用于一體化檢測的基因芯片及在片擴增方法
【專利摘要】用于一體化檢測的基因芯片及在片擴增方法，按如下步驟：（1）在基片上固定特異性核酸引物；（2）將固定特異性核酸引物的基片置于擴增管中；（3）將制備好的待檢測基因提取物、擴增體系加入到擴增管中；（4）將擴增管置于基因擴增儀中擴增；（5）基因擴增完成后，檢測基片上的熒光信號，從而獲得基因信息。本發明去除了通用的核酸雜交的步驟，極大地提高了效益，降低了成本；基片上固定特異性核酸引物，并置于擴增管中進行在片PCR，使各個PCR反應能分開進行，解決了多重PCR中引物互相干擾問題；實現一體化同時檢測多個基因信息，避免了擴增、產物轉移過程中可能出現的污染；使用的儀器簡單且通用，普通PCR儀和熒光顯微鏡即可完成檢測。
【專利說明】用于一體化檢測的基因芯片及在片擴增方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種在片PCR擴增的基因芯片，可以用于一體化檢測基因信息，使得基因擴增、檢測等相應功能在同一個封閉空間內即可完成，無需轉移操作。
【背景技術】
[0002]目前，在分子生物學、基因檢測、疾病的檢測與診斷等各種涉及核酸分子的檢測及研究過程中，聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)都是不可或缺的技術之一。PCR的原理是DNA (脫氧核糖核酸，Deoxyribonucleic acid)的半保留復制,雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。PCR反應中有兩條引物，即5'端引物和3'引物，按實驗需要設計引物，以一條DNA單鏈為基準(常以信息鏈為基準)，5,端引物與位于待擴增片段5,端上的一小段DNA序列相同；3'端引物與位于待擴增片段3'端的一小段DNA序列互補。PCR擴增方法靈敏度極高，可以將原本濃度極低的待測基因擴增到數萬至數百萬倍的濃度，其擴增產物一般使用電泳的方法來檢測。
[0003]但是，該技術存在如下問題:首先，因為PCR擴增的高靈敏度，在擴增和轉移過程中很容易發生交叉污染，而且該污染很容易被放大，出現“假陽性”的現象，不僅影響對結果的判斷，還常常需要其他實驗加以驗證。其次，使用電泳來檢測PCR擴增產物，需經染色才能顯現帶型，最常用的是極毒的溴化乙錠(EB)染色法。另外，一次PCR反應一般情況下只能檢測一個基因的信息。如果要檢測多個基因，即多重PCR，引物之間、引物與待測基因之間會產生干擾，很難實現在同一時間在一個反應體系內對多個基因的檢測，因此，還無法滿足人們對于多基因同時檢測的需求。
[0004]基因芯片(Genechip)又稱DNA芯片(DNA Chip),也稱為寡核苷酸陣列或雜交陣列分析，它是根據DNA雙螺旋原理而發展的核酸鏈間分子雜交的技術。它是在基片表面制備成千上萬的基因單元作為配基，對待測基因進行篩選。基片是指玻璃，硅片，石英，金屬，高分子材料，塑料片、尼龍膜、硝酸纖維膜、多孔膜，凝膠這類固相基底材料，通過化學、物理方法對其進行改性后可得到的具有功能性基團的載體表面。待測基因通過PCR擴增技術得到數量放大，再進行熒光標記，使其在篩選過程中產生可識別的熒光發射或光譜轉移。此熒光信號被檢測儀器檢出，達到基因識別的目的。將已知的DNA (探針)和未知的核酸序列之間的一方以有序的陣列固定到載玻片或娃片上，再與突光標記的另一方進行雜交。當突光標記的一方在DNA芯片上發現互補序列時即發生雜交，雜交的結果以熒光和模式識別分析來檢測。DNA芯片技術可以快速分析大量的基因信息，從而使生物醫學工作者可以研究并收集基因表達和變異信息。
