專利名稱：納米二氧化鈦多孔陶瓷柱層析純化菠蘿蛋白酶的方法
技術領域：
本發明涉及菠蘿蛋白酶分離純化技術領域。
背景技術：
菠蘿蛋白酶是存在于菠蘿莖和果實中的一類蛋白水解酶，廣泛用于食品領域、醫 藥工業及化妝品等領域，有澄清啤酒、水解蛋白、燒傷脫痂、抗腫消炎等功效。目前菠蘿蛋白 酶的提取方法主要有高嶺土吸附法、有機溶劑沉淀法和超濾法，生產中存在純化程度低、酶 液易失活等問題。研究表明，納米二氧化鈦粒徑和密度小，具有非常高的比表面積，對菠蘿 蛋白酶有很好的吸附作用。同時，二氧化鈦是一種安全的食用色素，用于食品加工過程安全 性好，對人體無害，并能耐受低濃度NaOH和HC1溶液的處理，有良好的化學惰性。本發明 將納米二氧化鈦燒結成多孔陶瓷材料填充到層析柱，利用柱層析技術實現低溫連續吸附洗 脫，實現了菠蘿蛋白酶的高效純化。
發明內容
為解決當前菠蘿蛋白酶生產中酶純度不高的技術問題，本發明利用納米二氧化鈦 對菠蘿蛋白酶的高吸附性和多孔陶瓷高比表面積的特性，將納米二氧化鈦燒結成多孔陶瓷 吸附材料，通過柱層析技術實現對菠蘿蛋白酶的高效純化分離。 本發明的技術方案是將納米二氧化鈦、粘土、石英、活性碳、長石按照
4:3:i:i: i左右的比例混合均勻，加水調和，成型，于12(xrc煅燒ih，燒結成多
孔陶瓷吸附材料。將此材料裝于層析柱，純化菠蘿蛋白酶。調節菠蘿蛋白酶粗提液pH為 4. 7±0. 2，在15 25"下進行吸附，酶液流速1. 5BV/h。吸附結束后，采用pH = 6. 0±0. 2， 0. 4mol/L的檸檬酸緩沖液作為洗脫緩沖液，流速lBV/h。將洗脫液進行陶瓷膜兩級超濾， 先用截留分子量為50KD的超濾膜超濾，除去較大分子量的雜蛋白，再用截留值10KD的超 濾膜超濾除去較小分子量的雜蛋白及其它小分子雜質，操作溫度在25 45t:，操作壓力在 0. 2 0. 35MPa。將超濾濃縮液進行冷凍干燥，得到成品達到600萬活力單位的菠蘿蛋白酶。
本發明的有益效果是利用二氧化鈦對菠蘿蛋白酶的高吸附性燒結出納米二氧化 鈦多孔陶瓷吸附材料，通過柱層析技術實現對菠蘿蛋白酶的高效純化，得到成品達到600 萬活力單位的菠蘿蛋白酶，可作為食品、醫藥原料廣泛用于食品領域、醫藥工業及化妝品等 領域。
具體實施例方式
實施例一 按照納米二氧化鈦40 % ，粘土 30 % ，石英10 % ，活性碳10 % ，長石10 %的比例，將 各原料混合均勻，加水調和，成型，干燥，于120(TC條件下煅燒lh，制成多孔陶瓷材料。將此 材料過篩，使粒徑在1 2mm，用蒸餾水沖洗，除去細小粉末，采用濕法裝柱。將菠蘿皮渣破 碎榨汁，過濾，在3000r/min條件下離心得粗酶。調節菠蘿蛋白酶粗提液pH為4. 6，在25°C
3下進行吸附，酶液流速1. 5BV/h。采用pH5. 8， 0. 4mol/L的檸檬酸緩沖液作為洗脫緩沖液，洗 脫緩沖液流速lBV/h。在0. 3Mpa， 25°C的操作條件下，洗脫液先用截留值50KD的超濾膜超 濾，除去較大分子量的雜蛋白；再在O. 35Mpa，3(TC條件下用截留值10KD的超濾膜超濾除去 較小分子量的雜蛋白及其它小分子雜質，濃縮倍數在5倍左右。濃縮液在_401:下凍結后， 放入冷凍干燥機中冷凍干燥，1小時后溫度升至-l(TC，恒溫5小時，然后逐步升溫到30°C， 干燥結束，得到成品600萬活力單位的菠蘿蛋白酶。
