具有促進成骨細胞方向性生長和遷移的支架制備方法【專利摘要】本發明公開的具有促進成骨細胞方向性生長和遷移的支架制備方法，步驟如下：將平行排列的醫用PLLA熔融紡纖維采用溶劑粘結法制備有序支架，或將醫用PLLA切片通過靜電紡絲技術制備納米纖維有序支架，或將有序支架進行膠原和殼聚糖涂層改性制備復合有序支架。該有序支架具有良好的成骨細胞生長、粘附、遷移和增殖效果，成骨細胞在有序支架上呈現方向性的生長、粘附和遷移效果，并且成骨細胞的生長方向沿著有序支架中PLLA纖維取向分布的方向。該有序支架具有較好的應用前景，可以應用于骨關節炎患者和骨修復等骨組織工程領域。【專利說明】具有促進成骨細胞方向性生長和遷移的支架制備方法
技術領域：
[0001]本發明涉及具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的支架制備方法，尤其是能夠應用于骨組織工程領域的左旋聚乳酸(PLLA)熔融紡纖維有序支架制備方法。【
背景技術：
】[0002]由創傷、炎癥、腫瘤引起的大面積骨缺損是外科整形醫生面臨的挑戰，近年來，組織工程提供了一些很有前途的方法對骨缺損進行修復(CanceddaR,GiannoniP,MastrogiacomoM:Atissueengineeringapproachtobonerepairinlargeanimalmodelsandinclinicalpractice.B1materials2007,28(29):4240-4250.)。人類骨骼對各種創傷具有非凡的再生能力，可以使得骨創傷的部位在形狀和大小方面與創傷前一模一樣。但是，自發的骨愈合并不是很理想。而固定對骨折愈合具有非常重要的作用。因此，有必要采用現代內固定技術來解決感染、血管質差、營養不良、大量骨或軟組織損失的問題(RobertsTT,RosenbaumAJ:Bonegrafts，bonesubstitutesandorthob1logicsThebridgebetweenbasicscienceandclinicaladvancementsinfracturehealing.0rganogenesis2012，8(4):114-124.)D從病人組織獲取細胞，通過體外培養，再種植在具有生物降解性的三維支架上。將細胞-支架復合物植入體內，支架被吸收和降解，骨形成細胞會快速生長，從而加快組織愈合，達到修復骨缺損的目的(CiapettiG,Ambros1L，SavarinoL，GranchiD，CenniE，BaldiniN，PaganiS，GuizzardiS，CausaF，GiuntiA:Osteoblastgrowthandfunct1ninporouspolyepsi1n-caprolactonematricesforbonerepair:apreliminarystudy.B1materials2003,24(21):3815-3824.)D[0003]目前的治療方法包括骨嫁接移植(自體移植、同源或異種移植)和骨修復生物材料(CanceddaRjGiannoniP，MastrogiacomoM:Atissueengineeringapproachtobonerepairinlargeanimalmodelsandinclinicalpractice.B1materials2007，28(29):4240-4250.)。骨嫁接移植方法在臨床實踐的成功率較高，但也有許多不足之處，比如并發癥、創傷后骨折不愈合、宿主骨缺損部分的替代物有限等問題(CanceddaRjGiannoniP，MastrogiacomoM:Atissueengineeringapproachtobonerepairinlargeanimalmodelsandinclinicalpractice.B1materials2007，28(29):4240-4250.MuramatsuK，DoiK，IharaK，ShigetomiM，KawaiS:Recalcitrantposttraumaticnonun1nofthehumerus-23patientsreconstructedwithvascularizedbonegraft.ActaOrthopScand2003，74(I):95-97.)。同種異體骨移植材料主要用來修復較大面積的骨缺損，但經過同種異體骨移植材料修復后的骨缺損失敗率在10年期間達到60%，這主要是由于組織材料性能的降解(強力和模量)、骨礦物質密度的減小和微裂隙的增加(WheelerDLjEnnekingWF:Allograftbonedecreasesinstrengthinvivoovertime.ClinOrthopRelatR2005(435):36-42.)。自體骨移植方法會引起捐獻者的發病率(LaurieSffSjKabanLB，MullikenJBjMurrayJE:Donor-SiteMorbidityafterHarvestingRibandIliacBone.PlastReconstrSurg1984，73(6):933-938.)，并且發病率及發病的表現程度和捐獻的部位、時間等有關(ChenYC,ChenCHjChenPL,HuangIYjShenYS,ChenCM:Donorsitemorbidityafterharvestingofproximaltibiabone.HeadNeck-JSciSpec2006，28(6):496-500.)。在過去的十年中，骨組織工程的主要目標是利用可生物降解材料作為充填大面積骨缺損的移植替代物。這些材料應能提供組織愈合過程的機械強度、骨傳導作用，以及新骨形成過程中可控的降解速率(RizziSC，HeathDT,CoombesAGAjBockN，TextorMjDownesS:B1degradablepolymer/hydroxyapatitecomposites:Surfaceanalysisandinitialattachmentofhumanosteoblasts.JB1medMaterRes2001，55(4):475-486.)。