[0005]基因芯片的出現，實現了同時檢測多個基因的想法，使得高通量檢測基因成為了可能。盡管利用基因芯片可以高通量地獲得基因的信息，同時檢測多個基因，但是其待測基因的擴增、擴增產物的轉移以及雜交都是在不同的體系中完成的，這難免使得每個步驟的銜接過程都增大了污染的可能性，從而降低了實驗檢測的準確性和可靠性。基因芯片在高通量基因檢測和篩選中有重要作用，但由于制造成本及雜交反應復雜性，在低通量的實際應用中受到了限制。為此，有科學家設計了一些方法來促進其應用，如管蓋芯片，其使用普通PCR擴增管，在專用管蓋內側固定分子探針，擴增后與PCR產物雜交。但其還是有DNA雜交這一步驟，為此還專門設計改造擴增管。
【發明內容】
[0006]本發明提供了一種用于一體化檢測的基因芯片及在片擴增方法，即將特異性核酸引物固定在基片上所制成的基因芯片，直接放入普通擴增管中進行PCR擴增，檢測中無需進行核酸分子雜交過程，減化了操作，提高基因檢測的準確性和可靠性。
本發明是通過以下技術方案實現的。
[0007]本發明所述的用于一體化檢測的基因芯片，在基片上固定特異性核酸引物。
[0008]本發明所述的用于一體化檢測的基因芯片及在片擴增方法，按如下步驟:
(1)在基片上固定特異性核酸引物；
(2)將固定特異性核酸引物的基片置于擴增管中；
(3)將制備好的待檢測基因提取物、擴增體系加入到擴增管中； (4)將擴增管置于基因擴增儀中擴增；
(5)基因擴增完成后，檢測基片上的熒光信號，從而獲得基因信息。
[0009]步驟(2)所述的擴增體系包括相應的酶和熒光標記的核酸引物系統等。
[0010]本發明所述的基片，包括玻璃、硅片、石英、金屬、高分子材料、塑料片、尼龍膜、硝酸纖維膜、多孔膜或凝膠等。
[0011]本發明所述的基因擴增儀可以是各種現有的擴增儀器，也可以是改進的專用擴增和檢測一體化儀器。
[0012]即將特異性核酸引物固定在基片上所制成的基因芯片，直接放入普通擴增管中進行PCR擴增，擴增體系中包括熒光標記的相應引物。
[0013]本發明將固定在基片上的特殊DNA序列，作為特異性的核酸引物的一部分放入擴增管中，加入相應的PCR擴增體系，包括所需的帶熒光標記的引物、酶以及緩沖液及待檢測基因，進行PCR擴增，基因擴增完成后，檢測基片上的熒光信號，從而獲得基因信息。
[0014]由于本發明將特異性的核酸引物固定于擴增管內的基片(玻璃，硅片，石英，金屬，高分子材料，塑料片、尼龍膜、硝酸纖維膜、多孔膜，凝膠等)上，在擴增管內構成一個相對封閉的空間，使得本發明可以被應用于一體化檢測基因，能在上述相對封閉的空間內完成。本發明使得基因擴增在一個相對封閉的空間內即可完成，避免了交叉污染，省去了核酸雜交操作過程，實現了基因在片擴增的一體化。
[0015]本發明有效地整合了 PCR技術與基因芯片技術的優勢，彌補了其缺陷，在實現一體化高通量檢測多個基因信息的同時，有效地避免了擴增、擴增產物轉移過程中可能出現的污染。同時去除了在基因芯片技術中通用的核酸雜交這一步驟，也去除了 PCR擴增后的電泳這一步驟，減化了操作，降低了成本，提高了效益。
[0016]本發明提供了一種用于一體化檢測的基因芯片及在片擴增方法，有效地整合了PCR技術與基因芯片技術的優勢，在實現一體化檢測多個基因信息的同時，有效地避免了擴增、擴增產物轉移過程中可能出現的污染。去除了在基因芯片技術中通用的核酸雜交這一步驟，減化了操作，提高了效益。
[0017]本發明與現有技術相比，具有以下優點:
(I)固定特異性核酸引物于基片上，該引物起著引物和探針的雙重作用，從而去除了通用的核酸雜交這一步驟，極大地提高了效益，降低了成本。
