一種提取小球藻中油脂的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提取小球藻中油脂的方法，屬于微藻生化工程【技術領域】，包括細胞破碎、萃取、制備藻油和回收小球藻細胞三個步驟。該方法不需要加入絮凝劑、不需要進行濃縮、不需要進行離心或者干燥制藻粉，具有提藻油工藝流程短、操作過程簡單、提取時間短、能耗低、成本低、藻油收率高、適于直接從發酵液中提油的優點。
【專利說明】一種提取小球藻中油脂的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微藻生化工程【技術領域】，具體涉及一種提取小球藻中油脂的方法。
【背景技術】
[0002]全球變暖和石油危機催生著低碳經濟的發展，替代能源的研究變得刻不容緩。微藻生物柴油作為一種新型綠色能源，由于能夠減少CO2的排放、脂質含量高、產量高、土地占用面積小等優點，成為目前世界各國研究的熱點。
[0003]利用小球藻進行油脂生產是一個復雜的系統工程，涵蓋多個技術環節，包括小球藻的篩選和培育、小球藻的規模培養、油脂的收集和加工等幾個方面。每個環節都對設備和生產水平有較高的要求。微藻胞壁堅韌，細胞胞體較油料作物小，所以傳統的壓榨法、有機溶劑提取法往往很難實現微藻油脂的高效提取。因此探索適合微藻脂質提取工藝方法是必要的。目前利用藻類制備油脂整體成本都比較高，因此尋找工藝簡單、能耗少、效率高的提取途徑關系到藻類制備油脂前景。
[0004]中國專利200810138499.7公開了一種微生物油脂分離提取方法，但是該方法需要先在攪拌的狀態下使用分子篩對藻液進行濃縮。這個過程需要消耗大量的時間、能量。另外回收分子篩的過程中，分子篩和藻細胞混在一起，會造成藻細胞的損失或分子篩的堵塞。在分子篩再生的過程中，還需要進行加熱或減壓才能恢復分子篩的脫水性能，這個過程同樣需要消耗大量的能源,總體成本高,不利于推廣和工廠化生產。
[0005]中國專利CN102559376B公開了一種提取異養小球藻中性油脂的方法，但該方法需要先離心收集藻細胞，在整個離心的過程中需要消耗較多的能源。在異養小球藻的發酵過程中，會有部分藻細胞因溶氧、營養物質缺乏而死亡或自溶，生物量(干重)越高這種現象越明顯，當生物量(干重)超過100g/L時，其死亡或自溶量約占總量的20?35%。在離心時候，會發生分層:細胞碎片會集聚在最上方，中間是水，最下層是正常細胞。采用離心會導致死亡或自溶部分所產生的油脂損失。
[0006]中國專利201210431210.7公開了一種藻類細胞中的生物油脂及其制備方法和應用，該方法使用了臭氧與高壓共同處理藻細胞，不斷打壓、泄壓反復處理40?80次來達到細胞破碎的效果，這個過程操作麻煩能耗高，而且快速泄壓有較大的噪音。
[0007]中國專利CN103725413A公開了一種從小球藻中提取海藻油的方法，該方法通過反復凍融技術對小球藻進行破壁處理，用乙醇做溶劑提取海藻油，操作簡單、能耗小，但是破壁效果差，油脂提取率低。
[0008]綜上所述，現有公開的的藻油提取技術，均存在工藝復雜、能耗較高、提取率低、提取速率慢的缺點。
【發明內容】
[0009]為了解決現有技術中存在的上述問題，本發明提供了一種提取小球藻中油脂的方法，該方法不需要加入絮凝劑、不需要進行濃縮、不需要進行離心或者干燥制藻粉，具有提藻油工藝流程短、操作過程簡單、提取時間短、能耗低、成本低、藻油收率高、適于直接從發酵液中提油的優點。
[0010]為實現上述發明目的，本發明提供的具體技術方案如下:
[0011]一種提取小球藻中油脂的方法，包括以下步驟:
[0012]I)細胞破碎:將新鮮小球藻與磷酸鹽緩沖溶液混合，配制成小球藻溶液，再加入纖維素酶，然后將超聲破碎儀的超聲探頭插入小球藻溶液中進行細胞破碎；
