一種基于膠原制備組織工程表皮的方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于膠原制備組織工程表皮的方法，采用人表皮干細胞作為種子細胞，以經過牛胎盤I型膠原構建的3D無細胞基質作為支架，利用添加MMPs抑制劑的CELLnTEC培養系統，氣液界面分離法構建為一種有活性的全層組織工程表皮。與現有技術相比，本發明本發明利用通過分化培養基中添加MMPs抑制劑marimastat 5nM，有效減少了支架和人工表皮產品的收縮。利用I型牛膠原3D支架結合CELLnTEC培養系統，能夠維持表皮干細胞的增殖和分化，不使用成纖維細胞，有效減少了人工表皮產品制備過程中的工作量和操作步驟。
【專利說明】
_種基于膠原制備組織工程表皮的方法
技術領域
[0001]本發明涉及人體組織工程技術，尤其涉及一種基于膠原制備組織工程表皮的方法。【背景技術】
[0002]皮膚是人體與外界環境接觸的屏障，對人體起保護、分泌、代謝等作用，還參與免疫反應，維持機體內環境的穩定等。在臨床上大面積燒傷和嚴重創傷患者，由于缺乏可供移植的自體皮膚，患者康復困難，甚至導致死亡。同種異體皮或異種皮移植是目前臨床上治療大面積燒傷患者應用較多的方法，異種皮膚移植會引起嚴重的免疫排斥反應，這兩種皮膚最終都要遭到宿主組織免疫反應的排斥而脫落掉，因此只能作為暫時封閉創面的一種手段。組織工程皮膚技術的發展與應用為修復、維護和改善損傷皮膚組織功能和形態提供了新的途徑。通過體外分離培養表皮干細胞，體外誘導分化成皮膚結構，用于大面積燒傷患者迅速覆蓋創面，減少患者水分的丟失以及避免發生嚴重感染，為挽救患者生命以及自體皮膚的生長提供重要條件。
[0003]組織工程皮膚構建的三要素為種子細胞、支架材料和組織構建。
[0004]組織工程表皮的種子細胞來源皮膚表皮結構基底層的表皮干細胞、黑色素細胞等，表皮干細胞在一定的微環境下可被誘導向角化細胞分化。其中，表皮干細胞具有強大的增殖和分化潛能，是皮膚及其附屬器發生、修復、重建的關鍵源泉，且在體外培養時更容易保持表皮細胞表型。
[0005]支架材料是種子細胞黏附、生長、迀移、增殖和分化的載體，是組織工程皮膚的“真皮”部分。人工合成類支架材料降解速率和微結構容易在合成過程控制，因此容易大規模生產，但其最大缺點是缺乏細胞識別信號，不利于細胞黏附及特異基因激活。天然生物類材料來源的的組織工程產品支架具有良好的相容性和適宜的降解速度，但其缺點是力學能力差。目前多采用膠原、氨基多糖等，該類材料具有良好的力學性能、低免疫原性及天然膠原三維支架結構，是一種理想的組織工程支架材料。
[0006]組織構建是組織工程的關鍵技術，在一定的微環境下，將培養的種子細胞與支架材料復合進行組織構建是組織工程表皮產品的關鍵步驟。體外構建的組織工程皮膚產品在功能上要接近生理皮膚，表皮細胞必須具有含角化的多層細胞結構，才能保證皮膚移植后具有抗感染、抗摩擦、保濕等防護功能。表皮細胞以單純的浸沒式培養只能形成多層結構， 不能正常角化。而采用氣-液分離培養的方式進行體外培養，類同于模擬人體在體條件，能夠有效構建組織工程皮膚。[〇〇〇7]目前組織工程皮膚已有多種產品，但大多數產品存在著依賴成纖維細胞作為飼養層，操作步驟多，不易質控，不易操作等缺點。而單純應用生物材料支架存在支架和皮片收縮的問題。經檢索，目前以無細胞I型牛膠原作為支架，同時只接種表皮干細胞而不依賴與真皮成纖維細胞的產品還未見報道。陸洪光等發明了一種用表皮干細胞體外制作組織工程皮膚的方法(專利申請號200710201677.1)，該方法以表皮干細胞作為種子細胞，以去表皮真皮作為支架材料，將培養的表皮干細胞膜片接種于去表皮真皮上，進行液下液面培養而得組織工程皮膚。該方法存在一些不足，一是采用的支架材料僅通過去表皮處理，沒有經過脫細胞處理，會使支架材料中包含較多的細胞成分，用于臨床容易導致免疫排斥反應的發生。
