專利名稱：用于通過選擇性抑制vegf來治療癌癥的組合物和方法
背景技術：
本申請要求1999年4月28日提交的共同待審美國臨時專利申請流水號60/131,432的優先權，本文特別收入該申請的全部正文和圖作為參考，而不作任何具體放棄。美國政府依據國家衛生研究院(NationalInstitute of Health，NIH)的1RO1 CA74951、5RO CA54168、和T32GM07062擁有對本發明的權利。
1.發明領域本發明主要涉及抗體、血管發生、和腫瘤治療領域。具體而言，本發明提供了特異性抑制VEGF結合兩種VEGF受體之一VEGFR2的抗VEGF抗體。這些抗體抑制血管發生并誘導腫瘤退化，而且已經證明了安全性，這要歸功于它們的特異性阻斷特性。本發明中基于抗體的組合物和方法還延伸至免疫綴合物和其它治療性聯合、試劑盒、和方法的使用，包括藥物前體。
2.相關技術的描述腫瘤細胞對化療劑的抗性是臨床腫瘤學中的一個重要問題。事實上，這是許多最普遍的人類癌癥仍然不能有效化療干預的主要原因之一，盡管該領域具有某些進展。
另一種腫瘤治療策略是使用“免疫毒素”，即使用抗腫瘤細胞抗體將毒素投遞至腫瘤細胞。然而，與化療方法一樣，當應用于實體瘤時，免疫毒素療法也遭遇了重大障礙。例如，抗原陰性細胞或抗原缺陷細胞能夠存活，并再次形成腫瘤或導致進一步的轉移。
實體瘤耐受基于抗體療法的另一個原因是高分子試劑(諸如抗體和免疫毒素)通常不能滲透腫瘤塊(Burrows等人，1992；Dvorak等人，1991a；Baxter和Jain，1991)。腫瘤內的物理擴散距離和間質壓力都嚴重限制了這種療法。已經證明，在所有人類癌癥中占超過90％的實體瘤耐受抗體和免疫毒素治療。
最近的策略是靶向實體瘤的血管結構。靶向腫瘤血管而非腫瘤細胞自身具有某些優點，即不大可能形成抗性腫瘤細胞，而且容易接近靶向的細胞。此外，由于許多腫瘤細胞依賴單一血管供應氧和營養，所以破壞血管能夠放大抗腫瘤效果(Burrows和Thorpe，1994a；1994b)。美國專利5,855,866和5,965,132描述了例示性的血管靶向策略，這兩項專利具體描述了將抗細胞試劑和毒素靶向投遞至腫瘤血管結構標記物。
血管靶向方法的另一種有效形式是使凝血因子靶向腫瘤血管結構表達或吸收的標記物(Huang等人，1997；美國專利號5,877,289、6,004,555、和5,＿＿,＿＿(美國申請流水號08/482,369，1998年10月20日交納頒證費))。向腫瘤血管結構投遞凝血劑而非毒素還具有其它優點，即降低免疫原性和甚至更低的毒副作用風險。正如美國專利5,877,289中公開的，優選用于這些腫瘤特異性“凝血配體”的凝血因子是截短形式的人凝血誘導蛋白質、組織因子(TF)、血液凝血主要起始物。
雖然使毒素和凝血因子向腫瘤血管的特異性投遞是腫瘤治療中的重大進步，但是某些外周腫瘤細胞能夠幸免于由這些療法引起的腫瘤內破壞。因此，需要聯合使用抗血管發生策略與美國專利5,855,866和5,877,289中破壞腫瘤的方法。
抗血管發生腫瘤治療策略基于抑制通常位于實體瘤外周的萌芽血管的增殖。大多在更傳統干預(諸如手術或化療)后，使用這些療法來降低微轉移的風險或抑制實體瘤的進一步生長。
血管發生指由原有血管和/或循環中的內皮干細胞形成新的血管結構(Asahara等人，1997；Springer等人，1998；Folkman和Shing，1992)。血管發生在許多生理學過程中具有至關重要的作用，諸如胚胎發生、創傷愈合、和月經。血管發生在某些病理學事件中也是重要的。除了在實體瘤生長和轉移中的作用之外，具有血管發生性成分的其它值得注意的狀況是關節炎、牛皮癬、和糖尿病性視網膜病變(Hanahan和Folkman，1996；Fidler和Ellis，1994)。
在正常和惡性組織中，血管發生受靶組織和較遠位點產生的血管發生刺激劑與血管發生抑制劑之間平衡的調控(Fidler等人，1998；McNamara等人，1998)。血管內皮生長因子-A(VEGF，也稱為血管通透因子，VPF)是血管發生的主要刺激物。VEGF是由缺氧和致瘤突變誘導的多功能細胞因子，可以由多種組織產生(Kerbel等人，1998；Mazure等人，1996)。
對于VEGF是病理性狀況中血管發生的主要刺激物的認識導致了設想阻斷VEGF活性的多次嘗試。已經有人建議，將抑制性抗VEGF受體抗體、可溶性受體構建物、反義策略、針對VEGF的RNA aptamer、和低分子量VEGF受體酪氨酸激酶(RTK)抑制劑用于干擾VEGF信號傳導(Siemeister等人，1998)。事實上，針對VEGF的單克隆抗體已經顯示在小鼠中抑制人腫瘤異種移植物的生長和腹水的形成(Kim等人，1993；Asano等人，1998；Mesiano等人，1998；Luo等人，1998a；1998b；Borgstrom等人，1996；1998)。
雖然上述研究強調了VEGF在實體瘤生長中的重要性，及其作為腫瘤治療靶的潛力，但是鑒定可抑制VEGF誘導的血管發生的其它試劑將有助于增加治療選擇。開發更特異性抑制VEGF受體結合的治療劑將是重要進步，只要改進的特異性不顯著危及抗腫瘤效果。
發明概述通過提供用于抗血管發生和抗腫瘤治療的新型治療性組合物和方法，本發明克服了現有技術的某些缺點。本發明以特異性抑制VEGF與兩種主要VEGF受體中僅其一的VEGFR2的結合的抗體為基礎。這些抗體可抑制血管發生并誘導腫瘤退化，就像其它抗VEGF抗體(包括早已用于臨床試驗的抗體)一樣有效，而且已經證明了安全性，這要歸功于它們的特異性阻斷特性。使用提供的特定種類的抗體，本發明的組合物和方法還延伸至免疫綴合物和聯合的應用，包括藥物前體。
本發明的特殊優勢是提供的抗體只抑制VEGF結合VEGFR2而非VEGFR1。這與包括A4.6.1在內的現有技術主導抗體相反，它們抑制VEGF結合VEGFR2和VEGFR1二者。因為VEGFR1具有與血管發生無關的重要生物學作用，特別是巨噬細胞的遷移和趨化性、破骨細胞和破軟骨細胞的功能，所以這種只抑制VEGFR2所介導血管發生的能力具有明顯優勢。這可以轉變成顯著的臨床好處，即巨噬細胞仍然能夠介導宿主的抗腫瘤應答，而且骨的新陳代謝(如在兒科癌癥治療中)沒有受到不利影響。
另一項優勢是，因為在存在本發明抗體時仍舊維持了VEGF與VEGFR1的結合，所以借助VEGF結合在腫瘤內皮上上調的VEGFR1，本發明的抗體能夠用于將附著的治療劑特異性投遞至腫瘤血管。因此，在免疫綴合物的內容中，本發明提供了在同一分子內具有抗血管發生和破壞腫瘤兩種特性的試劑。
還有另一項優勢在于提供的組合物能夠中和由VEGFR2介導的VEGF存活信號裸露的或綴合的本發明抗體由此可以與其它療法和/或附著試劑形成協同性聯合，特別是那些因VEGF抵消其破壞特性而在體內不能實現最大效力的方法和試劑。
本發明由此提供了特異性阻斷VEGF結合VEGFR2受體的抗體，或基本上只阻斷VEGF結合VEGFR2受體的抗體。這些抗體顯著抑制VEGF結合VEGFR2受體(KDR/Flk-1)，而不顯著抑制VEGF結合VEGFR1受體(Flt-1)。由此，抗體抑制VEGF結合VEGFR2受體(KDR/Flk-1)，而基本上不抑制VEGF結合VEGFR1受體(Flt-1)；在體內展示抗血管發生和抗腫瘤效果，且不顯著抑制巨噬細胞的趨化性、破骨細胞或破軟骨細胞的功能。
本發明的抗體簡便的稱為“阻斷VEGFR2而不阻斷VEGFR1的抗VEGF抗體”，甚至更簡便的稱為“阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體”，這用于簡單提及本發明的所有組合物、應用、和方法。“阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體”是阻斷VEGF結合VEGFR2受體的抗VEGF的抗體。顯然，這些抗體不是抗VEGFR2受體自身的抗體。
在本發明之前，沒有產生特異性阻斷VEGF結合VEGFR2而非VEGFR1的抗VEGF抗體的動機，也沒有預見這些抗體的任何優點。重要的是，由于阻斷性抗體需要從物理學上防止生長因子與其受體的相互作用，并且由于生長因子上的受體結合位點受限于大小，所以沒有任何跡象指出能夠開發這些特異性阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體。
然而，根據本文公開的發明人令人驚訝的發現，為現有技術提供了這樣的知識，即已經能夠制備這些特異性抑制性抗VEGF抗體，而且具有明顯優勢。本申請還描述了用于產生候選的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體的方法學，和由候選者群鑒定真正的阻斷VEGFR2的特異性抗體所需測定法的常規技術方面。因此，參照本發明，能夠制備一系列阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體并用于各種實施方案，包括抑制血管發生和治療血管發生性疾病和腫瘤，而不抑制經VEGFR1受體介導的VEGF信號傳導，且沒有與其有關的顯著缺點和副作用。
除了明確指出上限的情況，如貫穿完整申請書所用，術語“一個/種”的用意是“至少一個/種”、“至少第一個/種”、“一個/種或多個/種”、或“多數”所指成分或步驟。因此，如本文所用，“一種抗體”指“至少第一種抗體”。如同任何單個藥劑的量一樣，本領域技術人員參照本發明的內容可以知道各種聯用的可操作范圍和參數。
現在能夠通過競爭和/或功能測定法來鑒定“特異性抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2(KDR/Flk-1)的抗體。為了簡便，優選的測定法是基于ELISA的競爭測定法。在競爭測定法中，將VEGF與不同量的待測抗體(如摩爾數過量100倍-1000倍)預先混和或混和，并測定待測抗體降低VEGF結合VEGFR2的能力。VEGF可以預先標記并直接檢測，或者可以使用(第二種)抗VEGF抗體或二抗和三抗檢測系統來檢測。這種競爭測定法的ELISA形式是優選的形式，但是可以進行任何類型的免疫競爭測定法。
在存在完全無關抗體(包括非阻斷性抗VEGF單克隆抗體)時，VEGF與VEGFR2的結合是這種競爭測定法的對照高值。在檢驗測定中，在存在待測抗體時，VEGF結合VEGFR2的顯著降低指示待測抗體可顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2(KDR/Flk-1)。
顯著降低是“可重現的”，即一貫觀察到結合的降低。“顯著降低”，按照本申請的定義，指在抗體比VEGF摩爾數過量大約100倍至大約1000倍時，將VEGF與VEGFR2的結合可重現的降低至少大約45％、大約50％、大約55％、大約60％、或大約65％。
本發明的優選方面是所提供的抗體基本上不抑制VEGF結合VEGFR1，中等顯著降低VEGF結合VEGFR2的抗體仍然是有用的，只要它們基本上不抑制VEGF結合VEGFR1。但是，更優選的抗體是能夠更顯著抑制VEGF結合VEGFR2的抗體。在抗體比VEGF摩爾數過量大約100倍至大約1000倍時，這些抗體將VEGF與VEGFR2的結合可重現的降低至少大約70％、大約75％、或大約80％。雖然并非實踐本發明所需，但是將VEGF與VEGFR2的結合降低至少大約85％、大約90％、大約95％、或甚至更高的抗體絕非排除在外。
通過簡單的競爭測定法(諸如上文所述的測定法，但是使用VEGFR1)，可以容易的確認可抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2(KDR/Flk-1)、而不顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR1(Flt-1)的抗VEGF抗體或其抗原結合片段。
顯著降低的不存在是指“可重現的”，即一貫觀察到“結合的充分維持”。按照本申請的定義，“結合的充分維持”指在抗體比VEGF摩爾數過量大約100倍至大約1000倍時，將VEGF與VEGFR1的結合可重現的維持至少大約60％、大約75％、大約80％、或大約85％。
使用基本上不抑制VEGF結合VEGFR1的抗體的意圖是維持VEGFR1介導的生物學功能。因此，抗體只需要維持足夠的VEGF結合VEGFR1從而由VEGF誘導生物學應答。但是，更優選的抗體是能更顯著維持VEGF結合VEGFR1的抗體。這些抗體是在抗體比VEGF摩爾數過量大約100倍至大約1000倍時，能將VEGF與VEGFR1的結合水平可重現的維持于至少大約88％、大約90％、大約92％、大約95％、或大約98-99％。
可以理解，能更顯著抑制VEGF結合VEGFR2的抗體有可能耐受更大的VEGFR1結合降低。同樣的，當抗體使VEGF與VEGFR2的結合有中等降低時，應當更嚴格的維持與VEGFR1的結合。
用于鑒定和/或確認抗體抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2(KDR/Flk-1)的另一種優選的結合測定法是共沉淀測定法。共沉淀測定法檢驗抗體阻斷VEGF結合溶液中的一種或多種受體的能力。在這種測定法中，將VEGF或可檢測標記的VEGF與適當形式的受體一起溫育。
免疫沉淀或共沉淀測定法存在許多形式。在本發明中，“適當形式的受體”可以是討論中的VEGFR2受體或該受體的細胞外結構域。然后進行與針對VEGFR2受體或受體細胞外結構域上與VEGF結合位點不同的表位的抗體以及標準試劑的免疫沉淀。本發明提供了其它“適當”形式的VEGF受體，即連接了Fc抗體部分的受體細胞外結構域。這些受體/Fc構建物可以通過與有效的免疫沉淀組合物(諸如基于蛋白A的組合物)一起溫育來沉淀。
不管適當的受體，優選與對照進行免疫沉淀或共沉淀測定法。應當通過在不存在抗VEGF抗體時的沉淀來確認VEGF單獨結合選定受體的能力。優選在存在或不存在具有已知結合特性的抗體時進行平行溫育作為對照。更優選平行進行使用阻斷對照抗體和不阻斷對照抗體的測定法。
然后，通過與有效免疫沉淀組合物(諸如蛋白A組合物或蛋白ASepharose珠)一起溫育來免疫沉淀任何結合的免疫學物質。然后對沉淀檢驗VEGF的存在。當最初溫育中的VEGF是可檢測標記的VEGF(諸如放射性標記的VEGF)時，能夠直接檢測免疫沉淀中的任何VEGF。可以通過其它適當方法(如凝膠分離和使用抗VEGF抗體的免疫檢測)來檢測免疫沉淀中的未標記的VEGF。
可以容易的量化抗體在這種共沉淀測定法中阻斷VEGF結合VEGF受體(諸如VEGFR2)的能力，但是定性的結果也是有價值的。可以通過直接測量經標記的VEGF或對免疫檢測到的VEGF進行密度計分析來實現量化。由此可以檢測能夠可重現的(即一貫觀察到)抑制VEGF結合VEGFR2的抗體，而且可以根據上文描述的定量標準來選擇有用的抗體。
通過進行上文所述的共沉淀測定法(但是使用VEGFR1而非VEGFR2)也可以容易的鑒定不顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR1(Flt-1)的抗VEGF抗體。因此，使用這些方法也可以容易的鑒定可抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2(KDR/Flk-1)、而不顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR1(Flt-1)的抗VEGF抗體。
本申請還提供了用于鑒定和/或確認抗體可顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2(KDR/Flk-1)的多種功能測定法。這些方法通常涉及VEGFR2作為負責某些已確定生物學應答的受體的鑒定。雖然與上文在無細胞系統中進行的最可重現、可靠、省力、和劃算的競爭測定法相比并不優選，但是下文測定法也可用于本發明。
例如，可以通過檢驗抑制VEGF介導的內皮細胞生長(抑制VEGF的促有絲分裂活性)的能力來鑒定阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體。可以采用任何合適的測定法，在存在VEGF、存在或不存在待測抗體時使用多種內皮細胞進行。優選平行進行雙份實驗，諸如不含VEGF的和含具有確定特性(阻斷和不阻斷)的對照抗體的實驗。可以測定內皮細胞生長，并優選通過任何可接受的測定細胞數目的方法(包括比色法)來精確量化。
