專利名稱：光合細菌濃縮方法
技術領域：
本發明涉及水產養殖、污水凈化應用的有益微生物制劑的制備。
背景技術：
光合細菌是地球生物圈中最原始的能進行光合作用的原核生物，廣泛分布于湖泊、海洋、河流、稻田的底部表層和城市的污水排放渠中，具有很強的生命力。它們不僅能利用光能、固氮合成有機物質，也能通過多種方式和途徑轉化不同類型的有機物和無機物質，在水生態系統能量轉換、物質循環、水體凈化過程中起著重要的作用。應用光合細菌凈化水產養殖池塘水質，改善養殖環境，提高水產苗種成活率，防治魚、蝦病害方面顯示了巨大的潛力。但光合細菌菌液在使用保存和運輸過程中具有許多局限性，主要表現在光合細菌菌液品質不穩定，隨著保存時間的推移，有效活菌數不斷衰退、老化，影響使用效果。其次光合細菌菌液體積龐大，包裝桶費用高，運輸、保存不便。
發明內容
本發明需要解決常規光合細菌菌液品質不穩定、不易保存，菌液體積龐大，包裝桶費用高，運輸、保存不便的技術問題，提供一種能克服常規光合細菌菌液存在的問題的光合細菌濃縮方法。
本發明的技術方案包括采用規模生產培養的液體光合細菌和進行液體光合細菌電位決定離子(Pdi)測定，其特征是當菌液中出現絮狀時，立即用弱堿液體將電位決定離子調節至+130mv，稍加攪拌，添加RP-50凝絮劑，通過弱堿液和凝絮劑使電位決定離子(Pdi)值在32mv左右終止反應；菌體、電解質、RP-50絮凝劑在弱堿環境中沉淀，沉淀成低親和能的凝膠在容器中陳化8小時以上；用虹吸管吸取三分之二的上清液，余下的膠體團裝袋過濾；然后從濾袋中取出糊狀光合細菌稱重分裝成糊狀光合細菌產品。
本發明采用光合細菌培養至高峰期濃縮，使其處于休眠狀態，不但能最大限度地保存活菌數，而且經水稀釋后光合細菌復活率高，并以幾何倍數繁殖成優勢種群，克服了常規菌液產品品質不穩定、不易保存等缺點，具有體積小，重量輕，隨用隨配，使用簡便，便于運輸和儲存的技術效果。
具體實施例方式
本發明適用于紫色非硫細菌，紅螺菌科(Rhodospirillaceae)主要菌種是球型紅假單胞菌(RP.Sphaeroides)和沼澤紅假單胞菌(RP.Palustris)莢膜紅假單胞菌(RP.Capulata)光合細菌規模生產工藝。
菌種培養采用斜面培養(Molisch瓊脂斜面)，取菌種與茄子瓶斜面，在28度、2000lx光照厭氧條件下進行培養，七天后刮種收獲；菌液第一次擴大培養(RCVBN培養基)是將幾只茄子瓶斜面菌種在無菌室內用無菌生理鹽水洗至500ml三角燒瓶中，每瓶裝載不大于60ml，同時裝入數粒玻璃珠，用200RPm/min搖床震搖過夜，次日將均質后的液體移至4000ml三角燒瓶中，滿載培養液的狀態下，用雷磁攪拌機攪拌，溫度28-30℃，光照2000lx培養七天；第二次擴大培養用二萬毫升血清瓶，裝載19000ml，接種量大于15％，在溫度28-30℃，光照2000lx條件下培養七天，每天早晚人工各搖二次；第二次擴大培養后進行敞開式富集培養，培養基配方乙酸納CH3COONa(3g/L)、氯化鈉NaCL(0.1g/L)、硫酸胺(NH4)2SO4(0.3g/L)、硫酸鎂MgSO4.7H2O(0.2g/L)、磷酸二氫鉀KH2PO4(0.5g/L)、磷酸氫二鉀KH2O4(0.3g/L)、檸檬酸鐵(3.35mg/l)，取容積0.5-0.7噸(T)容器，接血清瓶菌種60L和340L培養基至容積0.5-0.7噸(T)容器，在溫度28-30℃，光照2000lx條件下培養，七天后測酸堿度(PH)、吸光值(OD)收獲。