【發明內容】
[0008]本發明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種基于膠原制備組織工程表皮的方法。
[0009]本發明通過以下技術方案來實現上述目的:
[0010]本發明采用人表皮干細胞作為種子細胞，以牛I型膠原構建的3D基質作為支架，利用氣液界面分離培養法復合構建為一種有活性的全層組織工程表皮，具體包括如下步驟:
[0011](1)表皮干細胞的分離和培養:
[0012]取同種皮膚組織小塊，含雙抗的PBS反復沖洗，置Dispasen中浸泡過夜，冷消化分離真皮、表皮，收集表皮皮片，剪為碎塊，胰酶熱消化，分離表皮干細胞，過濾并接種于I型牛膠原包被的培養皿中，通過專用選擇培養基篩選表皮干細胞；
[0013](2)1型牛膠原3D支架制備:[〇〇14]準備接種前1天，制備3D牛膠原支架，膠原配置:7.5ml 1.5mg/mL I型牛膠原溶液 10ml，lmL 10XDMEM，0.5mL NaH⑶3，lmL 200mM Hepes，0.1mL 1M NaOH，配制在低溫下進行，配制好后37°C條件下凝固30min，待膠原成固體后，緩慢添加PBS或基礎培養基置于培養箱中過夜，平衡PH;[〇〇15](3)接種表皮干細胞:[〇〇16]次日，吸棄培養板中平衡溶液待用，獲取培養至70%?80%融和狀態的P2代角質形成細胞，以Transwell培養小室作為氣液分離支架，支架上，接種6 X 105細胞數量于24mm 的嵌套培養皿的上室中，上室中添加Cnt-07，CELLnTEC培養基2ml，下室中添加Cnt-07， CELLnTEC培養基3ml繼續培養2天待細胞100 %匯合成片；[〇〇17](4)氣液分離培養構建組織工程皮膚:
[0018] 更換添加MMPs抑制劑marimastat 5nM，的角質細胞分化Cnt-3D，CELLnTEC培養基繼續培養2天，接種后第5天，將24mm的嵌套培養皿上室中液體吸出，保持細胞表面干燥，下室添加角質細胞分化Cnt-3D，CELLnTEC培養基0.8mL，液面不高于表皮細胞層，每天換液，至 12天角化表皮結構形成，即完成組織工程皮膚的制備過程。[0〇19] 進一步，步驟(1)中所述的Dispase II的濃度為3.3mg/ml，溫度4°C，消化時間為16 小時，步驟(2)中所述的I型牛膠原的濃度為1.5mg/ml;步驟(3)中所述的接種密度為6X 105 細胞數量于24mm培養面積，培養基為Cnt-07，CELLnTEC;步驟(4)中分化Cnt-3D，CELLnTEC培養基液體培養2天，氣液界面培養12天；步驟(4)中培養基中添加MMPs抑制劑marimastat 5nM;所述的同種皮膚組織源自健康兒童包皮環切術所切除的包皮組織。
[0020]本發明的有益效果在于:
[0021]本發明是一種基于膠原制備組織工程表皮的方法，與現有技術相比，本發明本發明利用通過分化培養基中添加MMPs抑制劑marimastat 5nM，有效減少了支架和人工表皮產品的收縮。利用I型牛膠原3D支架結合CELLnTEC培養系統，能夠維持表皮干細胞的增殖和分化，不使用成纖維細胞，有效減少了人工表皮產品制備過程中的工作量和操作步驟。【附圖說明】
[0022]圖1是本發明的角化細胞的分離培養與特征鑒定圖；
[0023]圖2是本發明的組織工程皮膚的組織學形態與特征鑒定圖；
[0024]圖3是本發明的移植后7天和14天的皮膚愈合情況對比圖；
[0025]圖4是本發明的組織學檢測皮膚再角化情況圖。【具體實施方式】
[0026]下面結合附圖對本發明作進一步說明:
