專利名稱：一種純生啤酒膜清洗再生酶制劑及清洗方法
一種純生啤酒膜清洗再生酶制劑及清洗方法技術領域
本發明屬于發酵工程領域，涉及啤酒發酵生產行業，具體是一種純生啤酒膜清洗再生酶制劑及清洗方法。
背景技術：
純生啤酒的生產中采用低溫微孔濾膜過濾除菌工藝取代傳統的巴氏熱殺菌過程， 使啤酒的口味更新鮮、純正、富有營養，深受消費者的青睞。純生啤酒生產技術的關鍵為無菌釀造、無菌過濾與無菌灌裝，而微孔濾膜過濾技術是純生啤酒生產的核心。純生啤酒的膜過濾系統，目前國內外啤酒廠一般采用粗、終兩套過濾系統對清酒進行過濾，利用其精細的物理過濾特性(粗濾0. 65 μ m,終濾0. 45 μ m)，將酒液中的啤酒酵母、有害微生物和一部分蛋白多酚等阻隔和過濾，保證純生啤酒的生物與非生物穩定性，從而保證啤酒的營養、質量和風味穩定性。由于啤酒發酵液中存在一些膜堵物質，堵塞膜孔后形成的膜污染可大大降低膜的濾過速度和酒液濾過量。為了減少膜堵塞問題，純生啤酒發酵普遍采取選用高成本的澳麥、加麥等優質麥芽進行釀造，并針對純生啤酒原料的特點對糖化工藝進行控制，減少半纖維素等的含量以減低對膜堵塞的影響；在清酒過濾時還通過使用硅藻土、硅膠與PVPP 來輔助濾膜的過濾，在膜過濾生產后還必須要有清洗再生工藝，清洗除去膜孔中的堵塞物， 使膜通量再生恢復。膜清洗再生工藝主要有①物理法清洗如熱水法、海綿球洗凈法、反壓沖洗和循環洗滌等；②化學法酸/堿清洗；③機械刮除方法等。目前在純生啤酒的生產中， 膜過濾結束后的清洗再生工藝主要使用化學法，先用水漂洗，除去附著在膜上的蛋白質、酒花樹脂等雜質，接著按照順序用溫水、熱堿、熱水、冷水進行清洗和再生。但微孔濾膜過濾一定量的酒液后其膜通量就迅速下降，采用以上化學法清洗再生工藝則再生效率很差，需更換膜以達到過濾要求。目前各啤酒廠配備的膜過濾系統以進口 Sartorius、Pall和Seitz 公司的產品較多，更換一套新過濾膜約20-40萬元，導致純生啤酒的運行成本較高。
膜的清洗再生，除了可以用酸、堿、表面活性劑等化學試劑洗去吸附在膜面和膜孔的污染物以外，對于大分子的污染物，還可以用相應的酶來水解成小分子，減低污染物的吸附和堵塞作用，進而易于從膜面和膜孔中清洗除去。酶法清洗可使膜性能恢復程度高，且不會對膜造成任何損害，這已在一些新興膜濃縮、膜分離行業得到了應用。如中國專利CN 100503818C發明了一種用于果蔬汁超濾濃縮工藝的超濾膜清洗酶及提高超濾膜通量的生產方法，針對果蔬汁膜過濾中的主要污染物成分果膠、纖維素、半纖維素、蛋白質等，設計了果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶等組分，分解膜表面的滯留物質，提高化學清洗劑清洗效果，改善膜通量，解決了果蔬汁濃縮生產上出現的超濾膜堵塞，膜污染，膜處理能力降低的問題。中國專利CN 101457182B發明了一種含有蛋白酶的液體膜清洗劑，用于主要有機污染物為蛋白質類大分子的生物發酵液分離用陶瓷膜的清洗，不僅縮短了清洗時間，還能減緩膜通量衰減速度，降低清洗頻率。一些研究報道也表明，用胰蛋白酶溶液清洗被醬油、紅霉素、肌酐發酵液污染的陶瓷膜，可以比酸/堿清洗法縮短清洗時間，提高濾料通量。發明內容
本發明的目的是針對純生啤酒膜過濾中主要的大分子膜堵物質，提供可水解這些膜堵物質的酶組分的組合，有效水解大分子為小片段，易于從膜面和膜孔中清洗除去；并提供一種酶法和化學法結合的，使純生啤酒濾膜在生產后膜通量能夠具有良好的再生恢復效果，提高膜的濾酒能力。