能夠抑制VEGF介導的內皮細胞生長的抗體通常展示可一貫觀察到的將VEGF介導的內皮細胞生長抑制大約25％、30％、35％、40％、45％、或大約50％。這些范圍內的抑制指示抗體完全能夠在體內抑制血管發生。本發明并不排除具有更顯著抑制活性的抗體。
用于鑒定本發明抗體的另一種功能測定法是檢驗對VEGF誘導的磷酸化的阻斷。可以采用任何合適的測定法，使用表達任何形式的天然或重組的可磷酸化VEGFR2的多種內皮細胞進行。在存在或不存在待檢驗抗體時將細胞與VEGF一起溫育適當時間。優選平行進行雙份實驗，諸如不含VEGF的和含具有確定特性(阻斷和不阻斷)的對照抗體的實驗。
可以測定VEGF誘導的VEGFR2磷酸化，并優選通過任何可接受的方法來精確量化。通常，免疫沉淀VEGFR2用于進一步的分析。可以直接測定VEGFR2的磷酸化程度，例如可以將細胞與32P標記的ATP一起溫育，使得能夠直接量化的免疫沉淀的VEGFR2內32P。優選通過其它方法來鑒定免疫沉淀的VEGFR2，如凝膠分離和使用結合磷酸酪氨酸殘基的抗體的免疫檢測。能夠抑制VEGF誘導的VEGFR2磷酸化的抗體通常(一貫觀察到的)降低磷酸化VEGFR2的水平。
用于鑒定本發明的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體的另一種功能測定法是檢驗對VEGF誘導的血管通透性的抑制。雖然可以使用任何測定法，特別合適的測定法是Miles通透性測定法，其中給動物(諸如豚鼠)注射染料(諸如Evan氏藍色染料)，并在存在或不存在待測抗體時提供VEGF，然后測定動物皮膚中出現的染料。優選平行進行雙重實驗，諸如不含VEGF的和含具有確定特性(阻斷和不阻斷)的對照抗體的實驗。動物皮膚中出現的染料通常是動物背部的斑點(諸如藍色斑點)，可以拍照并測量。
阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體在低濃度時(諸如比VEGF摩爾數過量100倍或1000倍)抑制VEGF誘導的血管通透性，就像一貫觀察到的抑制。不阻斷VEGF結合VEGFR2的抗體不顯著抑制VEGF誘導的血管通透性。只在高濃度時(諸如比VEGF摩爾數過量10倍)阻斷VEGF誘導的通透性的抗體一般不會是具有本發明特性的抗體。
廣泛接受用于血管發生及抗血管發生試劑的功能測定法是新血管形成的角膜微囊測定法和小雞尿囊絨毛膜測定法(CAM)。美國專利號5,712,291(本文特別收入作為參考)顯示了角膜微囊和CAM測定法足以鑒定用于治療極廣范圍的血管發生性疾病的試劑。
為了描述CAM測定法，本文還特別收入美國專利號5,001,116作為參考。基本上，在第3或4天剝去受精雞胚的殼將其取出，并將含待測化合物的甲基纖維素盤植入尿囊絨毛膜上。大約48小時后檢查胚胎，如果甲基纖維素盤附近出現清晰的無血管區，那么測量該區的直徑。正如美國專利號5,712,291(本文特別收入作為參考)中公開的，在本發明的內容中，任何無血管區的出現是抗血管發生抗體的充分證據。該區越大，抗體越有效。
可以使用大鼠或兔角膜來實踐新血管形成的角膜微囊測定法。正如美國專利號5,712,291和5,871,723(本文特別收入作為參考)證明的，這種體內模型作為臨床有效性的預兆獲得廣泛接受。雖然不認為與本發明有特別的關系，但是優選角膜測定法甚過CAM測定法，因為它們通常識別本身無活性但是代謝產生有活性化合物的化合物。
在本發明中，將角膜微囊測定法用于鑒定抗血管發生試劑。這由一貫觀察到的(且優選顯著的)角膜內血管數目的降低而表現的血管發生顯著降低獲得證明。這些應答優選定義為，當接觸待測物質時角膜只顯示偶然萌芽和/或發夾環而不顯示維持生長。
本發明的例示性的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體及其抗原結合片段包括具有下列特性的抗體或片段(a)顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2(KDR/Flk-1)；(b)不顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR1(Flt-1)；(c)抑制且優選顯著抑制VEGF誘導的VEGFR2的磷酸化；(d)抑制且優選顯著抑制VEGF誘導的血管通透性；(e)抑制且優選顯著抑制VEGF介導的內皮細胞增殖；(f)抑制且優選顯著抑制血管發生；(g)不顯著抑制VEGFR1介導的巨噬細胞、破骨細胞、或破軟骨細胞的刺激或激活；和(h)對患有血管化腫瘤的動物施用后定位于腫瘤血管結構和腫瘤基質。
本發明的特定方面基于發明人最初令人驚訝的發現下述抗體可特異性抑制VEGF結合VEGFR2受體，在體內具有顯著的抗腫瘤效果，且不抑制VEGF結合VEGFR1受體。在某些實施方案中，本發明由此提供了具有確定表位特異性的抗體，這些抗體或其抗原結合片段結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同。
參照本說明書和易于獲得的技術性參考文獻、技術、和起始材料，能夠實踐本文申請的發明。2000年3月27日提交了產生2C3單克隆抗體的雜交瘤細胞系的樣品，3月28日收到并保藏于美國典型培養物收藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，美國；2000年4月11日給予ATCC編號ATCC PTA 1595。這一保藏是國際承認根據用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約及其實施細則的規定下進行的。根據布達佩斯條約，在具有有關權利的美國專利發布后，可以由ATCC獲得雜交瘤。保藏的雜交瘤的可獲得性不應解釋為允許在違背任何政府機構參照本國專利法授予的權利的情況中實踐本發明。
因此，某些優選的組合物是包含至少第一種抗VEGF抗體或其抗原結合片段、或者至少第一種純化的抗VEGF抗體或其抗原結合片段的組合物，所述抗體或片段結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同；包含至少第一種單克隆抗體或其抗原結合片段的組合物，所述抗體或片段結合VEGF的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同；和包含至少第一種抗VEGF單克隆抗體或其抗原結合片段的組合物，所述抗體或片段結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA1595)相同。
盡管如此，本發明的其它組合物、抗體、方法、特別是第一種和第二種醫學應用涉及抗VEGF抗體或其抗原結合片段，它們不是單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)，但結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA1595)相同或基本上相同。
術語“結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同或相同”指抗體與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)可發生“交叉反應”。“交叉反應性抗體”是識別、結合的表位或“表位位點”或者對表位或“表位位點”的免疫特異性與單克隆抗體2C3(ATCC PTA1595)相同或基本上相同，從而能夠在與VEGF的結合中與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)有效競爭。“2C3交叉反應性抗體”簡稱為“2C3樣抗體”和“基于2C3的抗體”，本文這些術語可交換使用并應用于組合物、應用、和方法。
結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)大致相同、基本上相同或相同的一種或多種抗體的鑒定是簡單的技術問題，現在已經提供了具有有益特性的2C3。因為是在與參考抗體的比較中進行交叉反應性抗體的鑒定，可以理解，為了鑒定結合的表位與單克隆抗體2C3相同或基本上相同的抗體，實際上并不需要確定參考抗體(2C3)和待測抗體結合的表位。然而，本文收入了關于2C3結合的表位的重要信息，而且如Champe等人(1995，本文特別收入作為參考)所述可以進一步進行表位定位。
使用評價抗體競爭的多種免疫學篩選測定法，可以容易的進行交叉反應性抗體的鑒定。所有這些都是本領域的常規測定法，本文進一步詳細描述。1997年8月26日發布的美國專利號5,660,827(本文特別收入作為參考)進一步補充了關于如何產生結合的表位與指定抗體(諸如2C3)相同或基本上相同的抗體的教導。
例如，當待測抗體是由不同動物來源獲得的甚至是不同的同種型時，可以采用簡單的競爭測定法，其中混和(或預先吸收)對照(2C3)與待測抗體，并應用于VEGF抗原組合物。“VEGF抗原組合物”指包含2C3結合的本文所述VEGF抗原(諸如游離VEGF)的任何組合物。由此，基于ELISA和Western印漬的方案適用于這些簡單的競爭研究。
在某些實施方案中，可以在應用于抗原組合物之前將對照抗體(2C3)與不同量的待測抗體預先混和(如1∶10或1∶100)一段時間。在其它實施方案中，可以在暴露于抗原組合物的過程中簡單的混和對照與不同量的待測抗體。在任何情況中，通過使用異種型或同種型二抗，能夠只檢測結合的對照抗體，其結合將隨識別基本上相同表位的待測抗體的存在而降低。
在進行對照抗體與任何待測抗體(無論是異種型或同種型)之間的抗體競爭研究中，可以首先用可檢測標記物(諸如生物素、或酶標記物、甚至放射性標記物)標記對照(2C3)從而能夠進行隨后的鑒定。在這些情況中，可以多種比率(如1∶10或1∶100)預先混和或溫育經標記的對照抗體與待測抗體，(任選在適當時間后)然后測定經標記的對照抗體的反應性，并與在不含潛在的競爭性待測抗體的溫育中獲得的對照值進行比較。
測定法也可以是基于抗體雜交的一系列免疫學測定法之一，并通過測定標記物的方法來檢測對照抗體，如在生物素化抗體的情況中使用鏈霉親和素，或者有關酶標記時使用顯色底物(諸如過氧化物酶與3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺(TMB)底物)，或者簡單的檢測放射性標記。結合的表位與對照抗體相同的抗體能夠有效競爭結合，由此顯著降低對照抗體的結合，表現為結合的標記的降低。
將不存在完全無關抗體時(經標記的)對照抗體的活性作為對照高值。將經標記(2C3)抗體與完全相同(2C3)的未標記抗體一起溫育，此時發生競爭且經標記抗體的結合降低，由此獲得對照低值。在檢驗測定法中，在存在待測抗體時經標記抗體反應性的顯著降低指示待測抗體識別相同表位，即與經標記的(2C3)抗體發生“交叉反應”。
顯著降低是“可重現的”，即一貫觀察到的，結合的降低。“顯著降低”在本發明中定義為(在ELISA中2C3結合VEGF)在大約1∶10與大約1∶100之間的任何比例，可重現的降低至少大約70％、大約75％或大約80％。具有更嚴格的交叉阻斷活性的抗體在大約1∶10與大約1∶100之間的任何比例，(將ELISA或其它合適的測定法中2C3結合VEGF)可重現的降低至少大約82％、大約85％、大約88％、大約90％、大約92％、大約95％等。雖然本發明的實踐絕不要求完全或幾乎完全的交叉阻斷，諸如將2C3與VEGF的結合可重現的降低大約99％、大約98％、大約97％、或大約96％等，但是也不排除這些情況。
本發明由雜交瘤ATCC PTA 1595產生的單克隆抗體2C3或其抗原結合片段進行例示。本發明的另一個方面是產生單克隆抗VEGF抗體的雜交瘤，該抗體結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同。
本發明還提供了結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗VEGF抗體，其制備過程包括用至少第一種免疫原性VEGF成分免疫動物，并由經免疫動物選擇與單克隆抗體2C3(ATCC PTA1595)充分發生交叉反應的抗體；和結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCCPTA 1595)基本上相同的抗VEGF抗體，其制備過程包括用至少第一種免疫原性VEGF成分免疫動物，并通過鑒定充分降低2C3抗體結合VEGF的抗體而由經免疫動物選擇交叉反應性抗VEGF抗體。
結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同、特異性抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2(KDR/Flk-1)的抗VEGF抗體或其抗原結合片段；和結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同、抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2(KDR/Flk-1)但不顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR1(Flt-1)的抗VEGF抗體或其抗原結合片段構成了本發明的其它方面。
通過受體競爭、ELISA、共沉淀、和/或功能測定法和上文所述的2C3交叉反應性測定法中的一種或多種或組合，能夠容易的鑒定具有這些特性組合的抗體。上文描述了關于一貫顯著降低VEGF結合VEGFR2且一貫不顯著抑制VEGF結合VEGFR1的2C3樣抗體的定量評價指導。
本文顯示了在摩爾數比VEGF過量100倍和1000倍時，2C3將結合于VEGFR2包被的ELISA孔中的VEGF量分別降低至大約26％和19％。這些數字等同于將VEGF與VEGFR2的結合分別降低了大約74％和81％。本文顯示了在摩爾數比VEGF過量100倍和1000倍時，2C3將結合于VEGFR2包被的ELISA孔中的VEGF的量分別維持于大約92％和105％。
同樣可以理解，更顯著抑制VEGF結合VEGFR2的2C3樣抗體或交叉反應性抗體有可能耐受更大的VEGFR1結合降低。同樣，當抗體使VEGF與VEGFR2的結合具有中等降低時，應當更嚴格的維持與VEGFR1的結合。
因此，本發明的其它例示性抗VEGF抗體及其抗原結合片段(a)結合非構象依賴型VEGF表位(通過Western印漬中與VEGF的結合來評價)；(b)結合游離的VEGF；(c)顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2(KDR/Flk-1)；(d)不顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR1(Flt-1)；(e)抑制且優選顯著抑制VEGF誘導的VEGFR2的磷酸化；(f)抑制且優選顯著抑制VEGF誘導的血管通透性；(g)抑制且優選顯著抑制VEGF介導的內皮細胞增殖；(h)抑制且優選顯著抑制血管發生；
(i)不顯著抑制VEGFR1介導的巨噬細胞、破骨細胞、或破軟骨細胞的刺激或激活；(j)對患有血管化腫瘤的動物施用后定位于腫瘤血管結構和腫瘤基質；或(k)結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)相同或基本上相同。
在下面關于本發明的組合物、免疫綴合物、藥物、組合、混和藥物、試劑盒、第一種和第二種醫學應用、和所有方法的描述中，術語“抗體”和“免疫綴合物”或其抗原結合區指一系列阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體以及特異性2C3交叉反應性抗體，除非特別注明或由科學術語澄清。
如本文所用，術語“抗體”和“免疫球蛋白”泛指任何免疫學結合試劑，包括多克隆和單克隆抗體。根據重鏈恒定結構域的類型，將抗體主要分成5類IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM。它們中的一些又進一步分成亞類或同種型，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、等等。對應于不同種類免疫球蛋白的重鏈恒定結構域依次稱為α、δ、ε、γ、和μ。不同種類免疫球蛋白的亞基結構和三維構象是眾所周知的。
