專利名稱：用于食管癌治療方案選擇和/或預后評估的檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測試劑盒，具體地說是一種用于食管癌治療方案選擇和/或預后評估的檢測試劑盒。
背景技術：
食管癌是發生在胃腸道上端惡性程度最高的腫瘤之一。它的發生源于食管的上皮組織，大致可分為腺癌和鱗狀細胞癌。目前認為食管癌的發生可能與吸煙、嗜酒、胃食管返流性疾病、感染、飲食習慣(如常吃辛辣食物)、嚼煙、年齡及其它未知因素有關。雖然食管癌在全球范圍內總體發生率較低，但在中國、冰島、愛爾蘭、日本、韓國和英國卻是一種高發的惡性腫瘤。在美國食管癌發生率較低，2007年美國僅有15，000多新發病例，而在英國卻有近8，000新發病例，這使得食管癌成為英國第九位高發的惡性腫瘤。而全世界每年約有500，000食管癌新發病例，尤其是在最近20年，食管癌的發生呈現出持續上升趨勢。中國的食管癌發生率位居全世界第一，其次是某些非洲國家和日本。食管癌是一種預后很差的惡性腫瘤，往往在患者初診時腫瘤已經出現了轉移，結果導致食管癌患者的療效很差，五年生存率還不到5%。而在英國，食管癌患者的一年生存約為30%，五年生存率為8%。另一個導致食管癌預后差的原因是存在嚴重的醫療問題使得患者不能接受手術或輔助治療。因此而導致2007年英國有近7600名食管癌患者死亡，而全世界有超過400，000名患者死亡。目前沒有一種有效的手段對食管癌患者的預后進行檢測，且可輔助醫生選擇合理的有針對性的治療方案。
發明內容
本發明的目的在于提出一種可準確、快速的用于食管癌治療方案選擇和/或預后評估的檢測試劑盒。本發明的另一目的在于提出一種用于食管癌治療方案選擇和/或預后評估的基因芯片。本發明的第三目的在于提出一基因群的在制備食管癌治療方案選擇和/或預后評估檢測試劑盒中的新用途。本發明的發明思路為發明人鑒定出一組基因，其表達水平的變化具有顯著的臨床意義。再經過后期大量的統計學分析最終鑒定出16個基因(包括兩個管家基因)并制備得到檢測試劑盒，對這些基因的表達水平進行綜合分析后可以很好地對患者的預后進行評估。運用該試劑盒可以對手術后或組織活檢患者進行快速的臨床檢測，從而幫助臨床醫師對患者的預后進行很好的評估。此外，該檢測結果還可以鑒別出哪些患者不適合于常規的治療方案，從而建議患者選用更加合適的個體化治療方案。最后，這些分子標記物在將來可能作為潛在的藥物作用靶點用于腫瘤的治療。為了實現上述發明目的，本發明的具體技術方案為一種用于食管癌治療方案選擇和/或預后評估的檢測試劑盒，所述試劑盒包括檢測下述基因表達的試劑； 所述基因包括
BMP-8、CD133、CD29、Carl、CL5、Endomus2、Nectin3、Nectinl、Kail、PPARGCA、WAVE-1、 WAVE-3、BMP9、CMGl、IL22R 及 VEGF-D。所述基因還包括管家基因GAPDH及CK19。所述試劑為對權利要求1所述基因進行免疫組化檢測所用試劑。所述試劑盒具體組成為
(1)Hot-start Q-master mix (Abgene)；
(2)用于檢測權利要求1所述基因的引物；
(3)FAM標記的通用探針。所述引物序列如SEQ ID No. 1至36所示。用于檢測上述各基因表達的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID No. 1至36 所示。一種用于食管癌治療方案選擇和/或預后評估的基因芯片，所述基因芯片包括固相載體和探針，所述探針與下述基因和/或其互補序列進行雜交；所述基因包括
BMP-8、CD133、CD29、Carl、CL5、Endomus2、Nectin3、Nectinl、Kail、PPARGCA、WAVE-l、 WAVE-3、BMP9、CMGl、IL22R 和 VEGF-D。一基因群用于制備食管癌治療方案選擇和/或預后評估檢測試劑盒的用途，所述基因群包括下述基因
BMP-8、CD133、CD29、Carl、CL5、Endomus2、Nectin3、Nectinl、Kail、PPARGCA、WAVE-l、 WAVE-3、BMP9、CMGl、IL22R 及 VEGF-D。一基因群用于制備食管癌治療方案選擇和/或預后評估基因芯片的用途，所述基因群包括下述基因
BMP-8、CD133、CD29、Carl、CL5、Endomus2、Nectin3、Nectinl、Kail、PPARGCA、WAVE-l、 WAVE-3、BMP9、CMGl、IL22R 及 VEGF-D。
上述各基因的命名均來自于www. NCBI. LM. NIH. gov數據庫或者文獻中所公認的命名， 均為本領域技術人員公知的。本發明的有益效果
