在胃腸道移植物抗宿主病的治療中使用il-22的方法

在胃腸道移植物抗宿主病的治療中使用il-22的方法
【專利摘要】本發明提供了用于使用IL?22來治療如移植物抗宿主病的腸損傷炎性病癥的方法和組合物。具體而言，IL?22可以用來增強腸干細胞（ISC）恢復，并且用于增強同種異體造血移植后的免疫重建。在特別優選的實施方式中，本發明提供了在治療組合物中使用治療性的IL?22，包括二聚體形式的IL?22，所述治療組合物用來治療在造血干細胞移植患者和在患有炎癥性腸道疾病患者中的移植物抗宿主病，包括肝，胸腺，胃腸或其它移植物抗宿主病。
【專利說明】在胃腸道移植物抗宿主病的治療中使用IL-22的方法
[0001]交叉引用相關申請
[0002 ] 本申請請求2013年11月7日提交的美國臨時申請N0.61 /901，151的優先權，該申請的全部內容全部并入本文。
[0003]政府權利聲明
[0004]根據美國國立衛生院授予的授權號K08KHL115355A和P01CA023766，本發明是在美國政府支持下進行的。美國政府對本發明具有一定的權利。
技術領域
[0005]本發明提供了使用IL-22來治療例如移植物抗宿主病的腸道損傷病癥和炎性病癥的方法和組合物。具體而言，IL-22可以用來增強腸干細胞(ISC)的恢復，并且在同種異體造血移植后用于增強免疫重建。在特別優選的實施方式中，本發明提供了在治療組合物中使用治療性IL-22，包括二聚體形式的IL-22來治療在造血干細胞移植患者中和在患有炎癥性腸道疾病的患者中的移植物抗宿主病，包括肝，胸腺，胃腸或其它移植物抗宿主病。
【背景技術】
[0006]在胃腸道移植物抗宿主病(G1-GVHD)中從免疫介導損傷調節宿主組織恢復的機制尚未完全明了。目前降低臨床GVHD的策略具有限制移植后免疫功能和治療的(有利)移植物抗白血病/淋巴瘤(GVL)反應的不良影響。特別值得關注的是在患有移植物抗宿主病(GVHD)期間腸上皮組織的維護和再生，因為GVHD導致腸道細胞病態，其干擾腸道功能。
[0007]GI GVHD是同種異體造血干/祖細胞移植后導致急性GVHD相關死亡的主要因素。
[0008]因此，仍然需要移植后的對策用來在同種異體造血干/祖細胞移植(allo-HCT)后選擇性地促進腸上皮再生以降低GVHD而不限制治療性移植物抗白血病/淋巴瘤(GVL)的響應。
[0009]發明簡述
[0010]本發明是基于以下觀察，在同種異體骨髓移植(BMT)后在體內施用IL-22增強了腸干細胞(ISC)的恢復，減少了來自移植物抗宿主病(GVHD)的腸病態并且改善了移植后的整體存活率而不增強干細胞區位(niche)的功能或改變同種異體反應(al 1reactive)免疫。IL-22從免疫介導病理方面通過加速ISC池的再生增強了 ISCs的恢復。IL-22直接增加了Lgr5+ISCs在體內和體外的增殖。這導致了成熟上皮的加速恢復，而不通過干細胞區位增加生長因子的產生。
[0011]因此，本發明在一個方面涉及一種用于提高腸干細胞(ISC)生長/增殖的方法，該方法包括用外源或重組白介素-22(IL-22)或二聚體、融合蛋白或其綴合物，在一定條件下接觸ISC以促進ISC在體內或體外的生長。在一些實施方式中，ISC是Lgr5+細胞。
[0012]在一個相關的方面，本發明涉及到一種在受試者的胃腸道(GI)的上皮層受到損害后用于促進胃腸上皮細胞的恢復/再生的方法，該方法包括用IL-22或二聚體，融合蛋白(例如Fe融合蛋白)或其綴合物接觸受試者的腸干細胞。對胃腸道的損害可能由于炎癥性腸疾病，(例如炎性腸病，潰瘍性結腸炎，克羅恩病)輻射，腸自身免疫性疾病或移植(GVHD)。
[0013]在另一方面，本發明涉及一種用于治療移植后的受試者中GVHD的方法，該方法包括將治療有效量的IL-22或二聚體，融合蛋白或其綴合物給藥至受試者。該方法并不需要免疫抑制以達到其治療效果。
[0014]在一個方面，本發明涉及一種方法，其中本領域的技術人員一旦觀察到與腸損傷相關的癥狀發作，就開始給藥IL-22。在一個實施方式中，移植后從I天開始至6個月將IL-22給藥到受試者;在一個實施方式中，移植后從I周開始至4個月將IL-22給藥到受試者。
[0015]在另一個方面，本發明涉及在腸上皮細胞的恢復/再生中使用的或在GVHD的治療或預防/抑制中使用的IL-22或二聚體，融合蛋白或其綴合物。
[0016]術語
[0017]為了便于理解本發明，許多術語和短語定義如下:
[0018]本文所用的術語“IL-22多肽”或“IL-22”或“IL22”或“IL-22蛋白質”是指能夠產生本文所述的生物活性的生物活性多肽。本發明的IL-22包括但不限于人IL-22，重組人IL-22，小鼠IL-22和/或重組小鼠IL-22。特定多肽序列在美國專利申請N0.US2003/0100076，美國專利7，226，591和美國專利6，359，117中進行了描述，并且其全文以引證的方式并入本文。IL-22還包括修飾IL-22，例如聚乙二醇化的IL-22和共價修飾IL-22蛋白質。本文所用的IL-22多肽可以從多種來源，例如人類組織類型或從其它來源中分離出來，或通過重組或合成方法進行制備。例如，抗體的制備、純化、獲得、形成的描述，給藥、組合物、疾病的治療等單獨涉及到本發明的每個多肽。此外，在本發明中使用的IL-22可以是重組方法的產物，其中將編碼DNA的IL-22給藥到受試者，例如，乳桿菌表達IL-22。術語“IL-22多肽”還包括IL-22多肽的變體。本發明的IL-22也可以以一種方式進行修改以形成包括彼此融合的IL-22，異源多肽或氨基酸序列的嵌合分子。如本文所用的術語IL-22包括單體形式和二聚體形式的IL-22。然而，除非本文另有規定，在這些方法中使用rIL-22。IL-22也被稱為白介素-10相關的T細胞來源的誘導因子(IL-TIF)。
[0019]本文所用的術語“IL-22單體”是指一個IL-22蛋白質單元。
[0020]本文所用的術語“IL-22二聚體”是指具有多于一個IL-22分子單元的蛋白質，例如，IL-22 二聚體可以具有使用如短多肽，化學鍵和共價鍵的鏈接連接在一起的兩個IL-22分子。在一些實施方式中，IL-22 二聚體包含兩個重復的IL-22分子，在其它實施方式中，IL-22 二聚體由不同的IL-22蛋白質組成。可以發現在本發明中使用的IL-22 二聚體的進一步的示例在美國專利申請20130171100中進行了描述，在此其全文以引證的方式并入本文。一種合適的IL-22 二聚體是含有人白介素22(IL-22)并且在由Generon(上海)集團有限公司生產的無血清培養物中轉化的中國倉鼠卵巢(CH0)細胞中產生的重組IL-22二聚蛋白。例如在美國專利申請20130171100中對IL-22二聚體進行了描述，包括序列信息，美國專利申請20130171100在此通過引用全部并入本文。本文所用的形成多肽的IL-22可以從多種來源例如人組織類型或從其它來源中分離出來，或通過重組和合成方法制備。在一些實施方式中，IL-22二聚體包括載體蛋白，其包括但不限于人lgG(1,2,3，4)的Fe片段或人白蛋白。IL-22可以位于載體蛋白的C末端或N末端。
[0021]在一些實施方式中，以本文所述的任何一個方法使用的IL-22二聚體包括兩個單體單元，其中每個單體單元包括IL-22結構域和二聚化結構域。在一些實施方式中，IL-22 二聚體的每個單體單元包括通過任選的連接序列連接到二聚化結構域的IL-22結構域，例如為約5至約50個氨基酸的連接序列。在一些實施方式中，二聚化結構域包括至少兩個能夠形成分子間二硫鍵的半胱氨酸。在一些實施方式中，二聚化結構域包括至少一部分Fe片段。在一些實施方式中，Fc片段包括CH2和CH3結構域。在一些實施方式中，IL-22二聚體包括兩個單體單元，如美國專利申請20130171100所述，其全文以引證的方式全部并入本文。在一些實施方式中，IL-22 二聚體在經脈內給藥。
[0022]本文所用的術語“移植物抗宿主”或“GVH”是指移植(供體)細胞抗宿主細胞和組織的免疫反應。
[0023]本文所用的術語“移植物抗宿主病”或“GVHD”是指一種狀態，包括急性和慢性，是由于由GVH所產生的移植(移植物)細胞對宿主細胞和組織的影響所帶來的。換言之，在從干細胞發育的移植物或供體免疫細胞內輸入的供體免疫細胞，可能看到患者的(宿主)細胞作為外來細胞并且由于免疫反應對抗它們。作為示例，從他人獲得血液或骨髓移植的患者具有患急性GVHD的風險。甚至是與接受者HLA-匹配的供體可以引起GVHD，因為供體細胞還可以潛在地對受體的次要抗原差異做出免疫反應。急性移植物抗宿主病(GVHD)是一種特別由供體免疫細胞引起的在有同種異體骨髓或血液細胞移植患者中的病癥。常受影響的組織是腸表皮和肝臟。在嚴重的情況下，GVHD可以引起皮膚的起泡或過度腹瀉和消瘦。而且，由供體免疫細胞引起的在肝臟中的炎癥可以導致引起黃疸的阻塞。其它組織例如肺和胸腺也可能受到影響。診斷通常是通過使用顯微鏡查看一小片皮膚，肝，胃或腸以對特定炎性特征進行觀察來證實的。在嚴重的情況下，肝不能正常發揮功能來從體內消除廢物。急性GVHD通常在移植后的前三個月開始。在某些情況下，它能夠堅持，反復或在移植后三個月以上開始。強的松和/或其它免疫抑制藥物用來治療急性移植物抗宿主病。如果用強的松治療不成功，就使用其它免疫抑制藥物，即使很大比例的患者難以用免疫抑制藥物治療并且死亡。
[0024]患有急性GVHD并且存活下來的患者具有更大的風險發展為慢性GVHD。老年患者，接受了外周血(代替骨髓)移植的患者和具有不匹配或不相干供體的患者有更大的風險患有慢性GVHD ο慢性GVHD通常在移植后后期開始，并且比急性GVHD持續更長。患有慢性GVHD的患者可以呈現出各種癥狀。皮疹和/ 口腔潰瘍是本病最常見的初步跡象。不像急性GVHD，慢性GVHD可能導致在眼睛中產生眼淚和在口腔中產生唾液的腺體的損傷，這會導致干眼癥或口腔干燥癥。患者可能患有口腔潰瘍，這會在進食時引起疼痛，皮疹或肝炎。慢性GVHD也可能導致許多其它問題。其中一個問題就是在皮膚(皮膚硬化)和關節中形成疤痕組織。其它這樣的問題就是對肺部中的空氣通道的慢性損傷(閉塞性細支氣管炎綜合征)。強的松或其它類似的抗炎或免疫抑制藥物用于治療慢性移植物抗宿主病。如果用強的松進行治療沒有成功，可以使用其它免疫抑制藥物。正如在急性GVHD中，大部分患者是無法治愈慢性GVHD的。
[0025]如本文所用，術語“移植物抗白血病”或“GVL”或“移植物抗腫瘤作用”或“GVT”是指移植供體T淋巴細胞對接受者的患病骨髓和殘余腫瘤細胞有益的治療性免疫反應。
[0026]本文所用的術語“胃腸移植物抗宿主病”和“G1-GVHD”是指由供體免疫細胞引起的對胃和小腸的宿主組織的損傷，其作為GVHD的一部分可能導致食欲不振，惡心，嘔吐或腹瀉的損傷，無論是急性或慢性的。在嚴重的情況下，G1-GVHD可以導致腹部疼痛和胃或腸出血。
[0027]如本文所用，術語“同種異體移植”是指從供體到宿主患者的供體血液輸注或骨髓干細胞移植。換言之，患者從組織匹配或接近匹配的供體接受骨髓或血液的干細胞，即在主要的HLA基因位點相匹配，其可能是親戚或不是親戚。同卵雙胞胎同種異體移植被稱為同基因移植。
[0028]本文所用的術語“造血干細胞移植”或“HSCT”或“造血細胞移植”或“HTC”是指多能造血細胞的移植，包括干細胞，通常是來自于骨髓，外周血或臍帶血。
[0029]本文所用的術語“同種異體HSCT”是指從一個個體到另一個個體的多能造血干細胞的移植。這種同種異體HSCT是在患有血液或骨髓的某些癌癥患者中進行的，例如多發性骨髓瘤或白血病，先天性免疫缺陷和骨髓衰竭或其他血液疾病。在這些情況下，接受者的免疫系統通常在移移植前被輻射或化療破壞。感染和移植物抗宿主病是HSCT的主要并發癥。
[0030]如本文所用，術語“腸干細胞”和“ISC"是指多能干細胞，諸如Lgr5+細胞。
[0031]在提到腸細胞時，本文所用的術語“祖細胞”是指可能引起小腸或大腸的細胞分化的多能細胞，例如柱狀細胞和杯狀細胞。
[0032]在提到細胞時，本文所用的術語“隱窩基”是指在腸的隱窩區中發現的多能干細胞。
[0033]本文所用的術語“潘式細胞”或“杜夫細胞”是指在小腸和闌尾發現的一種特殊類型的上皮細胞。潘式的細胞或潘式細胞是從腸道干細胞衍生而來。
[0034]在提到腸類器官時，本文所用的術語“類器官”包括從在培養基中培養的上皮干細胞或分離的隱窩中得到的粘附有絨毛狀上皮細胞的中心腔。隱窩是指在上皮細胞基上的腸干/祖細胞區位。
[0035]本文所用的術語“細胞”是指由半滲透細胞膜包圍的核和細胞器組成的生物體的結構單元。它并不旨在限于活的或發揮功能的細胞。
[0036]本文所用的術語“接觸”或“治療”或“施用”化合物到細胞或組織，例如IL-22蛋白質或IL-22蛋白質組合物或細胞因子或細胞因子組合物等，是指將化合物放置在允許其接觸細胞的位置以產生“接觸”或“治療”細胞。所述接觸可以任何合適的方法來完成。例如，在一個實施方式中，接觸是通過將化合物添加至裝有細胞的管來完成的。接觸也可以是通過在微量滴定板中將化合物添加至細胞來完成的。接觸也可以通過將化合物添加至細胞的培養或類器官培養來完成的。它并不意味著限制化合物如何接觸細胞。在一個實施方式中，接觸可以是通過在動物體內施用化合物，例如IL-22分子組合物來完成的。
[0037]本文所用的術語“培養基”和“細胞培養基”是指適合于支持細胞的體外生長(即，細胞培養物)的介質。它并不意味著該術語是限于任何特定的細胞培養基的。例如，意在定義包括生長物以及維持培養基。事實上，意在該術語包括任何適于感興趣的細胞培養物的生長的培養基。
[0038]術語“樣品”例如“測試樣品”以其最廣義使用。在一種意義上它是指包括人細胞或組織的動物細胞或組織。在另一種意義上，它是指包括從任何來源獲得的標本或培養，特別是作為生物樣品。生物樣品可以從動物(包括人)中獲得，并且包括液體，固體，氣體，組織，細胞，血液骨髓和骨骼。
[0039]如本文所用，術語“初級隔離”是指從樣品中直接獲得細胞的過程。因此，細胞初級隔離，例如直接從小鼠或人類分離用于流式細胞分析的細胞的初級隔離涉及從受試者去除組織的方法，例如骨髓樣品或腸樣品等，隨后在例如分散酶的酶中消化。初級隔離可以使用固體或半固體瓊脂培養基或在液體中完成。
[0040]當提到細胞群時，本文所用的術語“部分”(如在“部分腸細胞中”或“部分骨髓細胞中”)是指至少一個細胞，這些細胞高達99%的群。例如，其中接觸導致至少一“部分”的所述細胞群，應該明確的是部分是關于細胞群的。
[0041]本文所用的術語“多肽”或“蛋白質”是指一種氨基酸，氨基酸序列，寡肽，肽或蛋白質或它們的一部分，無論天然存在的還是合成的。
[0042]當提到蛋白質時，本文所用的術語(如“在一部分給定蛋白質中部分”是指該蛋白質的片段。所述片段在大小上可以在從四個氨基酸殘基到整個氨基酸序列減去一個氨基酸的范圍內。
[0043]本文所用的術語“TBI”是指如本文所述的“全身照射”。
[0044]在提到細胞時，本文所用的術語“淋巴”是指這些淋巴譜系，例如T細胞，B細胞和NKT (天然殺傷T)細胞。
[0045]在提到細胞時，本文所用的術語“髓系”是指髓樣細胞譜系的這些細胞，例如巨噬細胞(和單核細胞)，粒細胞(包括嗜中性粒細胞，嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞)。