本發明解決上述技術問題的技術方案如下
1. 一種用于純生啤酒膜清洗再生的酶制劑由清洗再生酶I和清洗再生酶II組成；
1)清洗再生酶I由戊聚糖酶、β -葡聚糖酶和甘露聚糖酶組成，其活力范圍是若戊聚糖酶的酶活力以lOOOOU/g計，β -葡聚糖酶的酶活力以20000U/g計，甘露聚糖酶的酶活力以ιοοοου/g計時，戊聚糖酶、β-葡聚糖酶和甘露聚糖酶的質量百分比如下
戊聚糖酶40-80%
β-葡聚糖酶10-50%
甘露聚糖酶2-20%
2)清洗再生酶II由脯氨酸內切蛋白酶和中性蛋白酶組成，其活力范圍是若脯氨酸內切蛋白酶的酶活力以5U/g計，中性蛋白酶的酶活力以100000U/g計時，脯氨酸內切蛋白酶和中性蛋白酶的質量百分比如下
脯氨酸內切蛋白酶 40-80%
中性蛋白酶20-60%
本發明的純生啤酒膜清洗再生酶各組分，均由微生物發酵產生，各組分的衛生要求均符合我國《食品安全國家標準食品工業用酶制劑》(GB 255942010)或聯合國糧農組織和世界衛生組織食品添加劑聯合專家委員會(JECFA)、美國食品化學法典(FCC)關于食品加工用酶制劑的衛生要求。戊聚糖酶的基因可來源于黑曲霉、李氏木霉、綠色木霉、棉狀嗜熱絲孢菌、畢赤酵母、孤獨腐質霉、枯草芽孢桿菌、米曲霉等，β -葡聚糖酶的基因來源可以是地衣芽孢桿菌、孤獨腐質霉、哈次木霉、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、李氏木霉、解淀粉芽孢桿菌、綠色木霉、Disporotrichum dimorphosporum、Talaromyces emersonii 等，甘露聚糖酶的基因來源可以來源于枯草芽孢桿菌、黑曲霉、李氏木霉、鏈霉菌等，脯氨酸內切蛋白酶的基因來源可以來源于黑曲霉、點狀產氣單胞菌、黃單胞菌等，中性蛋白酶的基因來源可以來源于枯草芽孢桿菌等；但均不限于以上的菌株。
2.純生啤酒膜過濾后進行的酶法膜清洗再生方法，按以下步驟進行
1)常規水洗和堿法清洗
(1)在堿液罐中準備55°C熱水(約75%液位)，打入膜過濾系統保溫循環30分鐘。
(2)將膜過濾系統及管路中殘水排空，適當進行備壓排放；再打入55°C熱水，充滿過濾機，進行浸泡約40小時。
(3)將膜過濾系統的浸泡液排空，在膜過濾系統操作平臺設定用約2噸冷水沖洗膜過濾系統。
(4)CIP系統手動控制進行冷水沖洗堿罐5分鐘，排空浙干。
(5)配制堿性清洗劑，PH值10-12，進入膜過濾系統堿再生處理程序。
(6)按系統程序進行完整性測試。
2)清洗再生酶I清洗
(1)稱取膜清洗再生酶I 0. 5-2. Okg,用5L左右45°C溫水充分攪拌溶解。
(2)取潔凈紗布分別折疊成4、8、16層，將上述膜清洗再生酶I溶液逐級過濾至清。
(3)將步驟( 過濾至清的膜清洗再生酶I溶液用潔凈桶盛裝，并置于4°C以下低溫保存至使用，時間不超過3天。
(4)排空CIP系統堿液罐中的堿性清洗液，用冷水沖洗至pH試紙檢測為中性。
(5)在堿液罐中準備55°C熱水，將保存的澄清膜再生酶I溶液加入熱水中，熱水量使酶液稀釋1000倍，保溫循環30分鐘。
(6)將膜過濾系統及管路中殘水排空，將步驟( 稀釋的酶液打入膜過濾系統中， 適當進行備壓排放，保證充滿膜過濾機，進行浸泡12-40小時(無需再加熱)。
幻清洗再生酶II清洗
(1)稱取膜清洗再生酶II 0. 5-2. 0kg，加5L 37°C溫水充分攪拌溶解。
(2)排空CIP系統堿液罐中的清洗液，用冷水沖洗至pH試紙檢測為中性。
