAR-T的推廣和產業化。同時，這類化合物也可用于預防同種異體骨髓抑制所引起的GVHD。
【IPC分類】A61K31/5377, A61P37/06
【公開號】CN105078998
【申請號】CN201510471935
【發明人】范國煌
【申請人】范國煌
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月5日