[0046]本文所用的術語“所改變的功能”是指功能上的改變，或者是增加一種功能或者是減少一種功能，例如在細胞數量上的改變，例如總胸腺細胞，在細胞類型上的改變，例如前B細胞數量的改變，在CD8+細胞數量上的改變，在功能上的改變，例如能夠分泌特定細胞因子或誘導特定細胞類型的存活或成熟的上皮細胞等。
[0047]出于本發明的目的，“增加”或“增加的”或“上調”或“增強”或“顯示增加的功能”或“增加的功能”，或相對于功能的“增強”是指相對于對照或野生型，作用或細胞類型的更高水平，例如增加數量的特定細胞類型，即成熟功能性腸細胞，成熟的功能性T細胞或一定量的化合物。增加的功能可能會增加細胞類型，例如當“潘式細胞產量增加”時或當“淋巴樣細胞產量增加”時等，例如如本文所述用IL-22治療腸細胞增加基底隱窩細胞，潘式細胞等的產量，和當在體內治療骨髓細胞時，骨髓細胞增加的細胞功能增加淋巴樣細胞，例如增加未成熟的B細胞，前B細胞等，髓樣細胞類型例如粒細胞，巨噬細胞等。因此，在GVL期間從骨髓增加成熟功能性淋巴樣細胞的示例增加了(增強)至少一種淋巴細胞類型的數量，例如未成熟的B細胞，前B細胞等。此外，預期增強的或增強免疫功能的示例也可以指增強免疫能力，例如方法，其中用包含促使免疫功能增加的IL-22的組合物治療患有降低的免疫功能的免疫功能不全的患者，例如降低的T-細胞抗原受體譜，降低的細胞因子的分泌，降低的對抗原的增殖反應等。增加的免疫功能可以作為T-細胞抗原受體譜，細胞因子分泌，對抗原的增殖反應，對感染的反應能力等中的任何一項中的增加進行測定。
[0048]出于本發明的目的，“減少”或“減少的”或“降低”或“降低的功能”或“下調”或“具有降低功能”是指相對于對照或野生型，產量的較低水平，使得“細胞具有降低的功能”例如減少的細胞分裂，減少的分化為分化的細胞類型的子代細胞的數量，例如減少的從腸干細胞和腸祖細胞等產生的潘式細胞的數量。降低功能的其它示例可以是細胞因子生產的降低，S卩IL-22在敲除(KO)小鼠相對于IL-22+/+或野生型小鼠。作為其它示例，降低的功能是產生更少數量的成熟功能性胸腺細胞的胸腺上皮細胞，減少的功能是產生降低數量的成熟功能性淋巴樣細胞的骨髓細胞，骨髓來源的干細胞減少了淋巴樣細胞的數量。換言之，降低的功能也可以是改變的功能，例如，改變的骨髓免疫細胞的產生可能顯示出骨髓來源的干細胞具有(或產生)降低的淋巴樣細胞。具有降低的功能并不意味著是靜態結果。在一些實施方式中，接觸或施用本發明的IL-22組合物可能改變功能，例如當IL-22誘導具有降低功能的細胞以顯示增加的功能時，參見實施例。
[0049]本文所用的術語“體外測定”是指任何用于測定細胞或細胞亞型功能或數量的增加或減少的體外測定。對于類器官培養物的體外測定的讀數可以包括例如腸干細胞子代的流式細胞術測量，例如基底隱窩細胞。對于免疫功能的體外測定的讀數可以包括例如T細胞功能測定法，包括細胞因子產量，T細胞亞型，粒細胞，基質細胞，增殖，凋亡的程度等，參見在示例中使用的測定。
[0050]本文所用的術語“受試者”是指任何包括但不限于人類，非人靈長類動物，嚙齒類動物等的動物(例如，哺乳動物)，其成為特定治療的接受者。通常，術語“受試者”和“患者”在本文中可互換使用，特別是相對于“人類受試者”。出于本發明的目的，受試者可以是免疫功能不全的，即不能夠抵抗感染或控制異常細胞生長。免疫功能不全的受試者的示例包括具有以下任一條件的受試者，化療，暴露于輻射，蓄意照射，人免疫缺陷病毒感染，移植等。
[0051]術語“治療(treatment)”，“治療(treating)”等在本文中用來一般性意指獲得所需的藥理學和/或生理學效果。相對于受試者的治療性治療，就完全地或部分地預防疾病或其癥狀而言，其效果可能是預防性的，和/或就部分地或完全地治療疾病和/或歸因于該疾病的不利影響而言，其效果可能是治療性的。因此，“治療”是指治療性治療和預防性或防范性措施，其中目的是防止或減緩(減輕)靶向病態狀況或病癥。需要治療的受試者包括那些已經患有病癥以及那些傾向于患有病癥或那些要防止疾病的受體。
[0052]當參照本發明的方法時，本文所用的術語“治療”涵蓋在哺乳動物特別是人中的疾病的任何治療，并且包括(a)預防疾病在受試者中發生，受試者可以是易患疾病但還尚未診斷為患病的；(b)抑制疾病，即阻止其發展;或(C)減輕疾病，即使疾病消退。本發明針對治療具有醫學病癥的患者，醫學病癥涉及來自與例如輻射，化學療法，免疫抑制等疾病的相關的治療的免疫能力的損傷。因此，本發明的治療將涉及預防，抑制或減輕任何醫學病癥，其中免疫活性的所需水平將通過使用本發明的IL-22化合物來實現。在某些實施方式中，治療是指將受試者暴露于針對治療一種疾病的治療，例如輻射，化學療法等。
[0053]本文所用的術語“施用”或“給藥”是指給予藥物，前藥，藥物組合物或其它藥劑或治療性治療(例如，本發明的組合物)到生理系統(例如，在受試者的體內，體外或離體細胞，組織和器官中)的行為。施用到人體上的可接受是途徑是通過眼睛(眼)，口腔(口)，皮膚(透皮)，鼻(鼻內)，肺(吸入劑)，粘膜(例如，口腔粘膜或頰)，直腸，耳，通過注射(例如，靜脈內，皮下，瘤內，腹膜內等)等。施用“結合”一種或多種其它治療劑包括以任何順序同時(共同)和連續施用。
[0054]在提到組合物時，本文所用的術語“藥物”或“治療的”是指活性劑(例如，以有效量)(例如，IL-22蛋白或IL-DNA)與惰性或活性載體的組合物，這使組合物特別適合用于在體外、體內或離體(體外)診斷或治療。
[0055]本文所公開的多肽或興奮劑或其拮抗劑的“有效量”是其量足以進行一個具體說明的目的。相對于所闡述的目的，“有效量”可以憑經驗并且以常規方式來確定。在使用該藥物組合物時有效量的示例，將本發明的IL-22二聚體的安全且有效的量施用到有需要的哺乳動物(例如人)，在其中給藥劑量是藥學上可接受的有效給藥劑量。作為一個示例，適用于60kg的人的給藥劑量通常是0.01-300mg，在優選實施方式中給藥劑量是0.5-100mg，參見例如美國專利20130171100，其全部內容以引證的方式并入本文。
[0056]本文所用的術語“藥學上可接受的載體”是指任何標準的藥物載體，包括但不限于磷酸鹽緩沖鹽水溶液，水，乳劑(例如，如油/水或水/油乳劑)，和各種類型的潤濕劑，任何和所有溶劑，分散介質，包衣，月桂基硫酸鈉，等滲和吸收延遲劑，崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或淀粉羥基乙酸鈉)等。該組合物還可以包括穩定劑和防腐劑。載體，穩定劑和助劑的示例在本領域中進行了描述(參見例如Mar tin, Remington ’ s Pharmaceutical Sciences , 15thEd.,Mack Publ.C0.,Easton,Pa.(1975)，其全部內容以引證的方式并入本文)。
[0057]本文所用的術語“藥學上可接受的”或“藥理學可接受的”是指當施用到受試者時基本上不產生不良反應(例如，毒性，過敏，或免疫反應)的組合物。本發明的用于施用的IL-22 的形式的示例包括油膏，粉劑，貼片，噴霧劑，和吸入劑。
[0058]本文所用的術語“細胞因子”是指在生物體中作為信號化合物使用的蛋白或糖蛋白。它旨在包括同系物和合成版本。示例包括IL-22，IL-23，IL-21，IL-10家族，IL-7，干擾素(IFN)家族，CC趨化因子，CXC趨化因子等。
[0059]本文所用的術語“生物活性多肽”是指保持所需生物活性的任何多肽，如本文所述的生物IL-22活性物質，例如增加腸干細胞和腸祖細胞分裂，成熟等。
[0060]其中本文中列舉的“氨基酸序列”是指天然存在的蛋白質分子的氨基酸序列，“氨基酸序列”和類似術語，例如“多肽”和“蛋白質”并不意味著將氨基酸序列限制為與列舉的蛋白質分子相關的完整的，天然氨基酸序列。如本文所用術語“重組蛋白”或“重組多肽”是指由重組DNA分子(例如，由含有表達人IL-22基因的質粒或病毒的細胞表達的人IL-22)表達的蛋白分子。
[0061]本文所用的術語“重組DNA分子”是指包含通過分子生物學技術的方式接合在一起(例如，連接到質粒DNA序列或病毒序列的人IL-22基因)的DNA的片段的DNA分子。
[0062]本文所用的術語“核酸分子編碼”，“DNA序列編碼”，和“DNA編碼”是指脫氧核糖核苷酸沿著脫氧核糖核酸的鏈的順序或序列。這些脫氧核糖核苷酸的順序決定氨基酸沿著多肽(蛋白質)鏈的順序。因此DNA序列編碼氨基酸序列。
[0063]術語“基因”是指一種核酸(例如，DNA)序列，其包括產生多肽或前體所需的編碼序列。它意在術語包括通過全長編碼序列以及編碼序列的任何部分編碼的多肽，只要保留全長或片段化多肽所需活性和/或功能特性(例如，IL-22活性，配體結合，酶活性等)。該術語還包括結構基因的編碼區和在5’和3’端位于臨近編碼區在任一端為約IKb的距離的序列，使得基因對應于全長mRNA的長度。位于編碼區5’并且存在于mRNA上的序列被稱為“5’非翻譯序列”。位于編碼區3’并且存在于mRNA上(即，“下游”)的序列被稱為“3’非翻譯序列”。
[0064]術語“基因”包括cDNA和基因的基因組形式。基因克隆的基因組形式包含通過被稱為“內含子”或“插入區域”或“插入序列”的非編碼序列中斷的編碼區。內含子是轉錄為核RNA(hnRNA)的基因的片段；內含子可以包含例如增強子的調控元件。將內含子從核或最初轉錄物除去或“剪接掉”;因此在信使RNA(mRNA)轉錄物中缺乏內含子。在翻譯過程中mRNA發揮功能以指定在新生多妝中的氣基酸的序列或順序。
[0065]本文所用的術語“PCR產物”，“PCR片段”和“擴增產物”是指完成變性，退火和延伸的PCR步驟的兩個或多個循環后化合物的合成混合物。這些術語包括存在一個或多個靶序列的一個或多個片段的擴增的情況。
[0066]本文所用的術語“聚合酶鏈反應”(“PCR” )指的是在美國專利4,683,195,4,683,202和4，965，188中所描述的方法，其全部內容以引證的方式并入本文，其描述了一種用于提高未經克隆或純化的基因組DNA的混合物中的靶序列片段濃度的方法。這個用于擴增靶序列的方法包括引入大大過量的兩種寡聚核苷酸引物到含有所需靶序列的DNA混合物，隨后在DNA聚合酶的存在下熱循環的精確序列。兩個引物與它們各自的雙鏈靶序列的鏈互補。為了影響擴增，將混合物變性，然后引物退火到靶分子內的互補序列。然后退火，用聚合酶延伸引物，以便形成一對新的互補鏈。變性，引物退火和聚合酶延伸的步驟可以多次重復(即，變性，退火，延伸構成一個“循環”；可以有許多次“循環”)以獲得高濃度的所需靶序列的擴增片段。所需靶序列的擴增片段的長度由相對于彼此的引物的相對位置來確定，并且因此，該長度是可控參數。憑借該過程的重復方面，將該方法稱為“聚合酶鏈反應”(下文“PCR”)。因為靶序列的所需擴增片段成為混合物中的主要序列(就濃度而言)，將它們稱為“PCR擴增”。除了基因組DNA，可以用適當的一組引物分子擴增任何寡核苷酸或多核苷酸序列。特別地，通過PCR方法本身產生的擴增片段是它們本身，是隨后的PCR擴增的有效模板。用PCR能夠擴增在基因組DNA中的特定靶序列的單獨拷貝到由本發明的設備和系統可檢測出的水平。
[0067]本文所用的術語“擴增試劑”是指除引物，核酸模板和擴增酶之外的擴增所需的那些試劑(脫氧核糖核苷酸三磷酸，緩沖液等)。通常情況下，擴增試劑與其它反應成分放置在一起并且包含在反應容器(試管，微孔等)中。
[0068]本文所用的術語“反轉錄酶”和“RT-PCR”是指PCR的一種類型，其中起始原料是mRNA。使用逆轉錄酶將起始mRNA酶促轉化為互補DNA或“cDNA”。然后該cDNA用于“PCR”反應的“模板”。
[0069]本文所用的術語“實時聚合酶鏈式反應”或“定量聚合酶鏈反應”或“qPCR”是指測量在用于測定組織樣品中的特定的DNA或RNA序列水平的mRNA的變化。它是基于在PCR產物擴增期間檢測按比例產生的熒光信號的檢測。例如，實時PCR測量mRNA是通過用于使用Perkin Elmer/Applied B1systems Divis1n 7700序列檢測儀測量mRNA的變化的定量RT-PCR的Taqman?方法來完成。
[0070]本文所用的術語“引物”是指寡核苷酸，無論是天然存在的作為純化的限制性消化或合成產生，當該引物處于與核酸鏈互補的引物擴展產物合成被誘導的條件下(即在存在核苷酸和如DNA聚合酶的誘導劑且在合適的溫度和pH的情況下)，其能夠作為合成的起始點。引物優選為用于最大效應的擴增的單鏈，但是可選擇雙鏈。如果是雙鏈，引物在用于制備延長產物之前首先會經過拆鏈處理。優選地，引物是脫氧寡核苷酸。引物應足夠長以在誘導劑存在時引導延長產物的合成。引物的確切長度取決于很多因素包括:溫度、引物來源和使用方法。
[0071]本文所用的術語“樣品模板”是指源于被分析為用于例如腸細胞中產生的IL-22的“革巴”存在的樣品的核酸。與此相反，“背景模板”用來指核酸，而不是可能存在或不存在于樣品中的樣品模板。背景模板是通常是不被注意到的。它可能是攜帶的結果，或者它可以是由于存在尋求純化來遠離樣品的核酸污染。例如，來自類器官的核酸而不是那些待檢測的核酸可能在測試樣品中作為背景存在。【附圖說明】:
[0072]圖1.同種異體BMT/HCT后缺乏宿主衍生的IL-22增加死亡率。Α，Κ0受體，輕微抗原不匹配。Β，Κ0受體，MHC不匹配。C，抗IL-22中和抗體，MHC不匹配。D，K0骨髓，MHC不匹配。Ε，Κ0供體T細胞，MHC不匹配。F，造血KO受體，輕微抗原不匹配且BMT強度減小(3個月后，通過用IL-22K0或WT同系的CD45.1B6骨髓修復WT B6小鼠產生造血嵌合體)。數據為代表性數據(D)或2-4個獨立實驗數據結合。
[0073]圖2.A，WT 或 IL-22K0 受體 LP—B6BMT/HCT 的 GVHD 評分 Jn = 4-5BM 無 T 細胞，且 η =10ΒΜ+Τ小鼠/組hB’Be—BALB/c BMT兩周后小腸和大腸器官培養上清液的ELISA結果。C，B10.BR—B6BMT兩周后固有層細胞的qPCR結果。D，未進行BMT或B6—BALB/C BMT的經亞致死性輻射2周后胸腺ELISA結果。E，同種異體BMT后有或沒有GVHD的血清IL-22 J，B6小鼠腸勻漿的ELISA結果(結合兩次實驗數據hG’Be—BALB/c BMT 2周后，SI固有層中的宿主CD45+⑶3—ROR γ t+細胞，體外經IL-23刺激，代表三個獨立的移植實驗。
[0074]圖3.A，SI隱窩示意圖。B-C，IL_22R染色:括號表示祖細胞，綠色箭頭表示ISC，紅色箭頭或紅色IF表示潘式細胞。B，IL-22R IHCX，用于IL-22R的IF(綠色)，潘式細胞溶菌酶(紅色)和細胞核(藍色)。D-G，LP—B6，BMT/HCT之后3周。D，Lgr5_LacZ受體。Lgr5標記了 CBC/ISC，且β-半乳糖苷酶報道基因通過正常腸隱窩基底染成深色表示(右上)。染色和ISC存活在沒有GVHD的情況下仍然存在(左下)，而染色和干細胞在GVHD過程中明顯丟失(右中)。同時也展示了CBC計數結合的統計結果(左上)οΕ，基于WT或IL-22K0的小鼠中潘式細胞之間的隱窩基底的區位，從組織學上評價13(:<^，在訂或11^-221(0的受體中811'/!1(^ 3周后的組織學細胞凋亡。G，對WT或IL-22K0的受體中ΒΜ+Τ細胞口腔灌胃后的血漿FITC-葡聚糖。FITC-葡聚糖從上皮進入血液表明屏障完整性遭到損壞。*Ρ〈.05，**p〈.01，***ρ〈.001