(3)在堿液罐中準備37°C熱水，將保存的澄清膜再生酶溶液加入中，熱水量使酶液稀釋2000倍，保溫循環30分鐘。
(4)將膜過濾系統及管路中殘水排空，將步驟C3)稀釋的酶液打入膜過濾系統中， 適當進行備壓排放，保證充滿過膜過濾機，進行浸泡12-40小時(無需再加熱)；浸泡結束后，進行無菌取樣檢測細菌含量。
4)水洗
步驟3)結束后將膜過濾系統的浸泡液排空，在膜過濾系統操作平臺設定用2-10 噸冷水沖洗膜過濾系統。
5)堿性清洗劑循環
配制堿性清洗劑，pH值10-12，進入膜過濾系統堿再生處理程序，熱水及堿液加熱到55-60°C，在膜過濾系統操作面板上選擇所要再生的線進行清洗。再生完成后，膜過濾系統自動進行完整性測試；通過操作面板上可察看完整性測試情況，AP<70mbar。如果 ΔΡ彡70mbar可用冷水反復沖洗數次，直至壓差盡可能降下來。
6)完整性測試
完整性測試時間10分鐘，濾芯潤濕后在20°C 士5°C下進行完整性測試。用壓縮空氣或氮氣給過濾器施加:3bar的正向壓力，在這個過程中通過壓力使過濾器內的水從測試閥排出，打開排污閥將全部的殘留水排凈；緩慢將過濾器壓力升至1. 2bar的測試壓力，然后關閉氣體進口閥門，等待5分鐘使其達到穩定狀態。
本發明的優點是使用本發明的純生啤酒膜清洗再生酶和清洗方法，可顯著提高膜的再生恢復能力，延長膜的使用壽命，提高每套微濾膜的濾酒量35%以上，節約膜的使用成本。
具體實施方式
為實現本發明，事先進行試驗，將純生啤酒膜過濾生產后的濾膜解剖，收集膜堵物質，分析其主要成分及其性質，并用多種酶類進行水解反應，從中篩選對膜堵物質具有良好水解作用的酶種及其使用濃度。試驗研究表明，純生啤酒膜過濾生產中的大分子膜堵物質，主要包括蛋白質和蛋白質-多酚化合物、戊聚糖、β -葡聚糖等。
從純生啤酒膜堵物質中分離出的醇溶性物質，主要是蛋白質和蛋白質-多酚化合物。這些蛋白質是富含脯氨酸的大麥醇溶蛋白，由于脯氨酸的五元吡咯環結構的存在，蛋白質肽鍵前的脯氨酸氨基氮上缺少一個氫原子，使環結構前的羰基氧成為強的氫原子受體， 這樣來源于麥芽和酒花的多酚類物質不僅通過疏水作用與蛋白質聚合，還通過氫鍵與醇溶性蛋白富含脯氨酸的區域進一步穩定它們之間的聚合。這些穩定的聚合物在膜面形成濃差極化時容易析出、沉淀在膜面和膜孔中，形成了純生啤酒膜污染的重要來源。脯氨酸內切蛋白酶是專一性水解多肽中脯氨酸殘基的羧基端肽鍵位點，可將純生啤酒濾膜中的這些富含脯氨酸的蛋白質和蛋白質-多酚聚合物較充分地水解為短肽，減少蛋白質和多酚形成的聚合，從而易于從膜面和膜孔中清洗除去；酶切位點特異性較低的中性蛋白酶也可以有較好的作用。而其它的蛋白酶，如木瓜蛋白酶水解蛋白質的主要位點是下一個氨基酸為精氨酸殘基的位置，胰蛋白酶水解蛋白質的位點是由賴氨酸、精氨酸的羧基形成的肽鍵，糜蛋白酶主要識別肽鏈中的苯丙氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸殘基，彈性蛋白酶的識別位點為肽鏈中的纈氨酸、亮氨酸、絲氨酸等脂肪族氨基酸殘基，胃蛋白酶則識別和切斷酪氨酸、苯丙氨酸等氨基端的肽鍵，皆不能很好地水解富含脯氨酸的蛋白質和蛋白質-多酚聚合物。
從純生啤酒膜堵物質中分離出的多糖類物質，主要是來源于麥芽但在糖化過程中未能充分降解的半纖維素類如戊聚糖、葡聚糖等，以及來源于啤酒發酵后期酵母自溶時產生的甘露聚糖等。這些多聚糖物質在純生啤酒膜過濾時，醪液運動形成的剪切力能將醪液中無規則、無規律排列的多聚糖分子擴展、聯結在一起，通過氫鍵形成多聚糖膠體物質， 在膜過濾過程中通過濃差極化和膜污染沉積在膜表面和膜孔中。這些多聚糖可由相應的戊聚糖酶、β -葡聚糖酶、甘露聚糖酶等水解成小分子的糖，易于從膜面和膜孔中清洗除去。