[0018](2)基片上固定特異性核酸引物，并置于擴增管中進行在片PCR，使各個PCR反應能分開進行，解決了多重PCR中引物互相干擾問題。
[0019](3)實現一體化同時檢測多個基因信息，避免了擴增、產物轉移過程中可能出現的污染。 [0020](4)使用的儀器簡單且通用，普通PCR儀和熒光顯微鏡即可完成檢測，將大大推動基因芯片技術應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1是本發明實施例1的示意圖。
【具體實施方式】
[0022]本發明將通過以下實施例作進一步說明。
[0023]實施例1。
[0024]本發明的用于一體化檢測的基因芯片及在片擴增方法，即將特異性核酸引物固定在基片上所制成的基因芯片，直接放入普通擴增管中進行PCR擴增。固定在基片上的特殊DNA序列，作為引物的一部分放入擴增管中，加入相應的PCR擴增體系，包括所需的帶熒光標記的引物、待檢測基因、擴增體系(dNTP、相應的酶和緩沖液等)，進行PCR擴增，基因擴增完成后，檢測基片上的熒光信號，從而獲得基因信息。擴增管內的擴增體系包括用于管內在片PCR反應的基片、基片上固定的引物系統、帶標記的核酸引物系統、擴增體系(dNTP、相應的酶和緩沖液等)。
[0025]本發明的用于一體化檢測基因的在片PCR基因芯片，其使用方法如下:
(I)芯片的制備
塑料基片經清洗、等離子處理、化學修飾后在基片上得到活性基團，設計特異性的核酸引物使其一段帶有相應的活性基團，通過手工或點樣儀將核酸探針按照一定的陣列固定到經化學處理的基片上，制備出基因芯片。
[0026](2)基因擴增
將制備的基因芯片置于擴增管內，擴增管管內加入相應的PCR擴增體系，包括所需的帶熒光標記的引物、待檢測基因、擴增體系(dNTP、相應的酶和緩沖液等)。蓋好管蓋，將擴增管置于PCR擴增儀上擴增。
[0027](3)芯片檢測
將擴增后的基因芯片置于熒光顯微鏡下，逐個掃描，檢查結果。
[0028]實施例2。
[0029]本發明的用于一體化檢測的基因芯片及在片擴增方法，即將特異性核酸引物固定在基片上所制成的基因芯片，直接放入普通擴增管中進行PCR擴增，用于檢測轉基因大豆。在管內玻璃芯片上通過點樣儀固定上轉基因大豆轉入基因的特異性引物；擴增管內加入帶標記的特異性的引物、待測 基因、擴增體系(dNTP、相應的酶和緩沖液等)。PCR擴增后，經熒光掃描，若出現熒光，則基因擴增反應發生，待測基因中含有轉入基因，表明該樣品來源于轉基因大豆。
【權利要求】
1.一種用于一體化檢測的基因芯片，其特征是在基片上固定特異性核酸引物。
2.—種權利要求1所述的用于一體化檢測的基因芯片的在片擴增方法，其特征是按如下步驟: (1)在基片上固定特異性核酸引物； (2)將固定特異性核酸引物的基片置于擴增管中； (3)將制備好的待檢測基因提取物、擴增體系加入到擴增管中； (4)將擴增管置于基因擴增儀中擴增； (5)基因擴增完成后，檢測基片上的熒光信號，從而獲得基因信息； 步驟(2)所述的擴增體系包括相應的酶和熒光標記的核酸引物系統。
3.根據權利要求2所述的用于一體化檢測的基因芯片的在片擴增方法，其特征是所述的基片為塑料片、玻璃、硅片、石英、尼龍膜、硝酸纖維膜制成。
4.根據權利要求2所述的用于一體化檢測的基因芯片的在片擴增方法，其特征是所述的基因擴增儀為擴增儀器， 或專用擴增和檢測一體化儀器。
【文檔編號】C40B40/06GK103966320SQ201410166686
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月24日 優先權日:2014年4月24日
【發明者】吳凌偉, 秦煊 申請人:南昌大學