[0075]圖4.給藥rIL-22降低內臟GVHD病理反應，加強ISC恢復，但是不影響潘式細胞恢復或發揮功能。LP—B6BMT之后3周，從BMT后第7天開始每天給藥rIL-22^，給藥rIL-22后降低了內臟GVHD病理反應。B，給藥rIL-22后皮膚GVHD未觀察到明顯變化。C，給藥rIL-22后降低了隱窩細胞凋亡。D.Lgr5-LacZ受體顯示給藥IL-22后LacZ+隱窩基底ISCs恢復增強。E.潘式細胞在GVHD中有所減少，并且給藥IL-22后并沒有增加。F-G.小腸mRNA的qPCR結果。F.給藥IL-22后潘式細胞衍生的分子表達沒有明顯變化。G.1L-22處理后GVHD中先天抗菌基因增強。所有數據均為代表性數據或至少兩次實驗數據結合，并且每組至少5只小鼠。**p〈.01，***ρ〈.001ο
[0076]圖5.小腸隱窩間接體內培養類器官。隱窩從Β6小腸中分離，使用R-脊椎蛋白I，EGF和頭蛋白在基質膠上培養。A.培養第I天，隱窩腔開始閉合。B.培養24h后隱窩形成球體。C.培養7天后形成有新隱窩芽的類器官。
[0077]圖6.1L-22二聚體增強ISC功能。A.從Lgr5-GFP報道小鼠中分離的SI ISCs對IL-22受體的表達，左側圖表示GFP+細胞的增殖，中間和右側圖表示IL-22R的表達。B.K1-67的增加表明IL-22處理后患有GVHD的報道小鼠中Lgr5-GFP+SI ISCs有所增殖。C.體外類器官的高倍放大顯示其周長蹤跡，用于測量類器官的周長和面積。D-E.與IL-22培養一周后SI類器官尺寸變大。D.代表性圖片。E.與鼠源IL-22培養后的類器官尺寸。F.與F-652人源IL-22二聚體培養后的類器官尺寸。*p〈.05，#p〈.0I，*#p〈.001
[0078]圖7.1L-22和先天淋巴樣細胞增強間接體內培養的腸類器官的生長。a.在IL-22(5ng/ml)存在和不存在情況下ENR培養7天后的SI類器官明場顯微鏡圖片。b，類器官的顯微鏡可見蹤跡以測量周長及計算表面積。c-d，用0-5ng/ml的rmIL-22培養7天后類器官水平面的周長化111)和面積化1112):(3，51;(1兒1;6，11^22增加51(第4天)和1^1(第7天)類器官的新隱窩(肉芽)形成。f_g，在人源IL-22 二聚體F-652存在下培養的SI(f)和LI(g)類器官的尺寸(周長和表面積hh，在SI ILCs(隱窩:ILC比率=1:3)存在或不存在的情況下，使用ENR+/-1L-
2、IL-15、IL-7和IL-23在基質膠上培養的SI類器官的尺寸。數據由至少兩個獨立實驗數據結合或為其中代表性數據。*p〈0.05，#p〈0.0I，*#p〈0.001。
[0079]圖8.GVL模型。A-B.GVL抗A20淋巴瘤。A，WT與IL-22K0供體T細胞。沒有觀察到供體T細胞IL-22影響GVL抗A20淋巴瘤。WT和IL-22K0供體T細胞的受體在A20腫瘤情況下存活率相同。B，WT T細胞和日常IP PBS組與ril-22組。腫瘤生物發光證明給藥IL-22組并沒有干擾GVL抗熒光素酶+A20(A20TGL)<X.潛在可選擇的GVL模型:MLL-相關性白血病。供體T細胞調節GVT抗由MTT-AF9融合構建子的慢病毒轉導產生的AML。HCT與MLL-AF9白血病。圖示為MLL-AF9白血病的B64BALB/c 811'。艦1^為祖^4?9構建子的841^八81的轉導產生，然后轉移至次級受體中進行GVL測試。
[0080]圖9.每日使用rIL-22蛋白的IP給藥。HTC后3周在受體小腸、大腸和肝中觀察到GVHD病情減弱。移植3周后IL-22給藥的LP—B6BMT GVHD組織病理學觀察。p〈.001。
[0081 ]圖10使用rIL-22蛋白治療的受體。HCT后3周，在活性GVHD期間，觀察到Lgr5+ISC數量的增加，未見免疫抑制。移植三周后給藥rIL-22的Lgr5+腸干細胞。p〈.05。
[0082]圖11.使用Rag2-GFP骨髓和WT T細胞進行FVB到BALB/c MHC不匹配移植。HCT后4周，給藥rIL-22蛋白增加了供體骨髓衍生的CD4和CD8+胸腺輸出。移植4周后，給藥rIL-22的骨髓衍生的T細胞。p〈.01。
[0083]圖12.!1(:1'后給藥11^-22。1^486.(六-8)!1(:1'后3周每天給藥111^-221?，沒有1'細胞，81(白色)，BM+T細胞+PBS IP(黑色)，BM+T細胞+IL-22(灰色):A，腸GVHD病理反應評分。B，腸隱窩細胞凋亡評分。C，體外乳酸桿菌培養后IL-22的ELISA結果，左邊欄為乳酸-22&D，調pH(粉色)和不調pH((藍色))情況下表面固定IL-22的乳酸桿菌的IL-22FACS和陰性對照組乳酸桿菌(綠色)C3DjCT后每天乳酸灌胃的存活情況(左)和GVHD評分(右)，沒有T細胞的，BM(黑色，圓圈)，BM+T+PBS(黑色，正方形)，BM+T細胞+乳酸-WT(綠色)，BM+T細胞+乳酸_22s(紅色)，BM+T細胞+乳酸-22a(藍色)*p〈.05，*#ρ〈.001。
[0084]圖13.1L-22給藥降低GVHD病理反應。LP—B6，BMT后3周，IL-22:從第+7天開始，每天4呢。*** =卩〈.001。
[0085]圖14.1L-22給藥降低隱窩細胞凋亡。LP—B6，BMT后3周，IL-22:從第+7天開始，每天4呢。*** =卩〈.001。
[0086]圖15.1L-22給藥增加先天抗菌物質的表達。LP—B6，BMT后3周。
[0087]圖16.1L-22在類器官中激活STAT-3信號并增加ISC再生。a-b，Wnt/i3_連環蛋白軸的Wnt3，f3-連環蛋白，和Axin 2基因(a)與使用O、I或5ng/ml rmIL-22培養的SI類器官中Reg3i3和Reg3 γ先天抗菌物質的mRNA(b)的相對表達的qPCR結果。數據結合3個獨立實驗。C，ENR條件下培養的類器官細胞中磷酸-STAT3 (Y705)的細胞內染色，然后用濃度為20ng/ml的IL-22，脈沖流沖洗20min，用流式細胞儀進行評價。d，隱窩與ENR+/-STAT3抑制劑Stattic培養4天后，SI類器官明場圖像和表面積的測量。e，Lgr5-GFP+細胞中IL-22誘導的磷酸-STAT3(Y705)激活。f-g，在存在或不存在rmIL-22 (lng/ml)情況下，SI中單個Lgr5_GFP+I SCs被培養成類器官。f，IL-22增強類器官出芽(培養第4天)。早期萌芽的代表性照片按升序展示。*表示沒有出芽的早期類器官。▲表示出芽前的極化狀態，丨表示極化部位開始出芽。g，從單一干細胞(培養第13天)開始，IL-22能增加類器官的尺寸。h，IL-22(lng/ml)增加摻入EdU至SI類器官隱窩。111^-22(1-5呢/1111)增加1^的-6??高51 ISCs的數量。j，系列傳代移植表明，與IL-22(lng/ml)培養可以增加類器官數量。c-j數據均為至少兩個獨立實驗數據結合或為其中代表性數據。*p〈0.05; **p〈0.0I; ***p〈0.001。
[0088]圖17.在不大幅改變同種異體反應免疫力的情況下，IL-22可降低腸組織的病理反應。B6受體小鼠只移植了 LP T細胞耗盡的骨髓或LP骨髓和T細胞(H-2b^H-2b)來引起GVHD，每天通過IP注射方式給藥PBS或4ug后3周對腸組織進行組織病理學評價。a，柱狀圖表示GVHD評分和細胞凋亡。b，PBS或IL-22處理的小鼠腸的Η/E染色代表性圖片。箭頭表示腸上皮的凋亡細胞。c，BMT后3周用流式細胞法分析受體的脾細胞，結果顯示有出現供體T細胞亞群頻率，活化標志物⑶25表達和內臟室分子α4β7整合素表達。d，BMT后3周，對受體組織中脾臟和小腸中的炎癥細胞因子的表達進行了分析。e，BMT后3周，給藥IL-22 增加了小腸中 Reg3i3 和 Reg3 YmRNA 的表達 。數據均為兩個獨立實驗數據結合或為其中代表性數據，每組至少9只小鼠。*噸〈0.01 ;***ρ〈0.001。
[0089]圖18.IL-22不依賴于ISC區位，直接增加了體內的Lgr5+ISCs。a-f，LP4B6BMT(H-2b4H-2b)+/-T細胞;BMT后第7天開始，受體每日經PBS或4ug rmIL-22IP處理。數據均為兩個獨立實驗數據結合，每組至少7只小鼠。a，LP—B6BMT，以Lgr5_LacZ報道小鼠為受體。BMT后3周(每天給藥I3BS或rmIL-22兩周后)，對小腸Lgr5+CBC ISCs進行了評估。b，LP—B6BMT，以Lgr5-GFP報道小鼠為受體。BMT后14天(每天給藥PBS或rmIL-22—周后)，用流式細胞法評價GFP+ISCs，用于K1-67的表達。c，BMT后3周，每個小腸隱窩中的溶菌酶陽性潘式細胞的數量。d，BMT后3周患有GVHD的小鼠小腸中WNT3和EGF的相對表達量(qPCR).e，用流式細胞法評價潘式細胞中IL-22R表達和STAT3磷酸化作用。圖示為側向散射所得潘式細胞的入口(gating)和CD24表達情況(左圖)，潘式細胞IL-22R在基線和全體輻照1200cGy5天后的表達量(中間)，經20min的20ng/ml IL-22脈沖流后，類器官衍生的潘式細胞的STAT3磷酸化作用(右圖)。f，BMT后3周，患有GVHD的小鼠小腸R-脊椎蛋白_3mRNA的相對表達量(qPCR)。g，BMT后3周，從患有GVHD的小鼠小腸分離的隱窩中Wnt-激活的基因β-連環蛋白和Axin 2的相對表達量(9?00。11-丨，1^486811'后一周開始，每隔一天對小鼠皮下給藥1^3或100呢/1^ F-652，連續10周。對接受移植的小鼠進行GVHD臨床癥狀(h)和GVHD相關死亡率⑴監測。*ρ〈.05；**ρ〈0.01;***ρ〈0.001 ο
[0090]圖19.F-652給藥降低F0X3P缺失的嚴重程度。白喉毒素(DT)處理(50ug/Kg)F0X3P-DTR小鼠后T-reg缺失導致全身性自身免疫，包括胃腸自身免疫。這打亂了隱窩的體內平衡并對腸干細胞隔室造成了消極影響，這些可從小腸(SI)類器官生長的損壞得到考證。DT處理后8天收集SI隱窩。與單獨DT處理(+PBS)相比，(DT處理后)每隔一天給藥F-625(100ug/KG)可保護ISC隔室遠離T-regablat1n，培養7天后觀察到的類器官數量增加可以證明這點。每個檢測，在四個獨立培養中隨機選擇20個視場進行分析，所得數值取平均值+標準差。與對照樣相比*P〈0.01(單因素方差分析)。與DT+F-652相比**p〈0.05(單因素方差分析)。DT:白喉毒素。
[0091]圖20.F652處理提高整體存活率并減少體內GVHD全身性標志。實驗設計:LP—B6MHC匹配的同種異體骨髓移植模型，1100cGy XRT分割劑量，BM+T細胞組用5 X 16TCD BM細胞和4\10%05+1'細胞，然后以10(^8/1^劑量每隔一天皮下給藥?-652或1^3^實驗為MHC匹配同種異體骨髓移植模型，每個治療組10只小鼠，骨髓對照組5只小鼠。這些小鼠在骨髓移植后7天開始給藥F-652或PBS。然后以100yg/kg劑量皮下注射F-652或PBS，每隔一天注射一次，共10周。A:BMT后7天開始治療的實驗組的全身GVHD評分。B:BMT后7天開始治療的實驗組整體存活率。*表示P〈.05<X-D實驗為MHC匹配同種異體骨髓移植模型，每組5只小鼠，每組小鼠僅在全身GVHD癥狀開始發展后(BMT后4周)進行F-652或PBS治療。然后每隔一天對這些小鼠按100yg/kg劑量進行皮下注射F-652或I3BSt3C:小鼠表現出GVHD癥狀后開始治療的實驗組全身GVHD評分。D:小鼠表現出GVHD癥狀后開始治療的實驗組整體存活率。
[0092]發明詳述
[0093]本發明提供了用于IL-22對腸損傷和炎癥的癥狀的治療的方法和組合物，癥狀例如移植物抗宿主疾病。具體地，IL-22可以用于加快同種異體造血移植后腸干細胞(ISC)恢復和增強免疫重建。在特定優選實施例中，本發明提供了使用治療的組合物中的治療的IL-22，包括IL-22 二聚體形式，治療移植物抗宿主疾病的方法，包括例如肝臟、胸腺、胃腸的受影響的細胞或其他移植物抗宿主疾病對造血干細胞移植患者以及患有腸道感染癥狀的患者的影響。
[0094]IL-22被報道用于治療人體疾病，如胰腺病(如第6，551，799，號美國專利，全文以引證的方式并入本文中)和病毒性肝炎，包括促進肝細胞存活和增殖(如申請號為20130171100的美國專利，全文以引證的方式并入本文中)。然而，目前IL-22還沒用于治療人GVHD。實際上，發明人發現用供體T細胞引導IL-22產生來治療GVHD可能引起一些不良反應，如增加皮膚GVHD。
[0095]本發明方法中所用的IL-22不僅可以通過DNA重組技術產生，還可通過融合異種多肽產生。其它方法描述:合成本發明方法所用IL-22的載體和宿主細胞可以從Gething等，Nature，293:620-625 ;Mantei等，Nature ,281:40-46 ;EP117,060和EPl 17，058.中找到。重組IL-22，二聚體和融合蛋白可以用本領域技術人員已知的方法生產。更詳細信息參見申請號為2013/0171100的美國專利，其內容以引證的方式并入本發明中)。
[0096]編碼IL-22 二聚體或融合蛋白的DNA序列可以完全通過人工合成。或者，編碼IL-22的DNA可以通過PCR擴增或合成得到，然后連接起來形成編碼IL-22 二聚體的DNA序列。
[0097]簡要地，合適的宿主細胞與IL-22表達載體用已知方法進行轉化或轉染，然后在本領域技術人員已知條件下促進生長;轉染技術更具體地描述參見，如分子克隆:實驗手冊第三版，J.F.Sambrook和D.W.Russell編，Cold Spring Harbor Laboratory 2001 年出版。
[0098]適合表達IL-22的宿主細胞也為本領域已知，包括無脊椎動物細胞，如昆蟲細胞和哺乳動物細胞。合適的哺乳動物細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)，COS細胞;特別地，SV40-轉化的猴腎CVl細胞株(C0S-7，ATCC CRL 1651);人胚胎腎細胞株293(Graham等 J.Gen Virol.,36:59(1997));CH0/-DHFR(Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,77:4216(1980));鼠科睪丸滋養細胞(TM4, Mather ,B1l.Reprod.，23: 243-251) (1980));人肺細胞(MMT060562,ATCC CCL51);人肝臟細胞(Hep G2，HB 8065);鼠科乳腺癌細胞(MMT 060562,ATCCCCL51)0
[0099]包含核苷酸序列編碼IL-22的核酸可以嵌入可復制的載體中進行基因克隆或蛋白表達。很多用于蛋白質表達的載體都是本領域已知的。利用這些技術，將編碼IL-22的核酸序列嵌入一種合適的載體中，該載體可能進一步包含以下任何物質:一個或多個單獨序列，復制起點，一個或多個報告基因，增強子元件，啟動子，及轉錄終止序列。
[0100]轉染真核細胞和轉化原核細胞的方法均為本領域技術人員已知的，可能包括使用氯化鈣、磷酸鈣沉淀、脂質體或電穿孔。本領域技術人員應當能夠根據所選宿主細胞選擇合適的方法。