[0004]由于與骨的化學成分和機械性能比較相近，羥基磷灰石(Hap)可以單獨或者與其它材料復合作為骨修復的材料(MastrogiacomoMjScagl1neS，MartinettiRjDolciniLjBeltrameF，CanceddaRjQuartoR:Roleofscaffoldinternalstructureoninvivoboneformat1ninmacroporouscalciumphosphateb1ceramics.B1materials2006，27(17):3230-3237.)。除過化學成分和機械性能外，密度、孔的形狀、孔徑、孔間連通性也是設計骨修復支架的重要參數(Gauthier0，BoulerJM，AguadoEjPiletP，DaculsiG:Macroporousbiphasiccalciumphosphateceramics:1nfluenceofmacroporediameterandmacroporositypercentageonboneingrowth.B1materials1998，19(1-3):133-139.ChangBSjLeeCKjHongKSjYounHJ，RyuHS，ChungSS，ParkKff:Osteoconduct1natporoushydroxyapatitewithvar1usporeconfigurat1ns.B1materials2000，21(12):1291-1298.)D現有的可以應用于骨修復的材料主要有合成高分子、生物陶瓷以及復合材料等(RizziSC，HeathDTjCoombesAGA，BockN，TextorM，DownesS:B1degradablepolymer/hydroxyapatitecomposites:Surfaceanalysisandinitialattachmentofhumanosteoblasts.JB1medMaterRes2001，55(4):475-486.)D其支架制備方法有靜電紡PLGAf^CBashurCA，DahlgrenLA，GoldsteinAS:Effectoffiberdiameterandorientat1nonfibroblastmorphologyandproliferat1nonelectrospunpoly(D,L-lactic-co-glycolicacid)meshes.B1materials2006，27(33):5681-5688.)，通過乳化法制備的輕基磷灰石(CDHA)和β-磷酸三^(P-TCPMKastenP，LuginbuhlRjvanGriensvenM，BarkhausenT，KrettekC，BohnerΜ，BoschU:Comparisonofhumanbonemarrowstromalcellsseededoncalcium-deficienthydroxyapatite,beta-tricalciumphosphateanddemineralizedbonematrix.B1materials2003，24(15):2593-2603.),利用氣體發泡/粒子濾出法(GF/PL)制備的Poly(D，L-lactic-co-glycolicacid)/nano-hydroxyapatite(PLGA/HA)復合支架(KimSSjParkMS,Jeon0，ChoiCY,KimBS:PoIy(Iactide-co-glycoIide)/hydroxyapatitecompositescaffoldsforbonetissueengineering.B1materials2006，27(8):1399—1409.)，利用微球技術制備的聚合物基接枝支架(BordenMjAttawiaMjKhanY，LaurencinCT:Tissueengineeredmicrosphere-basedmatricesforbonerepair:designandevaluat1n.B1materials2002，23(2):551-559.)，利用相轉化和饒鑄技術制備的微孑L—大孑LPCL支架(CiapettiG，Ambros1L,SavarinoL,GranchiD，CenniE，BaldiniN，PaganiS，GuizzardiS，CausaF，GiuntiA:Osteoblastgrowthandfunct1ninporouspolyepsilon-caprolactonematricesforbonerepair:apreliminarystudy.B1materials2003，24(21):3815-3824.)，利用粒子濾出法制備的PCL-HA復合支架(YuHYjVandeVordPJjMaoLjMatthewHffjWooleyPHjYangSY:1mprovedtissue-engineeredboneregenerat1nbyendothelialcelImediatedvascularizat1n.B1materials2009，30(4):508-517.)，利用模塑方法制備的β-TCP多孔支架(YuanJjCuiLjZhangWJjLiuW，Ca。YL:Repairofcaninemandibularbonedefectswithbonemarrowstromalcellsandporousbeta-tricalciumphosphate.B1materials2007，28(6):1005-1013.)等。[0005]在骨修復時，有兩種類型的骨，即密質骨和松質骨。密質骨形成了長骨頭并且承擔了人身體的重量(SommerfeldtD，RubinC:B1logyofboneandhowitorchestratestheformandfunct1noftheskeleton.EurSpineJ2001，10(2):S86-S95.)。密質骨內的輕基磷灰石呈現有序結構，這種有序結構導致了密質骨的機械和生物屬性，如彈塑性行為、環境阻力和生物兼容性(ZhouH，LeeJ:Nanoscalehydroxyapatiteparticlesforbonetissueengineering.ActaB1mater2011，7(7):2769-2781.)。