實施例二 按照納米二氧化鈦38 % ，粘土 30 % ，石英10 % ，活性碳12 % ，長石10 %的比例，將 各原料混合均勻，加水調和，成型，干燥，于120(TC煅燒lh，制成多孔陶瓷材料。將此材料過 篩，使粒徑在1 2mm，用蒸餾水沖洗，除去細小粉末，采用濕法裝柱。將菠蘿破碎榨汁，過 濾，經3000r/min離心得粗酶。將粗菠蘿蛋白酶溶解，調節菠蘿蛋白酶粗提液pH為4. 7，在 15t:下進行吸附，酶液流速1. 5BV/h。采用p朋.O，O. 4mol/L的檸檬酸緩沖液作為洗脫緩沖 液，洗脫緩沖液流速lBV/h。在0. 2Mpa， 25°C的操作條件下，洗脫液先用截留值50KD的超 濾膜超濾，用截留值10KD的超濾膜超濾除去較小分子量的雜蛋白及其它小分子雜質，濃縮 倍數在6倍左右。濃縮液在_401:下凍結后，放入冷凍干燥機中冷凍干燥，2小時后溫度升 至-l(TC ，恒溫6小時，然后逐步升溫到30°C ，干燥結束，得到成品610萬活力單位的菠蘿蛋 白酶。 實施例三 按照納米二氧化鈦42%，粘土29%，石英10%，活性碳10%，長石9%的比例，將 各原料混合均勻，加水調和，成型，干燥，于120(TC煅燒lh，制成多孔陶瓷材料。將此材料過 篩，使粒徑在1 2mm，用蒸餾水沖洗，除去細小粉末，采用濕法裝柱。將菠蘿莖破碎榨汁，過 濾，離心得粗酶。將粗菠蘿蛋白酶溶解，調節菠蘿蛋白酶粗提液pH為4. 7，在2(TC下進行吸 附，酶液流速1. 5BV/h。采用pH5. 9， 0. 4mol/L的檸檬酸緩沖液作為洗脫緩沖液，洗脫緩沖液 流速lBV/h。在0. 25Mpa，25t:的操作條件下，洗脫液先用截留值50KD的超濾膜超濾，用截 留值10KD的超濾膜超濾除去小分子雜質，濃縮倍數在5倍左右。濃縮液在_401:下凍結后， 放入冷凍干燥機中冷凍干燥，2小時后溫度升至-l(TC ，恒溫6小時，逐步升溫到30°C ，干燥 結束，得到成品603萬活力單位的菠蘿蛋白酶。
權利要求
納米二氧化鈦多孔陶瓷柱層析純化菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于步驟為制備納米二氧化鈦多孔陶瓷層析柱，將粗提的菠蘿蛋白酶溶液經多孔陶瓷柱進行柱層析后，將解吸液超濾濃縮，濃縮液冷凍干燥得到菠蘿蛋白酶粉。
2. 根據權利要求1所述的納米二氧化鈦多孔陶瓷的制備方法，其特征在于，利用納米 二氧化鈦對菠蘿蛋白酶的高吸附性，結合多孔陶瓷高比表面積的特性，將二氧化鈦燒結成多孔陶瓷吸附材料。將納米二氧化鈦、粘土、石英、活性碳、長石按照4 : 3 : i : i : i左 右的比例，混合均勻，加水調和，成型，于120(TC煅燒ih，制成多孔陶瓷吸附材料。將此材料 過篩，使粒徑在1 2mm，用蒸餾水沖洗，除去細小粉末，采用濕法裝柱。
3. 根據權利要求1所述的納米二氧化鈦多孔陶瓷柱層析的方法，其特征在于，將調節 菠蘿蛋白酶粗提液pH為4. 7±0. 2，在15 25t:下進行吸附，酶液流速1. 5BV/h。吸附結束 后，采用P朋.0±0. 2，0. 4mol/L的檸檬酸緩沖液作為洗脫緩沖液，洗脫緩沖液流速lBV/h。
4. 根據權利要求1所述的超濾濃縮方法，其特征在于，采用陶瓷膜兩級超濾，先用截留 分子量為50KD的超濾膜超濾，除去較大分子量的雜蛋白，再用截留值10KD的超濾膜超濾 除去較小分子量的雜蛋白及其它小分子雜質。操作溫度在25 45t:，操作壓力在0. 2 0.35MPa。
5. 根據權利要求1所述的冷凍干燥方法，其特征在于，將超濾濃縮液在冷凍干燥機內 進行凍干，1 2小時后溫度升至-l(TC，恒溫5 6小時，逐步升溫到3(TC，干燥結束。
全文摘要
本發明是納米二氧化鈦多孔陶瓷柱層析純化菠蘿蛋白酶的方法，屬于酶分離純化技術領域，主要解決菠蘿蛋白酶純化和酶活性保留的問題。本發明的技術方案包括利用陶瓷燒結技術將納米二氧化鈦制成多孔陶瓷柱層析填料，采用柱層析技術對菠蘿蛋白酶進行純化，并通過超濾、冷凍干燥最大限度的保持酶活性，得到成品達到600萬活力單位的菠蘿蛋白酶，是一種高效、安全的制備高活性菠蘿蛋白酶的方法，產品可作為食品、醫藥原料廣泛用于食品、生物醫藥工業等領域。
文檔編號C04B38/08GK101709294SQ20091023115
公開日2010年5月19日 申請日期2009年12月10日 優先權日2009年12月10日
發明者吳茂玉, 和法濤, 宋燁, 葛邦國, 趙巖, 馬超 申請人:吳茂玉;宋燁;趙巖