[0101]在一個實施方案中，使用了從CHO細胞無血清培養中獲得的包含人IL-22的重組蛋白。
[0102]本發明方法使用的藥物組合物為安全且有效劑量的IL-22或其二聚體，融合蛋白或它們的結合體，以及藥學上可接受的賦形劑或載體。“安全且有效劑量”指的是足以顯著改善有需要的病人的病情而不引起嚴重的副作用的復合物的劑量。一般而言，IL-22藥物組合物為每劑量包含0.001-1，OOOmg的IL-22或其二聚物;在一個實施例中，藥物組合物為每劑量包含0.05-300mg的IL-22或其二聚物;另一個實施例中，藥物組合物為每劑量包含0.5-200mg的IL-22或其二聚物。
[0103]藥學上可接受的賦形劑或載體均為該領域技術人員所熟知的，可能包括纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、醋酸纖維素等)、明膠、滑石、固體潤滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如丙二醇、丙三醇、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑(如，吐溫RTM)、濕潤劑(如十二烷基硫酸鈉)、著色劑、調味劑、穩定劑、抗氧化劑、防腐劑、無熱源水等。
[0104]IL-22、二聚體、融合蛋白或它們結合體常規的給藥方式包括口服、直腸給藥、胃腸外給藥(靜脈注射，肌肉注射或皮下注射)和局部給藥。
[0105]同種異體淋巴細胞產生一種強烈的移植物抗白血病(GVL)效應，但是這種有益的效應受移植物抗宿主疾病限制。T細胞缺失會喪失GVHD和GVL效應。因此，在IL-22敲除的小鼠和輻照的小鼠模型中，IL-22由受體先天淋巴細胞產生并預期同種異體造血細胞移植(allo-HCT)實驗后為上皮細胞的恢復提供信號。這些IL-22缺失的受體顯示GVHD死亡率增高且在GVHD過程中有非常嚴重的隱窩基底腸干細胞(ISCs)丟失。自相矛盾地，在輻照的野生型(WT)受體中，由于抗放射性腸道細胞(ILCs)的消除，GVHD也會導致胃腸(GI)IL-22水平的降低。因此，發明人驚喜地發現，在allo-HCT后，施用IL-22可取消(降低)ILC消除并進一步減少GVHD病理狀況，而不影響移植物抗白血病(GvL)響應。
[0106]使用本發明的IL-22組合物和包括施用外源IL-22的方法的優勢在于細胞在GVHD時的預防保護及疾病的恢復，包括但不限于小腸、大腸和肝細胞。
[0107]1.1L-22對腸上皮細胞生物學和GVHD的貢獻
[0108]A.移植后有GVHD和沒有GVHD情況下，體內上皮細胞的保留情況
[0109]移植后，無GVHD情況下ISC和潘式細胞數量都保留較好，然而在有GVHD情況下，數量都有所減少(圖3D，4E) AVHD中ISC的丟失可能是由于它們區位的丟失所致，或者潘式細胞的丟失可能是由于其親代ISCs丟失所致。在正常的體內平衡情況下，小腸SI絨毛上皮細胞每3-5天更新一次，而潘式細胞存活的時間要長很多，會存活3周或更長時間。在組織損傷及特定移植后，這些動力學都可能被改變。
[0110]1.在無GVHD情況下，上皮細胞從小鼠Lgr5+ISCs恢復。
[0111]測量與ISC和潘式細胞功能相關的分子的GI表達以及上皮恢復的動力學。所用小鼠為與MSKCC的同事合作所得的C57BL/6(B6)背景可誘導的Lgr5-LacZ譜系追蹤報道(reporter)小鼠。經它莫西芬治療后，這些小鼠可在Lgr5+細胞及其后代中表達β-半乳糖苷酶報告分子。在移植當天，對受體小鼠進行它莫西芬治療，可以區分從移植后Lgr5+ISCs中新生的隱窩和絨毛。對小鼠LI和SI中的Lgr5+細胞再生上皮的動力學進行評價，應特別注意SI對潘式細胞恢復的動力學影響。對(a)未經移植而進行亞致死量(550cGy xl)和致死(550cGy x2)，(b)經同系(B6—B6)TCD BMT和(c)經同系T細胞的BMT后5，7和10天的小鼠進行評價，以控制a)條件因素b)細胞移植和c)T細胞轉移對從ISCs新生潘式細胞動力學的影響。除了譜系追蹤外，還要通過定量(q)PCR和免疫印跡法收集腸組織，從而檢測報告ISC基因(1^技、810-1、!10?1、11^6^1^丨81)，與13(:功能相關的潘式細胞基因(￥1^3 36?)的1?熟和蛋白質表達。
[0112]2.有GVHD的小鼠的上皮細胞恢復、I SC丟失和潘式細胞丟失。
[0113]GVHD情況下ISC和潘氏細胞數量減少(圖3D，4E) AMT后，隱窩功能和潘式細胞的恢復會由于GVHD中潘式細胞的丟失而發生改變。可以確定該丟失是由于干細胞功能損傷或免疫介導的干細胞損失所導致。GVHD情況下，ISC和潘式細胞損失動力學評價可以作為鑒別ISCs及其區位損傷的早期證據。對譜系追蹤報道小鼠Lgr5-LacZ中的上皮細胞進行譜系追蹤可以按本文描述的方法進行，然而只能在同種異體移植的設定中進行。可以對LP—B6(H-2b—H-2b)miHA和B10.BR—B6(H-2k—H-2b)MHC移植物不匹配的移植受體在BMT后隱窩、絨毛和潘式細胞恢復情況進行評價，比較TCD BMT受試者(無GVHD)與骨髓和T細胞受試者(有GVHDhBMT后5天，7天和10天再進行譜系追蹤，以評價從Lgr5+ISCs再生上皮的動力學情況。可以再次檢測13(:和潘式細胞相關分子(1^技，811-1，!10?1，11^6^1^丨81，￥1^3 46?)的表達。
[0114]另外，通過對移植前和BMT移植1、3、5、7、10、14天后ISC和潘氏細胞數量的時序研究，可以確定ISC丟失和潘式細胞丟失之間存在時間相關性。這可以通過使用Lgr5-LacZ僅有干細胞的B6報道小鼠完成，其中該小鼠的β-半乳糖苷酶報告分子只在Lgr5+I SCs中結構性地表達而不在小鼠后代中表達。因此，Lgr5+ISCs可以通過報道小鼠的使用來計數，而潘式細胞可以基于H&E染色后其特定的組織學外觀進行計數。可以建立ISC隔室損傷的最早直接證據，從而確定GVHD情況下ISC丟失或潘式細胞丟失發生在另一個之前。
[0115]按照小鼠模型標準，TBI可以作為移植前的條件作用的方法。另外，在接受非清髓性和消融劑量的化學治療后，可以通過評價臨床移植患者ISC隔室的損壞來評價GI上皮的恢復。所提議的研究強調以Lgr5的表達作為ISCs的標志，ISCs的功能主要體現在Lgr5+細胞的體內和間接體內的干細胞功能。還有另一種干細胞表型分析的方法，如⑶44+⑶166+⑶24一細胞評價。潘式細胞構成了 SI中的ISC區位，但是在LI中卻大量缺失，LI中Wnt信號是由區位支撐的kit+細胞提供給ISCs。因此，這里描述了研究方法和預期實驗方法，以評價GVHD情況下，SI中潘式細胞。可以通過ckit+LI區位細胞的組織學評價對LI進行進一步的研究。
[0116]3.體外ISC功能模型中，GVHD造成的隱窩損傷。
[0117]可以通過培養移植后小鼠腸類器官評價BMT后ISCs。使用基因的、表型的和組織學的標記物使得GVHD情況下ISCs減少(圖3D-E)。可以通過干細胞體外形成腸類器官的能力對干細胞進行功能性評價。從大小腸上皮中分離隱窩然后在具有干細胞生長因子(R-spondinl、EGF、小腸noggin ;R_spondinl、EGF、noggin、HGF 和大腸 Wnt3a)的半固體培養基中培養。由于每種隱窩包含一種有ISCs和支持型區位細胞的功能性干細胞隔室，間接體內培養隱窩生長為具有隱窩芽的類器官，包含了具有體內腸道隱窩絨毛結構和中央腔道的腸組織結構(圖6)。另外，作為其ISC能力的有力證據，SI和LI的單一 Lgr5+細胞按照這種方式生長可以長出自身區位細胞，并由單一細胞形成類器官38，39。這里所述的allo-BMTs可以通過分離沒有GVHD (僅TCD骨髓)的移植受體和有GVHD (骨髓+T細胞)的移植受體的SI和LI隱窩進行。通過收集BMT后1、3、5、7、10和14天的隱窩可以評價功能性干細胞/祖細胞區位損傷的動力學。另外，在功能性去除GVHD情況下干細胞區位和特異性ISCs條件下，Lgr5-GFP報道小鼠可以用作移植受體，便于BMT后通過FACS分離單一 I SC，并進行體外培養，來評價GVHD情況下所分離的I SCs的功能。
[0118]4.GVH反應抗干細胞區位的體外系統模型。
[0119]內臟GVHD表現為腸道疾病，而這顯然是涉及T細胞激活和迀移的全身性疾病過程達到巔峰的表現。實際上，同種異體T細胞和移植受體上皮細胞之間出現的直接相互作用是不為所知的。在不將本發明限制在任何特定的T細胞介導的干細胞區位損傷的機制下，為了有效檢驗其中的機制并將其形象化，間接體內培養下可以進行T細胞與GI上皮細胞直接相互作用的體外內臟GVHD模型實驗。在初步研究中，在同種異體T細胞存在下，降低了體外培養的隱窩生長為類器官的能力。
[0120]因此，小鼠SI和LI隱窩在同種異體T細胞存在下可被分離并培養成類器官。隱窩與原始T細胞、多克隆(抗CD3/抗-CD28)預活化的T細胞和隱窩背景小鼠APCs活化的T細胞一起培養。可以評價隱窩生長成類器官的能力。這考慮到了對預活化/抗原呈遞的要求，腸上皮細胞消除自身而直接激活T細胞的能力以及CD4和CD8T細胞功能差異進行辨別。類器官可以在光鏡下計數，測量試直徑和面積。可通過共聚焦顯微鏡得到高分辨三維圖像。除了培養完整的隱窩，上述實驗可以通過培養從Lgr5-GFP報道小鼠中分離的單一ISCs與同種異體T細胞以及測量類器官形成，重復進行。可以通過GFP表達直接反映培養的類器官中的ISC，也可以評價同種異體T細胞和ISCs之間的相互作用來確定同種異體T細胞是否可以直接消除I SCs或對其功能造成損傷。
[0121]可選擇地，基于⑶44+⑶166+⑶24—37表型的單一 ISCs可以通過FACS進行分離。此外，這樣做的另一個好處是，可以培養具有額外背景小鼠的細胞。
[0122]B.評價干細胞在GVHD中的消除
[0123]1.評價BMT之前或之后死亡受體中ISC和區位細胞的表達。
[0124]GVHD中ISCs的缺失可能是由于其區位提供的潘式細胞的缺失，或者潘式細胞的缺失可能是由于其前體ISCs的缺失。可選擇地，可能存在對由同種異體T細胞攻擊ISC和區位細胞介導的ISC隔室的綜合性非特異性損傷。我們假設ISCs和/或潘式細胞將表達在GVHD中其免疫介導消除所涉及的死亡受體。
[0125]在此subaim中，我們可以通過FACS從Lgr5-GFP報道小鼠和表型的這些細胞中隔離鼠科1308和潘式細胞來表達在6￥^中涉及的潛在死亡受體$&8、了即1?、1?^1?、和01?5)。表達可在TCD BMT后、在患有GVHD的小鼠內的基線處進行比較。ISCs和潘式細胞可以通過在ISCs中GFP表達和用于潘式細胞的顆粒狀(側向散射高)CD24+亮表型(參見圖18E)區分。我們也可以通過其MHC I型和II型的表達和其能夠對細胞凋亡提供抗性的分子的表達(BCL-
2、BCL-6和c-FLIP)比較ISCs和潘式細胞。
[0126]2.T細胞的細胞毒性分子在損傷ISC隔室中的功能。
[0127]T細胞的細胞毒性途徑可能涉及GVHD期間ISC隔室的損傷。我們可以測試缺乏以損壞ISCs和其體內和體外區位的細胞毒性途徑的T細胞的能力。SI和LI隱窩可與來自缺乏分泌的或細胞表面死亡受體配體$&^即€[、1?~7、了1^11^)和穿孔素的小鼠同種異體1'細胞培養并如本文所述評估類器官發育的數量和尺寸。然后通過進行帶有缺陷的T細胞的同種異體BMT并組織學評價用于ISC和潘式細胞消除后的BMT在體內評估具有在體外損傷隱窩的損傷能力的T細胞。如果體外同種異體T細胞/隱窩培養體系是不可靠的，那么潛在死亡配體的影響可以在傳統體內GVHD模型中進行測試。
[0128]細胞毒性缺陷T細胞的使用主要需要使用B6小鼠作為同種異體T細胞來源，防止使用用于體內Lgr5表達讀數和用于與缺陷T細胞一起培養的單個ISCs的選擇的B6背景Lgr5報道小鼠。因此，中和抗體可用于阻斷不管是T細胞還是使用的隱窩株的細胞毒性途徑，并可能通過FACS基于CD44+CD166+CD24—37表型和與B6背景缺陷T細胞一起培養隔離ISC。
[0129]3.在BMT后的患者中I SC分子和區位分子的表達
[0130]隱窩細胞凋亡是GIGVHD的標志，而且我們已經觀察到ISCs和潘式細胞在實驗GVHD模型中的缺陷，以及低潘式細胞計數與在患者中增漲的非復發死亡率有關。然而，對臨床GVHD中的ISC和區位細胞隔室的具體的損傷知之甚少。因此，我們可以評價BMT患者內ISC相關分子的表達。
[0131]為了評估臨床GVHD中ISCs和其區位細胞，我們可以評估需要內鏡檢查的患者的胃腸道中ISC相關分子的mRNA和蛋白表達來評價移植后GI癥狀。用于研究目的的活檢標本可以在MSKCC IRB協議下從承受臨床指示GI活檢移植后相關癥狀的患者上得到。對發現患有活檢證明是GI GVHD的患者和那些沒有GVHD的患者之間的樣品進行對比，包括已經接受T⑶移植的患者。組織標本可以被評價以表達如上所述Lgr5、BMI_l、Hopx、mTert、Lrigl、Wnt3和EGF。另外，考慮到我們發現在GVHD實驗中ISCs的IL-23依賴型IL-22介導型的支持，我們也可以評價活檢樣品中IL-22和IL-23的表達。我們還可以對這些樣品進行IHC來識別人隱窩中IL-22R的表達。最后，上述分子的GI表達可以與他們的內鏡檢查當天抽的外周血中的表達對比以評估內臟和全身表達之間的相關性。
[0132]活檢標本也可以通過FACS來評估以識別與上面⑶44、CD166和⑶24染色一起描述的表型識別為ISCs和潘式細胞的IL-22R表達。可替代地，ISCs可以通過原位雜交或用于Lgr5的IF來識別。
[0133]4.對患有GVHD的患者的ISC隔室的功能損傷
[0134]盡管ISC損傷被認為是由于GIGVHD內發現隱窩損傷而發生，且同時存在用于患有GVHD小鼠ISC損失的數據，但是這種類型的損傷沒有在患者中直接證明。我們考慮的是，患有GVHD的患者的可檢測I SCs比未患有GVHD的患者的更少。
[0135]為了評估患有GVHD的人類患者中ISCs的損失，SI和LI隱窩可以從經受臨床指示的用于評估移植后GI癥狀的內鏡檢查和活檢的患者中分離。從患者的活檢標本中分離的隱窩然后可以在體外進行培養以如本文所述用于形成類器官，比較患有或未患有GVHD的患者的類器官子代，以及比較GVHD嚴重性階段。作為替代方案，我們還可以通過進行如上所述的分離ISCs區位細胞的FACS來評估ISCs和區位細胞的損失。此外，來自MSKCC病理學系的正常GI組織因此可以被評價以作為用于對ISC隔室移植相關影響的陰性對照。
[0136]C.治療GVHD的I SC-支持方法
[0137]我們已經確定了IL-22缺乏的小鼠，加劇了GVHD中的ISC損失并在此表明，外源性IL-22給藥增加ISC恢復。因此，IL-22可以在體外組織體上用作ISC生長因子并在患有GVHD的小鼠內用作上皮靶向GVHD治療。
[0138]1.1L-22對體外類器官的影響。
[0139]雖然IL-22在損傷后可以維持上皮完整性，但IL-22對ISC隔室的影響很大程度上是未知的。我們的初步數據表明，IL-22R在I SCs上表達(圖7A)，并且表明對患有GVHD的小鼠給藥IL-22能增加ISCs的恢復(圖4D)。此外，我們觀察到，IL-22的給藥增加了 ISC的體外增殖(圖7B)，而且與l-5ng/ml rmIL-22共培養的SI和LI隱窩比沒有IL-22培養的隱窩生長形成的類器官大(圖7C-F)。