[0027]本發明采用人表皮干細胞作為種子細胞，以牛I型膠原構建的3D基質作為支架，利用氣液界面分離培養法復合構建為一種有活性的全層組織工程表皮，具體包括如下步驟: [〇〇28](5)表皮干細胞的分離和培養:[〇〇29]取同種皮膚組織小塊，含雙抗的PBS反復沖洗，置Dispasell中浸泡過夜，冷消化分離真皮、表皮，收集表皮皮片，剪為碎塊，胰酶熱消化，分離表皮干細胞，過濾并接種于I型牛膠原包被的培養皿中，通過專用選擇培養基篩選表皮干細胞；
[0030](6)1型牛膠原3D支架制備:[〇〇31]準備接種前1天，制備3D牛膠原支架，膠原配置:7.5ml 1.5mg/mL I型牛膠原溶液 10ml，lmL 10XDMEM，0.5mL NaH⑶3，lmL 200mM Hepes，0.1mL 1M NaOH，配制在低溫下進行，配制好后37°C條件下凝固30min，待膠原成固體后，緩慢添加PBS或基礎培養基置于培養箱中過夜，平衡PH;[〇〇32](7)接種表皮干細胞:[〇〇33]次日，吸棄培養板中平衡溶液待用，獲取培養至70%?80%融和狀態的P2代角質形成細胞，以Transwell培養小室作為氣液分離支架，支架上，接種6 X 105細胞數量于24mm 的嵌套培養皿的上室中，上室中添加Cnt-07，CELLnTEC培養基2ml，下室中添加Cnt-07， CELLnTEC培養基3ml繼續培養2天待細胞100 %匯合成片；[〇〇34](8)氣液分離培養構建組織工程皮膚:
[0035] 更換添加MMPs抑制劑marimastat 5nM，的角質細胞分化Cnt_3D，CELLnTEC培養基繼續培養2天，接種后第5天，將24mm的嵌套培養皿上室中液體吸出，保持細胞表面干燥，下室添加角質細胞分化Cnt-3D，CELLnTEC培養基0.8mL，液面不高于表皮細胞層，每天換液，至 12天角化表皮結構形成，即完成組織工程皮膚的制備過程。[0〇36] 進一步，步驟(1)中所述的Dispase II的濃度為3.3mg/ml，溫度4°C，消化時間為16 小時，步驟(2)中所述的I型牛膠原的濃度為1.5mg/ml;步驟(3)中所述的接種密度為6X 105 細胞數量于24mm培養面積，培養基為Cnt-07，CELLnTEC;步驟(4)中分化Cnt-3D，CELLnTEC培養基液體培養2天，氣液界面培養12天；步驟(4)中培養基中添加MMPs抑制劑marimastat 5nM;所述的同種皮膚組織源自健康兒童包皮環切術所切除的包皮組織。
[0037]以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的方法和設備為本技術領域常規方法和設備。除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
[0038]進一步，如上所述的組織工程皮膚構建新方法，具體包括如下步驟:[〇〇39]表皮干細胞的分離和培養[〇〇4〇]取環狀切除術后小兒包皮(家屬知情同意)，將組織先后在碘伏與75%的乙醇中消毒，并在含1%抗生素的PBS中進行漂洗;剔除皮下脂肪層、血管、結締組織，剪成lcm2小塊， 置于3.3mg/ml dispasell中4°C消化14hr，機械分開表皮與真皮層。將表皮置于離心管中， 加入0 ? 25 %胰酶5ml，在37 °C孵箱中消化15min。加DMEM+10 %FBS終止消化，1500r/min X 5min，棄上清，加入無血清角化培養基，在斡旋器上瞬時震蕩6次。70wii無菌濾網過濾，吸取單細胞懸液，3 X 106接種在已包被0.1 % I型牛膠原的培養皿中，置37 °C、體積分數為5 % C02 飽和濕度的培養箱中培養。待細胞長成70%?80%融和狀態時，用Tryple消化細胞5min， PBS稀釋消化液終止消化，吹打混懸，離心收集細胞，加培養基，轉移至I型膠原包被好的培養皿內，繼續培養至P2代，每兩天換液，用作構建表皮的種子細胞。