一種雞特異性免疫增強劑的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于免疫學技術領域，具體涉及一種雞特異性免疫增強劑的制備方法。
【背景技術】
[0002]我國是世界上禽蛋禽肉生產的大國，位居世界第一、第二，由于目前國內市場的消費日趨滿足，能否出口就成為制約我國養禽業發展的重要問題。其中，疫病控制及免疫預防中的藥物殘留問題是主要根源。在雞的所有疫病中，傳染性疾病可占到60%?70%，仍然是危害養雞業的最重要的疾病。因此，要想發展養雞業必須控制雞病毒性免疫抑制性疾病，我國未來養殖業的發展方向，應該實現由污染的環境、高昂的成本、低劣的產品，向環保、節能和生產大量綠色安全食品的轉變。作為綠色環保的生物性免疫增強劑一一特異性轉移因子，以其無抗原性、無毒副作用等特點，已在畜牧業上得到了廣泛的應用，并有取代抗生素和抗體的趨勢。特異性轉移因子是一種具有較強免疫活性的小分子物質，吸收快，作用迅速，無不良反應和毒副作用。由于其有抗原特異性和多方面的非特異性免疫功能，是一種理想的動物免疫增強制劑。
[0003]免疫增強制劑的制備方法主要采用透析-過柱法、超濾-過柱法或單純透析法，如曾仕廉等報道，將細胞置于_50°C凍結，再置于37°C水浴融化，如此反復凍融6次，4000r/min低溫冷凍離心，上清液經中空纖維超濾器超濾，截留相對分子質量5000的超濾液，再采用SephadexG-25柱層析進行洗脫純化。李富桂等報道，將組織置于組織搗碎機中粉碎勻漿后，用超聲波裂解組織細胞，再于4000r/min離心20min。棄去沉淀，將上清液裝入透析袋，攪拌透析48h，收集透析外液，蛋白質檢測為陰性，再將透析外液用SephadexG-25柱層析進行洗脫純化。江青艷等、日穆德瑪等和馬鳳龍等報道，用無菌鹽水洗凈組織，在無菌條件下攪碎、稱重，加1.5倍雙蒸餾水制成勻漿，凍融9次，3000r/min離心30min，取上清液用透析袋進行透析，溫度為4°C，磁力攪拌透析48h。以上介紹的免疫增強制劑的制備方法，工藝繁瑣，多肽產量低，不適合大規模批量生產。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種雞特異性免疫增強劑的制備方法，采用預處理和超濾等方法對傳統的制備工藝進行改良，工藝簡單，產品的生物活性好，多肽產量高。
[0005]為實現上述目的，本發明采用的技術方案是:
[0006]—種雞特異性免疫增強劑的制備方法，包括如下步驟:
[0007]步驟1、免疫健康豬:取雞目的疫苗作為抗原，對健康豬進行目的疫苗強化免疫；
[0008]步驟2、原材料預處理:采集免疫成功后豬的脾、胸腺及淋巴結，用純化水洗凈豬脾、胸腺及淋巴結，去其表面的筋膜及脂肪等組織，再用滅菌生理鹽水反復沖洗；
[0009]步驟3、組織勻漿的制取:將步驟2所得洗干凈的豬脾臟、胸腺及淋巴結剪碎，加入3倍體積的生理鹽水，在4°C的條件下用膠體磨磨細，制得組織勻漿；
[0010]步驟4、反復凍融:將步驟3制取的組織勻漿于_70°C快速冷凍，之后再在30°C左右進行水浴融化，按照此冷凍和融化的方式共重復進行五次，然后通過冰凍離心機于4°C以3000-4000r/min離心20-30分鐘，取上層紅色液體，離心渣再用2倍的生理鹽水稀釋，再用膠體磨磨細，置于冰凍離心機于4°C以3000-4000r/min離心20-30分鐘，取上層紅色離心液體，將兩次濾液混合在一起；
[0011]步驟5、超濾:將步驟4所得混合濾液用截流值為1KD的超濾膜加壓超濾，濾液為分子量小于6000道爾頓的轉移因子；
[0012]步驟6、除菌:將步驟5超濾得到的濾液用濾膜加壓過濾除菌，即得雞特異性免疫增強劑。