通常，當本發明使用抗體而非抗原結合區時，優選IgG和/或IgM，因為它們是生理學環境中最常見的抗體而且它們最易于在實驗室制備。
根據恒定結構域的氨基酸序列，哺乳動物抗體的“輕鏈”分成明顯不同的兩型κ和λ。本發明抗體對于κ或λ輕鏈的使用基本上沒有偏愛。
優選使用單克隆抗體(mAb)或其衍生物。認為mAb具有某些優點，如可再現和大規模生產，使得它們適用于臨床治療。本發明由此提供了鼠、人、猴、大鼠、倉鼠、兔、甚至青蛙或雞起源的單克隆抗體。通常優選鼠、人、或人化單克隆抗體。
本領域技術人員可以理解，術語“抗體”涵蓋的免疫學結合試劑延伸至來自所有物種的所有抗體及其抗原結合片段，包括二聚體、三聚體、和多聚體抗體；雙特異性抗體；嵌合抗體；人和人化抗體；重組和工程化抗體及其片段。
術語“抗體”由此用于指具有抗原結合區的任何抗體樣分子，而且該術語包括抗體片段，諸如Fab’、Fab、F(ab’)2、單結構域抗體(DAB)、Fv、scFv(單鏈Fv)、線性抗體、diabody、等等。本領域眾所周知制備和使用各種基于抗體的構建物和片段的方法(Kabat等人，1991，特別收入本文作為參考)。具體而言，EP 404,097和WO 93/11161(都收入本文作為參考)進一步描述了diabody，Zapata等人(1995，特別收入本文作為參考)進一步描述了線性抗體。
在某些實施方案中，本發明的組合物包含至少第一種抗VEGF抗體，其中所述抗體包含的至少第一個可變區包含的氨基酸序列區與SEQ IDNO7或SEQ ID NO9的氨基酸序列具有至少大約75％的序列同一性，更優選至少大約80％，更優選至少大約85％，更優選至少大約90％，最優選至少大約95％；其中所述抗VEGF抗體至少基本上維持本發明由2C3抗體例示的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體的生物學特性。
本文將關于本發明的這些或其它抗VEGF抗體序列的同一性或同源性定義為，比對序列并引入缺口(如果需要)從而實現最大序列同一性百分率后，候選序列中與序列SEQ ID NO7或SEQ ID NO9或與本發明的另一種抗VEGF抗體序列相同的氨基酸殘基百分率。特別重要的是，維持與用于序列比較的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體基本上相同、甚至更有效的生物學特性。使用本文詳細描述的多種測定法中的一種或多種，可以容易的進行這些比較。
在某些優選的實施方案中，本發明的抗VEGF抗體包含的至少第一種可變區包含的氨基酸序列區具有氨基酸序列SEQ ID NO7或SEQ IDNO9，例如包含核酸序列SEQ ID NO6或SEQ ID NO8編碼的氨基酸序列區的可變區。這些序列是涵蓋重鏈和輕鏈可變區CDR1-3(互補決定區)的2C3 scFv的Vh和Vκ序列。
在其它優選的實施方案中，提供了與最初的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(諸如2C3)相比具有改進的或更好的特性的第二代抗體。例如，第二代抗體可能具有更強的結合親和力，更有效的阻斷VEGF結合VEGFR2，更特異性的阻斷VEGF結合VEGFR2，甚至更少的阻斷VEGF結合VEGFR1，更強的抑制VEGF誘導內皮細胞增殖和/或遷移的能力，更好的抑制VEGF誘導血管通透性的能力，且優選增強在體內抑制VEGF所誘導血管發生并治療血管發生性疾病(包括血管化腫瘤)的能力。
使用本文詳細描述的多種測定法，可以容易的進行并量化用于鑒定有效的第二代抗體的比較。本發明涵蓋，與由2C3抗體例示的本發明阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體相比，生物學特性或活性增強至少大約10倍的第二代抗體，優選至少大約20倍，更優選至少大約50倍。
在某些實施方案中，采用的抗體是“人化的”、部分人的、或人的抗體。“人化”抗體通常是來自小鼠、大鼠、或其它非人物種并攜帶人恒定區和/或可變區結構域(“部分人嵌合抗體”)的嵌合單克隆抗體。用于本發明的多種人化單克隆抗體是嵌合抗體，其中將小鼠、大鼠、或其它非人單克隆抗體的至少第一種抗原結合區或互補決定區(CDR)可操作連接或“移植”到人抗體恒定區或“框架”上。
本文使用的“人化”單克隆抗體也可以是來自非人物種的單克隆抗體，其中一個或多個選定氨基酸已經變成人抗體中更常見的氨基酸。使用常規的重組技術，特別是定點誘變，可以容易的實現這一點。
本發明也可以制備并使用完全人的而非“人化的”抗體。可以通過由健康的主體獲得混和的外周血淋巴細胞群，其中包括抗原呈遞和抗體生成細胞，并在體外與免疫有效量的VEGF樣品混和來刺激細胞群，由此獲得這些人抗體。一旦獲得了人抗VEGF抗體生成細胞，則將它們用于雜交瘤和/或重組抗體生產。
用于單克隆抗體生產的其它技術包括用免疫有效量的VEGF樣品免疫包含人抗體庫的轉基因動物，優選轉基因小鼠。這也可以產生用于進行雜交瘤和/或重組抗體生產進一步操作的人抗VEGF抗體生成細胞，優勢在于可以由轉基因動物或小鼠容易的獲得脾細胞而非外周血細胞。
通過包括下列步驟的過程和方法可以容易的制備本發明的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(a)制備候選抗體生成細胞；并(b)由候選抗體生成細胞選擇顯著抑制VEGF結合VEGFR2(KDR/Flk-1)、而不顯著抑制VEGF結合VEGFR1(Flt-1)的抗體。
通過選擇與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)充分發生交叉反應的抗體可以容易的制備本發明的其它抗體。合適的制備過程和方法包括下列步驟(a)制備候選抗體生成細胞；并(b)由候選抗體生成細胞選擇與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)充分發生交叉反應的抗體。
由此，可以在指定患者中原位進行一種用于制備合適的抗體生成細胞并由其獲得抗體的方法，即僅僅給患者提供免疫有效量的免疫原性VEGF樣品將導致適當抗體生成。由此，仍然是由抗體生成細胞“獲得”抗體，但是不需要由宿主分離并隨后提供給患者，而是自發的定位于血管結構并展示其抗腫瘤的生物學效果。然而，因為顯著缺乏特異性，所以這些實施方案不是優選的。
也可以通過在體外用VEGF刺激外周血淋巴細胞來獲得合適的抗體生成細胞并隨后分離和/或純化抗體。
其它方法包括對動物施用包含至少第一種免疫原性VEGF成分的免疫組合物，并由經免疫動物選擇顯著抑制VEGF結合VEGFR2(KDR/Flk-1)、而不顯著抑制VEGF結合VEGFR1(Flt-1)、任選的與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)充分發生交叉反應的抗體。這些方法通常包括下列步驟(a)通過對動物施用至少一劑(任選的，超過一劑)免疫有效量的免疫原性VEGF樣品(諸如第一種人VEGF成分、基本上全長的VEGF成分、或重組人VEGF)來免疫動物；并(b)由經免疫動物獲得合適的抗體生成細胞，諸如產生的抗體顯著抑制VEGF結合VEGFR2(KDR/Flk-1)、而不顯著抑制VEGF結合VEGFR1(Flt-1)、任選與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)充分發生交叉反應的抗體生成細胞。
可以以VEGF綴合物的形式或與任何合適的佐劑(諸如弗氏完全佐劑)聯合施用免疫有效量的VEGF樣品。可以采用任何經驗性的技術或變化來增加免疫原性。通常優選完整的、基本上全長的人VEGF作為免疫原。
不管免疫方法的本質或免疫動物的類型如何，可以由經免疫動物獲得合適的抗體生成細胞，并優選進行進一步的人工操作。如本文所用，“經免疫動物”是非人動物，除非特別注明。雖然可以使用任何抗體生成細胞，但是最優選以脾細胞作為抗體生成細胞的來源。可以將抗體生成細胞用于包括下列步驟的制備過程(a)融合合適的抗VEGF抗體生成細胞與永生化細胞，來制備產生本發明單克隆抗體的雜交瘤；并(b)由雜交瘤獲得本發明的合適的抗VEGF抗體。
“合適的”抗VEGF抗體生成細胞、雜交瘤、和抗體是可產生或作為阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體，即顯著抑制VEGF結合VEGFR2(KDR/Flk-1)、而不顯著抑制VEGF結合VEGFR1(Flt-1)、任選與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)充分發生交叉反應的抗體的那些。
基于雜交瘤的單克隆抗體制備方法由此包括下列步驟(a)通過對動物施用至少一劑(任選的，超過一劑)免疫有效量的免疫原性VEGF樣品(優選完整的人VEGF樣品)來免疫動物；(b)由經免疫動物制備產生單克隆抗體的雜交瘤集合；(c)由雜交瘤集合選擇至少第一種雜交瘤，它產生至少第一種本發明的阻斷VEGFR2的抗VEGF單克隆抗體，任選與單克隆抗體2C3(ATCCPTA 1595)充分發生交叉反應的抗VEGF抗體；并(d)培養所述至少第一種抗體生成雜交瘤以提供至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF單克隆抗體；并優選的(e)由培養的至少第一種雜交瘤獲得所述至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF單克隆抗體。
在鑒定與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)充分發生交叉反應的抗VEGF抗體時，選擇步驟可以包括(a)使VEGF樣品接觸有效量的單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)和候選抗體；并(b)測定候選抗體充分降低2C3抗體結合VEGF樣品的能力；其中候選抗體充分降低2C3抗體結合VEGF樣品的能力指示結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗VEGF抗體。
選擇步驟還可以包括(a)使第一種VEGF樣品接觸結合有效量的單克隆抗體2C3(ATCCPTA 1595)并測定結合VEGF的2C3的量；(b)使第二種VEGF樣品接觸結合有效量的單克隆抗體2C3(ATCCPTA 1595)和競爭有效量的候選抗體并測定在存在候選抗體時結合VEGF的2C3的量；并(c)通過選擇將結合VEGF的2C3的量降低(優選)至少大約80％的候選抗體來鑒定結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗VEGF抗體。
由于將非人動物用于免疫，所以由這些雜交瘤獲得的單克隆抗體常常具有非人結構。正如本領域技術人員知道的和本文進一步描述的，可以對這些抗體任選的進行人化加工，移植或突變。或者，可以使用包含人抗體基因庫的轉基因動物(諸如小鼠)。這些動物的免疫將直接導致合適的人抗體的產生。
在產生了合適的抗體生成細胞、最優選雜交瘤(無論是產生人或是非人抗體)之后，可以克隆單克隆抗體編碼核酸以制備“重組”單克隆抗體。可以使用任何重組克隆技術，包括使用PCRTM來引發抗體編碼核酸序列的合成。因此，其它適用于制備單克隆抗體的方法包括含有如下使用抗體生成細胞的步驟的方法(a)由合適的抗VEGF抗體生成細胞(優選雜交瘤)獲得至少第一種合適的抗VEGF抗體編碼核酸分子或片段；并(b)在重組宿主細胞中表達核酸分子或片段以獲得本發明阻斷VEGFR2的抗VEGF重組單克隆抗體。
然而，可以使用非常適用于制備重組體單克隆抗體的其它有效的重組技術。這些重組技術包括基于噬菌粒文庫的單克隆抗體制備方法，包括下列步驟(a)通過對動物施用至少一劑(任選的，超過一劑)免疫有效量的免疫原性VEGF樣品(諸如完整的人VEGF樣品)來免疫動物；(b)制備組合型免疫球蛋白噬菌粒文庫，該文庫表達由經免疫動物的抗體生成細胞(優選來自脾)分離的RNA；(c)由噬菌粒文庫選擇至少第一種克隆，它表達至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體，任選與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)充分發生交叉反應的抗體；(d)由所述至少第一種選定克隆獲得阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體編碼核酸并在重組宿主細胞中表達核酸以提供所述至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體；并，優選的(e)獲得由來自所述至少第一種選定克隆的核酸表達的所述至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體。
同樣，在這些基于噬菌粒文庫的技術中，可以采用包含人抗體基因庫的轉基因動物，由此產生重組人單克隆抗體。
不管第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體核酸片段的制備方式如何，可以通過標準分子生物學技術容易的制備其它合適的抗體核酸片段。為了確認任何變體、突變體、或第二代阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體適用于本發明，對核酸片段進行檢驗以確認本發明阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體的表達。優選，還對變體、突變體、或第二代核酸片段進行檢驗以確認在標準(更優選標準嚴謹)雜交條件下的雜交。例示性的合適的雜交條件包括在大約7％十二烷基硫酸鈉(SDS)/大約0.5M NaPO4/大約1mM EDTA中于大約50℃雜交；并用大約1％SDS于大約42℃清洗。
由于可以容易的制備多種重組體單克隆抗體(人或非人起源的)，所以可以如下執行本發明的處理方法給動物或患者提供在患者體內表達生物學有效量的至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體的至少第一種核酸片段。“表達阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體、2C3樣抗體、或基于2C3抗體的核酸片段”通常至少是表達構建物的形式，也可以是包含于病毒或重組宿主細胞內的表達構建物的形式。本發明優選的基因治療載體通常是病毒載體，諸如重組逆轉錄病毒、單純皰疹病毒(HSV)、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、巨細胞病毒(CMV)、等等的載體。
本發明還提供了包含至少第一種純化的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同)或其抗原結合片段的組合物。這些組合物可以是制藥學可接受的組合物或用于實驗室研究的組合物。關于藥物組合物，它們可以優選配制用于胃腸外施用，諸如靜脈內施用。
本發明提供了關于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體的大量方法和應用，包括2C3交叉反應性抗體、2C3樣抗體、或基于2C3抗體。關于所有方法，術語“一個/種”指所述方法的“至少一個/種”、“至少第一個/種”、“一個/種或多個/種”、或“多數”步驟，除非特別注明。這與治療方法的施用步驟特別有關系。因此，本發明不僅可以采用不同劑量，而且可以使用不同劑數(如注射次數)，直至包括多次注射。可以使用聯合治療，在施用抗VEGF治療性抗體之前、之后、或之中進行施用。
本發明提供了具有重要生物學意義的多種有用的體外方法和應用。首先提供的是結合VEGF的方法和應用，通常包括使包含VEGF(優選游離的即未結合受體的VEGF)的組合物有效接觸至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段。
本發明還提供了檢測VEGF的方法和應用，通常包括在能夠有效形成VEGF/抗體復合物的條件下，使懷疑包含VEGF的組合物接觸至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCCPTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段，并檢測形成的復合物。檢測方法和應用可以與生物學樣品相結合，如用于血管發生和腫瘤的診斷，本發明還提供了基于這一點的診斷劑盒。
