在各種細胞群中納米顆粒介導的基因傳遞、基因組編輯和靶向配體的修飾的制作方法
【專利說明】在各種細胞群中納米顆粒介導的基因傳遞、基因組編輯和靶 向配體的修飾
[0001] 相關專利申請的交叉引用
[0002] 本專利申請要求于2013年9月23日提交的根據35U. S . C. §119的美國臨時申請 No. 61/881，072的優先權，其全部內容通過引用的方式并入本文。
[0003] 政府權利聲明
[0004]本發明是在美國政府支持的由國立衛生研究院所頒發的編號為R01AG030637的項 目下作出的。美國政府對本發明擁有特定的權利。
技術領域
[0005] 本發明主要涉及使用納米顆粒轉染細胞。更具體而言，本發明涉及用聚合復合物 核包被納米顆粒以用于將多核苷酸傳遞至細胞內修飾基因表達。
【背景技術】
[0006] 將多核苷酸引入細胞中以改變基因表達，這需要在進入細胞之前將多核苷酸恰當 地包裝以避免其降解，從而允許其進入細胞和直接傳遞至適當的亞細胞小室。改變表達的 有效性也取決于進入細胞后多核苷酸從包裝中釋放的時間期限（time-frame)。
[0007] 用于修飾基因表達的可利用的基于納米顆粒的技術受低水平的細胞轉染和在轉 染時有限的效果所限制，至少部分是由于其在滿足前述需求時受到的限制。因此，期望獲得 滿足所有這些要求以增強效果的基于納米顆粒的轉染劑及其使用方法。
【發明內容】
[0008] -方面，本發明通過提供了納米顆粒克服了現有技術的缺點并提供了額外的優 點。所述納米顆粒包括:核聚合復合物(polyplex)和在所述核聚合復合物上的二氧化娃涂 層，并且所述聚合復合物包括陰離子聚合物、陽離子聚合物、陽離子多肽和多核苷酸。另一 方面，納米顆粒還可以包括附著在二氧化硅涂層外表面的聚合物。
[0009] 本發明也提供了修飾細胞內多核苷酸的方法。該方法包括將細胞與納米顆粒接 觸，其中所述納米顆粒包括核聚合復合物和在所述核聚合復合物上的二氧化硅涂層，其中 聚合復合物包括陰離子聚合物、陽離子聚合物、陽離子多肽和多核苷酸。另一方面，納米顆 粒還可以包括附著在二氧化硅涂層外表面的聚合物。
[0010] 通過本發明的技術實現了額外的特征和優點。通過以下對本發明各個方面的詳細 描述以及隨附的附圖，本發明的這些以及其他目的、特征和優點將變得清晰。
【附圖說明】
[0011] 本發明的一個或多個方面被特別指出，并且在對說明書進行總結的權利要求書中 作為例子得到顯著保護。通過以下對本發明的詳細描述以及所附的附圖，本發明的前述和 其他目的、特征和優點將變得清晰，其中：
[0012] 圖1A-1B為根據本發明的一個方面的納米顆粒及其組分的一些實施方案的示意 圖；
[0013] 圖2A為根據本發明的一個方面的如何制備納米顆粒的示意圖；
[0014]圖2B為這樣的示意圖，其示出了根據本發明的一個方面的細胞如何攝取和在細胞 內處理納米顆粒的方法；
[0015] 圖3為這樣的圖示，其圖解說明了根據本發明的一個方面的包含不同比例的各種 帶電聚合物和多核苷酸對聚合復合物絡合的影響的圖；
[0016] 圖4為這樣的圖示，其圖解說明了根據本發明的一個方面的在聚合復合物中包含 或不包含陰離子聚合物的情況下，包含不同比例的各種帶電聚合物和多核苷酸對聚合復合 物絡合的影響；
[0017] 圖5為這樣的圖示，其圖解說明了根據本發明的一個方面的在陽離子多肽存在或 不存在的情況下，所包含的陰離子聚合物增加對聚合復合物的破壞作用；
[0018] 圖6為示出了根據本發明的一個方面的具有不同層的納米顆粒的尺寸的圖示；
[0019] 圖7為利用各種納米顆粒轉染的細胞的顯微照片，其為根據本發明的一個方面的 證明細胞攝取和轉染后納米顆粒亞細胞定位的顯微照片；
[0020] 圖8為利用納米顆粒轉染的細胞的顯微照片，其示出了根據本發明的一個方面的 轉染后納米顆粒在細胞內停留的持續時間；
[0021] 圖9A-B為示出了根據本發明的一個方面的細胞如何攝取納米顆粒的顯微照片，所 述納米顆粒在聚合復合物的二氧化硅涂層外部附著有聚合物層；
