專利名稱：高活性高耐受甲醛降解菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株高活性高耐受甲醛降解菌及其應用。 背景技術：
近年來，由于各種裝潢材料、涂料及粘接劑的大量使用，使得室內空氣中各種有害 物質濃度不斷增加。其中，不少物質具有較強的毒性或致癌性，而甲醛就是其中一種。甲醛 是一種原生毒素，它易發生加成、氧化、還原、聚合反應，同時有較好的水溶性。甲醛具有致 畸和致癌性，在我國有毒化學品優先控制的名單上居第2位。因此找到室內空氣中甲醛污 染防治對策刻不容緩，對人類健康意義重大。生物法防治尤其是降解微生物法是我們尋求的重要方法之一。然而，目前國內 關于甲醛降解菌的報道很少。黃賽花等(2007)報道(黃賽花，陳能場.一株甲醛降解真 菌 Aspergillus spp.H4 的分離鑒定[J],生態環境，2007，16 (4) :1175_1179.)篩選獲得 了 1株甲醛降解真菌黃曲霉，它能在144h內將1.241g/L甲醛降解至0. 004g/L;呂陽等 (呂陽，劉京，呂炳南，等.生物滴濾塔處理甲醛和三苯混合氣體的實驗研究[J].天津大 學學報，2007，40 (10) 1215-1219.)使用滴濾塔處理甲醛及三苯，并從中分離出了 1株甲 醛降解菌假單胞菌(Pseudomonas putida)，該菌能72h內將26. 2mg/L甲醛降解至2. 5mg/ L。國外關于甲醛降解菌的報道相對較多。Iwahara等(Iwahara M, Fukuda R, Nakahara K, et al. Isolation andproperties of Paecilomyces sp.no.5 capable of degrading high concentrationsof formaldehyde [J]. Biocontrol Sci, 2002, 7 (2) :107_110.)分離 了 1 株 Paecilomyces，能在 20d 之內完全降解 20g/L 的甲醛；Yamazaki 等(Yamazaki T， Tsugawa W, Sode K. Biodegradation of formaldehyde by aformaldehyde-resistant bacterium isolated from seawater[J]. Appl BiochemBiotechnol, 2001,91-3 :213_217.) 從海水里分離了 1株甲醛耐受細菌，它在3%的氯化鈉里能降解甲醛0. 4g/L ；Mirdamadi 等(Mirdamadi S, RajabiA, Khalilzadeh P, et al. Isolation of bacteria able to metabolize highconcentrations of formaldehyde[J]. World Journal of Microbiology &Biotechnology,2005,21(6-7) :1299_1301.)報道 P.pseudoalcaligenes OSS 菌株能 在24h內將濃度為3. 7g/L甲醛完全降解，72h內能降解70%濃度為5. 92g/L的甲醛， Methylobacterium. extorquens ESS 禾口 Methylobacterium. extorquens PSS 能完全降角軍 濃度為 2. 96g/L 的甲醛；Adroer 等(Adroer N, Casas C, Demas C, et al. Mechanism of Formaldehyde Biodegradation byPseudomonas-Putida[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1990,33(2) :217-220.)分離的 Pseudomonas putida A2 菌株能降解濃度為 0. 25g/L 的 甲酸；Eiroa 等(Eiroa M, Kennes C, Veiga M C. Formaldehyde biodegradation and itsinhibitory effect on nitrification[J]. J Chem Technol Biotechnol,2004, 79(5) :499-504.)報道以甲醇為添加碳源，硝化細菌也可以降解0. 03 3. 89g/L的甲 醛；而反硝化細菌在甲醛和甲醇并存時也可以降解1.36g/L的甲醛(Eiroa M, Vilar A， Kennes C, et al. Formaldehyde biodegradation in thepresence of methanol underdenitrifying conditions[J]. J Chem TechnolBiotechnol，2006，81 (3) :312_317·)； Kondo 等(Kondo Τ, Morikawa Y, Hayashi N,et al. Purification and characterization of formate oxidase from aformaldehyde-resistant fungus[J]. Fems Microbiol Lett, 2002,214(1) :137-142.)