下面結合實施例對本發明做進一步的描述。
本發明所采用的戊聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、脯氨酸內切蛋白酶、中性蛋白酶等原料均可通過市售方式加以購買。
實施例1
某一純生啤酒生產中清洗再生酶的制備與膜清洗
原料組成清洗再生酶I、清洗再生酶II。
清洗再生酶I
戊聚糖酶375g，β -葡聚糖酶100g，甘露聚糖酶25g。
制備方法將戊聚糖酶、β -葡聚糖酶、甘露聚糖酶在無菌環境下按上述比例通過機械混均即可。
清洗再生酶II:
脯氨酸內切蛋白酶250g，中性蛋白酶250g。
制備方法將脯氨酸內切蛋白酶、中性蛋白酶在無菌環境下按上述比例通過混均即可。
膜清洗
一套微孔濾膜(0. 45 μ m, 750mm, 36支)按生產要求過濾純生啤酒，然后按常規酸堿清洗方式進行再生在堿液罐中準備55°C熱水，打入膜過濾系統保溫循環30分鐘；將膜過濾系統及管路中殘水排空，進行備壓排放，再打入熱水，保證充滿過濾機，進行浸泡40小時；將膜過濾系統的浸泡液排空，在膜過濾系統操作平臺設定用2噸冷水沖洗膜過濾系統；CIP系統手動控制進行冷水沖洗堿罐5分鐘，排空浙干；配制堿性清洗劑，進入膜過濾系統堿再生處理程序。
取膜清洗再生酶I 0. ^g，用5L溫度為45°C的溫水充分攪拌溶解，過濾至清亮；排空CIP系統堿液罐中的堿性清洗液，用5-8°C冷水沖洗至PH試紙檢測為6. 8-7. 2 ；將膜過濾系統及管路中的殘水排空，把上述酶液打入膜過濾系統中，用0. 2kg壓力進行備壓排放，保證充滿過膜過濾機，進行浸泡30小時；
取膜清洗再生酶II 0. ^g，加5L溫度為37°C的溫水充分攪拌溶解，過濾至清亮； 排空CIP系統堿液罐中的清洗液，用5-8°C冷水沖洗至PH試紙檢測為6. 8-7. 2 ；將膜過濾系統及管路中的殘水排空，把上述酶液打入膜過濾系統中，用0. 2kg壓力進行備壓排放，保證充滿過膜過濾機，進行浸泡30小時，浸泡結束后，進行無菌取樣檢測細菌含量。
取樣后將膜過濾系統的浸泡液排空，在膜過濾系統操作平臺設定用5噸冷水沖洗膜過濾系統，經堿性清洗劑循環后通過完整性測試。結果如表1所示。
表1常規化學清洗再生效果
權利要求
1.一種用于純生啤酒膜清洗再生的酶制劑，其特征在于，該酶制劑由清洗再生酶I和清洗再生酶II組成；1)清洗再生酶I由戊聚糖酶、β-葡聚糖酶和甘露聚糖酶組成，其活力范圍是若戊聚糖酶的酶活力以ιοοοου/g計，β -葡聚糖酶的酶活力以20000U/g計，甘露聚糖酶的酶活力以ιοοοου/g計時，戊聚糖酶、β-葡聚糖酶和甘露聚糖酶的質量百分比如下戊聚糖酶40-80%β-葡聚糖酶10-50%甘露聚糖酶2-20%2)清洗再生酶II由脯氨酸內切蛋白酶和中性蛋白酶組成，其活力范圍是若脯氨酸內切蛋白酶的酶活力以5U/g計，中性蛋白酶的酶活力以100000U/g計時，脯氨酸內切蛋白酶和中性蛋白酶的質量百分比如下脯氨酸內切蛋白酶40-80%中性蛋白酶20-60%。