[0022] 圖10為這樣的示意圖，其示出了根據本發明的一個方面的包括在納米顆粒中的由 核酸編碼的TALEN肽引起硬化蛋白（sc 1 erostin)表達的沉默；
[0023] 圖11A-11C為這樣的圖示，其解釋說明了根據本發明的一個方面的用不同量的納 米顆粒轉染細胞對硬化蛋白和齡連蛋白表達的影響，所述納米顆粒針對硬化蛋白的表達；
[0024] 圖12A-12F為這樣的圖示，其解釋說明了根據本發明的一個方面的用不同量的納 米顆粒轉染細胞對各種細胞信號肽的表達水平的影響，所述納米顆粒針對硬化蛋白的表 達；
[0025]圖13為這樣的顯微照片，其證實了根據本發明的一個方面的用不同量的納米顆粒 轉染細胞對共轉染的報告基因的影響，所述報告基因響應于活性受到硬化蛋白介導的信號 轉導所抑制的轉錄因子，所述納米顆粒針對硬化蛋白的表達；
[0026]圖14A-14C為這樣的顯微照片，其證實了根據本發明的一個方面的用不同量的納 米顆粒轉染細胞對礦化作用的影響的圖，所述納米顆粒針對硬化蛋白的表達。
【具體實施方式】
[0027]下面結合附圖所示的非限制性實施方案，更充分地說明本發明的各方面及一些特 征、優點和細節。省略了對已知材料、制造工具、處理技術等的描述，從而避免在細節上模糊 本發明。然而，應當理解，在示出本發明的實施方案的同時，詳細的說明和具體的例子僅通 過說明的方式給出，而不是以受到限制的方式給出。根據本發明公開的內容，在本發明根本 觀念的精神和/或范圍內進行各種替換、改變、添加和/或排列對本領域技術人員來說都將 是顯而易見的。
[0028] 本發明公開部分提供了一種利用試劑轉染細胞從而修飾基因表達的多層納米顆 粒。本發明提供了納米顆粒及其使用方法，納米顆粒設計用于提高血清穩定性、靶向傳遞至 特定細胞類型、更高的核特異性和腔室特異性解包封(unpackaging)、提高在內化初始階段 保留顯著有效負載水平的能力、以及在內化階段之后保持有效負載釋放不同時間的能力。
[0029] 在一個方面，多核苷酸與聚合物的復合物(或者聚合復合物)在陰離子聚合物的存 在下，通過陽離子聚合物和多核苷酸縮合產生的，該復合物或聚合復合物介導的轉染效率 可高于多核苷酸-陽離子聚合物綴合物。通過該過程，可以制備更多的顆粒并增加用于細胞 攝取的納米顆粒的凈表面積，通過該技術也可采用改進的靜電相斥元件來釋放核酸。基于 現有文獻，可以預測核苷酸從包含陰離子聚合物的納米顆粒聚合復合物上快速解聚;然而 令人驚訝的是，與之相反，在本發明的一個方面中，包含陰離子聚合物的納米顆粒聚合復合 物核可以延長納米顆粒在細胞內停留的時間，以及影響基因表達或另外地調節細胞功能或 有效負載的試劑的釋放。
[0030] 在另一個方面中，納米顆粒中陽離子多肽的存在可以介導穩定性、亞細胞區室化 和有效負載釋放。作為一個例子，在各種聚合復合物中，組蛋白肽N端的片段統稱為組蛋白 尾肽，其不僅能夠通過各種組蛋白的修飾而去質子化(例如在組蛋白乙酰基轉移酶介導的 乙酰基化的情況中），還能夠作為聚合復合物的組分介導有效的核特異性解包封。利用通過 高爾基體和內質網的逆行轉運，它們的轉運可依賴替代的細胞內吞途徑，并且核被膜內部 存在的組蛋白的本質示出了組蛋白尾肽固有的定位序列。在本發明的一個方面中，包括組 蛋白尾肽可促進納米顆粒的核定位并導致其有效負載的多核苷酸的酶介導釋放。
[0031] 在另一個方面中，聚合復合物的二氧化硅涂層可以在初始細胞攝取之前或期間密 封其有效負載。通常使用的聚合復合物由聚（乙烯亞胺)和DNA構成，該聚合復合物具有在細 胞內化作用期間排除大部分有效負載(~90 % )的趨勢，而剩余的有效負載通常保持結合在 剩余的陽離子納米載體聚合物上。通過暫時穩定二氧化硅的中間層，盡管細胞攝取的幾率 降低，仍然可以觀察到更高的細胞內傳遞效率。在本發明的另一個方面中，用二氧化硅涂層 包被納米顆粒聚合復合物可密封聚合復合物，使其穩定直到其在目的亞細胞區室內加工時 釋放。
[0032] 在本發明的另