[0013]2)萃取:向上述步驟I)破碎后的小球藻溶液中加入疏水性有機溶劑對油脂成分進行萃取，萃取過程繼續使用超聲破碎儀；
[0014]3)制備藻油和回收小球藻細胞:萃取結束后，加入10%氫氧化鉀溶液沉淀小球藻細胞進行回收，搖勻靜止10分鐘后收集上層有機相，然后旋轉蒸發獲得油脂。
[0015]所述步驟I)細胞破碎中，小球藻溶液濃度是I X 101°個藻細胞/mL。
[0016]所述步驟I)細胞破碎中，纖維素酶加入量為I?5mg/lmL小球藻溶液，活性單位為20萬。
[0017]所述步驟I)細胞破碎中，超聲破碎儀功率為250W，探頭距離溶液底部I厘米。
[0018]所述步驟I)細胞破碎中，反應所需環境條件是25?35°C，pH 6.0。
[0019]所述步驟I)細胞破碎中，細胞破碎時間是I小時。
[0020]所述步驟2)萃取中，疏水性有機溶劑采用石油醚2 (沸程60?90°C )，添加量為小球藻溶液體積的1/2。
[0021]所述步驟2)萃取中，萃取時間為I小時,萃取溫度30?40°C,萃取過程中需要進行振蕩。
[0022]所述步驟2)萃取中，超聲破碎儀用法同步驟I)。
[0023]本發明的有益之處是:
[0024](I)不需要反復調節壓力和溫度、不需要加入絮凝劑、不需要進行離心或者干燥制藻粉，而是直接進行細胞破碎，破碎液在利用疏水性有機溶劑萃取時可以直接將里面的油脂萃取出來，提藻油的工藝流程極短，只有三步就可以獲得藻油，藻油的提取率高，減少了工藝流程、減少了物料損失、減少了能源消耗。
[0025](2)25?35°C，PH 6.0能夠保證油品的質量和色澤，同時結合纖維素酶和超聲破碎儀，極大提高小球藻細胞破壁率和油脂提取率。
[0026](3)回收的小球藻經過破壁，其中所富含的各種營養成分能夠完全釋放出來被人體吸收，用于小球藻產品制造，不會造成浪費，而且營養價值更高。
【具體實施方式】
[0027]實施例1
[0028]I)細胞破碎:將新鮮小球藻與磷酸鹽緩沖溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,濃度是I X 101°個藻細胞/mL，再加入10mg活性單位為20萬的纖維素酶，然后將功率為250W的超聲破碎儀的超聲探頭插入小球藻溶液距離底部I厘米處，在25?35°C，pH 6.0環境條件下進行細胞破碎I小時，細胞破碎率為96.3% ;
[0029]2)萃取:向上述步驟I)破碎后的小球藻溶液中加入疏水性有機溶劑石油醚2 (沸程60?90°C ) 50mL, 30?40°C溫度條件下對油脂成分萃取I小時，萃取過程進行間歇性振蕩；
[0030]3)制備藻油和回收小球藻細胞:萃取結束后，加入10%氫氧化鉀溶液沉淀小球藻細胞進行回收，搖勻靜止10分鐘后收集上層有機相，然后旋轉蒸發獲得油脂，油脂提取率為 78.7%。
[0031]實施例2
[0032]I)細胞破碎:將新鮮小球藻與磷酸鹽緩沖溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,濃度是I X 101°個藻細胞/mL，再加入300mg活性單位為20萬的纖維素酶，然后將功率為250W的超聲破碎儀的超聲探頭插入小球藻溶液距離底部I厘米處，在25?35°C，pH 6.0環境條件下進行細胞破碎I小時，測得細胞破碎率為99.2% ;
[0033]2)萃取:向上述步驟I)破碎后的小球藻溶液中加入疏水性有機溶劑石油醚2 (沸程60?90°C ) 50mL, 30?40°C溫度條件下對油脂成分萃取I小時，萃取過程進行間歇性振蕩；
[0034]3)制備藻油和回收小球藻細胞:萃取結束后，加入10%氫氧化鉀溶液沉淀小球藻細胞進行回收，搖勻靜止10分鐘后收集上層有機相，然后旋轉蒸發獲得油脂，油脂提取率為 86.4%o