2.純生啤酒膜過濾后進行的酶法膜清洗再生方法，按以下步驟進行1)常規水洗和堿法清洗(1)在堿液罐中準備罐的75%液位的55°C熱水，打入膜過濾系統保溫循環30分鐘；(2)將膜過濾系統及管路中殘水排空，適當進行備壓排放；再打55°C熱水充滿過濾機， 進行浸泡約40小時；(3)將膜過濾系統的浸泡液排空，在膜過濾系統操作平臺設定用2噸冷水沖洗膜過濾系統；(4)CIP系統手動控制進行冷水沖洗堿罐5分鐘，排空浙干；(5)配制堿性清洗劑，pH值10-12，進入膜過濾系統堿再生處理程序；(6)按系統程序進行完整性測試；2)清洗再生酶I清洗(1)稱取膜清洗再生酶I0. 5-2. 0kg，用1L-10L 45°C溫水充分攪拌溶解；(2)取潔凈紗布分將上述膜清洗再生酶I溶液逐級過濾至清；(3)將步驟(2)過濾至清的膜清洗再生酶I溶液用潔凈桶盛裝，并置于4°C以下低溫保存至使用，時間不超過3天；(4)排空CIP系統堿液罐中的堿性清洗液，用冷水沖洗至pH試紙檢測為中性；(5)在堿液罐中準備55°C熱水，將保存的澄清膜再生酶I溶液加入熱水中，熱水量使酶液稀釋1000倍，保溫循環30分鐘；(6)將膜過濾系統及管路中殘水排空，將步驟( 稀釋的酶液打入膜過濾系統中，適當進行備壓排放，保證充滿膜過濾機，進行浸泡12-40小時；3)清洗再生酶II清洗(1)稱取膜清洗再生酶II0. 5-2. 0kg，加5L 37°C溫水充分攪拌溶解；(2)排空CIP系統堿液罐中的清洗液，用冷水沖洗至pH試紙檢測為中性；(3)在堿液罐中準備37°C熱水，將保存的澄清膜再生酶溶液加入中，熱水量使酶液稀釋2000倍，保溫循環30分鐘；(4)將膜過濾系統及管路中殘水排空，將步驟C3)稀釋的酶液打入膜過濾系統中，適當進行備壓排放，保證充滿過膜過濾機，進行浸泡12-40小時；浸泡結束后，進行無菌取樣檢測細菌含量；4)水洗將步驟3)結束后將膜過濾系統的浸泡液排空，在膜過濾系統操作平臺設定用2-10噸冷水沖洗膜過濾系統；5)堿性清洗劑循環配制堿性清洗劑，PH值10-12，進入膜過濾系統堿再生處理程序，熱水及堿液加熱到 55-60°C，在膜過濾系統操作面板上選擇所要再生的線進行清洗；再生完成后，膜過濾系統自動進行完整性測試；通過操作面板上可察看完整性測試情況，AP<70mbar。如果 ΔΡ彡70mbar可用冷水反復沖洗數次，直至壓差降下來；6)完整性測試完整性測試時間10分鐘，濾芯潤濕后在20°C 士5°C下進行完整性測試；用壓縮空氣或氮氣給過濾器施加:3bar的正向壓力，在這個過程中通過壓力使過濾器內的水從測試閥排出，打開排污閥將全部的殘留水排凈；緩慢將過濾器壓力升至1. 2bar的測試壓力，然后關閉氣體進口閥門，等待5分鐘使其達到穩定狀態。
全文摘要
本發明公開了一種純生啤酒膜清洗再生酶制劑及清洗方法。本發明依據純生啤酒膜堵物質成分設計的膜清洗再生酶制劑包括以下組分清洗再生酶I戊聚糖酶(10000U/g)40-80％，β-葡聚糖酶(20000U/g)10-50％，甘露聚糖酶(10000U/g)2-20％；清洗再生酶II脯氨酸內切蛋白酶(5U/g)40-80％，中性蛋白酶(100000U/g)20-60％。優化的純生啤酒膜清洗再生方法為常規水洗和堿法清洗--酶法保溫循環清洗--酶法浸漬清洗--水洗--堿法清洗-完整性測試。本發明的膜清洗再生酶有效解決了純生啤酒膜堵物質引起的膜通量下降問題，提高膜的再生能力和純生啤酒濾酒能力35％以上。
文檔編號B08B7/04GK102492663SQ20111039374
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月1日 優先權日2011年12月1日
發明者張云光, 李曉明, 梁樹華, 蒙健宗, 鄭翔鵬, 韋函忠, 馬少敏 申請人:南寧邦爾克生物技術有限責任公司, 廣西大學