并且羥基磷灰石的有序結構與I型膠原蛋白的結構高度相關(SasakiN，SudohY:X-raypolefigureanalysisofapatitecrystalsandcollagenmoleculesinbone.Calcifiedtissueinternat1nal1997，60(4):361-367.)DHAp晶體最初沉積在膠原纖維的孔區，并且晶體的長軸與有序排列的膠原纖維呈現平行排列狀態(LandisW，SongM，LeithA，McEwenLjMcEwenB:Mineralandorganicmatrixinteract1ninnormallycalcifyingtendonvisualizedinthreedimens1nsbyhigh-voltageelectronmicroscopictomographyandgraphicimagereconstruct1n.Journalofstructuralb1logy1993，110(1):39-54.)0其中適合骨組織工程的支架孔徑大小為20-1500μπι(MurphyCM，HaughMG，O’BrienFJ:Theeffectofmeanporesizeoncellattachment,proliferat1nandmigrat1nincollagen-glycosaminoglycanscaffoldsforbonetissueengineering.B1materials2010，31(3):461-466.)，45%的孔隙率(Karageorg1uV，KaplanD:Porosityof3Db1materialscaffoldsandosteogenesis.B1materials2005，26(27):5474-5491.),最大應力為5.3MPa或者更大(Karageorg1uV,KaplanD:Porosityof3Db1materialscaffoldsandosteogenesis.B1materials2005，26(27):5474-5491.)。因此，有必要利用有序支架來模擬密質骨內羥基磷灰石的有序結構，并且模擬細胞生長的細胞外基質(ECM)環境。在三維條件下模擬細胞外基質(ECM)并且構建具有一定結構的組織工程支架是研究熱點(HubbellJA:Materialsasmorphogeneticguidesintissueengineering.CurrOpinB1tech2003，14(5):551-558.)。可以用許多處理方法來制備具有納米、微觀和宏觀尺度的天然或合成纖維支架(StevensMMjGeorgeJH:Exploringandengineeringthecellsurfaceinterface.Science2005，310(5751):1135-1138.BowlinGL:Anewspinonscaffold.MaterToday2004，7(5):64.)。但要模擬復雜的天然細胞外基質仍然比較困難，因為支架的結構和化學性質會影響到細胞反應(SunTjNortonD，RyanA，MacNeilS，HaycockJ:1nvestigat1noffibroblastandkeratinocytecell-scaffoldinteract1nsusinganovel3Dcellculturesystem.JournalofMaterialsScience:MaterialsinMedicine2007，18(2):321-328.)。通過絲狀偽足可以觀察粘附細胞與ECM之間的相互作用，因為細胞在起始階段會前伸，然后形成片狀偽足。這主要是由于受體整合素的作用，細胞才會粘附到ECM的配體(DalbyMjChildsS，RiehleMjJohnstoneH，AffrossmanS，CurtisA:Fibroblastreact1ntoislandtopography:changesincytoskeletonandmorphologywithtime.B1materials2003，24(6):927-935.)。如果細胞粘附在合成材料支架上，則可以通過吸附的一層很薄的蛋白質來調控細胞-支架材料之間的相互作用。其中體外細胞行為主要受宏觀、微觀和納米尺度的表面化學和形貌影響(StevensMM，GeorgeJH:Exploringandengineeringthecellsurfaceinterface.Science2005，310(5751):1135-1138.)。其中有序支架與ECM中蛋白質和多糖復雜的化學和物理交聯網絡的取向結構類似，可以指導細胞在空間的生長方向，并且對細胞行為進行調控(XuC，InaiR，KotakiM，RamakrishnaS:Alignedb1degradablenanofibrousstructure:apotentialscaffoldforbloodvesselengineering.B1materials2004，25(5):877-886.)。因此，可以利用有序支架模擬密質骨內ECM的取向結構，并且對成骨細胞在有序支架上的迀移、粘附和增殖進行調控，進而對骨修復效果進行調控。[0006]可以應用于醫用的合成高分子有聚氧乙烯(PEO)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯酸(PAA)、聚乙二醇(PEG)、左旋聚乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚己內酯(PCL)、聚乳酸(PLA)(KarageorgiouV，KaplanD:Porosityof3Db1materialscaffoldsandosteogenesis.B1materials2005，26(27):5474-5491.RezwanK，ChenQZ,BlakerJJ,BoccacciniAR:B1degradableandb1activeporouspolymer/inorganiccompositescaffoldsforbonetissueengineering.B1materials2006，27(18):3413-3431.)等。