經過深層厭氧光照培養的液體光合細菌，細胞壁分為兩層；內層為一薄層、厚約7-8納米，含有包壁酸的肽聚糖；外層由脂多糖和脂蛋白構成，為革蘭氏陰性菌；菌液中除了這兩種離子表面(菌體)外，還有電解質(培養基)；由擴散電荷層使溶液平衡，一旦平衡打亂，膠體物(菌體)隨即沉降；糊狀光合細菌固化后，一經稀釋，菌體與培養基恢復液態的電荷平衡，光合細菌在培養基中能正常生長。
糊狀光合細菌的制備工藝包括液體光合細菌電位決定離子(Pdi)的測定，測定時取10L新鮮的液體光合細菌，用電位儀測定，一般情況下Pdi為32mv左右；當菌液中出現絮狀時，Pdi值為-130mv，立即用弱堿液體將Pdi調節至+130mv，稍加攪拌，添加RP-50凝絮劑，Pdi為32mv左右終止反應；菌體、電解質、RP-50絮凝劑在弱堿環境中形成沉淀，這種沉淀在容器中陳化8小時以上；經陳化后的凝膠是以較小的低親和能的活性為特點，陳化后菌體容易過濾分離，采用虹吸管吸取近三分之二的上清液，余下的膠體團裝錦綸濾袋過濾；在錦綸濾袋中取出糊狀光合細菌稱重分裝成糊狀光合細菌產品。
產品質量的測定可隨機采樣10g取其中1g裝四支10ml離心管；四支離心管共裝載1g樣品后，用生理鹽水裝至每管的10ml刻度線，并滴入一滴6N氫氧化納NaOH，搖勻后離心15min，3000r/min，重復三次；收集四支離心管濕菌體，將液體光合細菌培養基注入離心管中洗下濕菌體搖勻后進行吸光值OD光度測定，采用三管法進行活菌數測定；將經堿處理、離心、洗滌過的菌體稱重烘干(105℃)測定每克糊狀光合細菌的干重。
權利要求
1.光合細菌濃縮方法，包括采用規模生產培養的液體光合細菌和進行液體光合細菌電位決定離子測定，其特征是當菌液中出現絮狀時，立即用弱堿液體將電位決定離子調節至+130mv，稍加攪拌，添加RP-50凝絮劑，通過弱堿液和凝絮劑使電位決定離子值在32mv左右終止反應；菌體、電解質、RP-50絮凝劑在弱堿環境中沉淀，沉淀成低親和能的凝膠，在容器中陳化8小時以上；用虹吸管吸取三分之二的上清液，余下的膠體團裝袋過濾；然后從濾袋中取出糊狀光合細菌稱重分裝成糊狀光合細菌產品。
2.根據權利要求1所述的光合細菌濃縮方法，其特征是糊狀光合細菌產品質量的測定隨機采樣10g取其中1g裝四支10ml離心管；四支離心管共裝載1g樣品后，用生理鹽水裝至每管的10ml刻度線，并滴入一滴6N氫氧化納NaOH，搖勻后離心15min，3000r/min，重復三次；收集四支離心管濕菌體，將液體光合細菌培養基注入離心管中洗下濕菌體搖勻后進行吸光值OD光度測定，采用三管法進行活菌數測定；將經堿處理、離心、洗滌過的菌體稱重烘干(105℃)測定每克糊狀光合細菌的干重。
全文摘要
光合細菌濃縮方法，涉及水產養殖、污水凈化用的有益微生物制劑的制備，需要解決光合細菌菌液品質不穩定、菌液體積大、包裝費用高、運輸、保存不便的問題。本發明包括采用規模生產培養的液體光合細菌和液體光合細菌電位決定離子測定，其特征是當菌液中出現絮狀時，立即用弱堿液體將電位決定離子調節至+130mv，稍加攪拌，添加凝絮劑，通過弱堿液和凝絮劑使電位決定離子值在32mv左右終止反應；菌體、電解質、絮凝劑在弱堿環境中沉淀成低親和能的凝膠，在容器中陳化8小時以上；用虹吸管吸取三分之二上清液，余下膠體團裝袋過濾；然后從濾袋中取出糊狀光合細菌稱重分裝成糊狀光合細菌產品。本發明適用于光合細菌規模生產。
文檔編號C12N1/20GK1854289SQ200510025529
公開日2006年11月1日 申請日期2005年4月28日 優先權日2005年4月28日
發明者黃寧宇, 常仁亮, 夏連軍 申請人:中國水產科學研究院東海水產研究所