[0140]IL-22對ISC功能的影響可以通過在開始培養零天或兩天0.1-10ng/ml rIL的存在下培養如上所述的分離的隱窩和ISCs來觀察到。IL-22也可以在培養的第零天加入，然后第二天從培養基上除去。可以對類器官尺寸和數量進行評估，并且還可以通過共聚焦顯微鏡高分辨率圖像進行評估。在識別最佳的IL-22的培養條件之后，我們可以培養來自具有IL-22的Lgr5-GFP報道小鼠的類器官，然后可以通過FACS評估JAK/STAT通信、增殖和抗凋亡分子的表達。我們還評估了 IL-22對從移植患者分離的人隱窩的影響。
[0141]為開始評估IL-22在調節ISC隔室中的作用，鼠小腸(SI)隱窩被分離并與EGF、頭蛋白和R-脊椎蛋白-1 (ENR)—起在存在或不存在重組鼠(rm)IL-22的情況下培養。隱窩與rmIL-22—起培養七天導致類器官的生長實質上比那些與ENR單獨培養的大(圖7A)。增加的類器官尺寸最早在培養5天之后變明顯。在三維培養條件下生長的類器官二維周長追蹤允許精確地測量類器官的尺寸(圖7B)。與0.5-5ng/ml rmIL-22—起培養導致SI類器官的生長以濃度依賴性方式增加，這可通過周長和表面積測定(圖7C)。雖然與>5ng/ml的rmIL-22—起培養也導致類器官尺寸的增加，但較高濃度的IL-22導致從培養隱窩生長的類器官數量的減少(數據未顯示)。這種毒性依賴于生長信號的累加效應，隨著R-脊椎蛋白_l、Wnt3和EGF的濃度增加都進一步減小IL-22作為放在培養中隱窩的百分比產生的類器官的植板率。
[0142]除了SI類器官尺寸的增加，與IL-22—起培養導致大腸(LI)類器官周長尺寸和表面積的增加(圖7D)<JSCs位于類器官發育過程中生長的隱窩芽內。IL-22培養導致在SI和LI類器官中隱窩芽的顯著變大(圖7A，E)，表明干細胞隔室再生的結構證據。此外，重組人IL-22 二聚體蛋白能夠增加 SI 和 LI 類器官的尺寸 (圖 7F，G)，表明該化合物的平移潛能。
[0143]組3ILCs是腸道細菌感染期間在腸炎中和在BMT13-16之后的GI IL-22的主要來源。為確定ILCs是否能夠調節ISC隔室并增強類器官的生長，CD45+CDllb-CDllc-B220-CD3-CD90+細胞從腸固有層分類，并在具有新鮮分離SI隱窩的基質膠中培養。ENR為類器官發育提供基本信號，且包括IL-23的細胞因子混合物被包括來激活ILCsdLC激活細胞因子單獨的存在對SI類器官的生長沒有影響。然而，與ILCs共培養導致類器官尺寸的增加(圖7H)，證明ILCs體外調節ISC隔室和上皮再生的潛能。
[0144]我們接下來評價類器官中由IL-22激活的細胞內信號傳導。雖然Wnt/β-連環蛋白信號對ISC維護和體外12類器官功能是必不可少的，但是我們發現在與IL-22—起培養的SI類器官內沒有分子產生以Wnt/β-連環蛋白途徑增加的證據，包括在Wnt3、i3-連環蛋白或Axin 2方面的表達沒有差異(圖16A)。盡管最近發現Slit2和Robol可調節ISC從化療和輻射17誘導的損傷恢復，但是我們還發現與IL-22培養后，它們的表達無明顯差異(未示出)。然而，與rmIL-22—起培養的類器官導致用于Reg3f3和Reg3 γ的mRNA的增加(圖16Β)，表達依賴于STAT3信號的固有抗菌分子。
[0145]雖然已報道STAT3對ISC的維護是重要的，但對ISCs內JAK/STAT信號的了解較少。我們通過光子流(phosflow)評價SI類器官中STAT3信號并發現IL-22導致STAT3Y705的磷酸化(圖16C)。此外，與STAT3抑制劑Stattic—起培養顯著損害SI類器官的生長(圖160)。1^5+ ISC可以在體內和體外生成所有細胞類型的成熟腸上皮細胞。通過流式細胞術檢測從Lgr5-GFP報道小鼠分離的SI隱窩細胞表明GFP+ISCs內STAT3Y705磷酸化響應IL-22的體外刺激(圖16E)，從而證明在Lgr5+細胞內IL-22的通信。
[0146]為確定在ISCs中的IL-22依賴型通信是否在功能上重要，我們通過熒光激活細胞分選分離Lgr5-GFP ISC，并在基質膠中在標準條件+/-1L-22下培養單個ISCs。僅培養4天后，IL-22導致早期類器官的芽顯著變大(圖16F)，最終在IL-22的存在下開始培養單個ISCs之后，導致類器官尺寸增加(圖16G)。因此，IL-22可對單個ISCs起作用以激活STAT3磷酸化并加速類器官的生長。
[0147]因為IL-22導致類器官尺寸增加、隱窩出芽和STAT3活化，所以我們接下來試圖確定這是否導致ISCs的膨脹。我們評估摻入與IL-22—起培養的類器官的5-乙炔基-2’-脫氧尿苷(EDU)，是因為用EdU進行一小時短孵育類器官已顯示標記了快速循環CBC細胞的S-相。IL-22導致類器官EdU摻入的增加，表明類器官隱窩內的增殖增強(圖16H)。此外，培養衍生自具有IL-22的Lgr5-GFP報道小鼠的類器官表明Lgr5_GFP高ISC膨脹以響應IL_22(圖161)。最后，連續傳代證明與IL-22—起培養后可能產生類器官數量的增加，進一步表明功能性的ISC隔室的膨脹(圖16J)。
[0148]從半固體培養基中純化的培養的類器官的FACS可能具有高的染色背景并可能難以解釋。在這種情況下，類器官生長+/_的IL-22可以通過基因表達對增殖和細胞凋亡進行評估。此外，經IL-22處理后，可以進行微陣列來全面評估隱窩基因的表達。
[0149]2.給藥IL-22對體內GVHD的影響
[0150]此處提到的ISC生物學發展成治療方法以改善ISC作為用于GVHD的上皮細胞靶向治療的功能。之前數據表明，由于IL-22-產物ILCs的缺失，IL-22產物在GVHD受到損傷(圖2)，并且當通過給藥rmIL-22重新引入IL-22到患有GVHD的小鼠體內可以降低腸道的GVHD病理及增加ISC的恢復(圖4)。此外，IL-22途徑似乎不顯示為GVL的組件，如給藥rIL-22治療的小鼠中IL-22K0 T細胞以及WT T細胞在抗A20淋巴瘤腫瘤細胞方面表現效果和GVL相當。(圖8A，B)0
[0151]我們獲得了臨床級人類的IL-22 二聚體，F-652(Generon(上海)有限公司)，它可以和老鼠IL-22R進行交叉反應。與重組的IL-22相比使用IL-22 二聚體的潛在的好處包括臨床轉化的應用還有增加的半衰期，如美國專利申請US2003/0100076描述，在此全文以引證的方式并入本文。我們發現，在體外培養中F-652能夠促進器官的生長(圖7F，G)。因此，除了進一步對類器官生長的影響，在體外培養中我們還測試了 IL-22 二聚體在ISC恢復、GVHD病理和生存以及GVL等方面的效果。在一個優選實施例中，IL-22二聚體的使用是考慮具有涉及炎癥性胃腸組織癥狀的治療患者，該炎癥性胃腸組織包括但不限于照射、放射治療、化療、炎癥性腸病、結腸炎、克羅恩病、自身免疫疾病、傳染病和移植物抗宿主病。在另一個優選實施例中，IL-22二聚體的使用是其對手術患者預防性的治療，其包括但不限于輻射照射、化療、組織移植、細胞移植，包括處于涉及胃腸組織炎癥的癥狀風險的患者，這類患者包括但不限于輻射患者、化療患者、傳染病患者、移植患者、自身免疫性疾病患者等。
[0152]Allo-BMT的表現可以如上述Lgr5LacZ報道小鼠作為miHA和MHC不匹配模型的受體一樣。受體可以在移植前和/或移植后通過F-652人的IL-22 二聚體移植治療，然后骨髓移植后三周將小鼠處死評價GVHD病理和ISC恢復。Allo-BMT WT受體可以用于并評估經F-652治療后GVHD的生存差異，而且我們可以移植患有血液惡性腫瘤的小鼠(如圖8)來評價經F-652治療后的GVL的療效。在免疫抑制劑存在的情況下給藥IL-22可能對提高ISC的功能最有效，我們也會評價F-652與靶向抗IL-23中和抗體一起給藥的結合。描述了 IL-23刺激同種異體T細胞介導GVHD的作用以及將IL-23阻擋在GVHD的潛在優勢。然而，抗IL-23中和抗體是防止T細胞引起GVHD，我們將限制內源性IL-22的表達產物。因此，這種組合的方法可以起到限制T細胞通過阻擋IL-23介導GVHD同時也會增加由于GVHD和IL-23中和而失去的IL-22來促進ISC功能。雖然IL-23中和反應是GVHD的潛在的治療方式，但它不是治療GVHD的現行標準。
[0153]初步數據表明，IL-22可能通過直接刺激ISC增殖來減少GVHD，而不是通過靶向ISC支持潘式細胞來間接支持ISC(圖4，7)。這些發現并不限制本發明為任何具體機制。因此，另一種方法是如已在結腸炎的實驗模型描述的通過將分離的I SC或完整隱窩轉移到患有GVHD的小鼠中來測試新的干細胞。
[0154]最近描述了患有GVHD的小鼠中減少的ISC和區位細胞形成的潘式細胞數量。IL-22治療后給出了穩定的同種異體免疫，我們下一步直接評價了 IL-22對ISC隔室的影響。我們利用Lgr5-LacZ受體進行了 LP—B6同種異體BMT以識別移植治療后的ISC AMT三周后，帶有T細胞的BMT導致GVHD而且導致Lgr5+SI ISC損傷嚴重(圖18a)。然而，rmIL-22的日常治療導致LGR5+ISC恢復增加甚至伴隨不間斷的同種異體免疫反應而沒有免疫抑制(圖18A)。
[0155]為了了解IL-22如何導致患有GVHD的小鼠中ISCs的增加，我們用LP骨髓和T細胞移植了B6Lgr5-GFP報道小鼠。受體每天經rmIL-22或者I3BS IP處理七天，然后分離SI隱窩并且通過流式細胞術在BMT后14天評價。與我們的體外發現的結果一致，促進細胞器的增長和EdU的摻入，rmIL-22體內治療后Lgr5-GFP+細胞表達增加了 K1-67，這表明該治療方法增強了 ISC隔室的增殖(圖18B)。
[0156]潘式細胞通過向CBC干細胞傳遞Wnt和EGF信號為Lgr5+ISCs提供了良好的微環境。此外，IL-22被認為可以調節潘式細胞和天然抗菌分子的產物。因此，我們假定IL-22給藥可以通過提高干細胞區位和增強潘式細胞介導的ISC支持來支持BMT后ISC的恢復。與臨床GVHD和MHC不匹配的實驗模型研究相一致，LP—B6最小抗原錯配BMT導致移植三周后潘式細胞減少(圖18C)。然而，盡管組織病理學減少(圖17A)，BMT后的rmIL-22給藥沒有促進潘式細胞的恢復(圖18C)。此外，我們發現對于潘式細胞的傳遞分子Wnt3和EGF在SI mRNA中并沒有增加，而已知Wnt3和EGF是支持Lgr5+ISCs的(圖18D)。我們還發現在基線或輻射損傷后IL-22R在潘式細胞中表達的極少證據，而在其他情況下他們還可以對IL-22作出反應，在體內實驗中潘式細胞響應IL-22時沒有表現出STAT3磷酸化作用(圖18E)。
[0157]盡管IL-22沒有提高潘式細胞的區位-支撐能力，但是IL-22在體內仍然可以間接通過增加基質介導的干細胞來促進I SC增殖。最近表明，即使在缺失潘式細胞衍生物Wnts33的情況下，基質細胞可以有助于維持ISC區位，通過Wnts和R-脊椎蛋白-3支持體內正常腸道平衡。但是，體內實驗中經IL-22治療后，我們沒有發現區位衍生的Wnt信號增加的證據(圖18F、G)，這表明免疫介導損傷后IL-22可以誘導ISC的增值，而不通過潘式細胞和基質衍生的干細胞區位作用。
[0158]最后，明確給出了體內實驗中IL-22在促進ISC再生和上皮細胞恢復方面的效果，我們評估了 IL-22給藥在全身性GVHD中的影響。已經有人提出了GI損傷是主要的全身性GVHD發病機制。與最近的一篇關于IL-22被用在移植手術中的報道一致，我們發現F-652給藥到MHC未匹配BMT的受體后GVHD死亡率并沒有改善(未示出)。但是，我們發現MHC匹配的同種異體BMT后一周，F-652早期干預的模型可以減少GVHD的全身癥狀而且可以顯著提高總存活數(圖18H，I)。
[0159]I1.1L-22+乳酸桿菌作為新型的預防和治療臨床GVHD的靶向治療方法。
[0160]作為IL-22的藥物介入的替代方法，如外源性IL-22，我們開發了乳酸菌的益生菌的策略，可以不間斷的產生IL-22，如下面和實驗部分所示。因此，在一個實施例中，外源IL-22 用于和益生菌結合的治療方法。在另一個實施例中 ，給予患者外源性 IL-22 和益生菌。在初步研究中，對BMT后的小鼠施用本發明的益生菌可以減少全身性GVHD。
[0161]因此，IL-22+乳酸桿菌被設想作為一種新型的靶向治療方法用于預防臨床GVHD和移植相關的組織損傷，而不限制基本的供體免疫功能。施用乳酸桿菌可以降低實驗性的GVHD。而且，副干酪乳桿菌(Lactobaci I Ius paracasei)是人體胃腸道菌群的正常組成部分。因此，發明人考慮使用工程副干酪乳桿菌傳遞外源性IL-22治療劑量以提供額外的治療效益。事實上，結合初步實驗結果，接下來A部分介紹制備和使用IL-22表達細菌顯示內源性IL-22產生的減少。在B部分詳細介紹了 IL-22+乳酸桿菌(包括成熟的實驗)的制備和使用的材料和方法。
[0162]A.HCT降低內源性IL-22在小鼠體內的表達
[0163]HCT的IL-22-/-K0受體證實輕微(圖1A)和較多(圖1B)抗原不匹配的HCT后增加死亡率，如同經抗IL-22中和抗體全身性處理的野生型(WT)受體(圖1C)。移植到IL-22K0受體導致GI和肝GVHD的組織病理學證據的增加(圖2A)。因此，宿主來源的IL-22會影響死亡率和移植后GVHD的病理狀態。
[0164]IL-22的表達是同種異體HCT后在胃腸道(圖2B)和血清(圖2E)內發現的。但是，IL-22的水平在GVHD中是降低的(圖2B、E)。腸的IL-23在HCT后也的得到了表達，IL-23為IL-22表達的樹突狀細胞衍生的調節子。IL-22產物CD45+CD3—RORyt+ILC是在T細胞耗盡(TCD)HCT后在固有層檢測出來的(圖2G)。這些ILC是宿主衍生物IL-7R+CCR6+NKp46—淋巴組織誘導物類細胞。盡管其抗輻射性，在GVHD期間IL-22生產ILC被迅速消除(圖2G)。因此，來自宿主的IL-22可以降低GVHD的死亡率，但是由于宿主ILC的消除IL-22對損傷的反應在GVHD中得到了抑制。
[0165]盡管宿主IL-22缺乏增加GVHD(圖1A-C和2A)，在IL-22K0受體中供體淋巴細胞腸滲透或細胞因子的分泌中并沒有觀察到明顯的差別，這表明在GVHD的降低發生并不受同種異體反應供體的免疫調控的影響。通過熒光激活細胞分選(FACS)測試腸IL-22R的表達，發現HCT后GI上皮細胞上IL-22R的增加。
[0166]免疫組化(IHC)和免疫熒光(IF)表明IL-22R在腸隱窩表達，ISC區位存在于腸隱窩(圖3A-C)。同種異體HCT移植到Lgr5LacZ報道小鼠，然后Lgr5下游產生β-半乳糖苷酶來鑒別ISC。作為ISC功能的證據，單個LGR5+隱窩基底柱狀細胞(CBC)能夠在體外和體內生成整個隱窩結構。在GVHD中觀察到了 I SC的急劇減少(圖3D)。此外，在非報道WT小鼠中通過IHC評價I SC區位，證實了在GVHD中CBC/1 SC損失(圖3Ε)。引人注目的是，在GVHD中，I L_2 2Κ0受體證明了 CBC/I SC的最大損失(圖3Ε)以及隱窩上皮細胞凋亡的增加(圖3F)，這表明IL-22保護I SC和祖細胞。最后，患有GVHD的IL-22K0小鼠證明降低IL-22調節的抗菌分子Reg3ya和Reg3f3的GI表達，還能增加口服后血清非吸收性碳水化合物FITC-葡聚糖易位(圖3G)，這表明增加了上皮屏障的損傷。