相比其它的可生物降解聚合物PGA和PCL，PLA的溶融紡絲更容易實現，并且可以制得粗細均勾和質量較好的纖維(RezwanK，ChenQZ,BlakerJJ,BoccacciniAR:B1degradableandb1activeporouspolymer/inorganiccompositescaffoldsforbonetissueengineering.B1materials2006，27(18):3413-3431.NairLS,LaurencinCT:B1degradablepolymersasb1materials.ProgPolymSci2007，32(8-9):762-798.)。[0007]根據纖維支架制備方法可以看出，這些纖維形成的支架主要為無序支架。而有序支架的概念是在1991年提出，當時Rizvi(RizviAHjffassermanAJjZazanisGjSilverFH:Evaluat1nofPeripheral-NerveRegenerat1ninthePresenceofLongitudinallyAlignedCollagen-Fibers.CellMater1991，I(4):279-289.)將平行有序排列的小直徑膠原纖維放置在硅膠管上，膠原纖維便形成10mm間距的有序支架。實驗結果表明成纖維細胞和雪旺細胞可以沿著膠原纖維有序排列的方向進行迀移。同時，這種有序排列的纖維可以提高組織再生效果，并且有序支架可以控制和引導細胞的生長方向。[0008]生物材料的表面改性是制備仿生材料的一種常用方法，其中生物材料與生物活性分子的結合是一種簡單的改性方法。利用長鏈蛋白如纖連蛋白(FN)、玻連蛋白(VN)和層粘連蛋白(LN)和支架結合可以促進細胞粘附和增殖(HumphriesMJ,AkiyamaSKjKomoriyaAjOldenK，YamadaKM:1dentificat1nofanalternativelysplicedsiteinhumanplasmafibronectinthatmediatescelltype-specificadhes1n.TheJournalofcellb1logy1986,103(6):2637-2647.)^而其它的改性方法有等離子體處理(提高支架表面親水性和細胞粘附)(YangJjBeiJjWangS:Enhancedcellaffinityofpoly(D，L-1actide)bycombiningplasmatreatmentwithcollagenanchorage.B1materials2002，23(12):2607-2614.)、表面涂層(促進細胞鋪展、粘附和生長)(HeW，MaZ,YongT，TeoWE,RamakrishnaS:Fabricat1nofcollagen-coatedb1degradablepolymernanofibermeshanditspotentialforendothelialcellsgrowth.B1materials2005，26(36):7606-7615.)和表面接枝(提高細胞鋪展和增殖)(MaZ,KotakiM，YongT，HeW，RamakrishnaS:Surfaceengineeringofelectrospunpolyethyleneterephthalate(PET)nanofiberstowardsdevelopmentofanewmaterialforbloodvesselengineering.B1materials2005，26(15):2527-2536.)等。而表面涂層有很多種類，比如熱噴涂、濺射鍍膜、脈沖激光沉積、動態混合涂層、浸漬涂層、溶膠-凝膠、電泳沉積、熱等靜壓和溶液沉積等(SunLjBerndtCC，GrossKAjKucukA:Materialfundamentalsandclinicalperformanceofplasma-sprayedhydroxyapatitecoatings:areview.JB1meclMaterRes2001，58(5):570-592.YangY，KimK-HjOngJL:Areviewoncalciumphosphatecoatingsproducedusingasputteringprocess——analternativetoplasmaspraying.B1materials2005，26(3):327-337.)。其中浸漬涂層是一種容易實現的方法，其實驗過程是先配制一定濃度的浸漬液，然后將材料浸漬其中一定時間，再將其取出在一定溫度條件下干燥，可以得到浸漬涂層的材料。在使用涂層方法改變材料的化學性質時，需要考慮涂層效果的穩定性(SunL,BerndtCC,GrossKA,KucukA:Materialfundamentalsandclinicalperformanceofplasma-sprayedhydroxyapatitecoatings:areview.JB1medMaterRes2001，58(5):570-592.)，即不會發生浸漬液與材料分離現象，不會使涂層效果減弱。在浸漬涂層支架時，膠原和殼聚糖是兩種常用的浸漬液。其中膠原蛋白是許多組織ECM的主要成分，并且其纖維結構有助于細胞粘附(ElsdaleT,BardJ:Collagensubstrataforstudiesoncellbehav1r.TheJournalofcellb1logy1972，54(3):626-637.)。而殼聚糖具有較好的生物降解和生物兼容性，沿著殼聚糖鏈的氨基和羥基能夠形成穩定的共價鍵，在生物醫學領域有廣泛應用(Cust0d1C，CerqueiraΜ,MarquesA，ReisR，ManoJ:Cellselectivechitosanmicroparticlesasinjectablecellcarriersfortissueregenerat1n.B1materials2015，43:23-31.)oFu(FuX，XuMjLiuJ，QiY，LiS，WangH:Regulat1nofmigratoryactivityofhumankeratinocytesbytopographyofmultiscalecollagen-containingnanofibrousmatrices.B1materials2014，35(5):1496—1506.)