本發明還提供了優先或特異性抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2的方法和應用，通常包括在有效抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2的條件下，在存在VEGF時，使包含表達VEGFR2(KDR/FLK-1)的內皮細胞的細胞或組織群接觸包含生物學有效量的至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段的組合物。
本發明還提供了顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2、而不顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR1的方法和應用。這些方法包括在有效抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2、而不顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR1的條件下，在存在VEGF時，使包含表達VEGFR2(KDR/Flk-1)和VEGFR1(Flt-1)的內皮細胞群的細胞或組織群接觸包含生物學有效量的至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段的組合物。
本發明的其它方法和應用涉及分析稱為VEGFR2和VEGFR1的VEGF受體的生物學作用，包括下列步驟(a)使包含VEGF和表達VEGFR2(KDR/Flk-1)和VEGFR1(Flt-1)受體的細胞群的生物學組合物或組織接觸包含生物學有效量的至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段的組合物；并(b)測定阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體對針對VEGF的至少第一種生物學應答的影響；其中i)在存在阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體時生物學應答改變指示為由VEGFR2介導的應答；且ii)在存在阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體時生物學應答維持指示為由VEGFR1介導的應答。
本發明還提供了抑制增殖的方法和應用，包括特異性抑制VEGF誘導的內皮細胞增殖和/或遷移，通常包括在有效抑制VEGF誘導內皮細胞增殖和/或遷移的條件下，使包含內皮細胞群和VEGF的細胞或組織群接觸包含生物學有效量的至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段的組合物。
本發明還提供了抑制VEGF誘導的內皮細胞增殖和/或遷移、而不顯著抑制VEGF誘導的巨噬細胞趨化性的方法和應用，通常包括在有效抑制VEGF誘導內皮細胞增殖和/或遷移、而不顯著抑制VEGF誘導的巨噬細胞趨化性的條件下，使包含內皮細胞、巨噬細胞、和VEGF的細胞或組織群接觸包含生物學有效量的至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段的組合物。
本發明還提供了抑制VEGF誘導的內皮細胞增殖和/或遷移、和任選的血管發生、而不顯著抑制VEGF刺激巨噬細胞、破骨細胞、或破軟骨細胞的方法和應用。這些方法通常包括在有效抑制VEGF誘導的內皮細胞增殖和/或遷移、或血管發生、而不顯著抑制VEGF刺激巨噬細胞、破骨細胞、或破軟骨細胞的條件下，使包含內皮細胞和巨噬細胞、破骨細胞、或破軟骨細胞中至少一種的細胞或組織群接觸包含生物學有效量的至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段的組合物。
可以在體外或在體內進行上述方法和應用，在后一種情況中，組織或細胞位于動物體內，并對動物施用抗VEGF抗體。在兩種情況中，上述方法和應用可以是用于抑制血管發生的方法或應用，包括在有效抑制血管發生的條件下，使包含潛在的血管發生性血管的組織或血管群(即潛在暴露于VEGF)接觸包含生物學有效量的至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段的抗血管發生組合物。
當先體外后體內維持潛在血管發生性血管群時，本發明可用于藥物投遞程序。優選將包含可靠的陽性和陰性對照的體外篩選實驗作為用于抑制或促進血管發生的藥物開發的第一步，以及用于描繪血管發生過程的更多信息。當潛在血管發生性血管群位于動物或患者體內時，對動物施用抗血管發生組合物作為治療的一種形式。
在所有上述抑制方法中，“生物學有效量”指阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選基于2C3抗體)的量能有效抑制VEGF誘導的內皮細胞增殖和/或遷移；抑制VEGF誘導的內皮細胞增殖和/或遷移或血管發生，而不顯著抑制VEGF誘導的巨噬細胞趨化性；抑制VEGF誘導的內皮細胞增殖和/或遷移，而不顯著抑制VEGF刺激巨噬細胞、破骨細胞、或破軟骨細胞；和總體上以有效抑制血管生長或血管發生的方式降低血管內皮細胞的增殖和/或遷移。
本發明由此提供了抑制VEGF誘導的血管發生和(優選的)治療血管發生性疾病、而不顯著抑制VEGF刺激巨噬細胞、破骨細胞、或破軟骨細胞的方法和應用。這些方法通常包括在有效抑制VEGF誘導的血管發生和治療血管發生性疾病、而不顯著抑制VEGF刺激巨噬細胞、破骨細胞、或破軟骨細胞的條件下，使包含內皮細胞和巨噬細胞、破骨細胞、或破軟骨細胞中至少一種的細胞或組織群接觸包含生物學有效量的至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段的組合物。
本發明還提供了抑制VEGF誘導的血管發生和(優選的)治療血管發生性疾病、而不對骨代謝產生顯著副作用的方法和應用。這些方法包括在有效抑制VEGF誘導的血管發生和治療血管發生性疾病、通過不顯著損害巨噬細胞、破骨細胞、或破軟骨細胞的活性而不對骨代謝產生顯著副作用的條件下，使包含血管內皮細胞和巨噬細胞、破骨細胞、或破軟骨細胞中至少一種的組織或血管發生性血管群接觸包含生物學有效量的至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段的組合物。
本發明提供了關于患有或有風險形成特征為非期望的、不適當的、異常的、過度的、和/或病理性的血管形成的任何疾病或紊亂的動物和患者的抗血管發生藥物篩選(體外)和療法(體內)。本領域技術人員眾所周知，異常血管發生存在于廣泛的疾病和紊亂中；一旦給出的抗血管發生療法在任何可接受的模型系統中顯示是有效的，則可以用于治療與血管發生有關的所有整個范圍內的疾病和紊亂。
本發明的方法和應用特別有意用于患有或有風險形成任何形式的血管化腫瘤；黃斑變性，包括與年齡有關的黃斑變性；關節炎，包括類風濕性關節炎；動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化病斑；糖尿病性視網膜病變和其它視網膜病變；甲狀腺增生，包括Grave氏病；血管瘤；新生血管性青光眼；和牛皮癬的動物和患者。
本發明的方法和應用還有意用于治療患有或有風險形成動靜脈畸形(AVM)、腦(脊)膜瘤、和血管再狹窄(包括血管成形術后的再狹窄)的動物和患者。本發明的治療性方法和應用有意的其它靶是患有或有風險形成血管纖維瘤、皮炎、子宮內膜異位癥、血友病關節、肥大性瘢痕、炎癥性疾病和紊亂、膿性肉芽腫、硬皮病、滑膜炎、沙眼、和血管粘連的動物和患者。
正如美國專利5,712,291(本文特別收入作為參考)中公開的，上述優選治療組絕非涵蓋了本發明可治療的所有種類的狀況。為了某些特定目的，本文收入美國專利5,712,291作為參考，這些目的包括鑒定可以用抗血管發生治療劑有效治療的大量其它狀況；顯示，一旦公開并要求專利保護確定類別的抑制血管發生化合物(在本案例中，是阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體，任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCCPTA 1595)基本上相同的抗體)，所有血管發生性疾病的治療代表統一的概念；和顯示，僅由來自單一模型系統的資料就能夠進行所有血管發生性疾病的治療。
在另一個方面，正如美國專利5,712,291(本文收入作為參考)中公開的，本發明的方法和應用有意用于治療患有或有風險形成纖維血管組織異常增殖、玫瑰痤瘡(酒糟鼻)、獲得性免疫缺陷綜合癥、動脈堵塞、特應性角膜炎、細菌性潰瘍、Bechets病、血液傳播腫瘤、頸總動脈梗阻性疾病、化學燒傷、脈絡膜新血管形成、慢性炎癥、慢性視網膜脫落、慢性眼色素層炎、慢性玻璃體炎(chronic vitritis)、隱形眼鏡過度配戴、角膜移植排斥、角膜新血管形成、角膜移植新血管形成、Crohn氏病、Eales病、流行性角膜結膜炎、真菌性潰瘍、單純皰疹感染、帶狀皰疹感染、高粘滯性綜合癥、Kaposi氏肉瘤、白血病、脂肪變性、Lyme氏病、邊緣角質分離、Mooren潰瘍、除麻風病以外的分枝桿菌感染、近視、眼部新血管化病、視窩、Osler-Weber綜合癥(Osler-Weber-Rendu)、骨性關節炎、Pagets病、平坦部炎、類天皰瘡、phylectenulosis、多動脈炎、激光后并發癥(post-lasercomplications)并發癥、原生動物感染、彈性假黃色瘤、翼狀胬肉干燥性角膜炎、角膜放射狀切開術、視網膜新血管形成、早產兒視網膜病變、晶狀體后纖維組織形成、結節病、鞏膜炎、鐮刀形紅細胞貧血病、Sogrens綜合癥、實體瘤、Stargarts病、Steven’s Johnson病、上緣角膜炎、梅毒、系統狼瘡、Terrien氏邊緣變性、弓形體病、外傷、Ewin肉瘤、神經母細胞瘤、骨肉瘤、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、潰瘍性結腸炎、靜脈堵塞、維生素A缺乏、和Wegeners結節病的動物和患者。
本發明還提供了用于治療患有或有風險形成關節炎的動物和患者的方法和應用，就與使用美國專利5,753,230(本文特別收入作為參考)描述的免疫學試劑治療關節炎一樣。美國專利5,972,922(本文也特別收入作為參考)進一步例示了抗血管發生策略對于治療非期望血管發生的應用，關系到糖尿病、寄生蟲病、異常創傷愈合、手術后肥大、燒傷、創傷或外傷、生發抑制、排卵和黃體形成抑制、植入抑制、和子宮內胚胎發育抑制。本發明的方法和應用的治療范圍涵蓋所有上述狀況。
美國專利5,639,757(本文收入作為參考)例示了抗血管發生策略在移植排斥的一般治療中的應用。WO 98/45331(本文特別收入作為參考)描述了使用基于VEGF抑制的抗血管發生策略來治療肺部炎癥、腎病綜合征、先兆子癇、心包積液(諸如與心包炎有關的心包積液)、和胸腔積液。本發明的方法和應用的治療范圍涵蓋患有或有風險形成任何上述狀況的動物和患者。
正如WO 98/16551(本文特別收入作為參考)中公開的，拮抗VEGF功能的生物學分子也適用于治療特征為非期望的血管通透性的疾病和紊亂。因此，本發明的VEGF拮抗性抗體、方法、和應用可用于治療患有或有風險形成特征為非期望的血管通透性的疾病和紊亂的動物和患者，如與腦瘤有關的浮腫、與惡性瘤有關的腹水、Meigs氏綜合癥、肺部炎癥、腎病綜合癥、心包積液、和胸腔積液、等等。
雖然這一統一的發明能夠治療所有上述疾病，但是本發明的方法和應用特別優選的方面是抗血管發生療法在患有或有風險形成血管化實體瘤、轉移性腫瘤、或原發性腫瘤轉移的動物和患者中的應用。
本發明還提供了抑制VEGF誘導的血管發生和(優選的)展現抗腫瘤或改進的抗腫瘤效果、而不顯著抑制VEGF刺激巨噬細胞、破骨細胞、或破軟骨細胞的方法和應用。這些方法通常包括在有效抑制VEGF誘導的血管發生和展現抗腫瘤或改進的抗腫瘤效果、而不顯著抑制VEGF刺激巨噬細胞、破骨細胞、或破軟骨細胞的條件下，使包含血管內皮細胞和巨噬細胞、破骨細胞、或破軟骨細胞中至少一種的組織、腫瘤環境、或血管發生性血管群接觸包含生物學有效量的至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段的組合物。
本發明由此提供了治療與血管發生有關的疾病(包括與血管發生有關的所有形式的癌癥)的方法和應用，包括對患有這樣一種疾病或癌癥的動物或患者施用治療有效量的包含阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段或者這種抗VEGF抗體的免疫綴合物的至少第一種藥物組合物。
本發明將使用未綴合的或裸露的抗體及其片段的抗血管發生方法與使用抗體或其抗原結合片段可操作附著治療劑的免疫綴合物的血管定向方法聯系在一起。除非特別注明或由科學術語澄清，如本文所用，術語“抗體及其片段”指“未綴合的或裸露的”抗體或其片段，未附著另一種試劑，特別是治療劑或診斷劑。這些定義不排除抗體修飾，諸如(只是作為范例)為了改進抗體的生物學半衰期、親和力、親合力、或其它特性的修飾，或者抗體與其它效應物的聯合。
本發明的抗血管發生治療方法和應用還涵蓋未綴合的或裸露的抗體和免疫綴合物二者的應用。在基于免疫綴合物的抗血管發生治療方法中，優選抗體或其抗原結合片段可操作附著第二種抗血管發生試劑(抗VEGF抗體自身是第一種抗血管發生試劑)。附著的抗血管發生試劑可能具有直接的或間接的抗血管發生效果。
抗血管發生治療方法和應用包括對患有與血管發生有關的疾病(包括與血管發生有關的所有形式的癌癥)的動物或患者施用治療有效量的包含至少第一種未綴合的或裸露的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段的至少第一種藥物組合物。同樣的，施用的抗體可以可操作連接第二種抗血管發生試劑。
治療轉移性癌癥的方法和應用包括對患有轉移性癌癥的動物或患者施用治療有效量的包含至少第一種未綴合的或裸露的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段的至少第一種藥物組合物。其它方法包括施用的抗體可以可操作連接第二種抗血管發生試劑的方法。
減少原發性癌癥轉移的方法和應用包括對患有原發性癌癥或曾經為此治療的動物或患者施用治療有效量的至少第一種未綴合的或裸露的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或其抗原結合片段；其中未綴合的或裸露的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或其片段任選與單克隆抗體2C3(ATCC PTA1595)結合基本上相同的表位。相似的，施用的抗體可以可操作連接第二種抗血管發生試劑。
治療與血管發生有關的疾病(包括與血管發生有關的所有形式的癌癥)的方法和應用還包括，以有效抑制疾病位點或血管化腫瘤內的血管發生的量，對患有這樣一種疾病(如血管化腫瘤)的動物或患者施用至少第一種未綴合的或裸露的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段。同樣的，施用的抗體可以可操作連接第二種抗血管發生試劑。
治療與血管發生有關的疾病(包括與血管發生有關的所有形式的癌癥)的方法和應用還包括，以有效抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2(KDR/Flk-1)由此抑制疾病或癌癥位點內的血管發生的量，對患有這樣一種疾病或癌癥的動物或患者施用至少第一種未綴合的或裸露的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段。施用的抗體可以可操作連接第二種抗血管發生試劑。