本發明試劑盒通過對多個基因表達水平的檢測和鑒定，來評估臨床治療的療效，從而判斷哪些患者的預后較差，哪些患者不適合使用常規的治療方案，為醫生選擇治療方案提供輔助參考。本發明試劑盒檢測方法簡便、準確性強，且成本較低，易于被廣大患者接受。
圖1為CTF8模式的分子標記物將食管癌患者分成兩組。0為“預后好”組；1為 “預后差”組，兩組之間存在顯著的統計學差異(P<0. 00001)。圖2為CTF8. 12模式的分子標記物將食管癌患者分成三組。1為“預后好”組；2 為“預后中”組；3為“預后差”組，三組之間存在顯著的統計學差異(p<0. 00001)。圖3為淋巴結轉移狀態與食管癌預后的關系。0為淋巴結轉移陰性；1為淋巴結轉移陽性。圖4為 M分期與食管癌預后的關系。2為 !分期MageII ;3為 !分期 StageIII; 4 為 TNM 分期 MagelV。圖5為腫瘤細胞分化狀態與食管癌預后的關系。1為高分化；2為高中分化；3為中分化；4為低中分化；5為低分化。圖6為腫瘤栓塞與食管癌預后的關系。0為出現腫瘤栓塞；1為無腫瘤栓塞。圖7為病理類型與食管癌預后的關系。1為鱗狀細胞癌；2為腺癌。圖8為CTF8模式的分子標記物將淋巴結轉移陰性的食管癌患者分為兩組。0為 “預后好”組；1為“預后差”組。圖9為CTF8模式的分子標記物將淋巴結轉移陽性的食管癌患者分為兩組。0為 “預后好”組；1為“預后差”組。
具體實施例方式實施例1目的基因的獲得 1、組織的收集、儲存和記錄
測試組織樣本由發明人收集，食管癌患者手術切除后的廢棄組織樣本(包括正常組織、 癌旁組織和腫瘤組織)并儲存于-80°C冰箱備用。2、食管癌組織的樣本處理及cDNA庫的構建
食管癌組織用低溫恒冷冰凍切片機(Leica)進行冰凍組織切片，保存部分切片以備組織學分析，約30份切片的組織用于提取RNA (方法如下)，在對RNA進行定量后，用等量RNA 構建cDNA庫。 3、組織RNA的提取以及cDNA的合成
將冰凍組織切成5-10Mffl厚度，其中一部分用于免疫組化分析(Jiang et al 2003a)。 取20-30份切片的組織在冰預冷的RNA提取試劑(RNA isolation reagent)中用勻漿器進行勻漿后。RNA的濃度用紫外分光光度計進行檢測(Jiang et al 2003a)。以總RNA 為模板，Oligo-dT為引物，用RT試劑盒(Promega)進行逆轉錄，并以β-actin引物作內參檢測所合成cDNA的質量。PCR引物用Beacon Designer (California, USA)進行設計，在 Invitrogen Ltd和Sigma公司合成。實驗所用分子生物學級的瓊脂糖和DNA Ladder均購自Invitrogen，常規PCR試劑和定量PCR試劑分別購自AbGene和Biorad。4、分子標記物的定量分析
對上述合成cDNA中待測基因表達水平的檢測采用基于Amplifuor 原理改進后的實時定量 PCR 技術(Nazarenko et al 1997 and Jiang et al 2003a and 2003b)。首先采用 Beacon Designer 軟件(version 2,Biosoft,Palo Alto,California,USA)設計 PCR 引物， 其中一條引物(通常是反義引物)末端加上一個Z序列(5’ actgaacctgaccgtaca’3，序列與通用的Z探針序列互補)。用于β-actin檢測的Taqman "<試劑盒購自Perkin-Elmer 。反應體系如下Hot-start Q-master mix、特異上游引物lOpmol，含有Z序列的下游引物 lpmol、FAM標記的探針(Intergen Inc. )IOpmol 以及約50ngRNA。反應在 IcyclerlQ (Bio-Rad , Hemel Hamstead, England, UK)上進行，具體反應條件如下首先94°C變性 12 min，然后進行50個熱循環，包括94°C變性15s，55°C復性40s，72°C延伸20s (Jiang et
5al 2003b, 2003c)。反應中采用內標與待測樣本同時進行擴增，從而確定樣本中目的基因的轉錄水平。結果以兩種方式來表示一種是等量RNA的轉錄水平，另一種是目的基因與 GAPDH基因或CK19基因表達水平的相對比值。5、根據目的基因的表達方式進行分子標記物選擇