禾Ij用浸潰涂層方法制備了膠原涂層支架，并且在其上種植角質細胞，實驗結果表明膠原涂層支架可以提高細胞的遷移、增殖和粘附cXheng【l】(ChengZYjTeohSH:Surfacemodificat1nofultrathinpoly(epsilon-caprolactone)filmsusingaeryIicacidandcollagen.B1materials2004，25(11):1991-2001.)的研究結果表明膠原涂層后的PCL膜具有較小的接觸角，并且細胞粘附和增殖效果得到提高。而(LinC-CjFuS-JjLinY-C，Yang1-K,GuY:Chitosan-coatedelectrospunPLAfibersforrapidmineralizat1nofcalciumphosphate.1ntJB1lMacromol2014，68:39—47.)和(MehrNG,LiXjChenG，FavisBD,HoemannCD:PoresizeandLbLchitosancoatinginfluencemesenchymalstemcellinvitrofibrosisandb1mineralizat1nin3Dporouspoly(epsi1n-caprolactone)scaffolds.JB1medMaterResA2014.)的研究結果表明殼聚糖涂層支架也可以促進細胞迀移、粘附和增殖。[0009]目前，有序支架的制備方法主要有靜電紡絲法、單向熱拉伸法、熔融沉積法、纖維打結法、脈沖熱封機熱壓法、紫外光固化粘合劑法。利用不同的接收裝置和接收方法制備有序支架的靜電紡絲方法，在某種程度上具有一些優勢，比如廣泛的醫用高分子材料、簡單的制備過程、納米尺度的纖維直徑和較高的孔隙率。但這種支架的力學性能較差，支架中有序纖維根數無法知道，纖維與纖維之間的粘合效果較差，并且國內沒有規模化制備靜電紡納米纖維的寬幅設備。利用靜電紡絲方法制備有序支架現在也只是小量實驗階段，無法滿足產業化實際應用要求。單向熱拉伸方法在拉伸過程中很容易造成纖維的斷裂，并且拉力的不均勻性會引起支架表面的不平整。熔融沉積法是借助計算機輔助技術來實現纖維的有序排列，操作過程比較復雜，成本較高。纖維打結法、脈沖熱封機熱壓法和紫外光固化粘合劑法在制備有序支架過程中，很難控制有序支架中纖維的根數和形成較大尺寸的支架。【
發明內容】[0010]本發明的目的是針對現有技術存在的不足，而提供一種具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的支架制備方法。[0011]本發明的具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的支架制備方法，有以下五種技術解決方案。[0012]方案一:具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的支架制備方法，其特征是包括如下步驟:1)將具有光滑表面、圓形橫截面、直徑70.30μπι-0.16mm、熔點170.69°C的醫用聚左旋乳酸(PLLA)熔融紡纖維平行排列成為有序纖維束；2)采用以下a)?c)中任一方法，將步驟I)的平行排列的醫用聚左旋乳酸熔融紡有序纖維束制備成有序支架:a)攪拌下，將聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)溶解在四氫呋喃溶液中，配制體積濃度為5%的聚乳酸-羥基乙酸共聚物的四氫呋喃溶液，將配制的聚乳酸-羥基乙酸共聚物的四氫呋喃溶液均勻刷涂在平行排列的醫用聚左旋乳酸有序纖維束的正反面各兩次，然后將其放在通風櫥中，使四氫呋喃完全揮發，在60°C下烘干，再將其浸沒在液氮中淬火5min，淬火結束后，放在通風櫥中干燥，去除冷凝的水蒸氣，然后將其放置在四氫呋喃中0.5-5s，在45°C下真空干燥；b)攪拌下，將聚乙醇酸(PGA)溶解在四氫呋喃溶液中，配制體積濃度為5%的聚乙醇酸的四氫呋喃溶液，將配制的聚乙醇酸的四氫呋喃溶液均勻刷涂在平行排列的醫用聚左旋乳酸有序纖維束的正反面各兩次，然后將其放在通風櫥中，使四氫呋喃完全揮發，在60°C下烘干，再將其浸沒在液氮中淬火5min，淬火結束后，放在通風櫥中干燥，去除冷凝的水蒸氣，然后將其放置在四氫呋喃中0.5-5S，在45°C下真空干燥；c)攪拌下，將聚己內酯(PCL)溶解在四氫呋喃溶液中，配制體積濃度為5%的聚己內酯的四氫呋喃溶液，將配制的聚己內酯的四氫呋喃溶液均勻刷涂在平行排列的醫用聚左旋乳酸有序纖維束的正反面各兩次，然后將其放在通風櫥中，使四氫呋喃完全揮發，在60°C下烘干，再將其浸沒在液氮中淬火5min，淬火結束后，放在通風櫥中干燥，去除冷凝的水蒸氣，然后將其放置在四氫呋喃中0.5-5S，在45°C下真空干燥。[0013]方案二:具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的支架制備方法，其特征是包括如下步驟:1)將具有光滑表面、圓形橫截面、直徑70.30μπι-0.16mm、熔點170.69°C的醫用聚左旋乳酸(PLLA)熔融紡纖維平行排列成為有序纖維束；2)攪拌下，將聚左旋乳酸溶解在四氫呋喃溶液中，配制體積濃度為5%的聚左旋乳酸的四氫呋喃溶液，將配制的聚左旋乳酸的四氫呋喃溶液均勻刷涂在步驟I)的平行排列的醫用左旋聚乳酸有序纖維束的正反面各兩次，然后放在通風櫥中，使四氫呋喃完全揮發。[0014]方案三:具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的支架制備方法，其特征是包括如下步驟:1)將具有光滑表面、圓形橫截面、直徑70.30μπι-0.16mm、熔點170.69°C的醫用聚左旋乳酸(PLLA)熔融紡纖維平行排列成為有序纖維束；2)攪拌下，將聚左旋乳酸切片溶解在四氫呋喃溶液中，配制體積濃度為5%的左旋聚乳酸的四氫呋喃溶液，將配制的左旋聚乳酸的四氫呋喃溶液均勻刷涂在步驟I)的平行排列的醫用左旋聚乳酸有序纖維束的正反面各兩次，然后放在通風櫥中，使四氫呋喃完全揮發，得到有序支架；3)攪拌下，將乙酸溶解在去離子水中，配制體積濃度為2%的乙酸水溶液，將膠原溶解到乙酸水溶液中，配制質量濃度為0.5%的膠原乙酸溶液，將步驟2)的有序支架完全浸沒在膠原乙酸溶液中3h，取出，放在通風櫥中，使乙酸完全揮發，在37°C條件下干燥。