治療與血管發生有關的疾病(包括與血管發生有關的所有形式的癌癥)的方法和應用還包括對患有血管化腫瘤的動物或患者施用治療有效量的至少第一種未綴合的或裸露的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段；其中抗VEGF抗體顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2(KDR/Flk-1)、而不顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR1(Flt-1)。同樣的，施用的抗體可以可操作連接第二種抗血管發生試劑。
治療與血管發生有關的疾病(包括與血管發生有關的所有形式的癌癥)的另一種方法和應用包括對患有這樣一種疾病、癌癥、或血管化腫瘤的動物或患者施用治療有效量的至少第一種未綴合的或裸露的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCCPTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段；其中抗VEGF抗體顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2(KDR/Flk-1)、而不顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR1(Flt-1)，由此抑制疾病位點、癌癥、或血管化腫瘤內的血管發生、而不顯著損害動物體內巨噬細胞的趨化性。施用的抗體還可以可操作連接第二種抗血管發生試劑。
治療與血管發生有關的疾病(包括與血管發生有關的所有形式的癌癥)的另一種方法和應用包括對患有這樣一種疾病、癌癥、或血管化腫瘤的動物或患者施用治療有效量的至少第一種未綴合的或裸露的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCCPTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段；其中抗VEGF抗體顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2(KDR/Flk-1)、而不顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR1(Flt-1)，由此抑制疾病位點、癌癥、或血管化腫瘤內的血管發生、而不顯著損害動物體內巨噬細胞、破骨細胞、和/或破軟骨細胞的活性。同樣的，施用的抗體還可以可操作連接第二種抗血管發生試劑。
治療與血管發生有關的疾病(包括與血管發生有關的所有形式的癌癥)的方法和應用還包括，以有效抑制疾病位點或血管化腫瘤內血管發生、而對骨代謝沒有顯著負面影響的量，對患有這樣一種疾病(如血管化腫瘤)的動物或患者施用至少第一種未綴合的或裸露的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段。
上述抗血管發生治療方法和應用通常包括對動物或患者系統施用該制藥學有效組合物，諸如通過穿皮、肌肉內、靜脈內注射等等。然而，可以接受能夠使治療劑定位于血管發生位點(包括腫瘤或腫瘤內血管內皮細胞)的任何施用路徑。因此，其它合適的投遞路徑包括口、直腸、鼻、局部、和陰道給藥。美國專利5,712,291(本文特別收入作為參考)進一步描述了可以與血管發生性疾病或紊亂的治療相結合的各種施用路徑。
正如美國專利5,753,230(本文特別收入作為參考)中關于其它免疫學試劑的描述，對于治療關節炎的方法和應用可以采用如滑膜內施用。對于與眼有關的狀況，包括眼科配方和施用。
如本文所用，“施用”指以一定的量和一定的時間提供或投遞基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療劑從而有效展現抗血管發生和/或抗腫瘤效果。通常優選被動施用蛋白質性狀的治療劑，這部分是因為比較簡單和可重復。
然而，術語“施用”在本文用于指向腫瘤血管結構投遞或提供基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療劑的任何和所有方法。因此，“施用”包括以有效投遞至腫瘤的方式提供產生基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療劑的細胞。在這些實施方案中，可能需要將細胞配制或包裝于選擇性通透膜、結構、或可植入裝置中，通常可以通過除去這種裝置來終止治療。通常優選施用外源性阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3樣抗體，因為這代表了能夠密切監測并控制劑量的非侵入式方法。
本發明的治療性方法和應用還延伸至以在腫瘤附近有效表達或有效定位于腫瘤的方式提供編碼基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療劑的核酸。可以采用任何基因治療技術，諸如裸露DNA的投遞、重組基因和載體、基于細胞的投遞，包括對患者細胞的先體外后體內操作等等。
在其它實施方案中，本發明提供了向與疾病有關的血管發生性血管投遞選定的治療劑或診斷劑的方法和應用。這些實施方案優選用于向腫瘤或者腫瘤內血管結構或基質投遞選定的治療劑或診斷劑，包括對患有血管化腫瘤的動物或患者施用生物學有效量的包含至少第一種免疫綴合物的組合物，在所述免疫綴合物中診斷劑或治療性可操作附著于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段。
雖然實踐這些實施方案并不需要理解本發明靶向方面的作用機制，但是認為本發明的抗體通過借助于VEGF結合血管發生性和腫瘤血管結構上表達的VEGFR1將附著的試劑投遞至這些血管結構。由此，本發明的這些方法和應用包括將選定的治療劑或診斷劑投遞至血管發生性血管、腫瘤、或腫瘤內血管結構，包括以能夠使抗體有效結合在血管發生性血管、腫瘤、或腫瘤內血管結構上表達、過度表達、或上調的VEGFR1上所結合的VEGF由此將診斷性或治療劑投遞至血管發生性血管、腫瘤、或腫瘤內血管結構上的VEGF-VEGFR1的方式，對需要治療的動物或患者施用生物學有效量的包含免疫綴合物的組合物，在所述免疫綴合物中診斷性或治療劑可操作附著于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段。
投遞至腫瘤或者腫瘤內血管結構或基質的選定治療劑能夠抑制或特異性抑制腫瘤血管結構中的血流；破壞或特異性破壞腫瘤血管結構；并誘導腫瘤壞死或特異性壞死。由此，這些方法和應用可以概括成用于治療患有血管化腫瘤的動物或患者的方法，包括對動物或患者施用治療有效量的包含至少第一種免疫綴合物的至少第一種藥物組合物，所述免疫綴合物包含阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段，并任選附著有治療劑。
用于本發明的“治療有效量”指基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的免疫綴合物，在施用于選定的動物或患者之后，能夠有效的特異性殺死至少一部分腫瘤或腫瘤內血管內皮細胞；特異性誘導至少一部分腫瘤或腫瘤內血管內皮血管的壞死；特異性促進至少一部分腫瘤或腫瘤內血管的凝血；特異性阻塞或破壞至少一部分腫瘤輸血血管；特異性誘導至少一部分腫瘤的壞死；和/或誘導腫瘤退化或緩解的量。在實現這些效果的同時，幾乎不結合或殺死正常、健康組織中的血管內皮細胞；幾乎不凝血、阻塞、或破壞健康、正常組織中的血管；并對動物或患者的正常、健康組織的不利副作用是可忽略的或易處理的。
如本文有關促進凝血或破壞腫瘤血管結構的內容和/或有關結合腫瘤基質和/或引起腫瘤壞死的內容，術語“優先”和“特異性”指基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的免疫綴合物能夠實現基本上局限于腫瘤基質、血管結構、和腫瘤位點的基質結合、凝血、破壞、和/或腫瘤壞死，而在動物或主體的正常、健康組織中基本上不引起凝血、破壞、和/或組織壞死。由此基本上維持了健康細胞和組織的結構和功能不受本發明實踐的損害。
雖然本發明的抗體通過結合VEGFR1所結合的VEGF能夠將試劑有效投遞至血管發生性和腫瘤血管結構，但是其它方法和應用也能夠利用將治療劑投遞至腫瘤基質的原理，并展現對附近血管的治療性效果。這些方法和應用包括以能夠使免疫綴合物有效結合腫瘤基質內非受體結合的VEGF的量，對患有血管化腫瘤的動物或患者施用含有治療劑可操作附著于至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段的免疫綴合物。
這些方法和應用包括以能夠使免疫綴合物有效定位于腫瘤基質內使得附著的治療劑展現對腫瘤周圍血管結構和/或腫瘤細胞的抗腫瘤效果的量，對患有血管化腫瘤的動物或患者施用含有治療劑可操作附著于至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段的免疫綴合物。
本發明的組合物以及方法和應用由此延伸至包含基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的免疫綴合物的組合物，所述綴合物包含至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCCPTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段，以及可操作附著的至少第一種治療性或診斷劑。基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療性綴合物優選連接放療劑、抗血管發生試劑、誘導凋亡試劑、抗微管蛋白藥物、抗細胞或毒害細胞試劑、或凝血劑(凝血因子)。
本發明由此提供了一系列綴合的抗體及其片段，其中抗體可操作附著至少第一種治療性或診斷劑。術語“免疫綴合物”廣泛用于定義抗體與另一種有效試劑的可操作連接，而非僅指任何類型的可操作連接，特別是不限制于化學“綴合”。特別涵蓋重組融合蛋白質。只要投遞或靶向試劑能夠結合靶且治療性或診斷劑在投遞后充分發揮功能，則這種附著方式就是合適的。
還包括試劑經抗體上的碳水化合物部分的附著。抗體中天然存在O-連接的和N-連接的糖基化。如果需要，可以簡單的通過在抗體一級序列中插入適當的氨基酸序列(諸如Asn-X-Ser、Asn-X-Thr、Ser、或Thr)來修飾重組抗體以再造或創造額外的糖基化位點。
目前優選用于基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療性綴合物以及相關方法和應用的藥劑，是補充或增強抗體的效果，和/或選擇用于特定腫瘤類型或患者的那些。“補充或增強抗體效果的治療劑”包括放療劑、抗血管發生試劑、誘導凋亡試劑、和抗微管蛋白藥物，其中的任何一種或多種優選用于本文。
優選試劑與基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體的附著或連接產生了“免疫綴合物”，這些免疫綴合物常常具有增強的甚至協同的抗腫瘤特性。目前優選用于這種方式的抗血管發生試劑是制管張素(angiostatin)、抑內皮素(endostatin)、任何一種促血管生成素(angiopoietin)、抑血管素(vasculostatin)、制霉菌素(canstatin)、和maspin。目前優選的抗微管蛋白藥物包括秋水仙素、紫杉醇、長春花堿、長春花新堿、長春堿酰胺(vindescine)、和任何一種或多種combretastatin。
抗細胞和毒害細胞試劑的使用產生基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的“免疫毒素”，而凝血因子的使用產生基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的“凝血配體”。還涵蓋使用至少兩種治療劑，諸如一種或多種放療劑、抗血管發生試劑、誘導凋亡試劑、抗微管蛋白藥物、抗細胞和毒素細胞試劑、和凝血因子的組合。
在某些應用中，基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療劑可操作附著于能夠殺死內皮細胞或抑制內皮細胞生長或分裂的毒害細胞、抑制細胞、或者抗細胞試劑上。合適的抗細胞試劑包括化療劑，以及細胞毒素和抑制細胞的試劑。抑制細胞的試劑通常是干擾靶細胞的天然細胞周期，優選使細胞退出細胞周期的那些。
例示性化療劑包括類固醇；細胞因子；抗代謝物，諸如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氨甲喋呤、或氨基喋呤；蒽環霉素(anthracycline)；絲裂霉素C；長春花生物堿；抗生素；秋水仙胺(demecolcine)；依托泊甙(etoposide)；光輝霉素；和抗腫瘤烷化試劑，諸如苯丁酸氮芥或苯丙氨酸氮芥。事實上，可以使用本文表C中公開的任何試劑。某些優選的抗細胞試劑是DNA合成抑制劑，諸如柔紅霉素、羥基紅比霉素(doxorubicin)、阿霉素(adriamycin)、等等。
在某些治療性應用中，優選毒素部分，因為與其它潛在試劑相比，大多數毒素引起殺死細胞效果的能力要高得多。因此，某些優選用于基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體構建物的抗細胞試劑是由植物、真菌、或細菌衍生的毒素。例示性毒素包括表鬼臼毒素；細菌內毒素或細菌內毒素的脂質A部分；核糖體滅活蛋白，諸如皂草素或gelonin；α-帚曲菌素(α-sarcin)；曲霉菌素；局限曲菌素；核糖核酸酶，諸如胎盤核糖核酸酶；白喉毒素；和假單胞菌外毒素。
優選的毒素是A鏈毒素，諸如蓖麻毒蛋白A鏈。最優選的毒素部分常常是經處理而修飾或除去碳水化合物殘基的蓖麻毒蛋白A鏈，即所謂的“脫糖基A鏈”(dgA)。脫糖基蓖麻毒蛋白A鏈是優選的，因為它極有效力、半衰期較長，而且進行臨床等級和劑量的制造在經濟上是可行的。也可以使用重組和/或截短的蓖麻毒蛋白A鏈。
對于腫瘤靶向和免疫毒素治療，本文特別收入下列專利和專利申請作為參考，進一步補充關于抗細胞和毒害細胞試劑的傳授美國申請流水號07/846,349；08/295,868(美國專利號6,004,554)；08/205,330(美國專利號5,855,866)；08/350,212(美國專利號5,965,132)；08/456,495(美國專利號5,776,427)；08/457,487(美國專利號5,863,538)；08/457,229；08/457,031(美國專利號5,660,827)；和08/457,869(美國專利號6,051,230)。
本發明的基于2C3的抗體或其它阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體可以連接抗微管蛋白藥物。如本文所用，“抗微管蛋白藥物”指抑制細胞有絲分裂的任何試劑、藥物、藥物前體、或其組合，優選其抑制是通過直接或間接的抑制細胞有絲分裂必需的微管蛋白活性，優選微管蛋白的聚合或解聚達到的。
目前優選用于本文的抗微管蛋白藥物是秋水仙素；taxanes，諸如紫杉醇；長春花生物堿，諸如長春花堿、長春花新堿、和長春堿酰胺；和combretastatin。例示性的combretastatin是combretastatinA、B、和/或D，包括A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、B-1、B-2、B-3、B-4、D-1、和D-2及其藥物前體形式。
基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療劑可以包含能夠促進凝血的成分，即凝血劑。本文，靶向抗體可以直接或間接(如經另一種抗體)連接可直接或間接刺激凝血的因子。
優選用于這些用途的凝血因子是組織因子(TF)和TF衍生物，諸如截短的組織因子(tTF)、二聚體、三聚體、多聚體形式的組織因子、和激活因子VII能力缺陷的突變型組織因子。其它合適的凝血因子包括依賴維生素K的凝血因子，諸如因子II/IIa、因子VII/VIIa、因子IX/IXa、因子X/Xa；缺乏Gla修飾的依賴維生素K的凝血因子；Russell蝰蛇毒因子X激活劑；激活血小板的化合物，諸如血栓烷A2和血栓烷A2合酶；和纖維蛋白溶解抑制劑，諸如α2-抗纖溶酶。