[0167]因此，GI損傷導致IL-23感應。IL-23反過來又可以通過ILC刺激IL-22的產生。這種內源IL-22保護上皮細胞和干/祖細胞而不受炎性組織損傷。然而，在GVHD中IL-22-產生ILC喪失了限制組織損傷的必要性。如本文所示，HCT后腹腔注射IL-22(例如，4ug/小鼠每日)扭轉ILC枯竭效應和在腸道中IL-22在GHVD病理學中的損失并減少在ISC/祖細胞室位于的腸隱窩中細胞凋亡(圖12A-B)。但是，對于臨床使用全身細胞因子給藥是昂貴的，并可能會有不可預期的全身反應。因此，發明人制備了兩株連續生產IL-22的副干酪乳桿菌(圖12C-D)。一株產生可分泌的IL_22(乳酸-22s)而另一株產生IL-22固定在細菌細胞表面(乳酸-22a)。
[0168]B.1L22+乳酸桿菌治療GVHD
[0169]如本文所述，發現這種IL-22缺乏可以導致GVHD的增加(圖1到3)，IL-22介導使GVHD減小(圖12)，!1(:1'后11^-22-依賴型誘導抗菌分子，幾-22使用在此描述的本發明的lacto-22s和lacto-22a細菌在HCT后給藥。兩株乳酸桿菌與HCT—起給藥(圖12E)。小鼠接受骨髓和T細胞al1-HCT以引發GVHD。從移植第一天開始，給小鼠灌胃18-1O9計量的再懸浮在PBS中的野生型副干酪乳桿菌(乳酸-WT)、乳酸-22s或乳酸-22a，或單獨灌胃I3BS直到HCT后30天。GVHD導致灌胃PBS的小鼠大量死亡。雖然乳酸-WT有提高小鼠存活率的趨勢，但由于GVHD這些小鼠的因死亡率依然很高。
[0170]相反，接受乳酸-22s或乳酸-22a的小鼠和沒有T細胞移植的小鼠相比沒有明顯不同的死亡率。此外，從重量，毛皮質量，皮膚完整性，姿勢和活動的評估來看接受lacto_22s的小鼠明顯降低了GVHD的臨床評分。而HCT后小鼠重量的改變可以作為GI GVHD的替代指標，這些研究結果的系統性表明，GI保護可能是預防全身性疾病免受GVHD的關鍵。
[0171]如上所述方法，完成了 T細胞耗盡的MHC匹配的allo-HCT，而且每天給小鼠灌胃乳酸-WT、乳酸-22s和乳酸-22a。另外，用于IL-22的PCR技術被考慮用在受體腸道以證實在胃腸道內存在乳酸-22。從病人臨床表現來看MHC相匹配的allo-HCT模型最符合移植，基于MHC移植供體優先被選擇出來去匹配受體。另外，進行了 HCT三周后將小鼠處死評估GVHD病理學和隱窩細胞凋亡的實驗。為了直接測試乳酸-22對ISC的影響，如上所述Lgr5-LacZ小鼠作為受體進行移植將評價Lgr5+ISC的消除。施用乳酸-22比rIL-22安全而且能夠減小GI疾病，降低死亡率。
[0172]乳酸菌生產的IL-22對腸上皮細胞的影響
[0173]經乳酸-22治療的小鼠可以降低GVHD死亡率及相應的癥狀。因此完成通過ELISA檢測血清中全身性IL-22含量進而確定乳酸-22對腸上皮細胞的影響的實驗。通過ELISA檢測組織勻漿樣本中的IL-22以及通過IHC和western印記檢測腸磷酸化STAT-3方法評估IL-22在組織內的后續影響。最后，如果灌胃乳酸桿菌可以滲透到上皮可以通過電鏡拍照。另外，培養來自移植小鼠血液或組織勻漿的乳酸菌以確定細菌是否進入體循環。乳酸-22攜帶抗氯霉素基因在培養條件下可以幫助正確識別乳酸-22。
[0174]乳酸-22對供體T細胞和受體菌群的影響
[0175]BALB/c al lo-HCT中的B6HCT小鼠每天被灌胃乳酸-WT和乳酸-22。供體骨髓來自⑶45.1，且T細胞來自WT B6 (⑶45.2+)，以通過流式細胞術幫助鑒別供體T細胞。測量了脾臟、腸系膜淋巴結和腸固有層內供體T細胞的膨脹還包括效應-調節性T細胞的比率。我們也將評估活性/記憶標記的供體T細胞表達和包括Fas配體的細胞毒性效應分子。血清及細胞內細胞因子的炎性細胞因子的表達，我們將采用PCR檢測上皮組織IL-22(Reg3 γ和Reg3i3)誘導的天然抗菌分子的表達。IL-22作為抗菌劑后續可能對菌群有影響，而且施用的乳酸桿菌本身的存在對菌群也有深遠的影響，為了評估給藥乳酸-22后的微生物多樣性我們將進行如我們最近發表的16S rDNA測序。
[0176]乳酸-22對GVL的影響
[0177]鑒于IL-22R在非造血細胞的表達的限制，乳酸-22不能抑制GVL或促進造血腫瘤的生長。實驗準則對乳酸-22潛在的臨床移植是很重要的。體內rIL-22治療后IL-22K0供體T細胞或者WT T細胞的初步實驗在GVL能力方面沒有表現出明顯差異(圖8A-B)。因此，乳酸-22對GVL的影響可以通過標準的腫瘤細胞株進行T細胞充滿HCT來測量(A20、EL4)。可以監測小鼠的腫瘤進展和相關的發病率/死亡率。此外，通過生物熒光監測腫瘤的生長。
[0178]雖然實驗有效，HCT與腫瘤細胞系代表一種與重新(denovo)惡性腫瘤臨床移植疑似直接相關的模型。因此，我們已開發了針對混合系白血病(MLL)相關的急性髓細胞白血病(AML)的GVL實驗模型(圖8C)。涉及MLL基因的重排與移植的研究是非常相關的，因為它們在治療AML相關疾病中是非常普遍的，攜帶一個不良臨床預后，并且是allo-HCT的暗示31。乳酸-22灌胃后，將通過由MLL-AF9轉導誘導的AML測量GVL。該高風險繼發性白血病的模型比腫瘤細胞系更真實地反映臨床疾病。因此可以通過移植效果和在外周血、脾臟、骨髓內GFP報道表達監測腫瘤的發展。
[0179]實驗
[0180]提供以下實施例是為了證明并進一步說明某些優選的實施方案和本發明的各方面，這不應當被解釋為限制其范圍。
[0181 ]在下面的實驗公開中，應用以下縮寫:N(正常)；M(摩爾的)；mM(毫摩爾的)；μΜ(微摩爾的);mol (摩爾);mmol(毫摩爾);μπιο1(微摩爾);nmol(納摩爾);pmol(皮摩爾)；g(克)；mg(毫克);yg(微克)；ng(納克)；I或L(升);ml(毫升);μ1 (微升)；cm(厘米);mm(毫米);μπι(微米);nm(納米)；度.C.(攝氏度;Gy(戈瑞)和cGy(厘戈瑞)。
[0182]實施例1
[0183]此實施例描述了本文所用的材料和方法。
[0184]材料和方法:
[0185]C57BL/6(CD45.2B6，H_2b)、B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ(CD45.lB6con_genic，H-2b)、11 12b-/-B6、BALB/c (H_2d)和LP (H_2b)小鼠是從 Jackson實驗室獲得。B6和BALB/c1122-/-小鼠由Genentech提供，其是抗-1L-22中和抗體8E11 C3LgrS-LacZ和Lgr5-GFP B6小鼠由H.Clevers (Barker等人，2007)提供。如先前所述(Petrovi c等人，2004)進行BMT過程，BALB/c宿主接受骨髓(5x 106)的分劑量致死輻射為850cGy，耗盡抗Thy-1.2和低-TOX-Mrabbi t補充體(Cedarlane實驗室)的T細胞，或者也可以用I 10cGy分劑量致死輻射接受T細胞耗盡骨髓(5\106)的86宿主。供體1'細胞(一般為1\10686或知1061^，除非另有說明)，通過收集供體脾細胞并經尼龍毛通道(通常>70%的T細胞純度)或經⑶5的Miltenyi MACS純化(通常>90 %純度)使T細胞富集來制備，用于移植。對受體小鼠的生存和臨床GVHD癥狀進行監測并且如前所述處死受體小鼠用于盲人組織病理學和流式細胞分析(Petrovic等人，2004)。對于嵌合的實驗，CD45.1B6同類系小鼠經致死劑量照射并與野生型或IL22-/-⑶45.2骨髓重組。三個月后，供體重組是通過用于⑶45.1與⑶45.2對比的外周血的FACS來確定，且嵌合小鼠再次被照射(900cGy，分劑量)，并用LP骨髓(10X106)和T細胞(3 X 106)移植。
[0186]小鼠。
[0187]C57BL/6(CD45.2B6，H-2b)和 LP(H-2b)小鼠是從 Jackson 實驗室(美國巴港)獲得。B6Lgr5-LacZ 和 B6Lgr5-gfp-1res-CreERT2 (Lgr5-GFP)小鼠由H.Clevers 提供。小鼠在 MSKCC無病原設施中每個籠子有5個的微隔離籠中飼養，并接受標準食物和蒸壓無菌飲用水。小鼠的維護和過程根據紀念斯隆凱特琳癌癥中心(MSKCC)機構動物護理和使用委員會的機構協議指導完成。
[0188]隱窩隔離和細胞分離。
[0189]腸隱窩的隔離和用于流式細胞分析的細胞的分離很大程度上如前所述進行。簡單地說，通過CO2窒息使小鼠安樂死后，收集小腸和大腸，將器官縱向打開并清洗。小腸已經在5mM的乙二胺四乙酸(EDTA)中孵育60分鐘或在1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)中孵育25分鐘(4°C)以解離隱窩；大腸在4型膠原酶(Worthington)中孵育30分鐘(37°C)。收集含有隱窩的上清液。為使隱窩分解成單個細胞，隱窩沉淀物進一步在補充有0.8KU/ml DNasel(羅氏藥業)的IX trypLE快速(Gibco公司，生命技術)中孵育。用于提取RNA的解離的隱窩在Iml試劑盒(英杰公司)中懸浮并在-80 0C中儲存。
[0190]類器官培養。
[0191 ] 每孔400隱窩于4°C在液化生長因子減少的基底膠(康寧公司)(25 %高級的DMEM/Fl2培養基(胎牛血清)；75%生長因子減少的基質膠)中懸浮。然后，它們以50yL小腸液滴、30yL大腸液滴的方式在預熱的δ-表面Nunc 24孔板涂覆，每個液滴含有約100-500隱窩。基質膠液滴聚合后，500μ1完整隱窩培養基加入到小腸隱窩培養物中(ENR-介質:先進DMEM/卩12(3丨811^)、2111]\1的1^-谷氨酰胺(3丨811^)、10111]\1 HEPES(Sigma)、100U/ml青霉素/100yg/ml鏈霉素(Sigma)、lmM N-乙酰半胱氨酸(Sigma)、I XB27添加劑(英杰公司)、I XN2補充物(英杰公司)、50ng/ml mEGF(派普泰克)、100ng/ml的mNoggin(派普泰克公司制)和人源R-脊椎蛋白-1-轉染的HEK293T細胞的10%人源R-脊椎蛋白-1條件培養基。在一些評估芽的實驗中，hR-脊椎蛋白-1的濃度降低到1.25-5%。大腸隱窩在除了上述的蛋白質和1%牛血清白蛋白(Sigma),還含有50 %的Wnt3a條件培養基的WENR-培養基中培養。對于大腸培養物，將1uM58202190(5丨81^，0311^.57067)和40(5抑制劑(483-01，1'0(^丨8)加入到'^謝中。所有孔板在37°C/5%⑶2下孵育，且培養基每隔2-3天更換。對照孔板不進行處理，如果適用，處理孔板隨著培養基的變化，接收不同濃度的重組鼠(rm)IL-22(金斯瑞)。隱窩在第七天用血清移液管機械地破壞它們來傳代，通過在過量介質中旋下隱窩來洗掉基質膠，并在形成沉淀后在液化基質膠上使它們連接起來。我們還測試了由中國Generon(上海)股份有限公司提供的F-652的影響，F-652是重組人源IL-22二聚體分子。在一些實驗中，類器官在Stattic(STAT3三抑制劑化合物、6-硝基苯并[b]噻吩-1，1-二氧化物;Tocris生物科技)存在的情況下從隱窩培養。
[0192]使用修飾的隱窩解離協議將腸干細胞從LgR5-GFP小鼠中分離，該協議使用30mMEDTA3，4 20分鐘，然后若干過濾步驟和使用TrypLE孵育5分鐘并渦流0.8分鐘以下以產生單細胞懸浮液。Lgr5-GFP高細胞通過熒光激活細胞分選分離。5000ILCS在30yL生長因子減少的基質膠液滴中涂覆并在介質中含有1yM rho-激酶抑制劑Y-27632、在基質膠中含有Ιμπι鋸齒狀I凹口配體(Anaspec)和rho激酶抑制劑(1ym)的WENR中培養。I SC培養物在沒有來自D4的Wnt的情況下培養。
[0193]對于先天淋巴樣細胞(ILC)共培養實驗，腸淋巴細胞從小腸固有層分離。清洗小腸片段后，添加20ml/小鼠預熱EDTA/IEL溶液(含有5 %FBS的IxPBS，1mM Hepes緩沖液，I %青霉素/鏈霉素康寧，I %L-谷氨酰胺(Gibco)，ImM EDTA和ImM DTT溶液，隨后將樣品置于37°C震蕩培養箱中15分鐘。對樣品(ΙΟΟμπι)進行染色并將其置于膠原酶溶液(RPMI 1640,5%FCS ,1 OmM 11叩^，1%?5，1%谷氨酰胺和11^/1111膠原酶4(羅氏)和仏8/1111 DNAse 1(羅氏)，并置于37°C震蕩培養箱中10分鐘。之后，將樣品在1500rpm下離心五分鐘，并用不含酶的RPMI溶液清洗。幾次清洗后，將細胞懸浮液轉移至40%PerColl溶液(RPMI包Percoll)，其在80%PerColl溶液上覆蓋。旋轉含有固有層界面后，吸出單核細胞并在介質中清洗。然后用細胞外標記物和用于生存的Topro 3對細胞懸浮液進行染色。ILCs經挑選并分類為1'0?103-、8220-、001113-、0)11(3-、0)45+、0)3+和0)90.2+細胞。在基質膠中每孔用400隱窩涂覆 lOOOILCs。為了與 ILCs 共培養，將 rmIL-2(1000y/ml)、rmIL-15(10ng/mlWPrmIL-7(50ng/ml)和rmIL-23(50ng/ml)添加到ENR培養基中。共培養物與在含有ENR且沒有ILCs存在的細胞因子中培養的隱窩對比。
[0194]骨髓移植。
[0195]如先前所述進行骨髓移植(BMT)過程。使用少數組織相容性抗原-不匹配骨髓移植模型(1^—86，!1-2|3^1-2|3)。年齡為8到10周的雌性86￥1'小鼠典型地用作移植受體。隔離接受I 10cGy分次劑量致死照射3-4小時的受體小鼠(550cGy X 2)以減少胃腸道毒性。為從安樂死供體小鼠得到LP骨髓細胞，無菌收集股骨和脛骨并用無菌培養基洗出骨髓管。骨髓細胞是通過使用抗Thyl.2和低-TOX-M兔子補充體(Cedarlane實驗室)孵育耗盡T細胞。通過剩余污染性T細胞的定量對T細胞耗盡的骨髓進行純度分析。T細胞的污染通常約為單輪補充體消耗后所有白細胞的0.2%和第二輪后的0.1%。通過從安樂死供體小鼠無菌收集脾細胞來制備LP供體T細胞。使用MACS系統(德國美天旎生物技術)的具有CD5磁珠的正向選擇來純化T細胞。細胞的純度通過流式細胞術測定并且常規大約為90%。除非另有說明，受體在每只小鼠有或沒有4 X 106T細胞的情況下通常經尾靜脈注射接受5 X 106骨髓細胞。
[0196]如前所述6，每天監測小鼠存活率并用建立的臨床GVHD評分系統(包括體重、姿勢、活動、皮毛起皺和皮膚完整性)每周檢測小鼠移植物抗宿主病(GVHD)的得分。最大可能得分10的臨床GVHD指數然后產生。得分5或以上的小鼠被認為是垂死的并通過CO2窒息實施安樂死。
[0197]細胞因子給藥。
[0198]重組鼠IL-22從GenScript購買并按生產商所描述的重組成濃度為40yg IL-22/lOOOul磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。每只小鼠每日經腹膜內注射ΙΟΟμΙ PBS或含有4yg重組小鼠IL-22的10yL PBS處理。IL-22給藥在骨髓移植后第七天開始。此安排是基于未移植小鼠內測試的rIL-22藥代動力學的結果。對于體內F-652的給藥，小鼠在骨髓移植后第七天開始經PBS或100yg/KGF-652隔天皮下注射10周處理。