[0015]方案四:具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的支架制備方法，其特征是包括如下步驟:1)將具有光滑表面、圓形橫截面、直徑70.30μπι-0.16mm、熔點170.69°C的醫用聚左旋乳酸(PLLA)熔融紡纖維平行排列成為有序纖維束；2)攪拌下，將聚左旋乳酸切片溶解在四氫呋喃溶液中，配制體積濃度為5%的聚左旋乳酸的四氫呋喃溶液，將配制的聚左旋乳酸的四氫呋喃溶液均勻刷涂在步驟I)的平行排列的醫用左旋聚乳酸有序纖維束的正反面各兩次，然后放在通風櫥中，使四氫呋喃完全揮發，得到有序支架；3)攪拌下，將乙酸溶解在去離子水中，配制體積濃度為2%的乙酸水溶液，將殼聚糖溶解在乙酸水溶液中，配制質量濃度為1%的殼聚糖乙酸溶液，將步驟2)的有序支架完全浸沒在殼聚糖乙酸溶液中3h，取出，放在通風櫥中使乙酸完全揮發，在37°C條件下干燥。[0016]方案五:具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的支架制備方法，其特征是包括如下步驟:將聚左旋乳酸(PLLA)切片溶解于三氯甲烷和N，N二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶劑中，混合溶劑中三氯甲烷和N，N二甲基甲酰胺的體積比為9:1，攪拌至完全溶解配制質量濃度為8%的紡絲液，采用靜電紡絲法制備支架，控制靜電紡絲設備中紡絲電壓為12kv，注射針頭流量為0.8mL/h，接收輥轉速為1000轉/分，接收距離為20cm，紡絲時間為5h，紡絲時環境溫度為23°C，濕度為64%，所用注射管的體積為20mL，注射針頭內徑為6mm，注射針頭長度為10cm0[0017]本發明的有益效果在于:本發明方法工藝簡單，制備的具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的支架具有良好的生長、粘附、迀移和增殖性能，成骨細胞在本發明制備的有序支架上呈現方向性的生長、粘附和迀移效果，并且成骨細胞的生長方向沿著有序支架中PLLA纖維取向分布的方向。該有序支架具有較好的應用前景，可以應用骨關節炎患者和骨修復等骨組織工程領域。【附圖說明】[0018]圖1是成骨細胞在實施例1PLLA-PLGA有序支架上的方向性生長、粘附和迀移結果O[0019]圖2是成骨細胞在實施例2PLLA-PGA有序支架上的方向性生長、粘附和迀移結果。[0020]圖3是成骨細胞在實施例3PLLA-PCL有序支架上的方向性生長、粘附和迀移結果。[0021]圖4是成骨細胞培養在實施例1、2、3制備的有序支架上培養Id、3d、5d后的增殖結果比較。[0022]圖5是成骨細胞在實施例4PLLA-PLLA熔融紡纖維有序支架上的方向性生長、粘附和迀移結果。[0023]圖6是成骨細胞在實施例5PLLA靜電紡納米纖維有序支架上的方向性生長、粘附和迀移結果。[0024]圖7是成骨細胞培養在實施例4、5制備的有序支架上培養ld、3d后的增殖結果比較。[0025]圖8是成骨細胞在實施例6膠原涂層聚左旋乳酸熔融紡纖維有序支架上的方向性生長、粘附和迀移結果。[0026]圖9是成骨細胞在實施例7殼聚糖涂層聚左旋乳酸熔融紡纖維有序支架上的方向性生長、粘附和迀移結果。[0027]圖10是成骨細胞培養在實施例6、7制備的有序支架上培養ld、3d后的增殖結果及與實施例5的結果比較。【具體實施方式】[0028]以下結合實施例進一步說明本發明。[0029]實施例1:將具有光滑表面、圓形橫截面、直徑0.16mm、熔點170.69°C的醫用PLLA熔融紡纖維進行平行排列成為有序纖維束;將0.5gPLGA切片(購自山東省醫療器械研究所中試廠，分子量為30萬，熔點為54.33°C)溶解于1mL四氫呋喃中，攪拌直到完全溶解形成均勻PLGA/四氫呋喃溶液(體積濃度為5%)。把PLGA/四氫呋喃溶液均勻刷涂在PLLA有序纖維束的正反面各兩次，然后將其放在通風櫥中24h，使四氫呋喃完全揮發，在60°C的烘箱中烘干20min，再將其浸沒在液氮中淬火5min。淬火結束后，放在通風櫥中干燥30min，去除冷凝的水蒸氣。并且將其放置在四氫呋喃中Is，然后在真空烘箱中45°C下干燥24h，得到具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的PLLA-PLGA有序支架。[0030]圖1是成骨細胞在本例制得的PLLA-PLGA有序支架上的生長、粘附、迀移和增殖結果，由圖可見，成骨細胞在有序支架上呈現方向性的生長、粘附和迀移效果。成骨細胞的生長方向沿著有序支架中PLLA熔融紡纖維取向分布的方向。[0031]成骨細胞在本例制得的PLLA-PLGA有序支架上培養ld、3d、5d后的增殖效果見圖4，該支架具有良好的細胞相容性，沒有毒性，可以促進細胞的生長和增殖。[0032]實施例2:將具有光滑表面、圓形橫截面、直徑0.16mm、熔點170.69°C的醫用PLLA熔融紡纖維進行平行排列成為有序纖維束;將0.5gPGA切片(購自山東省醫療器械研究所中試廠，分子量為30萬，熔點為209.22°C)溶解于1mL四氫呋喃中，攪拌直到完全溶解形成均勻PGA/四氫呋喃溶液(體積濃度為5%)。把PGA/四氫呋喃溶液均勻刷涂在PLLA有序纖維束的正反面各兩次，然后將其放在通風櫥中24h，使四氫呋喃完全揮發，在60°C的烘箱中烘干20min，再將其浸沒在液氮中淬火5min。淬火結束后，放在通風櫥中干燥30min，去除冷凝的水蒸氣。并且將其放置在四氫呋喃中IS，在45°C下真空干燥24h，得到具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的PLLA-PGA有序支架。