下列專利和專利申請(本文特別收入作為參考)描述了使用凝血配體的腫瘤靶向和治療，進一步補充關于凝血配體和凝血因子的傳授美國申請流水號07/846,349；08/205,330(美國專利號5,855,866)；08/350,212(美國專利號5,965,132)；08/273,567；08/482,369(美國專利號5,＿＿,＿＿；1998年10月20日交納頒證費)；08/485,482；08/487,427(美國專利號6,004,555)；08/479,733(美國專利號5,877,289)；08/472,631；和08/479,727；和08/481,904(美國專利號6,036,955)。
本領域眾所周知免疫綴合物和免疫毒素的制備(參閱美國專利4,340,535，本文收入作為參考)。本文收入下列專利和專利申請作為參考，進一步補充關于免疫毒素的產生、純化、和使用的傳授美國申請流水號07/846,349；08/295,868(美國專利號6,004,554)；08/205,330(美國專利號5,855,866)；08/350,212(美國專利號5,965,132)；08/456,495(美國專利號5,776,427)；08/457,487(美國專利號5,863,538)；08/457,229；08/457,031(美國專利號5,660,827)；和08/457,869(美國專利號6,051,230)。
在免疫綴合物和免疫毒素的制備中，可以通過使用某些接頭而獲得某些優勢。例如，常常優選包含空間上受阻礙的二硫鍵的接頭，因為它們在體內的穩定性較高，由此防止在作用位點結合前釋放毒素部分。通常需要綴合物在除預定作用位點以外的體內任何位點保持完整，而在預定作用位點具有優良的“釋放”特征。
根據所用的特定毒素化合物，可能需要提供可操作附著阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或基于2C3的抗體和毒素化合物的肽隔離物，其中肽隔離物能夠折疊成二硫鍵環結構。環內的蛋白水解切割將產生雜二聚體多肽，其中抗體和毒素化合物僅僅通過一個二硫鍵連接在一起。
當使用某些其它毒素化合物時，可以提供不可切割的肽隔離物使阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或基于2C3的抗體可操作附著毒素化合物。可用于連接不可切割的肽隔離物的毒素自身可以通過蛋白水解切割轉變成毒性細胞的二硫鍵形式。這種毒素化合物的范例是假單胞菌外毒素化合物。
多種化療劑和其它制藥學試劑也能夠成功綴合至基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療劑。例示性的綴合于抗體的抗腫瘤試劑包括羥基紅比霉素(doxorubicin)、道諾霉素、氨甲喋呤、和長春花堿。此外，還描述了其它試劑的附著，諸如新制癌菌素、大分子霉素、三亞胺醌、和α-鵝膏菌素(參閱美國專利5,660,827；5,855,866；和5,965,132；本文收入作為參考)。
根據本發明人的一項早期工作，現在也能夠容易的實踐凝血配體的制備。一種或多種凝血因子與基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體的可操作連接可以是直接連接，諸如上文關于免疫毒素所述。或者，可操作連接可以是間接附著，諸如抗體可操作附著第二種結合區，優選結合凝血配體的抗體或其抗原結合片段。凝血因子應當附著于基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體中不同于功能性促凝位點的其它位點，當利用共價鍵連接分子時尤其如此。
間接連接的凝血配體常常基于雙特異性抗體。本領域也眾所周知雙特異性抗體的制備。一種制備方法包括分開制備具有針對(一方面)腫瘤成分和(另一方面)凝血劑的特異性的抗體；然后由兩種選定抗體產生肽F(ab’γ)2片段，隨后通過還原提供分開的Fab’γSH片段；再將待偶聯的兩種配偶體之一的SH基團用交聯劑烷化，諸如鄰-亞苯基二馬來酰亞胺，從而在一種配偶體上提供游離的馬來酰亞胺基團；然后再通過硫醚連接使這種配偶體連接另一種配偶體，從而產生所需F(ab’γ)2異綴合物(Glennie等人，1987；本文收入作為參考)。也可以進行其它方法，諸如使用SPDP或蛋白A的交聯。
用于產生雙特異性抗體的其它方法是通過融合兩種雜交瘤來形成四倍體瘤。如本文所用，術語“四倍體瘤”用于描述兩種B細胞雜交瘤的產生性融合。使用目前的標準技術，將兩種抗體生成雜交瘤融合產生子代細胞，然后選擇維持表達兩組純系型免疫球蛋白基因的那些細胞。
產生四倍體瘤的優選方法包括選擇至少一種親本雜交瘤的酶缺陷突變體。然后將這第一種突變體雜交瘤細胞系與經致死暴露于(如)碘乙酰胺而排除持續存活的第二種雜交瘤細胞融合。細胞融合能夠挽救第一種雜交瘤，因為它們由經致死處理的雜交瘤獲得原為酶缺陷的基因；也能夠通過與第一種雜交瘤融合而挽救第二種雜交瘤。優選而非要求的是相同同種型、不同亞類的免疫球蛋白的融合。使用混合亞類的抗體可以便于用其它測定法分離優選的四倍體瘤。
可以使用微量滴定鑒定方案、FACS、免疫熒光染色、獨特型特異性抗體、抗原結合競爭實驗、和抗體鑒定領域的其它常用方法來鑒定優選的四倍體瘤。分離四倍體瘤后，由其它細胞產物純化雙特異性抗體。這可以通過免疫球蛋白純化領域熟練技術人員知道的多種抗體分離方案來實現(參閱《抗體實驗室手冊》(AntibodiesA LaboratoryManual)，1988；本文收入作為參考)。優選蛋白A或蛋白G Sepharose柱。
在免疫綴合物、免疫毒素、和凝血配體的制備中，可以采用重組表達。將編碼選定的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體和治療劑、毒素、或凝血劑的核酸序列以相同讀碼框附著于表達載體中。重組表達由此導致核酸的翻譯而產生所需免疫綴合物。化學交聯劑和抗生物素蛋白生物素橋連也可以將治療劑連接至基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體。
本文收入下列專利和專利申請作為參考，進一步補充關于凝血配體(包括雙特異性抗體凝血配體)的制備、純化、和使用的傳授美國申請流水號07/846,349；08/205,330(美國專利號5,855,866)；08/350,212(美國專利號5,965,132)；08/273,567；08/482,369(美國專利號5,＿＿,＿＿；1998年10月20日交納頒證費)；08/485,482；08/487,427(美國專利號6,004,555)；08/479,733(美國專利號5,877,289)；08/472,631；08/479,727；和08/481,904(美國專利號6,036,955)。
包含放療劑、抗血管發生試劑、誘導凋亡試劑、抗微管蛋白藥物、毒素、和凝血劑的免疫綴合物，無論是通過化學綴合或重組表達產生的，都可以采用生物學可釋放鍵和/或可選擇性切割隔離物或接頭。這些組合物優選在循環過程中相當穩定，并在投遞至疾病或腫瘤位點后優先或特異性釋放。
某些優選的范例是對酸敏感的隔離物，其中特別包括連接秋水仙素或羥基紅比霉素(doxorubicin)的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體。其它優選的范例是包含肽酶和/或蛋白酶切割位點的肽接頭，所述肽酶和/或蛋白酶特異性或優先存在于疾病位點(諸如腫瘤環境)或在該處有活性。將免疫綴合物投遞至疾病或腫瘤位點將導致切割，并相對特異性釋放凝血因子。
特別優選包含尿激酶、尿激酶原、纖溶酶、纖溶酶原、TGFβ、鏈激酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa、或金屬蛋白酶(MMP)(諸如間質膠原酶、明膠酶、或溶基質素)的切割位點的肽接頭，正如美國專利5,877,289(本文收入作為參考)描述和賦予的，并由表B2進一步例示。
阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體還可以經衍生而導入能夠經生物學可釋放鍵附著治療劑的功能基團。靶向抗體由此可以經衍生而導入酰肼、肼、伯胺、或仲胺終端的側鏈。治療劑可以經Schiff堿連接、腙或酰腙鍵、或酰肼接頭而進行綴合(美國專利5,474,765和5,762,918，本文特別收入作為參考)。
無論主要基于抗血管發生還是血管靶向，本發明的組合物和方法可以與其它治療劑和診斷劑聯合使用。對于與本發明阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(諸如基于2C3的抗體)“聯合”使用的生物學試劑(優選診斷性或治療劑)，“聯合”簡便的用于包括一系列實施方案。除非特別注明或由科學術語澄清，術語“聯合”用于各種形式的聯合組合物、藥物、混和藥物、試劑盒、方法、以及第一種和第二種醫學應用。
本發明的“聯合”方案由此包括(例如)基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體是裸露抗體并與非可操作附著的試劑或治療劑聯合使用。在這些情況中，試劑或治療劑可以以非靶向或靶向形式使用。在“非靶向形式”中，試劑，特別是治療劑，通常參照本領域標準用法來使用。在“靶向形式”中，試劑通常可操作附著于將試劑或治療劑投遞至血管發生性疾病位點或腫瘤的獨特抗體或靶向區。生物學試劑(診斷劑和治療劑)的這些靶向形式在本領域也是相當標準的。
在本發明的其它“聯合”方案中，基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體是免疫綴合物，其中抗體自身可操作連接試劑或治療劑。在某些優選的范例中，試劑(包括診斷劑和治療劑)是“2C3-靶向試劑”。可操作附著包括本文所述和本領域知道的所有形式的直接和間接附著。
“聯合”應用，特別是基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體與治療劑的聯合，還包括聯合組合物、藥物、混和藥物(cocktail)、試劑盒、方法、和第一種和第二種醫學應用，其中治療劑是藥物前體的形式。在這些實施方案中，能夠將藥物前體轉變成藥物功能形式的激活成分也可以可操作附著于本發明基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體。
在某些優選的實施方案中，治療性組合物、聯合、藥物、混和藥物、試劑盒、方法、和第一種和第二種醫學應用是“2C3-藥物前體聯合”。本領域普通技術人員可以理解，除非特別注明，術語“2C3-藥物前體聯合”指基于2C3的抗體可操作附著能夠將藥物前體轉變成活性藥物的成分，而不是指基于2C3的抗體附著藥物前體自身。然而，不要求本發明的藥物前體方案必需以2C3-藥物前體聯合的形式使用。因此，藥物前體可以以它們用于本領域的任何方式使用，包括ADEPT和其它形式。
由此，優選就診斷劑，更優選就治療劑描述聯合組合物、藥物、混和藥物、試劑盒、方法、和第一種和第二種醫學應用時，，聯合包括阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(諸如基于2C3的抗體)的裸露抗體和免疫綴合物；而本發明體內實施方案的實踐包括在裸露抗體或免疫綴合物給藥之前、之時、或之后施用生物學、診斷性、或治療劑；條件是在有些綴合或未綴合形式中，實現有些形式的抗體與有些形式的生物學、診斷性、或治療劑的全面供應。
本發明特別優選的聯合組合物、方法、和應用包括阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體與抑內皮素的組合(美國專利5,854,205，本文特別收入作為參考)。這些包括阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3構建物是裸露抗體或免疫綴合物的情況；和免疫綴合物的情況，其中阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3連接抑內皮素，任選制管張素；其中聯合治療性方法或應用包括在此之前、之時、或之后施用抑內皮素，任選制管張素；條件是在有些綴合或未綴合形式中，實現2C3、抑內皮素、和任選制管張素的全面供應。還提供了可操作附著膠原酶的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體，當特異性投遞至腫瘤時，膠原酶將在原位產生抑內皮素，從而實現相似好處。
關于本發明對腫瘤效果的上述和其它解釋是為了簡單的說明聯合操作模式、附著試劑種類、等等。不應當將這種敘述方法解釋為對本發明基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體的有益特性的窮舉或過度簡化。因此，可以理解，這些抗體自身具有抗血管發生特性和VEGF中和特性(諸如中和VEGF的存活功能)；這些抗體的免疫綴合物將維持這些特性并與附著試劑的特性聯合；抗體與任何附著試劑的聯合效果通常將增強和/或放大。
本發明由此提供了(任選)在至少第一種組合物或容器中包含生物學有效量的至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段或者這種抗VEGF抗體的免疫綴合物，和生物學有效量的至少第二種生物學試劑、成分、或系統的組合物、藥物組合物、治療劑盒、和混和藥物。
“至少第二種生物學試劑、成分、或系統”通常是治療性或診斷劑、成分、或系統，但也未必。例如，所述至少第二種生物學試劑、成分、或系統可以包括用于修飾抗體和/或將其它試劑附著于抗體的成分。某些優選的第二種生物學試劑、成分、或系統是藥物前體或產生并使用藥物前體的成分，包括產生藥物前體自身的成分和使本發明抗體適于在這些藥物前體或ADEPT方案中發揮功能的成分。
當包含治療性或診斷劑作為至少第二種生物學試劑、成分、或系統時，這些治療劑和/或診斷劑通常就是用于血管發生性疾病的。這些試劑是適用于治療或診斷在美國專利5,712,291、5,753,230、5,972,922、5,639,757、WO 98/45331、和WO 98/16551(本文特別收入作為參考)任一項中公開的疾病或紊亂的試劑。
當待治療的疾病是癌癥時，治療劑盒或混和藥物中將包含“至少第二種抗癌試劑”。術語“至少第二種抗癌試劑”是參照阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3構建物稱為第一種抗癌試劑而選擇的。本發明的抗體由此可以聯合化療劑、放療劑、細胞因子、抗血管發生試劑、誘導凋亡試劑、或抗癌免疫毒素或凝血配體使用。
如本文所用，“化療劑”指用于治療惡性腫瘤的傳統化療劑或藥物。該術語只是為了簡單而使用，事實上展現抗癌效果的其它化合物在技術上也可以稱為化療劑。然而，“化療”在本領域已經具有獨特含義，并根據這一標準含義進行使用。本文描述了大量的例示性化療劑。本領域普通技術人員可以容易的理解化療劑的應用和適當劑量，但是當與本發明聯合使用時，可以適當的降低劑量。
誘導凋亡的試劑是也可以稱為“化療劑”的新的一類藥物。這些藥物的任何一種或多種，包括基因、載體、反義構建物、和核酶，也可以適當的用于本發明的聯合。目前優選的第二種試劑是抗血管發生試劑，諸如制管張素、抑內皮素、抑血管素、制霉菌素、和maspin。
其它例示性的抗癌試劑包括(如)新霉素、鬼臼毒素、TNFα、αvβ3拮抗劑、鈣離子載體、誘導鈣流試劑，及其任何衍生物或藥物前體。目前優選的抗微管蛋白藥物包括秋水仙素、紫杉醇、長春花堿、長春花新堿、長春堿酰胺、combretastatin，及其任何衍生物或藥物前體。
抗癌免疫毒素或凝血配體也是合適的抗癌試劑。“抗癌免疫毒素或凝血配體”或靶向試劑-治療劑構建物基于的是靶向試劑，包括結合腫瘤細胞、腫瘤血管結構、或腫瘤基質的可靶向或可接近成分并可操作附著治療劑(包括毒害細胞試劑即免疫毒素和凝血因子即凝血配體)的抗體或其抗原結合片段。腫瘤細胞、腫瘤血管結構、或腫瘤基質的“可靶向或可接近成分”優選表面表達、表面可接近、或表面定位的成分，但是也可以靶向由壞死的或受損的腫瘤細胞或血管內皮細胞釋放的成分，包括腫瘤細胞的細胞溶質和/或核抗原。
抗體和非抗體靶向試劑都可以使用，包括生長因子，諸如VEGF和FGF；包含三肽R-G-D、可特異性結合腫瘤血管結構的肽；和其它靶向成分，諸如膜聯蛋白及相關配體。