[0035]實施例3
[0036]I)細胞破碎:將新鮮小球藻與磷酸鹽緩沖溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,濃度是I X 101°個藻細胞/mL，再加入500mg活性單位為20萬的纖維素酶，然后將功率為250W的超聲破碎儀的超聲探頭插入小球藻溶液距離底部I厘米處，在25?35°C，pH 6.0環境條件下進行細胞破碎I小時，測得細胞破碎率為99.5% ;
[0037]2)萃取:向上述步驟I)破碎后的小球藻溶液中加入疏水性有機溶劑石油醚2 (沸程60?90°C ) 50mL, 30?40°C溫度條件下對油脂成分萃取I小時，萃取過程進行間歇性振蕩；
[0038]3)制備藻油和回收小球藻細胞:萃取結束后，加入10%氫氧化鉀溶液沉淀小球藻細胞進行回收，搖勻靜止10分鐘后收集上層有機相，然后旋轉蒸發獲得油脂，油脂提取率為 89.7%。
[0039]實施例4
[0040]I)細胞破碎:將新鮮小球藻與磷酸鹽緩沖溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,濃度是I X 101°個藻細胞/mL，再加入10mg活性單位為20萬的纖維素酶，在25?35°C，pH6.0環境條件下進行細胞破碎I小時，測得細胞破碎率為62.9% ;
[0041]2)萃取:向上述步驟I)將功率為250W的超聲破碎儀的超聲探頭插入破碎后的小球藻溶液距離底部I厘米處，然后加入疏水性有機溶劑石油醚2 (沸程60?90°C )50mL,30?40°C溫度條件下對油脂成分萃取I小時，萃取過程進行間歇性振蕩；
[0042]3)制備藻油和回收小球藻細胞:萃取結束后，加入10%氫氧化鉀溶液沉淀小球藻細胞進行回收，搖勻靜止10分鐘后收集上層有機相，然后旋轉蒸發獲得油脂，油脂提取率為 81.6%。
[0043]實施例5
[0044]I)細胞破碎:將新鮮小球藻與磷酸鹽緩沖溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,濃度是I X 101°個藻細胞/mL，再加入300mg活性單位為20萬的纖維素酶，在25?35°C，pH6.0環境條件下進行細胞破碎I小時，測得細胞破碎率為68.1% ;
[0045]2)萃取:向上述步驟I)將功率為250W的超聲破碎儀的超聲探頭插入破碎后的小球藻溶液距離底部I厘米處，然后加入疏水性有機溶劑石油醚2 (沸程60?90°C )50mL,30?40°C溫度條件下對油脂成分萃取I小時，萃取過程進行間歇性振蕩；
[0046]3)制備藻油和回收小球藻細胞:萃取結束后，加入10%氫氧化鉀溶液沉淀小球藻細胞進行回收，搖勻靜止10分鐘后收集上層有機相，然后旋轉蒸發獲得油脂，油脂提取率為 84.8%0
[0047]實施例6
[0048]I)細胞破碎:將新鮮小球藻與磷酸鹽緩沖溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,濃度是I X 101°個藻細胞/mL，再加入300mg活性單位為20萬的纖維素酶，在25?35°C，pH6.0環境條件下進行細胞破碎I小時，測得細胞破碎率為69.5% ;
[0049]2)萃取:向上述步驟I)將功率為250W的超聲破碎儀的超聲探頭插入破碎后的小球藻溶液距離底部I厘米處，然后加入疏水性有機溶劑石油醚2 (沸程60?90°C )50mL,30?40°C溫度條件下對油脂成分萃取I小時，萃取過程進行間歇性振蕩；
[0050]3)制備藻油和回收小球藻細胞:萃取結束后，加入10%氫氧化鉀溶液沉淀小球藻細胞進行回收，搖勻靜止10分鐘后收集上層有機相，然后旋轉蒸發獲得油脂，油脂提取率為 88.7%。