從土壤中分離了 1 株甲醛耐受真菌 Aspergillus nomiusIRI013, 在甲醛濃度為4. 5g/L時還能生長并把甲醛完全消耗掉；Mitsui等(Mitsui R，Omori M, Kitazawa H, et al. Formaldehyde-limited cultivationof a newly isolated methylotrophic bacterium, Methylobacterium sp MF 1 :Enzymatic analysis related to C-Imetabolism [J], J Biosci Bioeng，2005，99 (1) 18-22.)分離了 1 株甲基營養菌 Methylobacterium sp. MFl能夠在200h內降解1. 2g/L甲醛。迄今國內外報道的甲醛降解 菌，其甲醛的耐受濃度和降解活性都還不夠高，影響了其實際應用。
發明內容
本發明目的是提供一株高活性高耐受甲醛降解菌及其在微生物降解甲醛中的應用。本發明采用的技術方案是一株高活性高耐受甲醛降解菌——惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida) xyz-zjut，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址湖北省武漢市珞珈山武漢大學，430072， 保藏日期2010年5月23日，保藏號為CCTCCNo =M 2010125。該菌株的16S rDNA序列如下
1actattgaatgcattcgagcggacgacgggagcttgctccttgattcagcggcgtacggg
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圖1為掃描電鏡照片；圖2為細菌系統發育進化樹；圖3為不同氮源對細菌降解甲醛的影響(2g/L甲醛，降解時間24h，pH7，180r/min, 30 °C )；圖4為蛋白胨濃度對細菌降解甲醛的影響(2g/L甲醛，降解時間24h，pH7，180r/ min, 30°C )；圖5為KH2PO4對細菌降解甲醛的影響(3g/L甲醛，降解時間24h，pH7，180r/min, 30 °C )；圖6為K2HPO4對細菌降解甲醛的影響(3g/L甲醛，降解時間24h，pH7，180r/min, 30 °C )；圖7為MgSO4 · 7H20對細菌降解甲醛的影響(3g/L甲醛，降解時間24h，pH7，180r/ min, 30°C )；圖8為微量元素母液對細菌降解甲醛的影響(3g/L甲醛，降解時間24h，pH7，180r/ min, 30°C )；圖9為pH值對細菌降解甲醛的影響圖(3g/L甲醛，降解時間24h，180r/min, 30 °C )；圖10為溫度對細菌降解甲醛的影響(3g/L甲醛，降解時間24h，pH7，180r/min)；圖11為不同濃度甲醛降解過程。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此實施例1 1材料與方法1.1 材料1. 1. 1菌種來源從浙江工業大學廢棄試劑處理點土壤分離得到的1株能夠以甲醛為唯一碳源的 菌株。1.1.2培養基及試劑基本培養基組成=KH2PO40. 7g/L，K2HPO4 0. 85g/L，(NH4)2SO4L 2g/L，MgSO4 · 7H20 0. lg/L，CaCl2 0. 01g/L，FeSO4 · 7H20 0. 001g/L，微量元素母液 0. ImL,溶劑為水，ρΗ7· 0， 115°C 滅菌 30min。微量元素母液組成H3BO36g/L，CoCl2 · 6H20 4g/L，ZnSO4 · 7H20 2g/L，MnCl2 · 4H20 0. 6g/L, Na2MoO4 · 7H20 0. 6g/L, NiCl2 · 6H20 0. 4g/L, CuCl2 · 2H20 0. 2g/L，溶劑為水。乙酰丙酮溶液50g乙酸銨、6mL冰乙酸及0. 5mL乙酰丙酮試劑溶于IOOmL水中。 此溶液在冰箱內保存至少可穩定一個月。1. 2 方法1. 2. 1甲醛檢測方法甲醛檢測方法參照修訂后的GB/T 13197-1991 (水質甲醛的測定乙酰丙酮分光光 度法[S].)，吸取適量試樣于25mL具塞刻度管中，用水稀釋至標線，加入2. 5mL乙酰丙酮溶 液搖勻，于60°C水浴15分鐘，取出冷卻后在波長414nm處，以水為參比測量吸光度，減去空 白管所測得的吸光度，然后從校準曲線上查出試樣中甲醛的含量。1. 2. 