抗腫瘤細胞免疫毒素或凝血配體可以包含由B3(ATCC HB 10573)、260F9(ATCC HB 8488)、D612(ATCC HB 9796)、和KS1/4例示的抗體，所述KS1/4抗體可以由包含載體pGKC2310(NRRL B-18356)或載體pG2A52(NRRL B-18357)的細胞獲得。
還涵蓋含有可結合壞死腫瘤細胞所釋放細胞內成分的抗體或其抗原結合區的抗腫瘤細胞靶向試劑。優選的抗體是結合存在于經誘導可滲透的細胞中或基本上所有壞死和正常細胞的細胞空殼中，但是不存在于哺乳動物正常存活細胞的外部或在其上不可接近的不溶性細胞內抗原的單克隆抗體或其抗原結合片段。
授予Alan Epstein及其同事的美國專利5,019,368、4,861,581、和5,882626(本文特別收入作為參考)進一步描述并傳授了如何產生并使用對由體內惡性細胞變得可接近的細胞內抗原具有特異性的抗體。所述抗體對哺乳動物惡性細胞的細胞內成分而非細胞外成分具有足夠特異性。例示性的靶包括組蛋白，但是涵蓋由壞死的腫瘤細胞特異性釋放的所有細胞內成分。
對患有血管化腫瘤的動物或患者施用后，這些抗體定位于惡性細胞，因為血管化腫瘤必然包含壞死的腫瘤細胞，這要歸功于在體內發生的并引起至少一部分惡性細胞壞死的腫瘤改造過程。另外，這些抗體與增強腫瘤壞死的其它療法的聯合使用有助于增強靶向和后繼療法的效力。
正如本文公開的，這些種類的抗體由此可以直接或間接的與促血管生成素(angiopoietin)相結合，并將促血管生成素施用至血管化腫瘤內的壞死惡性細胞。
也正如美國專利5,019,368、4,861,581、和5,882,626(本文收入作為參考)中公開的，這些抗體可以與診斷方法(見下文)聯合使用，也可以用于測量抗腫瘤療法的效力的方法。這些方法通常包括制備和施用經標記的抗體并測量經標記抗體與優先結合于壞死組織內的內部細胞成分靶的結合。這些方法由此使壞死組織成像，其中抗體的局部集中指示抗體的存在，并指示由抗腫瘤療法殺死的細胞的空殼。
抗腫瘤基質免疫毒素或凝血配體通常包含結合結締組織成分、基底膜成分、或激活的血小板成分的抗體；正如與纖維蛋白、RIBS、或LIBS的結合所例示的。
抗腫瘤血管結構免疫毒素或凝血配體可以包含結合血管化腫瘤的輸血血管(優選腫瘤內血管)表面表達、表面接近、或表面定位成分的配體、抗體或其片段。這些抗體包括結合血管化腫瘤的腫瘤內血管的表面表達成分的那些抗體，包括腫瘤內血管結構細胞表面受體，諸如endoglin(TEC-4和TEC-11抗體)、TGFβ受體、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白、VCAM-1、ICAM-1、PSMA、VEGF/VPF受體、FGF受體、TIE、αvβ3整聯蛋白、pleiotropin、內皮唾液酸蛋白、和MHC II類蛋白質。抗體也可以結合腫瘤內血管的細胞因子或凝血劑可誘導成分。某些優選的試劑將結合氨基磷脂，諸如磷脂酰絲氨酸或磷脂酰乙醇胺。
其它抗腫瘤血管結構免疫毒素或凝血配體可以包含結合配體或生長因子的抗體或其片段，所述配體或生長因子可結合腫瘤內血管結構細胞表面受體。這些抗體包括結合VEGF/VPF(GV39和GV97抗體)、FGF、TGFβ、結合TIE的配體、腫瘤相關纖連蛋白異構體、分散因子(scatterfactor)/肝細胞生長因子(HGF)、血小板因子R(PF4)、PDGF、和TIMP的那些抗體。抗體或其片段也可以結合配體受體復合物或生長因子受體復合物；而當配體或生長因子或受體沒有形成配體受體復合物或生長因子受體復合物時，抗體即不結合配體或生長因子，也不結合受體。
抗腫瘤細胞、抗腫瘤基質、或抗腫瘤血管結構的抗體-治療劑構建物可以包含抗血管發生試劑、誘導凋亡試劑、抗微管蛋白藥物、毒害細胞試劑(諸如由植物、真菌、或細菌衍生的毒素)。常常優選蓖麻毒蛋白A鏈和脫糖基蓖麻毒蛋白A鏈。抗腫瘤細胞、抗腫瘤基質、或抗腫瘤血管結構的抗體-治療劑構建物可以包含凝血劑(直接和間接作用的凝血因子)或結合凝血因子的第二抗體結合區。常常優選可操作附著組織因子或組織因子衍生物，諸如截短的組織因子。
關于本發明的組合物、試劑盒、和/或藥物，可以在單一容器或容器裝置中或者在不同容器或容器裝置中包含聯合有效量的治療劑。混和藥物通常混和在一起供聯合使用。常常優選配制用于靜脈內施用的試劑。也包括成像成分。試劑盒還可以包含關于使用所含至少第一種抗體和一種或多種其它生物學試劑的指示。
一般而言，可以與基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療劑基本上同時施用至少第二種抗癌試劑于動物或患者，諸如施用單一藥物組合物或緊密施用兩種藥物組合物。
或者，可以在一段時間對動物或患者相繼施用基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療劑和至少第二種抗癌試劑。如本文所用，“一段時間后相繼”指“交錯”使用，使得對動物或患者施用至少第二種抗癌試劑的時間與基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療劑不同。通常以有效隔開的時間施用這兩種試劑，使得兩種試劑分別展現治療性效果，即以“生物學有效時間間隔”施用兩種試劑。可以在基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療劑之前或之后的生物學有效時間，對動物或患者施用所述至少第二種抗癌試劑。
因此，本發明提供了用于治療患有血管化腫瘤的動物或患者的方法，包括(a)對動物或患者進行充分減小腫瘤負荷的第一種治療；并(b)隨后以有效抑制任何存活腫瘤細胞轉移的量對動物或患者施用至少第一種抗血管發生試劑；其中所述至少第一種抗血管發生試劑是至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段；任選其中所述抗體或其片段可操作連接第二種抗血管發生試劑。
優選的第一種治療包括手術切除和化療干預。也可以使用聯合抗血管發生試劑，諸如促血管生成素2或靶向腫瘤的促血管生成素2構建物。
用于治療患有血管化腫瘤的動物或患者的其它方法，包括(a)以有效誘導充分腫瘤壞死的量對動物或患者施用第一種抗體-治療劑構建物；其中所述第一種抗體-治療劑構建物包含的治療劑可操作連接至可結合腫瘤細胞、腫瘤血管結構、或腫瘤基質的表面表達、可表面接近、或表面定位成分的第一種抗體或其抗原結合片段；并(b)隨后以有效抑制任何存活腫瘤細胞轉移的量對動物或患者施用第二種抗體；其中所述至少第二種抗體是至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段；并且任選其中抗體或其片段可操作連接第二種抗血管發生試劑。
在特別優選的實施方案中，本發明提供了用于與藥物前體和ADEPT聯合使用的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體和2C3的抗體。在這些組合物、聯合、藥物、試劑盒、方法、和應用中，基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或其片段將經修飾提供轉變或酶促能力，或者可操作連接(優選共價連接或綴合)能夠將至少一種藥物前體轉變成有活性藥物的至少第一種轉變劑或酶。
有酶活性或綴合了酶的抗體或其片段可以與最初分開的“藥物前體”配方聯合使用。藥物前體是沒有活性或略有活性的藥物形式，在接觸了與阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3抗體相連的酶能力、轉變功能、或酶后，可轉變成有活性的藥物形式。
因此，提供了試劑盒，其優選在分開的組合物和/或容器中包含(a)生物學有效量的至少第一種具有酶功能的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體和2C3的抗體或其片段，優選抗體或其片段可操作連接、共價連接、或綴合至少第一種酶；和(b)生物學有效量的至少第一種基本上無活性的藥物前體，通過阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3抗體或其片段的酶功能或與其可操作連接、共價連接、或綴合的酶，可將其轉變成基本上有活性的藥物。
本發明提供了有益方法和應用，其包括(a)對患有血管化腫瘤的動物或患者施用生物學有效量的至少第一種藥物組合物，其包含至少第一種基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其片段具有酶功能，優選其中抗體或其片段可操作連接、共價連接、或綴合至少第一種酶；其中所述抗體或其片段在施用后定位于血管化腫瘤的血管結構、腫瘤內血管結構、或基質；并(b)隨后在有效時間后對動物或患者施用生物學有效量的至少第二種藥物組合物，其包含生物學有效量的至少一種基本上無活性的藥物前體；其中藥物前體通過阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3抗體或其片段的酶功能或與其結合、連接、或綴合的酶轉變成基本上有活性的藥物；其中所述抗體或其片段定位于所述血管化腫瘤的血管結構、腫瘤內血管結構、或基質。
在某些其它實施方案中，本發明的抗體和免疫綴合物可以聯合一種或多種診斷劑，通常就是用于血管發生性疾病的診斷劑。本發明由此包括一系列診斷性組合物、試劑盒、和方法。
關于癌癥的診斷和治療，本發明的診斷性和成像性組合物、試劑盒、和方法包括體內和體外診斷。例如，可以使用診斷有效量的腫瘤診斷成分使血管化腫瘤成像，所述腫瘤診斷成分包含可結合腫瘤細胞、腫瘤血管結構、或腫瘤基質的可接近成分的至少第一種結合區，且可操作附著體內診斷性成像試劑。
優選使用包含至少第一種可結合腫瘤血管結構或腫瘤基質可接近成分的結合區的診斷性成分進行腫瘤成像，來提供血管化腫瘤的基質和/或血管結構的影像。可以采用任何合適的結合區或抗體，諸如關于治療性構建物所述。通過使用可檢測標記的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體構建物可以提供某些優勢，其中形成的影像將指示將要使用的治療劑的結合位點。
無論是不是基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體，可檢測標記的體內腫瘤診斷劑可以包含X射線可檢測的化合物，諸如鉍(III)、金(III)、鑭(III)、或鉛(II)；放射性離子，諸如銅67、鎵67、鎵68、銦111、銦113、碘123、碘125、碘131、汞197、汞203、錸186、錸188、銣97、銣103、锝99m、或釔90；核磁旋轉共振同位素，諸如鈷(II)、銅(II)、鉻(III)、鏑(III)、鉺(III)、釓(III)、鈥(III)、鐵(II)、鐵(III)、錳(II)、釹(III)、鎳(II)、釤(III)、鋱(III)、釩(II)、或鐿(III)；或者若丹明或熒光素。
可以在腫瘤治療前如下進行預先成像(a)對動物或患者施用診斷有效量的藥物組合物，其包含的診斷劑可操作附著至少第一種可結合腫瘤細胞、腫瘤血管結構(優選的)、或腫瘤基質(優選的)可接近成分的結合區，包括可操作附著基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體構建物的診斷劑；并(b)隨后檢測結合至腫瘤細胞、腫瘤血管(優選的)、或腫瘤基質(優選的)的可檢測標記的第一種結合區(或基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體)；由此獲得腫瘤、腫瘤血管結構、和/或腫瘤基質的影像。
還可以如下進行癌癥治療(a)通過對患有血管化腫瘤的動物或患者施用診斷最小量的至少第一種可檢測標記的腫瘤結合劑來形成血管化腫瘤的影像，優選基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體構建物，其包含可操作附著于腫瘤結合劑或者基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體的診斷劑，由此形成腫瘤、腫瘤血管結構(優選的)、或腫瘤基質(優選的)的可檢測影像；并(b)隨后對同一動物或患者施用治療最佳量的至少第一種裸露的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3抗體或者使用這種抗體的治療劑一抗體構建物，由此引起抗腫瘤效果。
由此提供了成像和治療配方或藥物，其通常包括(a)第一種藥物組合物，其包含診斷有效量的可檢測標記的腫瘤結合劑，優選基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體構建物，并包含可操作附著于腫瘤結合劑或者基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3抗體的可檢測試劑；和(b)第二種藥物組合物，其包含治療有效量的至少第一種裸露的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3抗體或者使用這種抗體的治療劑-抗體構建物。
本發明還提供了體外診斷劑盒，它包含至少第一種組合物或藥物組合物，所述組合物或藥物組合物包含生物學有效量的至少第一種診斷劑，該診斷劑可操作附著于至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段。
本發明還提供了聯合試劑盒，其中的診斷劑有意用于體外應用，優選用于檢驗由動物或患者獲得的生物學樣品。如此，本發明提供了試劑盒，其通常在至少兩個分開的容器中包含至少第一種組合物、藥物組合物、或醫學混和藥物，其中包含生物學有效量的至少第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(任選結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA1595)基本上相同的抗體)或其抗原結合片段或者這種抗VEGF抗體的免疫綴合物；和生物學有效量的體外應用的至少第一種診斷劑、成分、或系統。
“體外應用的診斷劑、成分、或系統”可以是能夠診斷一種或多種具有血管發生性成分的疾病的任何診斷劑或試劑聯合。體外診斷由此包括適用于產生關于下列專利中公開的疾病或紊亂的診斷性或預后性信息的那些試劑美國專利5,712,291、5,753,230、5,972,922、5,639,757、WO 98/45331、和WO 98/16551(本文特別收入作為參考)。
關于癌癥的診斷和治療，體外診斷優選包括包含至少第一種結合區的診斷性成分，所述結合區可結合腫瘤細胞、腫瘤血管結構(優選的)、或腫瘤基質(優選的)的可接近成分，且可操作附著通過體外診斷性檢驗可直接或間接檢測的“可檢測或報導試劑”。在體外可直接檢測的“可檢測或報導試劑”包括諸如放射性標記和可由免疫熒光檢測的報導試劑等。
在體外可間接檢測的“可檢測或報導試劑”包括與其它外源試劑聯合發揮功能的試劑，諸如在接觸顯色底物后產生有色產物的可檢測酶。體外間接檢測還延伸至包含第一種結合區的可檢測或報導成分或系統，所述結合區可結合腫瘤細胞、腫瘤血管結構(優選的)、或腫瘤基質(優選的)的可接近成分，并聯合至少一種針對第一種結合區具有免疫特異性的檢測抗體。“檢測抗體”優選附著直接或間接可檢測試劑(諸如放射性標記或酶)的“第二抗體”。或者，可以使用“第二和第三抗體檢測系統”，包括針對第一種結合區具有免疫特異性的第一種檢測抗體與針對第一種檢測抗體具有免疫特異性的第二種檢測抗體的聯合，其中第二種檢測抗體附著直接或間接可檢測試劑。
圖的簡述附圖構成了本說明書的一部分，而且進一步演示了本發明的某些方面。通過參考這些附圖，并與本文描述的特定實施方案相結合，可以更好的理解本發明。
圖1。2C3抑制了VEGF介導的ABAE細胞生長。在存在各種指定抗體和0.5nM VEGF的條件下培養ABAE細胞。通過用酶將MTS(Owen試劑)轉變成黃色甲的比色法來測定4天后的生長情況。以甲生成占僅用VEGF進行培養的對照孔的百分率顯示結果。通過在不含VEGF或抗體的條件下培養細胞來測定背景，并由對照和樣品孔減去背景。結果顯示三次測定的算術平均值，其標準偏差始終低于平均值的20％。圖1顯示在存在抗VEGF的IgG抗體的情況中的生長曲線，mAb 4.6.1作為陽性對照，具有無關特異性的IgG(對照IgG)作為陰性對照。
