一枝蒿多糖作為疫苗佐劑的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種免疫佐劑，尤其設及一枝葛多糖在疫苗佐劑中的應用，屬于生物
技術領域。
【背景技術】
[0002] 新疆一枝葛(Artemisia rupestris L)系菊科葛屬植物，為多年生草本，主要分布 于我國新疆阿爾泰山、天山和昆侖山區。一枝葛是新疆維吾爾醫常用藥，用于治療熱性感 冒、發熱、頭痛、肝炎、等麻疹等。W-枝葛為主藥的復方制劑，已針對病毒性感冒和過敏性 鼻炎等癥在新疆上市銷售，臨床應用廣泛。近十余年研究者們對其化學成分和藥理作用等 方面進行了深入細致的研究，發現一枝葛全草含黃酬類、多糖類等多種化學成分，具有抗過 敏、抗氧化、抗病毒、調節免疫等多種作用。
[0003] 疫苗的應用對于控制人類疾病的流行起到了非常重要的作用。新型疫苗，如重組 疫苗、亞單位疫苗、合成多膚疫苗、蛋白疫苗及DNA疫苗等具有良好的抗原特異性和安全性， 應用前景廣泛，但免疫原性較差，運些疫苗只有與安全高效的免疫佐劑配合使用才能增強 其免疫原性或增強宿主對抗原的保護性，發揮良好的預防和治療效果。新型疫苗成功的關 鍵依賴高效安全的疫苗佐劑。不論是獸用疫苗研究領域還是人用疫苗研究領域，對疫苗佐 劑數量上和質量上的要求越來越高了。現實狀況是原有的疫苗佐劑已不能滿足新型疫苗飛 速發展的需要，因此研制高效、安全的疫苗佐劑對于疾病的預防和治療W及保護人類的健 康具有積極意義。
[0004] 疫苗佐劑能夠顯著增強疫苗的免疫原性和安全性、節約抗原的用量，是疫苗學領 域研究的重要內容。盡管近年來疫苗佐劑發展迅猛，種類繁多，均存在不同的缺陷，如免疫 效果不理想或毒副作用大等而限制了在人體和動物的應用和發展，能夠用于臨床的免疫佐 劑種類很少，截止目前，唯一通過抑A批準的人用疫苗佐劑僅有侶佐劑，已經使用了 80多年， 它只能激發體液免疫，不能誘導細胞介導的免疫反應，并且對病毒抗原誘導免疫反應的能 力較差。
[000引理想的新型免疫佐劑應該是對動物機體的細胞或體液免疫均有有效的激發作用、 作用持久穩定、免疫次數減少、副作用小，同時便于生產和易于注射。
[0006] 佐劑發揮作用是由于增強抗原的免疫原性、提高疫苗的免疫效果，因此，佐劑一般 可在多種疫苗中進行使用。如目前的侶佐劑，因此佐劑的研究對感染性疾病的防治有很高 的應用價值。
[0007] 植物來源的多糖對免疫系統發揮多方面的重要調節作用，又無嚴重毒副反應而成 為安全、高效新型疫苗佐劑的候選資源。植物來源的免疫活性物質，具有資源豐富、價格低 廉、毒副作用小、無殘留等優點，因此植物多糖作為佐劑與疫苗配合使用是佐劑研究發展的 重要途徑和新的趨勢。
[0008] 經系統的查閱文獻和專利，目前未發現一枝葛多糖具有疫苗佐劑作用的報道。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的在于提供一枝葛多糖（Aqueous extracts of A;rtemisia rupestris L, AEAR)在疫苗佐劑中的應用。
[0010] 本研究發現，一枝葛多糖能夠明顯刺激血清中抗體I gG、I gGl和I gG2a的產生，對 ConA和LPS刺激的淋己細胞增殖反應明顯增高，可W激發淋己細胞分泌產生細胞因子IL-4 和IFN-丫。表明一枝葛多糖不僅誘發了較強的體液免疫反應，而且誘導了較強的細胞免疫 反應，可W用于疫苗佐劑。
[0011] 為實現上述目的，本發明所采用的技術方案是： 本發明設及所述的一枝葛多糖在疫苗佐劑中的應用。
[0012] 本發明所述的疫苗為蛋白疫苗、基因疫苗、多膚疫苗、滅活疫苗或減毒活疫苗。
[0013] 本發明所述的一枝葛多糖采用超聲輔助水提醇沉法提取。本發明通過對新鮮或干 燥的新疆一枝葛粉末，石油酸脫脂，加入蒸饋水超聲，濾液濃縮后加入無水乙醇攬拌沉淀， 沉淀物經過離屯、，真空干燥，得到一枝葛多糖的粗制品。
[0014] 再對一枝葛粗多糖用Sevage試劑(氯仿：正下醇=4:1)除蛋白，離屯、，合并上清，重 復上述操作多次，收集上清，加入乙醇，靜置過夜，沉淀物經過離屯、，真空干燥，得到一枝葛 多糖可作為疫苗佐劑。