[0033]圖2是成骨細胞在本例制得的PLLA-PGA有序支架上的生長、粘附、迀移和增殖結果，由圖可見，成骨細胞在有序支架上呈現方向性的生長、粘附和迀移效果。成骨細胞的生長方向沿著有序支架中PLLA熔融紡纖維取向分布的方向。[0034]成骨細胞在本例制得的PLLA-PGA有序支架上培養ld、3d、5d后的增殖效果見圖4，該支架具有良好的細胞相容性，沒有毒性，可以促進細胞的生長和增殖。[0035]實施例3:將具有光滑表面、圓形橫截面、直徑0.16mm、熔點170.69°C的醫用PLLA熔融紡纖維進行平行排列成為有序纖維束;將0.5gPCL切片(購自山東省醫療器械研究所中試廠，分子量為30萬，熔點為59.77°C)溶解于1mL四氫呋喃中，攪拌直到完全溶解形成均勻PCL/四氫呋喃溶液(體積濃度為5%)。把PCL/四氫呋喃溶液均勻刷涂在PLLA有序纖維束的正反面各兩次，然后將其放在通風櫥中24h，使四氫呋喃完全揮發。在60°C的烘箱中烘干20min，再將其浸沒在液氮中淬火5min。淬火結束后，在通風櫥中干燥30min，去除冷凝的水蒸氣。并且將其放置在四氫呋喃中IS，在45°C下真空干燥24h，得到具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的PLLA-PCL有序支架。[0036]圖3是成骨細胞在本例制得的PLLA-PCL有序支架上的生長、粘附、迀移和增殖結果，由圖可見，成骨細胞在有序支架上呈現方向性的生長、粘附和迀移效果。并且成骨細胞的生長方向沿著有序支架中PLLA熔融紡纖維取向分布的方向。[0037]成骨細胞在本例制得的PLLA-PCL有序支架上培養ld、3d、5d后的增殖效果見圖4，該支架具有良好的細胞相容性，沒有毒性，可以促進細胞的生長和增殖。[0038]實施例4:將具有光滑表面、圓形橫截面、直徑70.30μπι、熔點170.69°C的醫用PLLA恪融紡纖維進行平行排列成為有序纖維束;將IgPLLA切片(購自濟南岱罡生物工程有限公司，分子量為30萬，熔點為176.9°C)溶解于20mL四氫呋喃中，攪拌直到完全溶解形成均勻PLLA/四氫呋喃溶液(體積濃度為5%)ο把PLLA/四氫呋喃溶液均勻刷涂在PLA有序纖維束的正反面各兩次，把濕的有序支架放在通風櫥中24h，使四氫呋喃完全揮發，得到干燥后的具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的PLLA-PLLA有序支架。[0039]圖5是成骨細胞在本例制得的PLLA-PLLA有序支架上的生長、粘附、迀移和增殖結果，由圖可見，成骨細胞在有序支架上呈現方向性的生長、粘附和迀移效果。并且成骨細胞的生長方向沿著有序支架中PLLA熔融紡纖維取向分布的方向。[0040]成骨細胞在本例制得的PLLA-PLLA有序支架上培養1、3、5d后的增殖效果見圖4，該支架具有良好的細胞相容性，沒有毒性，可以促進細胞的生長和增殖。[0041]實施例5:將0.8g的PLLA切片溶解于10mL三氯甲烷和N，N二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶劑中，混合溶劑中三氯甲烷和DMF的體積比為9:1，攪拌至完全溶解制備質量濃度8%的紡絲液。利用靜電紡絲設備，并控制紡絲電壓為12kv，注射針頭流量為0.8mL/h，接收輥轉速為1000轉/分，接收距離為20cm，紡絲時間為5h，紡絲時環境溫度為23°C，濕度為64%。所用注射管的體積為20mL，注射針頭內徑為6mm，注射針頭長度為10cm的條件制備具有光滑表面和圓形橫截面，纖維直徑為510nmPLLA納米纖維有序支架。[0042]圖6是成骨細胞在本例制得的PLLA納米纖維有序支架上的生長、粘附、迀移和增殖結果，由圖可見，成骨細胞在有序支架上呈現方向性的生長、粘附和迀移效果。并且成骨細胞的生長方向沿著有序支架中PLLA熔融紡纖維取向分布的方向。[0043]成骨細胞在本例制得的PLLA納米纖維有序支架上培養ld、3d后的增殖效果見圖7，該支架具有良好的細胞相容性，沒有毒性，可以促進細胞的生長和增殖。[0044]實施例6:將具有光滑表面、圓形橫截面、直徑70.30μπι、熔點170.69V的醫用PLLA熔融紡纖維進行平行排列成為有序纖維束;將IgPLLA切片(購自濟南岱罡生物工程有限公司，分子量為30萬，熔點為176.9°C)溶解于20mL四氫呋喃中，攪拌直到完全溶解形成均勻PLLA/四氫呋喃溶液(體積濃度為5%)ο把PLLA/四氫呋喃溶液均勻刷涂在PLA有序纖維束的正反面各兩次，把濕的有序支架放在通風櫥中24h，使四氫呋喃完全揮發，得到干燥后的有序支架。[0045]然后將有序支架進行膠原涂層改性。首先將乙酸溶解在去離子水中，配制體積濃度為2%的100mL乙酸溶液。稱取0.5g膠原溶解在上述乙酸溶液中，直至膠原完全溶解，制備質量濃度0.5%的膠原乙酸溶液。將制備好的有序支架放入玻璃器皿中，并倒入膠原溶液使支架完全浸沒在膠原溶液中3h。浸泡結束后，將有序支架從玻璃器皿中取出，放在通風櫥中24h，再將其放在37°C的電熱鼓風干燥箱中3h使其完全干燥，得到膠原涂層聚左旋乳酸熔融紡纖維有序支架。[0046]圖8是成骨細胞在本例制得的膠原涂層聚左旋乳酸熔融紡纖維有序支架上的生長、粘附、迀移和增殖結果，由圖可見，成骨細胞在有序支架上呈現方向性的生長、粘附和迀移效果。并且成骨細胞的生長方向沿著有序支架中PLLA熔融紡纖維取向分布的方向。[0047]成骨細胞在本例制得的膠原涂層聚左旋乳酸熔融紡纖維有序支架上培養ld、3d后的增殖效果見圖10，該支架具有良好的細胞相容性，沒有毒性，可以促進細胞的生長和增殖。[0048]實施例7:將具有光滑表面、圓形橫截面、直徑70.30μπι、熔點170.69V的醫用PLLA熔融紡纖維進行平行排列成為有序纖維束;將IgPLLA切片(購自濟南岱罡生物工程有限公司，分子量為30萬，熔點為176.9°C)溶解于20mL四氫呋喃中，攪拌直到完全溶解形成均勻PLLA/四氫呋喃溶液(體積濃度為5%)ο把PLLA/四氫呋喃溶液均勻刷涂在PLA有序纖維束的正反面各兩次，把濕的有序支架放在通風櫥中24h，使四氫呋喃完全揮發，得到干燥后的有序支架。