[0013]本發明的特點還在于，在步驟I中，所用雞目的疫苗選自雞新城疫疫苗、雞傳染性法氏囊炎疫苗。
[0014]本發明的特點還在于，在步驟I中，對健康豬進行目的疫苗強化免疫的過程如下:
[0015]對選擇的健康豬利用目的疫苗進行皮下多點注射進行免疫，免疫共進行4次，每次免疫間隔一周，4次免疫的免疫劑量依次為50羽/頭、100羽/頭、200羽/頭、500羽/頭。
[0016]本發明的特點還在于，在步驟I中，所選健康豬無傳染病和寄生蟲病，所選健康豬的體重約100kg。
[0017]本發明的特點還在于，在步驟6中，所用濾膜的孔徑為0.22um。
[0018]本發明的有益效果如下:
[0019]本發明提供的一種雞特異性免疫增強劑的制備方法，采用預處理和超濾等方法對傳統的制備工藝進行改良，工藝簡單，產品的生物活性好，多肽產量高。結果改良工藝后平均多肽含量為3.27g/L，明顯高于傳統工藝平均多肽含量1.25g/L，提高近2.6倍，測定其生物活性亦比原工藝制備明顯提高。利用本發明制備的雞特異性免疫增強劑具有很好的市場利用前景，生產流程既簡便又高效，大規模生產后可更加廣泛的在獸醫臨床上應用，可以有效的預防和控制雞病毒性疾病的發生與流行，從而減少此類疾病給養禽業帶來的巨大的經濟損失，以實現更好的企業效益和社會效益。
【具體實施方式】
[0020]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例子僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0021]實施例1
[0022]本發明實施例的一種雞特異性免疫增強劑的制備方法，按照如下步驟進行:
[0023]步驟1、免疫健康豬:選取無傳染病和寄生蟲病的健康豬，體重約100kg，取雞目的疫苗作為抗原，對健康豬進行目的疫苗強化免疫，所用雞目的疫苗選自雞新城疫疫苗，對健康豬進行目的疫苗強化免疫的過程如下:
[0024]對選擇的健康豬利用雞新城疫疫苗進行皮下多點注射進行免疫，免疫共進行4次，每次免疫間隔一周，4次免疫的免疫劑量依次為50羽/頭、100羽/頭、200羽/頭、500羽/頭；
[0025]步驟2、原材料預處理:采集免疫成功后豬的脾、胸腺及淋巴結，用純化水洗凈豬脾、胸腺及淋巴結，去其表面的筋膜及脂肪等組織，再用滅菌生理鹽水反復沖洗；
[0026]步驟3、組織勻漿的制取:將步驟2所得洗干凈的豬脾臟、胸腺及淋巴結剪碎，加入3倍體積的生理鹽水，在4°C的條件下用膠體磨磨細，制得組織勻漿；
[0027]步驟4、反復凍融:將步驟3制取的組織勻漿于_70°C快速冷凍，之后再在30°C左右進行水浴融化，按照此冷凍和融化的方式共重復進行五次，然后通過冰凍離心機于4°C以3000r/min離心30分鐘，取上層紅色液體，離心渣再用2倍的生理鹽水稀釋，再用膠體磨磨細，置于冰凍離心機于4°C以3000r/min離心30分鐘，取上層紅色離心液體，將兩次濾液混合在一起；
[0028]步驟5、超濾:將步驟4所得混合濾液用截流值為1KD的超濾膜加壓超濾，濾液為分子量小于6000道爾頓的轉移因子；
[0029]步驟6、除菌:將步驟5超濾得到的濾液用濾膜加壓過濾除菌，即得雞特異性免疫增強劑，所用濾膜的孔徑為0.22um。
[0030]實施例2
[0031]本發明實施例的一種雞特異性免疫增強劑的制備方法，按照如下步驟進行:
[0032]步驟1、免疫健康豬:選取無傳染病和寄生蟲病的健康豬，體重約100kg，取雞目的疫苗作為抗原，對健康豬進行目的疫苗強化免疫，所用雞目的疫苗選自雞傳染性法氏囊炎疫苗，對健康豬進行目的疫苗強化免疫的過程如下:
[0033]對選擇的健康豬利用