[0015] 本發明使用方法:一枝葛多糖與抗原采用皮下途徑一起注射機體。所述的疫苗為 注射制劑，一枝葛多糖在所述注射制劑中的劑量為1.5mg/kg~lOOmg/kg。
[0016] 本發明一枝葛多糖在疫苗佐劑中的應用，通過動物分組及免疫方法、ELISA檢測小 鼠血清中抗OVA特異性抗體滴度及細胞免疫學活性等實驗，結果證明一枝葛多糖可W作為 蛋白疫苗、基因疫苗、多膚疫苗、滅活疫苗或減毒活疫苗的佐劑，其免疫增強效果明顯優于 侶佐劑，其具有副作用小、來源廣泛、易于生產，并且本發明的一枝葛多糖的制備過程簡單， 成本較低，并且收率較高，有利于大規模生產。
【附圖說明】
[0017]圖巧小鼠免疫OVA特異性抗體IgG滴度檢測結果。
[0018] 圖2為小鼠免疫OVA特異性抗體IgGi和IgGsa的檢測結果。
[0019] 圖3為ConA和LI^刺激小鼠淋己細胞增殖反應的情況。
[0020] 圖4為一枝葛多糖佐劑對小鼠淋己細胞增殖的細胞因子IL-4產生的影響。
[0021 ]圖5為一枝葛多糖佐劑對小鼠淋己細胞增殖的細胞因子IFN-丫產生的影響。
[0022] 圖6為一枝葛多糖佐劑對口蹄疫疫苗IgG抗體水平產生的影響。
[0023] 圖7為一枝葛多糖佐劑對口蹄疫疫苗IgGi和IgGsa抗體水平產生的影響。
[0024] 圖8為一枝葛多糖佐劑對口蹄疫疫苗小鼠淋己細胞增殖反應的情況。
[002引圖9為一枝葛多糖佐劑對口蹄疫疫苗細胞因子IFN- 丫產生的影響。
[0026] 圖10為一枝葛多糖佐劑對口蹄疫疫苗細胞因子IL-4產生的影響。
[0027] 圖11為一枝葛多糖佐劑對流感疫苗IgG抗體水平產生的影響。
[0028] 圖12為一枝葛多糖佐劑對流感疫苗IgGl和IgG2a抗體水平產生的影響。
[0029] 圖13為一枝葛多糖佐劑對流感疫苗小鼠淋己細胞增殖反應的情況。
[0030] 圖14為一枝葛多糖佐劑對小鼠OVA基因疫苗IgG抗體水平產生的影響。
【具體實施方式】
[0031] W下結合本發明具體實施例，對本發明一枝葛多糖在疫苗佐劑的應用進行詳細說 明。 實施例1:不同劑量一枝葛多糖對小鼠免疫模式抗原卵清白蛋白（OVA)的動物實驗 本實施例一枝葛多糖的制備方法是： 步驟1:新鮮或干燥的新疆一枝葛粉末，石油酸脫脂，加入蒸饋水超聲，濾液濃縮后加入 無水乙醇攬拌沉淀，沉淀物經過離屯、，真空干燥，得到一枝葛粗多糖的粗制品； 步驟2: -枝葛粗多糖用Sevage試劑(氯仿:正下醇為4:1)除蛋白，離屯、，合并上清，重復 上述操作多次，收集上清，加入乙醇，靜置過夜，沉淀物經過離屯、，真空干燥，得到一枝葛粗 多糖。
[0032] 實施方法： 實驗材料:一枝葛多糖母液配置:〇. Ig的一枝葛粗多糖溶解在IOml生理鹽水中，配置成 1 Omg/ml的母液。配置OVA母液:0.01 g OVA溶解在1 Oml的生理鹽水中，配置成Img/ml的母液。
[0033] 動物免疫:將6-8周齡ICR小鼠，隨機分配成8組，每組6只，實驗分組如表1所示。
[0034] 表1小鼠免疫分組
每組疫苗溶解在生理鹽水中，每只小鼠注射100微升，第0天皮下注射，第一次注射 后間隔14天進行再次注射，共注射兩次。
[0035] 為了檢測小鼠體液免疫水平，皮下注射后采血，分離小鼠血清，間接化ISA法分別 檢測IgGJgGi和IgGsa抗體水平。W2 iig/ml OVA抗原包被96孔酶標板中，4°C過夜，3%牛 血清白蛋白37°C封閉化；PBST(將Tween 20溶于PBS，使Tween 20終濃度為0.05%得到 的溶液）洗涂4次；加入按不同倍數稀釋小鼠血清，37°C解育化；PBST洗涂4次，每次5 分鐘；加羊抗小鼠辣根過氧化物酶標記IgGJgGi和IgG2a抗體（Southernbiotech)(均按 1:5000稀釋），37°C解育化。每孔加入底物TMB，37°C避光顯色5-15min，加入終止液2mol/L 出S〇4,每孔50山，終止顯色，置于450nm/655nm測定每孔光密度值，陽性滴度終點為OD