[0199]GVHD靶器官的組織病理學分析。
[0200]使用⑶2窒息使小鼠安樂死，其被用于在BMT后21天進行器官分析。對于GVHD的組織病理學分析，小腸和大腸在福爾馬林中保存、石蠟包埋、切片、并用蘇木精和曙紅(H&E)染色。如先前所述，由19個不同的GVHD相關參數構成的半定量得分被計算。
[0201 ] 潘式細和干細胞組織染色
[0202]對潘式細胞的染色，從安樂死的小鼠收集腸并在福爾馬林中保存、石蠟包埋、切片、并用多克隆兔抗人溶菌酶3.2.1.17(Dakocytoma1n)染色。為評價干細胞的數量，收集來自移植有LP骨髓(如果適用，還有T細胞)的Lgr5-LacZ受體小鼠的小腸。β半乳糖苷酶(LacZ)如先前Barker等人所述進行染色。清洗的2.5厘米尺寸的小腸片段用冰冷固定液孵育，該固定液由I %甲醛、0.02 %NP40和0.2 %戊二醛構成。除去固定液后，器官為LacZ的存在進行染色。然后器官在福爾馬林中保存、石蠟包埋、切片并用核固紅(矢量)復染。
[0203]細胞因子多重測定。
[0204]脾和小腸從安樂死的BMT受體中收集。然后將器官混勻、離心，并將上清液在_20°C下儲存直到用于細胞因子的分析。細胞因子多重測定法使用小鼠Th I/Th2/Th 17/TH22 13倍FlowCytomix多重試劑盒(e生物科技)在解凍的樣品上進行，并根據制造商的方案進行。
[0205]流式細胞術。
[0206]為了在體內實驗中評估IL-22的影響，從安樂死小鼠中收集淋巴器官并加工成單細胞懸液。用抗體的合適的混合物對細胞染色。為了分析細胞內分子，e生物科技固定/透化試劑盒根據用于細胞內染色的制造商協議來使用。徹底清洗后，同時用細胞內和細胞外抗體對細胞染色。用于細胞內和細胞外染色的焚光染料標記抗體購自BD Pharmingen(⑶4、CD8、CD24、CD25、CD45、a407、K1-67 和 P-STAT3Y705)、e 生物科技(Foxp3)、R&D(IL-22R)和英杰公司(GFP) JAPI和可固定活/死細胞染色試劑盒(英杰公司)用于存活力染色。如Sato等7所述，潘式細胞可基于亮CD24染色和側向散射粒度來識別。
[0207]對于小腸類器官細胞的流式細胞術，ENR培養基被除去，且隱窩和基質膠在TrypLE中懸浮約8分鐘。通過P200移液槍用力吸移造成機械破碎后，用1ml含有10%FBS和0.8KU/mlDNase I的DMEM/F12培養基清洗隱窩懸浮液。然后懸浮液用于評價GFP+細胞的百分比。當適用時，將細胞直接染色或根據目標蛋白的細胞外或細胞內位置將細胞第一固定和透化。所有對活細胞的染色在沒有Mg2+和Ca2+，含有0.5 % BSA的PBS中進行。5-乙炔基-2 ’ -脫氧尿苷(EdU)摻入實驗，EdU在使用trypLE解離細胞之前，在完整類器官培養物的ENR培養基中進行I小時預孵育。使用用于成像和流式細胞儀(美國生命技術公司)的Click-1t試劑盒對細胞染色。
[0208]用PFA4%(10分鐘37°C)固定之前用磷酸化-STAT3對類器官染色，用20ng/ml IL-22在37 °C 20分鐘將細胞刺激為機械破碎的隱窩(用于傳代)，或者刺激為單細胞(TrypLE)。在一些實驗中，使用產生自新鮮分離的隱窩(非類器官)的單細胞懸浮液進行IL-22刺激。得到刺激和固定細胞的單細胞懸浮液后，過濾(40um)樣品并用冰冷的(_20°C)甲醇透化。固定/電燙細胞用PBS補充水份并在染色之前使用PBS充分清洗，使用抗-磷酸化-STAT3 JAGFP和/或細胞表面標記物的染色在4°C下進行30分鐘。所有流式細胞術使用FACSDiva(BD生物科技)在LSR II細胞儀(BD生物科技)上進行，并且數據用Flowjo軟件(Treestar)進行分析。
[0209]類器官測量。
[0210]每孔的類器官數目通過光鏡計數以評估在培養第七天的增長效率。對于尺寸評估，使用具有5x(0.25NA DRY)和10x(0.3NA DRY)Zeiss物鏡的MetaMorph廣角現場成像系統顯微鏡拍攝二維明視野顯微鏡照片，呈現每個類器官的最大橫截面。每個橫截面的面積和周長使用MetaMorph軟件測量。
[0211]qPCR
[0212]對于定量的(q)PCR，小腸片段或分離的隱窩從安樂死的小鼠中收集并在-80°C下保存。RNA從這些組織中提取并在-20 0C保存。可替代地，RNA在體外培養后從類器官中分離。逆轉錄-PCR使用Quant1-Tec逆轉錄試劑盒(QIANGEN)進行。用于實時PCR的從美國應用生物系統公司得到的特異性引物如下:肌動蛋白:Mm01205647_gl;HPRT:Mm00446968_ml;Reg30:MmOO44O616_gl；Reg3γ:Mm00441127_ml;WNT3:Mm00437336_ml和EGF:Mm00438696_ml;Rspo3:MmOO6611O5_ml;Axin2:MmOO44361O_ml;0-連環蛋白:Mm00483039_ml wPCR在具有TaqMan通用PCR主混合物(美國應用生物系統公司)的Step-One Plus(美國應用生物系統公司)上進行。mRNA的相對量用β-肌動蛋白或HPRT作為管家基因通過比較的AC(t)方法來計笪并ο
[0213]統計數據和軟件
[0214]所有柱狀圖及誤差柱狀圖代表用于各組+SEM的平均值。為比較兩個組，進行t-檢驗或非參數U檢驗。方差分析用于兩組以上的比較。對所有統計數據進行計算并使用GraphPad Prism生成顯示圖。所有實驗用每組至少3_5小鼠進行至少兩次。
[0215]GVHD靶器官的組織病理學分析。
[0216]犧牲GVHD小鼠，且小腸、大腸和肝臟被除去、在福爾馬林中保存、石蠟包埋、切片并用蘇木精和曙紅(H&E)染色。評分如先前所述(Petrovic等人，2004)進行。
[0217]組織分析和流式細胞術。來自GVHD小鼠的淋巴器官被加工成單細胞懸浮液，且固有層淋巴細胞在上皮解離和在DNase 1(羅氏)和膠原酶D(羅氏)中消化后分離。表面染色用抗體的相應混合物進行，而且e生物科技的固定/透化試劑盒根據制造商協議用于細胞內染色。用于IL-22R(大鼠-抗-小鼠IL-22R抗體496514，R&D系統)的FACS包括表面和細胞內染色。使用用于IL-22表達的BD GolgiPlug(lul/ml)和IL-23(40ng/ml)或用于IFN-G和TNF表達的佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-醋酸酯(50ng/ml)和離子霉素(500ng/ml)重復刺激5小時后，使用抗-1L-22(lH8PWSR，eB1science)、抗-1FN-g(XMG1.2，m) PharMingen)或抗_TNF_a(MP6-XT22，BD PharMingen)進行細胞內細胞因子染色。IL-22和IL-23ELISA根據制造商協議(B1Legend)在每個來自上清液上小腸和大腸的勻漿上進行，該上清液來自在含有FBS的RPMI中在37°下過夜培養的腸。免疫組化、免疫熒光、TUNEL、LacZ和ISC組織腸從正常小鼠中收集，在福爾馬林中固定，并用大鼠-抗-小鼠IL-22R染色，其是與同型對照和/或多克隆兔抗-人溶菌酶3.2.1.17(0&1?^7切111&-^011)對比的抗體496514(1?&0系統)。免疫熒光二次染色使用用于IL-22R的AF488進和用于溶菌酶的AF568進行。如Gavrieli等人(1992)所述，TUNEL測定在福爾馬林中固定/石蠟包埋的組織上進行。對于Lgr5-LacZ的移植，得到2.5cm的回腸片段，且用于半乳糖苷(LacZ)存在的染色按照Barker等人(2007)進行。簡言之，小腸在I %甲醛、0.2 %戊二醛和0.02 %NP40的I3BS中固定，然后使用β_半乳糖苷底物孵育。組織然后再次在4%PFA的PBS中固定并石蠟包埋，且切片用核固紅(矢量)復染。為了評估非報道小鼠中的ISCs，隱窩基底柱狀腸干細胞如所報道的通過其形態和其在潘式細胞之間隱窩基底處的位置識別(Barker等人，2007)。定量PCR逆轉錄-PCR用QuantiTect逆轉錄試劑盒(QIANGEN)來完成。對于實時PCR，從美國應用生物系統公司得到的特定引物和探針組如下:β-肌動蛋白:Mm01205647_gl，Reg3b:Mm00440616_gl和在具有
TaqMan通用PCR主混合物(美國應用生物系統公司)的ABI7500(美國應用生物系統公司)上進行。Reg3g和Reg3b mRNA的相對量通過比較直流DC(t)的方法來計算。
[0218]統計數據。柱狀圖和誤差柱狀圖分別代表各組的平均值+SEM。存活數據用Mantel-Cox log-rank測試分析。對于非存活逐點分析，非配對t檢驗用于在兩個實驗組之間對比，或非參數Mann-Whitney U檢驗用于非高斯分布，且方差分析用于兩個以上的組的比較。存活移植用每組10-38只小鼠進行，且所有其他實驗用每組至少六只小鼠進行至少兩次。
[0219]進行MHC不匹配和次要組織相容性抗原(miHA)不匹配的移植來模擬高度侵略性GVHD和臨床相關移植方案。受體小鼠受致死TBI限制，是因為高劑量化療的藥代動力學難以在實驗中控制。受體然后用T細胞耗盡(TCD)的骨髓移植，其補充有磁珠純化的T細胞以控制GVHD的影響。按照MSKCC IACUC監測移植后受體小鼠GVHD的臨床癥狀(包括體重、活動、姿勢、皮毛和皮膚完整性)，且通常受體在移植后2-3周之間犧牲來評價T細胞功能和GVHD病理。統計分析將使用為MSKCC BMT服務的Sean Devlin，生物統計學家來進行。在一般情況下，對每組至少五只小鼠進行移植，并且所有實驗將至少重復一次。兩組之間的比較將用非參數U檢驗進行。兩組以上的實驗將通過方差分析進行評估。
[0220]類器官培養。從來自腸上皮細胞的小腸和LI分離的隱窩并在存在干細胞生長因子(用于SI的R-脊椎蛋白1、EGF、頭蛋白；用于LI的R-脊椎蛋白1、EGF、頭蛋白、HGF和Wnt3a)的半固體培養基中培養。因為每個隱窩包含具有ISCs的功能性干細胞隔室和支持性區位細胞，體外培養的隱窩生長形成具有含隱窩絨毛結構和中央腔的體內腸組織的隱窩芽的類器官(圖6)。此外，作為它們ISC能力的證據，來自SI和LI的單Lgr5+細胞能夠以這種方式產生自身區位細胞并從單個細胞形成類器官38，39。同種異體-BMTs如描述進行，SI和LI隱窩從未患有GVHD (單獨TCD骨髓)的受體和患有GVHD(骨髓+T細胞)的受體中分離。隱窩將在BMT后1、
3、5、7、10以及14天收集以評價對功能干/祖細胞區位的動力學損傷。此外，Lgr5-GFP報道小鼠將作為移植受體，使得單個ISCs可以通過BMT后的FACS分離并在體外培養以評價GVHD中隔離的I SCs的功能。這將提供干細胞區位和GVHD內特異性I SCs的功能性讀數。
[0221]實施例1I
[0222]宿主衍生IL-22對限制死亡率和移植后GVHD病理學是重要的。
[0223]受體IL-22的消除增長了移植后的死亡率:鑒于報道的IL-22在GI組織損傷中起保護作用，我們開始評估BMT后IL-22的功能。
[0224]IL-22敲除(KO)受體證明在輕微(圖1A)和較多(圖1B)抗原不匹配BMT后死亡率增加，如同經抗-1L-22中和抗體全身性處理的野生型(WT)受體(圖lC)<JL-22在供體骨髓(圖ID)或T細胞(圖1E)中的缺乏對結果沒有可觀察的影響。造血嵌合體中BMT強度的減少(低T細胞和輻射劑量)表明，IL-22缺乏限制宿主造血隔室GVHD死亡率的增加(圖1F)，植入IL-22^) 受體導致 GI GVHD組織病理學證據的增加(圖2A)。
[0225]L-22在骨髓移植后表達并在GVHD中減少:我們接下來鑒定同種異體BMT后，IL-22在胃腸道(圖2B-C)、胸腺(圖2D)和血清(圖2E)內的表達。然而，IL-22的水平在GVHD中降低(圖2B-E)。組織IL-22表達在未經BMT的全身照射(TBI)后被誘導(圖2D，F)，且腸IL-23，IL-22表達31—34的樹突狀細胞衍生3()調節子，也在BMT后和在沒有BMT的TBI后表達。IL-22產生CD45+CD3—ROR yt+ILCs在T細胞耗盡(TCD)BMT后在固有層被檢測到(圖2G)。這些ILCs是宿主衍生的IL-7R+CCR6+NKp46—類淋巴組織誘導物類細胞，并且甚至在BMT-T⑶后三個月，它們包括50%以上的固有層ILCs。其他腸道IL-22生產者未在BMT后檢測到。盡管其在BMT-TCD后的抗輻射性和長期持久性，生產ILCs的IL-22在GVHD中迅速消除(圖2G)。這些數據表明，a) IL-22 在BMT 后表達 ，但由于宿主ILCs的消除在GVHD中減少和 b) 宿主衍生IL-22降低了BMT后的死亡率。
[0226]ISCs表達IL-22R:雖然宿主的IL-22缺乏使GVHD增加(圖1-2A)，在IL-22K0受體的供體淋巴細胞腸浸潤或細胞因子分泌中沒有發現可觀察的差異，表明GVHD內的減少不是由于同種異體反應供體免疫的操縱。為識別IL-22的直接靶標，我們通過熒光激活細胞分選(FACS)評估腸的IL-22R表達并在BMT后的GI上皮細胞上觀察IL-22R的增加。
[0227]免疫組織化學(IHC)和免疫熒光(IF)表明在ISC區位位于其中的腸隱窩中IL-22R的表達(圖3A-C)<JL-22R的13(:表達通過來自1^5-6??報道小鼠的純化1308的?六03來確認(參見圖7A)。
[0228]I SC在GVHD中消失，且I L_22的消除導致在GVHD過程中I SCs損失的增加:為確定是否ISCs可能是GVHD的目標，我們在Lgr5-LacZ報道小鼠中進行同種異體BMT，其在Lgr5下游產生β-半乳糖苷酶來識別ISCs8。作為ISC功能的證據，單個Lgr5+CBC細胞能夠在體外和體內產生整個隱窩結構。與報道的研究結果一致，我們觀察到GVHD過程中ISCs的顯著減少(圖3D)。此外，在非報道WT小鼠中通過IHC評估ISC區位確認了GVHD過程中CBC ISC的損失(圖3E)。引人注目的是，IL-22K0受體證明在GVHD期間CBC I SC的巨大的損失(圖3E)和隱窩上皮細胞的細胞凋亡的增加(圖3F )，表明IL-22保護了 I SCs和祖細胞。最后，患有GVHD的IL-2 2小鼠證明IL-22調節的抗菌分子Reg3y和Reg3i3的GI表達的降低和口服(圖3G)后不可吸收碳水化合物FITC-葡聚糖血清易位的增加，表明對GI上皮細胞屏障的損傷增加。
[0229]IL-22的給藥保留了GVHD中的ISCs并降低了GVHD病理反應:考慮到GVHD中IL-22表達的減少和在IL-22缺乏的GVHD中ISCs損失的惡化，我們接下來檢測IL-22給藥在GVHD中的效果。我們發現BMT三周后每日給藥rmIL-22(第+7天開始4ug IP)導致受體的S1、LI和肝臟中GVHD病理反應的降低(圖4A);在皮膚中沒有觀察到病理差異(圖48)^幾-22受體已經在腸炎癥細胞因子水平沒有差異的情況下降低了腸隱窩的細胞凋亡(圖4C)。為了評估IL-22給藥對ISC隔室的影響，我們使用Lgr5-LacZ的ISC報道小鼠在B6同型異體BMT中進行LP。經rIL-22處理的受體證明BMT三周后在無免疫抑制的活性GVHD期間Lgr5+ISCs數量增加(圖4D)。此外，我們發現在GVHD中經IL-22治療后使用Lgr5-GFP報道因子增加了 ISC增殖(見圖7B)。