[0051]實施例7
[0052]I)細胞破碎:將新鮮小球藻與磷酸鹽緩沖溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,濃度是I X 101°個藻細胞/mL，再加入10mg活性單位為20萬的纖維素酶，然后將功率為250W的超聲破碎儀的超聲探頭插入小球藻溶液距離底部I厘米處，在25?35°C，pH 6.0環境條件下進行細胞破碎I小時，測得細胞破碎率為96.3% ;
[0053]2)萃取:向上述步驟I)將功率為250W的超聲破碎儀的超聲探頭插入破碎后的小球藻溶液距離底部I厘米處，然后加入疏水性有機溶劑石油醚2 (沸程60?90°C )50mL,30?40°C溫度條件下對油脂成分萃取I小時，萃取過程進行間歇性振蕩；
[0054]3)制備藻油和回收小球藻細胞:萃取結束后，加入10%氫氧化鉀溶液沉淀小球藻細胞進行回收，搖勻靜止10分鐘后收集上層有機相，然后旋轉蒸發獲得油脂，油脂提取率為 87.2%。
[0055]實施例8
[0056]I)細胞破碎:將新鮮小球藻與磷酸鹽緩沖溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,濃度是I X 101°個藻細胞/mL，再加入300mg活性單位為20萬的纖維素酶，然后將功率為250W的超聲破碎儀的超聲探頭插入小球藻溶液距離底部I厘米處，在25?35°C，pH 6.0環境條件下進行細胞破碎I小時，測得細胞破碎率為99.2% ;
[0057]2)萃取:向上述步驟I)將功率為250W的超聲破碎儀的超聲探頭插入破碎后的小球藻溶液距離底部I厘米處，然后加入疏水性有機溶劑石油醚2 (沸程60?90°C )50mL,30?40°C溫度條件下對油脂成分萃取I小時，萃取過程進行間歇性振蕩；
[0058]3)制備藻油和回收小球藻細胞:萃取結束后，加入10%氫氧化鉀溶液沉淀小球藻細胞進行回收，搖勻靜止10分鐘后收集上層有機相，然后旋轉蒸發獲得油脂，油脂提取率為 95.6%。
[0059]實施例9
[0060]I)細胞破碎:將新鮮小球藻與磷酸鹽緩沖溶液混合，配制成小球藻溶液10mL,濃度是I X 101°個藻細胞/mL，再加入300mg活性單位為20萬的纖維素酶，然后將功率為250W的超聲破碎儀的超聲探頭插入小球藻溶液距離底部I厘米處，在25?35°C，pH 6.0環境條件下進行細胞破碎I小時，測得細胞破碎率為99.5% ;
[0061]2)萃取:向上述步驟I)將功率為250W的超聲破碎儀的超聲探頭插入破碎后的小球藻溶液距離底部I厘米處，然后加入疏水性有機溶劑石油醚2 (沸程60?90°C )50mL,30?40°C溫度條件下對油脂成分萃取I小時，萃取過程進行間歇性振蕩；
[0062]3)制備藻油和回收小球藻細胞:萃取結束后，加入10%氫氧化鉀溶液沉淀小球藻細胞進行回收，搖勻靜止10分鐘后收集上層有機相，然后旋轉蒸發獲得油脂，油脂提取率為 96.1%。
[0063]上述實施例1、2、3是僅在細胞破碎過程中使用超聲破碎儀，纖維素酶的用量對小球藻細胞破碎率和油脂提取率的影響，可以看出，在其他因素相同的條件下，小球藻細胞破碎率和油脂提取率隨著纖維素酶用量的增加而增大，而纖維素酶用量在300mg和500mg時，細胞破碎率和油脂提取率差異不明顯，因此纖維素酶的最佳用量為3mg/lmL小球藻溶液。
[0064]實施例4、5、6是僅在萃取過程中使用超聲破碎儀,纖維素酶的用量對小球藻細胞破碎率和油脂提取率的影響，結果同上。