2菌株的篩選及純化將少量土壤樣品置于IOOmL無菌生理鹽水中，加玻璃珠震蕩15min后靜置，取15ml 上清用針筒加濾膜過濾，然后將濾膜取出置于基本培養基中，然后加入一定量的0. lg/L甲 醛，180r/min、30°C搖床中培養。將少量培養液涂布到以甲醛作為唯一碳源的基本培養基平板，將培養皿于30°C培 養箱倒置培養，觀察菌落形態并挑取培養皿上的單菌落進行進一步鑒定。1. 2. 3菌株的鑒定使用透射電鏡觀察細菌形態，用革蘭氏染色法將細菌染色并在顯微鏡下觀察菌體 顏色，按標準方法進行細菌的生理生化指標(沈萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗[M].北 京高等教育出版社，1999. 116-120.)測定。16S rDNA序列的擴增采用正向引物5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCGA-3‘，反向引物 5 ‘ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ‘，以細菌的總DNA為模板，PCR反應程序如下94°C變性 4min，94°C 50s, 52°C lmin，72°C 2min，30 個循環；72°C 5min，4°C保存。PCR 產物的測序由上 海英駿生物技術有限公司完成。將16S rDNA的堿基序列在NCBI數據庫上進行BLAST，選出具有代表性的9株細菌 的16S rDNA全序列，利用軟件MEGA4. 0構建系統發育樹，進行系統發育分析。
1. 2. 4培養條件對菌株降解能力的影響及其正交優化分別選取無機氮源KN03、(NH)2SO4、尿素、有機氮源蛋白胨和酵母膏，測定甲醛降解 率。在選擇較佳氮源的基礎上，再考察氮源添加量對細菌降解甲醛的影響，試驗以無菌的含 2g/L甲醛的培養基作為對照。考察KH2P04、K2HPO4, MgSO4 · 7H20、CaCl2, FeSO4 · 7H20 和微量元素母液對細菌降解
甲醛的影響；考察溫度對細菌降解甲醛的影響，因甲醛的揮發性與溫度有關(王金權，羅建 中，溫碧燕，等.室內甲醛釋放規律研究進展[J].環境與可持續發展，2006，1 :24-26.)，所 以每個溫度都設定一個對照；考察PH對細菌降解甲醛的影響，試驗以無菌的含3g/L甲醛的 培養基作為對照。在單因素試驗基礎上，按表1的試驗因素和水平進行L9 (34)正交試驗，以獲得較優 甲醛降解條件。在獲得的最優條件下，進一步提高甲醛濃度提高以考察細菌對高濃度甲醛 的降解能力，甲醛濃度取4、5和6g/L，每個甲醛濃度分別設置對照，每隔一段時間測定培養 基及對照組中甲醛濃度，繪制甲醛降解曲線。表1 正交試驗因素與水平
權利要求
1.一株高活性高耐受甲醛降解菌——惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)xyz-zjut, 保藏于中國典型培養物保藏中心，地址湖北省武漢市珞珈山武漢大學，430072，保藏日期 2010 年 5 月 23 日，保藏號為 CCTCCNo :M 2010125。
2.如權利要求1所述的惡臭假單胞菌xyz-zjut在微生物降解甲醛中的應用。
3.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述降解在30°C、pH8.O條件下進行。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述降解在組成如下的培養基中進行蛋白 胨 1. 2g/L，KH2P044g/L，K2HP043g/L，MgSO4 · 7H20 0. 2g/L，微量元素母液 0. lmL/L，溶劑為水； 所述微量元素母液組成如下:H3B036g/L, CoCl2 · 6H20 4g/L，ZnSO4 · 7H20 2g/L，MnCl2 · 4H20 0. 6g/L, Na2MoO4 · 7H20 0. 6g/L, NiCl2 · 6H20 0. 4g/L, CuCl2 · 2H20 0. 2g/L，溶劑為水。
全文摘要
本發明提供了一株高活性高耐受甲醛降解菌及其在微生物降解甲醛中的應用。本發明惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)xyz-zjut，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址湖北省武漢市珞珈山武漢大學，430072，保藏日期2010年5月23日，保藏號為CCTCC NoM2010125。本發明的有益效果主要體現在本發明提供了一株高活性高耐受甲醛降解菌及其應用方法，為生物防治處理甲醛提供了基礎，應用前景廣闊。
文檔編號A62D3/02GK101993837SQ20101020453
公開日2011年3月30日 申請日期2010年6月21日 優先權日2010年6月21日
發明者吳石金, 徐云, 邱樂泉, 鄭重, 金晶, 鐘衛鴻, 鐘莉, 陳建孟 申請人:浙江工業大學