[〇〇411 I型牛膠原3D支架制備[0〇42] 準備接種前1天，制備3D牛膠原支架。膠原配置(10ml):7.5ml 1.5mg/mL I型牛膠原溶液，lmL 10XDMEM，0.5mL NaHC03，lmL 200mM Hepes，0.1mLlM NaOH，配制在低溫下進行，配制好后37°C條件下凝固30min。待膠原成固體后，緩慢添加PBS或基礎培養基置于培養箱中過夜，平衡PH。[〇〇43]接種表皮干細胞[〇〇44]次日，吸棄培養板中平衡溶液待用。獲取培養至70%?80%融和狀態的P2代角質形成細胞，以Transwell培養小室作為氣液分離支架，支架上，接種6 X 105細胞數量于24mm 的嵌套培養皿的上室中，上室中添加培養基(Cnt-07，CELLnTEC)2ml，下室中添加培養基 (Cnt-07，CELLnTEC) 3ml繼續培養2天待細胞100 %匯合成片。
[0045]氣液分離培養構建組織工程皮膚
[0046]更換添加MMPs抑制劑mar imas tat 5nM。的角質細胞分化培養基(Cnt_3D， CELLnTEC)繼續培養2天。接種后第5天，將24mm的嵌套培養皿上室中液體吸出，保持細胞表面干燥，下室添加角質細胞分化培養基(Cnt-3D，CELLnTEC) 0.8mL，液面不高于表皮細胞層， 每天換液，至12天角化表皮結構形成，即完成組織工程皮膚的制備過程。[〇〇47]上述制備過程中所使用的表皮干細胞專用培養基為CELLnTEC公司的Cnt-07培養基；角化細胞分化專用培養基為CELLnTEC公司的Cnt-3D培養基并添加麗Ps抑制劑 marimastat 5nM〇[〇〇48]本發明的有益效果如下:本發明采用表皮干細胞作為種子細胞，利用I型牛膠原3D 支架結合CELLnTEC培養系統，能夠維持表皮干細胞的增殖和分化，不使用成纖維細胞，解決了單純表皮細胞在支架材料上增殖緩慢的缺點，并有效減少了人工表皮產品制備過程中的工作量和操作步驟。本發明利用通過分化培養基中添加MMPs抑制劑，有效減少了支架和人工表皮產品的收縮。【具體實施方式】
[0049][〇〇5〇]下面結合實施例對本發明進行詳細的描述。
[0051]種子細胞的篩選與培養是構建組織工程皮膚重要的一步。表皮干細胞因其具有較大的增殖和分化潛能成為種子細胞的首選，但該細胞的特征之一是慢周期性，細胞的增殖速度較慢。以前的方法多數通過添加真皮成纖維細胞作為種子細胞促進表皮干細胞的增殖與分化。本發明只采用表皮干細胞作為種子細胞，CELLnTEC系統培養，解決了依賴真皮成纖維細胞的缺點。[〇〇52]支架材料是組織工程的第二要素，本發明采用同種無細胞膠原作為支架材料，既具備了良好的天然皮膚結構，為種子細胞提供良好的支架環境;又具備了良好的生物相容性和極低免疫原性，有效促進種子細胞的黏附與增殖。[〇〇53]組織構建是組織工程的關鍵技術，本發明采用氣-液分離的方法，模擬人體在體條件，可有效構建組織工程皮膚。[〇〇54] 實施例1
[0055]表皮干細胞培養及分化各階段培養基的組成及培養方法與結果 [〇〇56]方法:取環狀切除術后小兒包皮(家屬知情同意)，將組織先后在碘伏與75%的乙醇中消毒，并在含1%抗生素的PBS中進行漂洗;剔除皮下脂肪層、血管、結締組織，剪成lcm X lcm小塊，置于3.3mg/ml dispasell中4°C消化14hr，機械分開表皮與真皮層。將表皮置于離心管中，加入0.2 5 %胰酶5m 1，在37 °C孵箱中消化15min。加DMEM+10 % FBS終止消化， 1500r/min X 5min，棄上清，加入無血清角化培養基，在斡旋器上瞬時震蕩6次。