[0065]實施例7、8、9是在細胞破碎和萃取兩個步驟中均使用超聲破碎儀，纖維素酶的用量對小球藻細胞破碎率和油脂提取率的影響，結果同上，但僅在細胞破碎過程中使用超聲破碎儀，油脂提取率較低，僅在萃取過程中使用超聲破碎儀，細胞破碎率和油脂提取率都較低，而在細胞破碎和萃取兩個步驟中均使用超聲破碎儀，細胞破碎率和油脂提取率都達到很聞水平，操細胞破壁率最聞可達到99.5%,油脂提取率最聞可達到96.1 %。
[0066]綜上所述，本發明最佳的實施方案是實施例9所述方案。本發明不需要反復調節壓力和溫度、不需要加入絮凝劑、不需要進行離心或者干燥制藻粉，而是直接進行細胞破碎，破碎液在利用疏水性有機溶劑萃取時可以直接將里面的油脂萃取出來，提藻油的工藝流程極短，只有三步就可以獲得藻油，藻油的提取率高，減少了工藝流程、減少了物料損失、減少了能源消耗，在25?35°C，PH 6.0條件下能夠保證油品的質量和色澤，同時結合纖維素酶和超聲破碎儀，極大提高小球藻細胞破壁率和油脂提取率，回收的小球藻經過破壁，其中所富含的各種營養成分能夠完全釋放出來被人體吸收，用于小球藻產品制造，不會造成浪費，而且營養價值更高。
【權利要求】
1.一種提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)細胞破碎:將新鮮小球藻與磷酸鹽緩沖溶液混合，配制成小球藻溶液，再加入纖維素酶，然后將超聲破碎儀的超聲探頭插入小球藻溶液中進行細胞破碎； 2)萃取:向上述步驟I)破碎后的小球藻溶液中加入疏水性有機溶劑對油脂成分進行萃取，萃取過程繼續使用超聲破碎儀； 3)制備藻油和回收小球藻細胞:萃取結束后，加入10%氫氧化鉀溶液沉淀小球藻細胞進行回收，搖勻靜止10分鐘后收集上層有機相，然后旋轉蒸發獲得油脂。
2.根據權利要求1所述的一種提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，所述步驟I)中，小球藻溶液濃度是I X 1010個藻細胞/mL。
3.根據權利要求1所述的一種提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，所述步驟I)中，纖維素酶加入量為I?5mg/lmL小球藻溶液,活性單位為20萬。
4.根據權利要求1所述的一種提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，所述步驟I)中，超聲破碎儀功率為250W，探頭距離溶液底部I厘米。
5.根據權利要求1所述的一種提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，所述步驟I)中，反應所需環境條件是25?35°C，pH 6.0。
6.根據權利要求1所述的一種提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，所述步驟I)中，細胞破碎時間是I小時。
7.根據權利要求1所述的一種提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，所述步驟2)中，疏水性有機溶劑采用石油醚2 (沸程60?90°C )，添加量為小球藻溶液體積的1/2。
8.根據權利要求1所述的一種提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，所述步驟2)中，萃取時間為I小時，萃取溫度30?40°C，萃取過程中需要進行振蕩。
9.根據權利要求1所述的一種提取小球藻中油脂的方法，其特征在于，所述步驟2)中，超聲破碎儀用法同步驟I)。
【文檔編號】C11B1/04GK104312720SQ201410632017
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月11日 優先權日:2014年11月11日
【發明者】白玉龍, 張國威 申請人:甘肅德福生物科技有限公司