首先用 Minitab 軟件(Minitab Inc. , State College, PA16801, USA)對樣本的目的基因轉錄水平進行分析。確定最終的入選基因根據備選基因的表達水平及其是否能將長期患病組同其它組區分開來進行最后選擇，篩選條件收集患者的臨床分期、病理類型、治療方式以及生存時間等臨床資料，如果通過備選基因的表達水平能夠很好地將患者的這些臨床資料進行區分，尤其是能夠區分不同生存期患者，則確定為最終的入選基因。通過Excel (Microsoft Office 2007 version)軟件進行分組和簡單的統計學分析，再用SPSS (SPSS Inc., Chicago, Illinois, US)軟件對患者的生存期作進一步的統計學分析。試劑盒的配制在確定最終入選的基因標記物后，具體基因標記物見表1，根據這些標記物配制檢測試劑盒。首先配制所有用于檢測基因表達的試劑，然后將其自動點樣到用于檢測臨床和細胞樣本的96孔板中。試劑盒在實驗室配制好后，儲存于_20°C備用。6、分子標記物的鑒定
在實驗分析后，最終確定16個基因作為判斷食管癌患者預后和療效評估的分子標記物，見表 Io BMP-8、CD133、CD29、Carl, CL5、Endomus2、Nectin3、Nectinl、Kail、PPARGCA、 WAVE-1、WAVE-3、BMP9、CMG1、IL22R 及 VEGF-D，GAPDH 管家基因對照和 CK19 管家基因對照。
表1作為食管癌遺傳標記物的16個基因標記物
權利要求
1.一種用于食管癌治療方案選擇和/或預后評估的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測下述基因表達的試劑；所述基因包括BMP-8、CD133、CD29、Carl、CL5、Endomus2、Nectin3、Nectinl、Kail、PPARGCA、WAVE-l、 WAVE-3、BMP9、CMGl、IL22R 及 VEGF-D。
2.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述基因還包括管家基因GAPDH 及 CK19。
3.根據權利要求1或2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑為對權利要求1所述基因進行免疫組化檢測所用試劑。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒組成為(1)Hot-start Q-master mix (Abgene)；(2)用于檢測權利要求1所述基因的引物；(3)FAM標記的通用探針。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述引物序列如SEQID No. 1至36所示。
6.用于檢測權利要求1中所述各基因表達的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID No. 1至36所示。
7.一種用于食管癌治療方案選擇和/或預后評估的基因芯片，所述基因芯片包括固相載體和探針，其特征在于，所述探針與下述基因和/或其互補序列進行雜交；所述基因包括BMP-8、CD133、CD29、Carl、CL5、Endomus2、Nectin3、Nectinl、Kail、PPARGCA、WAVE-l、 WAVE-3、BMP9、CMGl、IL22R 和 VEGF-D。
8.基因群用于制備食管癌治療方案選擇和/或預后評估檢測試劑盒的用途，其特征在于，所述基因群包括下述基因BMP-8、CD133、CD29、Carl、CL5、Endomus2、Nectin3、Nectinl、Kail、PPARGCA、WAVE-l、 WAVE-3、BMP9、CMGl、IL22R 及 VEGF-D。
9.基因群用于制備食管癌治療方案選擇和/或預后評估基因芯片的用途，其特征在于，所述基因群包括下述基因BMP-8、CD133、CD29、Carl、CL5、Endomus2、Nectin3、Nectinl、Kail、PPARGCA、WAVE-l、 WAVE-3、BMP9、CMGl、IL22R 及 VEGF-D。
全文摘要
本發明公開了一種用于食管癌治療方案選擇和/或預后評估的檢測試劑盒，所述試劑盒包括檢測下述基因群表達的一種或多種試劑；所述基因群由下述基因中兩個或兩個以上基因組成BMP-8、CD133、CD29、Car1、CL5、Endomus2、Nectin3、Nectin1、Kai1、PPARGCA、WAVE-1、WAVE-3、BMP9、CMG1、IL22R和VEGF-D。本發明通過對多個基因表達水平的檢測和鑒定，來評估臨床治療的療效，從而判斷哪些患者的預后較差，哪些患者不適合使用常規的治療方案。本發明試劑盒檢測方法簡便、準確性強，且成本較低，易于被廣大患者接受。
文檔編號C40B40/06GK102199664SQ20111007208
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月24日 優先權日2011年3月24日
發明者姜文國, 張力建 申請人:姜文國, 張力建