70wii無菌濾網過濾，吸取單細胞懸液，3 X 106接種在已包被0.1 % I型牛膠原的培養皿中，置37 °C、體積分數為5%C02飽和濕度的培養箱中培養。待細胞長成70%?80%融和狀態時，用Tryple消化細胞5min，PBS稀釋消化液終止消化，吹打混懸，離心收集細胞，加培養基，轉移至I型膠原包被好的培養皿內，繼續培養至P2代，每兩天換液，用作構建復合皮的種子細胞和進行細胞鑒定(K19及p63免疫細胞化學染色鑒定)。[〇〇57]結果:采用CELLnTEC公司的角化細胞選擇培養基能夠很好的實現人包皮角化細胞的增殖和純化。在原代3X106接種密度條件下，6-7天角化細胞能夠生長至80%匯合，傳代后，以IX 106密度接種，5天角化細胞能夠生長至80%匯合，細胞傳至2-3代增殖能力和純度最佳，適合用于構建組織工程皮膚。此方法分離純化的細胞具有角化細胞特征:呈鋪路石樣集落生長，免疫細胞化學染色結果顯示，表達角化細胞標志角蛋白19和核蛋白p63,陽性細胞比例占90%以上(圖1)。
[0058]實施例2
[0059]角質形成細胞代數、接種量、接種時間及氣液界面培養角質化層形成的方法與結果[0〇6〇] 方法:準備接種前1天，制備3D牛膠原支架。膠原配置(10ml): 7.5ml 1.5mg/mL I型牛膠原溶液，lmL 10XDMEM，0.5mL NaHC03，lmL 200mM Hepes，0.1mL 1M NaOH，配制在低溫下進行，配制好后37°C條件下凝固30min。待膠原成固體后，緩慢添加PBS或基礎培養基置于培養箱中過夜，平衡PH。次日，吸棄培養板中平衡溶液待用。獲取培養至70 %?80 %融和狀態的P2代角質形成細胞，接種6X105細胞數量于24mm的嵌套培養皿的上室中，上室中添加培養基(Cnt-07，CELLnTEC) 2ml，下室中添加培養基(Cnt-07，CELLnTEC) 3ml繼續培養2天待細胞100 %匯合成片，更換角質細胞分化培養基(Cnt-3D，CELLnTEC)繼續培養2天。第5天，將 24mm的嵌套培養皿上室中液體吸出，保持細胞表面干燥，下室添加角質細胞分化培養基(Cnt-3D，CELLnTEC)0.8mL，液面不高于表皮細胞層，每天換液，至12天角化表皮結構形成。
[0061] 結果:按上述方法能夠獲得直徑大于6cm的組織工程表皮，組織學結果證明其具有完整的基底細胞層、角質層以及3-5層的顆粒細胞和棘細胞層。免疫組化染色顯示基底層細胞表達P63蛋白，顆粒細胞和棘細胞層表達角蛋白10,角質層表達AKH1。以上結果均證明我們獲得了具有完整組織結構的組織工程表皮(圖2)。[〇〇62] 實施例3[〇〇63] 免疫缺陷小鼠皮膚移植試驗驗證組織工程皮膚移植安全性及治療效果 [〇〇64]方法:取6-8周，平均20g裸小鼠12只，雄性，采用隨機數字法分為4組。[〇〇65] A組:皮膚損傷后，僅進行組織工程皮膚移植。[〇〇66] B組:皮膚損傷后，進行相同的包扎處理。
[0067]皮膚移植具體過程:動物麻醉后，于動物背部近頸側靠近腹部一側做直徑12mm的圓形全層皮膚及肌筋膜的切除。創面覆蓋同樣大小的移植物，再用生物敷料貼于移植物上， 創可貼固定。術后觀察至小鼠完全蘇醒并能自由活動，分組放置常規飼養。術后大體情況觀察:連續觀察動物體溫、飲食、活動等一般情況。手術后每只動物每天傷口拍照，觀察創面愈合情況。皮膚活檢取材，常規行蘇木精-伊紅染色，鏡下觀察創面愈合情況。
[0068]結果:裸鼠組移植皮膚存活完好，皮膚紅潤，愈合良好。移植后第3天，觀察移植物貼合良好，證明皮膚移植模型構建成功。移植后第14天，各組創傷完全愈合，A組沒有形成瘢痕結構，傷口愈合質量最好(圖3,4)。移植后第60天時，皮片依舊存活良好，小鼠沒有其他生理病變，說明組織工程皮膚移植對受體沒有潛在安全性危害。[〇〇69]本發明構建所得的組織工程皮膚更接近天然皮膚的結構，組織形態學顯示該組織工程皮膚具有表皮的多層結構，表皮層中具有多層不同分化程度的細胞，達到了組織工程皮膚的形態學要求。