[0230]IL-22的給藥增強了 ISC功能而不改善ISC區位:考慮到我們在GVHD觀察到的ISCs損失，我們試圖評估在正常上皮細胞維護中構建ISC區位的潘式細胞。與在侵略性MHC不匹配的GVHD中報道的一樣，我們在輕微不匹配GVHD模型中觀察到潘式細胞的減少(圖4E)。然而，雖然IL-22的給藥增加了 Lgr5+ISCs在GVHD中的恢復，但在IL-22的給藥后沒有觀察到潘式細胞數目上的差異(圖4E)。此外，在WNT3或EGF mRNA的表達無明顯差異，認為IL-22的給藥后，干細胞益處并不是由于在ISC區位功能的改善(圖4F)。相反，IL-22的治療導致Reg3y和Reg3i3表達的增加(圖4G)，表明IL-22給藥的潛在抗菌的優點。
[0231]總結:我們的初步數據表明上皮細胞和免疫系統之間的相互網絡，其中胃腸組織損傷導致IL-23的誘導，其可以通過ILCs刺激IL-22生產。這種IL-22保護來自炎性組織損傷的上皮細胞和ISC隔室。然而，必要地促進ISC功能的IL-22生產的ILCs在GVHD期間丟失。這表明，GVHD導致ISC隔室的損傷以及其在組織損傷后調解上皮細胞再生的能力。這也表明在GVHD內通過替換丟失的IL-22用于增強ISC功能的潛在治療方法。然而，這些研究結果的有效翻譯需要詳細了解移植后腸道正常穩態、直接地在ISCs上和其潘式細胞區位上的損傷、及IL-22對ISCs和其祖細胞的影響。
[0232]實施例1II
[0233]每日IP給藥rIL-22
[0234]在具有T細胞耗盡骨髓和植入致死劑量照射小鼠的MACS純化T細胞的C57BL/6(B6)輕微抗原不匹配模型中臨床模仿LP13HCT后第七天開始受體每天通過腹腔內(IP)注射給藥PBS或4ug鼠重組(r)IL-22。此安排是基于在未移植小鼠內測試的rIL-22的藥物動力學的結果O
[0235]在HCT三周后每日IP給藥rIL-22導致受體小腸、大腸和肝內GVHD病理反應的降低(圖9，P〈0.001)。在皮膚組織病理學中未觀察到差異，與我們先前的發現IL-22缺乏受體證明等價皮膚GVHD—致。腸道病理反應的進一步評估表明，在腸道淋巴細胞浸潤無差異的情況下，rIL-22受體在小腸和大腸中降低了腸隱窩細胞凋亡(P〈0.01)，表明GVHD中的減少是由于IL-22對上皮細胞的直接影響。此外，在脾T細胞膨脹或在GI細胞因子表達上沒有觀察到差異，包括炎癥細胞因子的復合面。
[0236]實施例1V
[0237]IL-22給藥對腸干細胞(ISC)隔室的影響。
[0238]使用Lgr5-LacZ的ISC報道小鼠LP到B6同種異體HCT。經rIL_22治療的受體證明HCT三周后的沒有免疫抑制的活性GVHD期間Lgr5+I SC數目的增加(圖10，P〈0.05)。用Lgr5_GFP報道小鼠的初步證據表明ISC燈-67染色的增加，從而11^-22給藥后增加了15(:增殖。11^-22治療后小腸的qPCR證明Reg3 γ (Ρ〈0.001)和Reg3f3(P〈0.01)的表達增加，表明IL-22給藥潛在的抗菌益處。然而，在Wnt3和EGF的表達上不存在差異，認為IL-22給藥后的干細胞益處不是由于ISC區位功能的改善。
[0239]實施例V
[0240]IL-22給藥到BALB/c中的B6腫瘤挑戰受體沒有限制GVL。
[0241]在造血細胞中未發現的IL-22R表達。因此，監測熒光素酶+A20腫瘤細胞的生物發光以跟蹤通過植入經rIL-22治療的BALB/c腫瘤挑戰受體內的B6T細胞介導的GVT效果。
[0242]實施例VI
[0243]IL-22給藥甚至在活性GVHD期間改善外周T細胞重建。
[0244]FVB MHC不匹配移植骨髓移植到具有Rag2-GFP骨髓和WT T細胞的BALB/c中。IL-22給藥如本文所述，提高HCT四個周后的供體骨髓衍生的CD4和CD8+胸腺移植(圖11，P〈0.01)。
[0245]實施例VII
[0246]本發明的IL-22+乳酸桿菌的使用和HCT后IL-22+乳酸桿菌對GVHD和GI組織損傷的效果。
[0247]該實施例示出GVHD中通過IL-22+乳酸桿菌給藥減少GVHD組織損傷的IL-22生產的內源性損失的結果(A部分)。如下面B部分所示，乳酸桿菌給藥顯示能減少實驗GVHD。
[0248]副干酪乳桿菌是人類胃腸道菌群的正常組成部分。因此本發明人設想的使用副干酪乳桿菌傳送治療劑量的外源性的IL-22，用于提供額外的治療益處。
[0249]A.內源性的IL-22表達降低的小鼠HCT的實驗結果。
[0250]HCT的IL-22-/-K0受體證明下列輕微(圖1A)和較多(圖1B)的抗原不匹配HCT增加了死亡率，這與全身經抗-1L-22中和抗體治療的野生型(WT)受體一樣(圖1C)。植入IL-22K0受體導致胃腸和肝GVHD組織病理學證據增加(圖2A)。因此，宿主衍生的IL-22影響死亡率和移植后的GVHD病理反應。
[0251 ] IL-22的表達在allo-HCT后在胃腸道(圖2B)和血清(圖2E)中發現。然而，IL-22的水平在GVHD期間減少(圖2B，C)。腸的IL-23，IL-22表達的樹突細胞衍生調節因子，也在HCT后表達。產生CD45+CD3—ROR γ t+ILC的IL-22在T細胞耗盡(TCD)HCT之后在固有層被識別到(圖2G)。這些ILC是宿主衍生IL-7R+CCR6+NKp46—淋巴組織誘導物類細胞。盡管他們有抗輻射性，但產生ILC的IL-22在GVHD期間被迅速消除(圖2G)。因此，宿主衍生IL-22降低了 GVHD死亡率，但響應損傷的IL-22在GVHD期間由于消除宿主ILC而鈍化。
[0252]雖然宿主IL-22的缺乏增加了GVHD(圖1和圖2A)，但在IL-22敲除受體中供體淋巴細胞腸浸潤或細胞因子的分泌中沒有可觀察的差異，表明GVHD中的減少不是由于同種異體反應供體免疫的操縱。腸IL-22R表達通過熒光激活細胞分選(FACS)來測定，且在HCT后的GI上皮細胞可觀察到IL-22R的增加。
[0253]免疫組織化學(IHC)和免疫熒光(IF)表明ISC區位位于其中的腸隱窩中IL-22R的表達(圖3A-C) ο在Lgr5-LacZ報道小鼠中植入同種異體HCT，其在Lgr5的下游產生β-半乳糖苷酶來識別ISC。作為ISC功能的證據，單個Lgr5+隱窩基底柱狀細胞(CBC)能夠在體外和體內產生整個隱窩結構。可觀察到GVHD期間ISC的急劇減少(圖3D)。此外，在非報道WT小鼠中通過IHC評估ISC區位確認了GVHD期間CBC/ISC的損失(圖3E)。引人注目的是，IL-22K0受體證明在GVHD期間CBC/ISC的(圖3E)的巨大的損失和隱窩上皮細胞凋亡的增加(圖3F)，表明IL-22保護了 ISCs和祖細胞。最后，患有GVHD的IL-22K0小鼠證明IL-22調節的抗菌分子Reg3γ和Reg30的GI表達的降低和口服后不可吸收碳水化合物FITC-葡聚糖血清易位的增加(圖3G)，表明對上皮細胞屏障的損害增加。
[0254]因此，GI損傷導致IL-23的誘導。IL-23反過來又可以通過ILC刺激IL-22的生產。這種內源性的IL-22保護來自炎性組織損傷的上皮細胞和干/祖細胞隔室。然而，必需的限制組織損傷的生產ILC的IL-22在GVHD期間丟失。如本文所示，HCT后rIL-22通過腹膜內注射給藥(例如4ug/小鼠每日)在腸內逆轉GVHD病理反應中ILC枯竭和IL-22的損失，并在ISC/祖細胞隔室位于其中的腸隱窩中減少細胞凋亡(圖12A，B)。然而，對于臨床使用，全身細胞因子給藥是昂貴的，并且可能具有未預料到的全身效應。因此，本發明人制備結構性地生產IL-22的副干酪乳桿菌的兩種菌株(圖12C，D)。一種菌株產生分泌IL-22(乳酸-22s)，而另一種產生固定于細菌細胞表面的IL-22(乳酸-22a)。
[0255]B.1L22+乳酸桿菌治療GVHD的結果。
[0256]如本文所述，發現IL-22缺乏導致GVHD增加(圖1到3)，IL-22介導GVHD的減少(圖12)以及HCT后的抗菌分子的IL-22依賴性誘導后，用如本文所述的本發明的乳酸-22s和乳酸-22a菌在HCT后給藥IL-22。兩株乳酸桿菌的給藥與HCT相關(圖12E)。小鼠經歷具有骨髓和T細胞的同種異體HCT以導致GVHD。從移植第一天開始，給小鼠灌胃18-1O9計量的再懸浮在I3BS中的野生型副干酪乳桿菌(乳酸-WT)、乳酸-22s或乳酸-22a和單獨灌胃PBS直到HCT后30天。GVHD導致在用PBS灌胃的小鼠中顯著的死亡率。雖然接受乳酸-WT的小鼠有提高存活率的趨勢，但由于GVHD這些小鼠的死亡率依然很高。
[0257]相反，接受乳酸-22s或乳酸-22a的小鼠和沒有T細胞的移植小鼠相比沒有明顯不同的死亡率。此外，從重量，毛皮質量，皮膚完整性，姿勢和活動的評估來看接受乳酸-22s的小鼠明顯降低了GVHD的臨床評分。而HCT后小鼠重量的改變可以作為GI GVHD的替代指標，這些研究結果的系統性表明，GI保護可能是預防全身性疾病免受GVHD的關鍵。
[0258]如上所述完成了 T細胞耗盡的MHC匹配同種異體-HCT，而且每天給小鼠灌胃乳酸-WT、乳酸-22s和乳酸-22a。
[0259]實施例VIII
[0260]使用臨床模型LP—C57BL/6(B6)輕微抗原不匹配HSCT(H-2b—H-2b)，我們發現，從移植后第7天開始每日經重組鼠(rm)的IL-22(4ug，腹膜內注射)的治療導致GVHD減少腸病理反應而不改變同種異體免疫。相對于PBS處理的對照組，BMT三周后在rmIL-22處理的患有GVHD的小鼠中整體GVHD病理反應和上皮細胞凋亡評分顯著變低(P〈0.001)。我們觀察到，經rmIL-22(且無藥理學免疫抑制)處理的小鼠具有數目增長的LGR5+ISC并顯著變大的ISC增殖(P〈0.01)。這不是由于在ISC區位中IL-22依賴性的變化，因為潘式細胞數、潘式細胞衍生生長因子(EGF、WNT3)和基質衍生的生長因子(Rspo3)均在IL-22給藥后保持不變。然而，抗菌蛋白Reg30和Reg3 γ都是通過在rmIL-22處理小鼠的小腸(SI) (P〈0.01和p〈0.001分別地)的qPCR來上調，雖然這并沒有在內臟微生物菌群中導致一致的變化。
[0261]為評價對上皮細胞再生的直接影響，我們在IL-22存在的情況下進行腸類器官培養試驗。從野生型B6小鼠SI和的大腸(LI)隱窩產生的類器官證明與IL-22培養7天后尺寸顯著增加(？〈0.001，51，圖^;?〈0.05丄1)。與先天淋巴樣細胞(11^0共培養隱窩，體內11^-22有效生產者，也導致類器官尺寸的增加。此外，與IL-22培養顯著增加類器官的出芽(新隱窩形成)，隨著在IL_22(lng/ml)存在的情況下連續傳代導致增加的類器官膨脹，表明IL-22可以直接增加ISC膨脹。事實上，IL-22培養導致SI隱窩從Lgr5-GFP報道小鼠培養后類器官EDU摻入的增加和LGR5+ISC的膨脹(P〈0.001，圖1B)。證明對ISC的直接影響，IL-22導致在LGR5+細胞的STAT3磷酸化特異性和導致在培養僅四天的從分離的單個SI ISC培養的類器官芽的增加(Ρ〈0.01)。
[0262]為調查用于人類的平移潛力，我們在小鼠腸隱窩上測試了人源IL-22二聚體分子(F-652，Gener0n(上海)公司制造)，并發現F-652顯著增加SI和LI類器官的尺寸。使用上述LP—B6同種異體HSCT模型，我們發現用100ug/kg F-652從BMT后開始第7天隔日皮下(SQ)處理會導致臨床GVHD評分(P〈0.0001)和存活率(p〈0.05，圖1C)的顯著改善。
[0263]IL-22和先天淋巴樣細胞可以通過直接在上皮干細胞作用彌補免疫功能和組織再生。IL-22和F-652療法可能是一種新型的方法以促進患有GVHD的患者的腸道恢復而不增加移植后免疫缺陷。
[0264]綜上所述，IL-22給藥被發現能夠在GVHD期間減少腸道病理反應，提高ISC恢復，促進供體骨髓衍生的T細胞發育。出人意料的是，IL-22的給藥不損害GVL。這些結果表明，移植后的IL-22的給藥代表一種新型方法以在同種異體HCT后保護腸上皮細胞并改善免疫功能重建。
[0265]在上述說明書中提及的所有出版物和專利在此通過引證的方式并入本文。所描述的組合物和本發明的方法的各種修改和變型對將本領域技術人員是顯而易見的，且不脫離本發明的范圍和精神。盡管本發明已經結合具體優選的實施方案進行了描述，但是應當理解的是，本發明不應當不適當地限于這些具體實施方案。實際上，用于實施本發明的所描述的方式的各種修改對在藥品、診斷學、免疫學、細胞生物學、分子生物學或相關領域技術人員是顯而易見的，且旨在在本發明的范圍和權利要求之內。
[0266]以下參考文獻全文以引證的方式并入本文:
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【主權項】
1.一種在胃腸道受傷或損傷后促進受試者的胃腸上皮細胞恢復/再生的方法，所述方法包括用白介素-22(IL-22)接觸受試者的腸干細胞(ISC)。2.—種治療受試者的移植物抗宿主病(GVHD)而無免疫抑制的方法，所述方法包括對受試者給藥治療有效量的IL-22。3.—種增強腸干細胞(ISC)增殖的方法，所述方法包括在一定條件下用外源性IL-22接觸所述的ISC以促進ISC的生長。4.根據權利要求1，2或3所述的方法，其中所述IL-22是重組IL-22。5.根據權利要求4所述的方法，其中所述重組IL-22是人IL-22。6.根據權利要求1，2或3所述的方法，其中所述IL-22是以IL-22二聚體的形式。7.根據權利要求1，2或3所述的方法，其中所述IL-22是融合蛋白的形式。8.根據權利要求1或3所述的方法，其中所述ISC是Lgr5+。9.根據權利要求1所述的方法，其中所述受傷或損傷是由于炎癥性腸疾病，炎癥性直腸疾病，自身免疫性疾病，輻射或移植物抗宿主病(GVHD)。10.根據權利要求2所述的方法，其中在移植前將所述治療有效量的IL-22給藥到受試者。11.根據權利要求2所述的方法，其中一旦觀察到與對胃腸道傷害有關的癥狀，將所述治療有效量的IL-22給藥到受試者。12.根據權利要求2所述的方法，其中在移植后從一天到六個月將所述治療有效量的IL-22給藥到受試者。13.根據權利要求2所述的方法，其中在移植后從開始的一周到四個月開始將所述治療有效量的IL-22給藥到受試者。14.根據權利要求2所述的方法，其中每天給藥所述IL-22。15.根據權利要求3所述的方法，其中所述接觸是在體內或體外。16.—種IL-22或其二聚體，用于腸上皮細胞的再生。17.一種IL-22或其二聚體，用于治療炎癥性直腸疾病，自身免疫疾病，輻射誘發的腸損失或移植物抗宿主病(GVHD)。
【文檔編號】C07K14/00GK106029100SQ201480072525
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2014年11月7日
【發明人】馬塞爾·范登布林克, 艾倫·哈納斯, 卡洛琳·林德曼斯, 湯姆·唐
【申請人】紀念斯隆–凱特林癌病中心, 健能隆醫藥技術（上海）有限公司