[0049]然后將有序支架進行殼聚糖涂層改性。首先將乙酸溶解在去離子水中，配制得到體積濃度為2%的乙酸溶液。稱取0.5g殼聚糖溶解在50mL體積濃度為2%的乙酸溶液中，直至殼聚糖完全溶解，制備質量濃度I%的殼聚糖乙酸溶液。其中殼聚糖的DAC>85%，80目，購自濟南海得貝海洋生物工程有限公司。將制備好的有序支架放入玻璃器皿中，并倒入殼聚糖乙酸溶液使支架完全浸沒在殼聚糖乙酸溶液中3h。浸泡結束后，將有序支架從玻璃器皿中取出，放在通風櫥中24h，再將其放在37°C的電熱鼓風干燥箱中3h使其完全干燥，得到殼聚糖涂層聚左旋乳酸熔融紡纖維有序支架。[0050]圖9是成骨細胞在本例制得的殼聚糖涂層聚左旋乳酸熔融紡纖維有序支架上的生長、粘附、迀移和增殖結果，由圖可見，成骨細胞在有序支架上呈現方向性的生長、粘附和迀移效果。并且成骨細胞的生長方向沿著有序支架中PLLA熔融紡纖維取向分布的方向。[0051]成骨細胞在本例制得的殼聚糖涂層聚左旋乳酸熔融紡纖維有序支架上培養ld、3d后的增殖效果見圖10，該支架具有良好的細胞相容性，沒有毒性，可以促進細胞的生長和增殖。【主權項】1.具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的支架制備方法，其特征是包括如下步驟:1)將具有光滑表面、圓形橫截面、直徑70.30ym-0.16mm、熔點170.69°C的醫用聚左旋乳酸熔融紡纖維平行排列成為有序纖維束；2)采用以下a)?c)中任一方法，將步驟I)的平行排列的醫用聚左旋乳酸熔融紡有序纖維束制備成有序支架:a)攪拌下，將聚乳酸-羥基乙酸共聚物溶解在四氫呋喃溶液中，配制體積濃度為5%的聚乳酸-羥基乙酸共聚物的四氫呋喃溶液，將配制的聚乳酸-羥基乙酸共聚物的四氫呋喃溶液均勻刷涂在平行排列的醫用聚左旋乳酸有序纖維束的正反面各兩次，然后將其放在通風櫥中，使四氫呋喃完全揮發，在60°C下烘干，再將其浸沒在液氮中淬火5min，淬火結束后，放在通風櫥中干燥，去除冷凝的水蒸氣，然后將其放置在四氫呋喃中0.5-5s，在45°C下真空干燥；b)攪拌下，將聚乙醇酸溶解在四氫呋喃溶液中，配制體積濃度為5%的聚乙醇酸的四氫呋喃溶液，將配制的聚乙醇酸的四氫呋喃溶液均勻刷涂在平行排列的醫用聚左旋乳酸有序纖維束的正反面各兩次，然后將其放在通風櫥中，使四氫呋喃完全揮發，在60°C下烘干，再將其浸沒在液氮中淬火5min，淬火結束后，放在通風櫥中干燥，去除冷凝的水蒸氣，然后將其放置在四氫呋喃中0.5-5S，在45°C下真空干燥；c)攪拌下，將聚己內酯溶解在四氫呋喃溶液中，配制體積濃度為5%的聚己內酯的四氫呋喃溶液。將配制的聚己內酯的四氫呋喃溶液均勻刷涂在平行排列的醫用聚左旋乳酸有序纖維束的正反面各兩次，然后將其放在通風櫥中，使四氫呋喃完全揮發，在60°C下烘干，再將其浸沒在液氮中淬火5min，淬火結束后，放在通風櫥中干燥，去除冷凝的水蒸氣，然后將其放置在四氫呋喃中0.5-5S，在45°C下真空干燥。2.具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的支架制備方法，其特征是包括如下步驟:1)將具有光滑表面、圓形橫截面、直徑70.30ym-0.16mm、熔點170.69°C的醫用聚左旋乳酸熔融紡纖維平行排列成為有序纖維束；2)攪拌下，將聚左旋乳酸溶解在四氫呋喃溶液中，配制體積濃度為5%的聚左旋乳酸的四氫呋喃溶液，將配制的聚左旋乳酸的四氫呋喃溶液均勻刷涂在步驟I)的平行排列的醫用左旋聚乳酸有序纖維束的正反面各兩次，然后放在通風櫥中，使四氫呋喃完全揮發。3.具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的支架制備方法，其特征是包括如下步驟:1)將具有光滑表面、圓形橫截面、直徑70.30ym-0.16mm、熔點170.69°C的醫用聚左旋乳酸熔融紡纖維平行排列成為有序纖維束；2)攪拌下，將聚左旋乳酸切片溶解在四氫呋喃溶液中，配制體積濃度為5%的左旋聚乳酸的四氫呋喃溶液，將配制的左旋聚乳酸的四氫呋喃溶液均勻刷涂在步驟I)的平行排列的醫用左旋聚乳酸有序纖維束的正反面各兩次，然后放在通風櫥中，使四氫呋喃完全揮發，得到有序支架；3)攪拌下，將乙酸溶解在去離子水中，配制體積濃度為2%的乙酸水溶液，將膠原溶解到乙酸水溶液中，配制質量濃度為0.5%的膠原乙酸溶液，將步驟2)的有序支架完全浸沒在膠原乙酸溶液中3h，取出，放在通風櫥中，使乙酸完全揮發，在37°C條件下干燥。4.具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的支架制備方法，其特征是包括如下步驟:I)將具有光滑表面、圓形橫截面、直徑70.30ym-0.16mm、熔點170.69°C的醫用聚左旋乳酸熔融紡纖維平行排列成為有序纖維束；2)攪拌下，將聚左旋乳酸切片溶解在四氫呋喃溶液中，配制體積濃度為5%的聚左旋乳酸的四氫呋喃溶液，將配制的聚左旋乳酸的四氫呋喃溶液均勻刷涂在步驟I)的平行排列的醫用左旋聚乳酸有序纖維束的正反面各兩次，然后放在通風櫥中，使四氫呋喃完全揮發，得到有序支架；3)攪拌下，將乙酸溶解在去離子水中，配制體積濃度為2%的乙酸水溶液，將殼聚糖溶解在乙酸水溶液中，配制質量濃度為1%的殼聚糖乙酸溶液，將步驟2)的有序支架完全浸沒在殼聚糖乙酸溶液中3h，取出，放在通風櫥中使乙酸完全揮發，在37°C條件下干燥。5.具有促進成骨細胞方向性生長和迀移的支架制備方法，其特征是包括如下步驟:將聚左旋乳酸切片溶解于三氯甲烷和N，N二甲基甲酰胺的混合溶劑中，混合溶劑中三氯甲烷和N，N二甲基甲酰胺的體積比為9:1，攪拌至完全溶解配制質量濃度為8%的紡絲液，采用靜電紡絲法制備支架，控制靜電紡絲設備中紡絲電壓為12kv，注射針頭流量為0.8mL/h，接收棍轉速為1000轉/分，接收距離為20cm，紡絲時間為5h，紡絲時環境溫度為23°C，濕度為64%。所用注射管的體積為20mL，注射針頭內徑為6mm，注射針頭長度為10cm。【文檔編號】A61L27/18GK105944145SQ201610435977【公開日】2016年9月21日【申請日】2016年6月16日【發明人】馮建永【申請人】浙江理工大學