[0070]以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特征及本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。
【主權項】
1.一種基于膠原制備組織工程表皮的方法，其特征在于:采用人表皮干細胞作為種子 細胞，以牛I型膠原構建的3D基質作為支架，利用氣液界面分離培養法復合構建為一種有活 性的全層組織工程表皮，具體包括如下步驟:(1)表皮干細胞的分離和培養:取同種皮膚組織小塊，含雙抗的PBS反復沖洗，置Dispase II中浸泡過夜，冷消化分離 真皮、表皮，收集表皮皮片，剪為碎塊，胰酶熱消化，分離表皮干細胞，過濾并接種于I型牛膠 原包被的培養皿中，通過專用選擇培養基篩選表皮干細胞；(2)1型牛膠原3D支架制備:準備接種前1天，制備3D牛膠原支架，膠原配置:7.5ml 1.5mg/mL I型牛膠原溶液10ml， lmL 10XDMEM，0.5mL NaHC03，lmL 200mM H印es，0.1mL 1M NaOH，配制在低溫下進行，配制 好后37°C條件下凝固30min，待膠原成固體后，緩慢添加PBS或基礎培養基置于培養箱中過 夜，平衡PH;(3)接種表皮干細胞:次日，吸棄培養板中平衡溶液待用，獲取培養至70 %?80 %融和狀態的P2代角質形成 細胞，以Transwell培養小室作為氣液分離支架，支架上，接種6 X105細胞數量于24mm的嵌 套培養皿的上室中，上室中添加Cnt-07，CELLnTEC培養基2ml，下室中添加Cnt-07，CELLnTEC 培養基3ml繼續培養2天待細胞100 %匯合成片；(4)氣液分離培養構建組織工程皮膚:更換添加MMPs抑制劑marimastat 5nM，的角質細胞分化Cnt_3D，CELLnTEC培養基繼續 培養2天，接種后第5天，將24mm的嵌套培養皿上室中液體吸出，保持細胞表面干燥，下室添 加角質細胞分化Cnt-3D，CELLnTEC培養基0.8mL，液面不高于表皮細胞層，每天換液，至12天 角化表皮結構形成，即完成組織工程皮膚的制備過程。2.根據權利要求1所述的基于膠原制備組織工程表皮的方法，其特征在于:步驟(1)中 所述的Dispase II的濃度為3.3mg/ml，溫度4°C，消化時間為16小時。3.根據權利要求1所述的基于膠原制備組織工程表皮的方法，其特征在于:步驟(2)中 所述的I型牛膠原的濃度為1.5mg/ml。4.根據權利要求1所述的基于膠原制備組織工程表皮的方法，其特征在于:步驟(3)中 所述的接種密度為6 X 105細胞數量于24mm培養面積，培養基為Cnt-07，CELLnTEC。5.根據權利要求1所述的基于膠原制備組織工程表皮的方法，其特征在于:步驟(4)中 分化Cnt-3D，CELLnTEC培養基液體培養2天，氣液界面培養12天。6.根據權利要求1所述的基于膠原制備組織工程表皮的方法，其特征在于:步驟(4)中 培養基中添加MMPs抑制劑marimastat 5nM〇7.根據權利要求1所述的基于膠原制備組織工程表皮的方法，其特征在于:所述的同種 皮膚組織源自健康兒童包皮環切術所切除的包皮組織。
【文檔編號】A61L27/60GK105963795SQ201610380784
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月2日
【發明人】魏軍, 楊銀學, 陳冬梅, 梁雪云, 劉淑丹, 楊婷婷, 李玉奎, 劉曉明
【申請人】寧夏醫科大學總醫院