圖2。2C3在ELISA中阻斷了VEGF結合VEGFR2而非VEGFR1。用VEGFR1(Flt-1/Fc)或VEGFR2(sFlk-1)的細胞外結構域包被孔，然后僅與1nM VEGF一起溫育，或者與VEGF和100nM或1000nM的指定IgG一起溫育。然后將平板與1μg/ml兔抗VEGF(A-20，Santa Cruz Biotechnology公司)一起溫育，并使用綴合了過氧化物酶的山羊抗兔抗體進行顯色。測定進行三次。圖2顯示在不存在抗體的情況中的平均結合百分率和標準偏差。星號指示Student配對T檢驗在統計學上與不存在抗體的情況顯著不同(p＜0.002)的數值。
圖3A和圖3B。2C3抑制了人腫瘤異種移植物的體內生長。圖3A在第0天將1×107個NCI-H358 NSCLC細胞皮下注射到nu/nu小鼠中。圖3B在第0天將5×106個A673橫紋肌肉瘤細胞皮下注射到nu/nu小鼠中。在第1天和其后每周兩次給小鼠i.p.注射指定IgG。以100、10、或1μg/次的劑量注射2C3，而以100μg/次的劑量注射具有無關特異性的對照IgG(圖3A)和3E7(圖3B)。每周2-3次測量腫瘤。圖3A顯示研究期間的平均值和標準誤差，圖3B顯示研究的最后一天(第26天)的數據。
圖4。2C3治療降低了成形人NCI-H358 NSCLC腫瘤異種移植物的大小。在指定時間給具有大約300-450mm3皮下NCI-H358腫瘤的小鼠腹膜內注射50μg或100μg 2C3(n＝14)、mAb 4.6.1(n＝5)、3E7(n＝12)、或對照IgG(n＝9)。圖4顯示116天的平均腫瘤體積以及SEM。
圖5A和5B。2C3和3E7治療成形人腫瘤異種移植物的比較。圖5A給具有大約450mm3皮下NCI-H358腫瘤的小鼠用2C3(n＝6)或3E7(n＝4)進行治療。治療(T)是腹膜內注射100μg IgG，但是起始治療是靜脈內注射500μg IgG。圖5A顯示平均腫瘤體積以及SEM。在研究結束時(第116天)，處死小鼠，分離腫瘤并稱重。2C3治療組的平均腫瘤重量是0.054g，而3E7治療組的平均腫瘤重量是0.545g。圖5B給具有大約200-250mm3皮下HT1080腫瘤的小鼠腹膜內注射100μg 2C3(n＝9)、3E7(n＝11)、對照IgG(n＝11)、或生理鹽水(n＝11)。如圖所示(T)，隔天治療小鼠。在第26天處死非2C3治療小鼠，因為此時每組超過50％的小鼠具有大型潰瘍腫瘤。圖5B顯示平均腫瘤體積以及SE。
發明詳述實體瘤和癌在人類所有癌癥中所占比例超過90％。雖然在淋巴瘤和白血病的治療中已經研究了單克隆抗體和免疫毒素的應用，但是這些試劑在針對癌和其它實體瘤的臨床試驗中無效的結果令人失望(Abrams和Oldham，1985)。基于抗體的治療無效的首要原因是高分子不容易轉運進入實體瘤。甚至一旦進入了腫瘤塊內，由于存在腫瘤細胞間緊密連接、纖維基質、間質壓力梯度、和結合位點屏障，這些分子也不能均勻分布(Dvorak等人，1991a)。
在開發用于治療實體瘤的新策略的過程中，涉及靶向腫瘤血管結構而非腫瘤細胞的方法提供了明顯優勢。有效破壞或阻斷腫瘤血管，則阻止了經過腫瘤的血流并導致血崩式的腫瘤細胞死亡。抗體-毒素和抗體-凝血劑構建物早已有效用于特異性靶向并破壞腫瘤血管，導致腫瘤壞死(Burrows等人，1992；Burrows和Thorpe，1993；WO 93/17715；WO 96/01653；美國專利號5,855,866；5,877,289；5,965,132；6,051,230；6,004,555；美國流水號08/482,369，1998年10月20日交納頒證費；本文收入作為參考)。
當使用抗體、生長因子、或其它結合配體將凝血劑特異性投遞至腫瘤血管結構時，這些試劑稱為“凝血配體(coaguligand)”。目前優選用于凝血配體的凝血劑是截短的組織因子(tTF)(Huang等人，1997；WO 96/01653；美國專利號5,877,289)。TF是血液凝血的重要起始劑。在損傷位點，血液中的因子VII/VIIa開始接觸并結合血管周圍組織細胞上的TF。存在磷脂表面時，TFVIIa復合物激活因子IX和X，繼而導致凝血酶、纖維蛋白、和最終血塊的形成。
已經描述了在腫瘤內皮上可供利用、但在正常內皮上基本上不存在的多種合適的靶分子。例如可以利用表達的靶，諸如endoglin、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白、VCAM-1、ICAM-1、PSMA、TIE、與LAM-1反應的配體、VEGF/VPF受體、FGF受體、αvβ3整聯蛋白、pleiotropin、或內皮唾液酸蛋白(美國專利號5,855,866；5,877,289；和6,004,555；Burrows等人，1992；Burrows和Thorpe，1993；Huang等人，1997；本文收入作為參考)。
如美國專利號5,776,427和6,036,955(本文收入作為參考)所述，通過天然的腫瘤環境或人為干預后可誘導的其它靶也是可靶向的實體。當與正常組織預先抑制和腫瘤血管誘導結合使用時，也可以采用MHC II類抗原作為靶(美國專利號5,776,427；6,004,554；和6,036,955；本文收入作為參考)。
吸收的靶是另一組合適的靶，諸如VEGF、FGF、TGFβ、HGF、PF4、PDGF、TIMP、結合TIE的配體、或腫瘤相關纖連蛋白異構體(美國專利號5,877,289和5,965,132；本文收入作為參考)。纖連蛋白異構體是可結合受體整聯蛋白家族的配體。腫瘤相關纖連蛋白異構體是腫瘤血管結構和腫瘤基質二者的可靶向成分。
目前優選用于這些臨床靶向應用的標記物是與受體相關的VEGF。事實上，VEGF受體復合物的裝配是至今觀察到的最特異性的腫瘤血管結構標記物(美國專利號5,877,289；5,965,132；和6,051,230；Lin-Ke等人，1996；Dvorak等人，1991b)。
VEGF受體復合物為將藥物或其它效應物特異性靶向腫瘤內皮提供了有吸引力的靶——因為腫瘤富含細胞因子和生長因子，而且VEGF受體在缺氧條件(大多數實體瘤中存在)下上調(Mazure等人，1996；Forsythe等人，1996；Waltenberger等人，1996；Gerber等人，1997；Kremer等人，1997)。特別是腫瘤微環境中配體及其受體二者的上調將導致，與正常組織中的內皮相比，腫瘤血管內皮上的已占據受體濃度更高(美國專利號5,877,289和5,965,132)。Dvorak及其同事也顯示針對VEGF N端的兔多克隆抗體在注射進入攜有同系瘤的小鼠后選擇性地使腫瘤血管顯色(Lin-Ke等人，1996)。
VEGF作為臨床干預靶的作用不限于免疫毒素或凝血配體療法。事實上，VEGF是涉及實體瘤血管發生的關鍵因子之一(Ferrara，1995；Potgens等人，1995)，既是有效的通透劑(Senger等人，1983；Senger等人，1990；Senger等人，1986)又是內皮細胞促分裂原(Keck等人，1989；Connolly等人，1989；Thomas，1996)。根據VEGF與血管發生之間的聯系提出了多種針對VEGF干預的治療性策略(Siemeister等人，1998)。A.VEGF和VEGF受體血管內皮生長因子(VEGF)是由缺氧和致癌突變誘導的多功能細胞因子。它是胚胎發生中血管網絡的發育和維持的主要刺激物。它作為有效的誘導通透性試劑、內皮細胞趨化性試劑、內皮存活因子、和內皮細胞增殖因子而發揮功能(Thomas，1996；Neufeld等人，1999)。因為VEGF等位基因之一或二者的定向破壞將導致胚胎致死(Carmeliet等人，1996；Ferrara等人，1996)，所以正常胚胎發育需要它的活性(Fong等人，1995；Shalaby等人，1995)。
VEGF是在大量生理學和病理學過程中驅動血管發生的重要因子，包括創傷愈合(Frank等人，1995；Burke等人，1995)、糖尿病性視網膜病變(Alon等人，1995；Malecaze等人，1994)、牛皮癬(Detmar等人，1994)、動脈粥樣硬化(Inoue等人，1998)、類風溫性關節炎(Harada等人，1998；Nagashima等人，1999)、實體瘤生長(Plate等人，1994；Claffey等人，1996)。
多種細胞和組織產生VEGF，它存在至少5種異構體(121、145、165、189、和206個氨基酸)，是由相同基因編碼的剪接變體(Houck等人，1991；Ferrara等人，1991；Tischer等人，1991)。較小的兩種異構體，121和165，是由細胞分泌的(Houck等人，1991；Anthony等人，1994)。分泌型VEGF是介于38-46kDa之間的專性二聚體，單體通過兩個二硫鍵相連。
VEGF二聚體以高親和力結合兩種已詳細鑒定的受體，VEGFR1(Flt-1)和VEGFR2(KDR/Flk-1)，它們在內皮細胞上選擇性表達(Flt-1和Flk-1是小鼠同源物)。VEGF結合VEGFR1和VEGFR2的Kd依次為15-100pM和400-800pM(Terman等人，1994)。最近鑒定的第三種細胞表面蛋白質neuropilin-1也以高親和力結合VEGF(Olander等人，1991；De Vries等人，1992；Terman等人，1992；Soker等人，1998)。
VEGFR1和VEGFR2是III型受體酪氨酸激酶(RTK III)家族的成員，該家族的特征為七個細胞外IgG樣重復、單個跨膜結構域、和一個細胞內斷裂酪氨酸激酶結構域(Mustonen和Alitalo，1995)。直到最近，才認為VEGFR1和VEGFR2幾乎專一的在內皮細胞上表達(Mustonen和Alito，1995)。雖然已經報導VEGFR1和VEGFR2在刺激內皮細胞增殖、遷移、和分化方面具有不同功能(Waltenberger等人，1994；Guo等人，1995)，但是每種受體在VEGF生物學和內皮細胞體內平衡中的精確作用在本發明之前尚未清晰闡述。
使用敲除小鼠的最近研究顯示VEGF、VEGFR1、和VEGFR2維管發生(vasculogenesis)、對于血管發生和胚胎發育而言是必需的(Fong等人，1995；Shalaby等人，1995；Hiratsuka等人，1998)。在致死敲除研究中，與缺乏每種受體有關的表型是不同的。VEGFR2的靶向破壞導致缺乏內皮細胞分化且不能形成卵黃囊血島或經歷維管發生的胚胎(Shalaby等人，1995)。VEGFR1無效突變體顯示維管發生受損、內皮細胞裝配紊亂、且血管膨脹(Fong等人，1995；Hiratsuka等人，1998)。VEGFR1顯然具有生死攸關的生物學作用。
雖然VEGFR1具有較低的酪氨酸激酶活性，但是它與VEGF的親和力比VEGFR2高。這說明VEGFR1的細胞外結構域特別重要。這一假設受到來自敲除小鼠的研究結果的強力支持，這些敲除小鼠刪除了VEGFR1的酪氨酸激酶結構域，同時VEGF結合結構域保持完整(Hiratsuka等人，1998)。VEGFR1-酪氨酸激酶缺陷胚胎生成正常的血管并存活至產期(Hiratsuka等人，1998)。
除了較早的敲除(Fong等人，1995；Shalaby等人，1995)，Hiratsuka等人(1998)的研究指出VEGFR1具有生死攸關的生物學作用。然而，酪氨酸激酶信號傳導似乎并不是至關重要的因素。有趣的注意到，來自VEGFR1敲除小鼠的巨噬細胞不展示VEGF誘導的趨化性(Hiratsuka等人，1998；本文收入作為參考)，由此暗示VEGFR1是負責介導對VEGF的這一重要生物學應答的受體。
某些小組已經報導VEGFR2是VEGF誘導的有絲分裂和通透性中的主要信號受體(Waltenberger等人，1994；Zachary，1998；Korpelainen和Alitalo，1998)。VEGFR1在內皮細胞功能中的作用不清楚得多，但是在巨噬細胞的遷移和趨化性中的功能已記錄于上文Hiratsuka等人(1998)的研究中。
Clauss等人(1996；本文收入作為參考)還報導了VEGFR1在單核細胞的激活和趨化性中具有重要作用。事實上，巨噬細胞/單核細胞譜系的細胞只表達VEGFR1，它是負責介導單核細胞募集和促凝血活性的受體(Clauss等人，1996)。結合單核細胞和巨噬細胞上VEGFR1的VEGF還通過升高細胞內鈣和誘導酪氨酸磷酸化來發揮作用(Clauss等人，1996)。
認為VEGF二聚體與VEGF受體的結合可誘導受體二聚體化。受體二聚體化引起特定酪氨酸殘基(VEGFR2的細胞內側Y801與Y1175和VEGFR1的細胞內側Y1213與Y1333)的自身轉磷酸化。這導致信號轉導級聯，包括磷脂酶Cγ(PLCγ)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的激活和細胞內鈣離子的增加(Hood和Meininger，1998；Hood等人，1998；Kroll和Waltenberger，1998)。
VEGF誘導的信號傳導更下游的細胞內事件較不清楚，但是許多小組顯示在VEGF激活VEGFR2后產生一氧化氮(NO)(Hood和Meininger，1998；Hood等人，1998；Kroll和Waltenberger，1998)。VEGF對VEGFR2而非VEGFR1的激活還顯示激活Src和Ras-MAP激酶級聯，包括MAP激酶ERK1和2(Waltenberger等人，1994、1996；Kroll和Waltenberger，1997)。
VEGFR1在內皮細胞功能中的作用不清楚得多，特別是因為Flt-1酪氨酸激酶缺陷小鼠能夠存活并生成正常的血管(Hiratsuka等人，1998)。已有人提出內皮上VEGFR1的主要生物學作用是作為無信號配體結合分子，或向VEGFR2呈遞VEGF可能需要的“誘餌”受體。
VEGF與病理性血管發生狀態之間的聯系促進了阻斷VEGF活性的各種嘗試，包括開發針對VEGF的某些中和性抗體(Kim等人，1992；Presta等人，1997；Sioussat等人，1993；Kondo等人，1993；Asano等人，1995)。也已經描述了針對VEGF受體的抗體，諸如美國專利號5,840,301和5,874,542，和在本發明之后的WO 99/40118。事實上美國專利號5,840,301和5,874,542提出阻斷VEGF受體而非VEGF自身由于多種原因是有益的。
還已經報導了可溶性受體構建物(Kendall和Thomas，1993；Aiello等人，1995；Lin等人，1998；Millauer等人，1996)、酪氨酸激酶抑制劑(Siemeister等人，1998)、反義策略、RNA aptamer、和針對VEGF或VEGF受體的核酶(Saleh等人，1996；Cheng等人，1996；Ke等人，1998；Parry等人，1999；本文收入作為參考)。B.抗VEGF抗體B1.抗體特性范圍各種抑制性方法的應用顯示，通過干預VEGF信號傳導在阻斷血管發生和/或抑制腫瘤生長中至少有些效果。事實上，針對VEGF的單克隆抗體顯示在小鼠中抑制人類腫瘤異種移植物的生長和腹水的形成(Kim等人，1993；Asano等人，1995；1998；Mesiano等人，1998；Luo等人，1998a；1998b；Borgstrom等人，1996；1998)。
抗體A4.6.1是高親和力的抗VEGF抗體，能夠阻斷VEGF結合VEGFR1和VEGFR2二者(Kim等人，1992；Wiesmann等人，1997；Muller等人，1998)。A4.6.1 Fab片段結合的VEGF的丙氨酸掃描誘變和X射線結晶學顯示，A4.6.1結合的VEGF表位集中于第89-94位氨基酸周圍。這一結構資料證明A4.6.1競爭性抑制VEGF結合VEGFR2，但是最有可能通過位阻現象抑制VEGF結合VEGFR1(Muller等人，1998；Keyt等人，1996；本文收入作為參考)。
A4.6.1是至今文獻中最廣泛利用的中和性抗VEGF抗體。它顯示在小鼠中抑制多種人類腫瘤的生長和VEGF誘導的血管通透性(Brem，1998；Baca等人，1997；Presta等人，1997；Mordenti等人，1999；Borgstrom等人，1999；Ryan等人，1999；Lin等人，1999；本文收入作為參考)。A4.6.1還在已詳細鑒定的人卵巢癌小鼠模型中抑制腹水形成，并在新的轉移小鼠模型中抑制腫瘤傳播。A4.6.1最近已通過單價噬菌體展示技術進行了人化，目前作為抗癌劑正在進行I期臨床試驗(Brem，1998；Baca等人，1997；Presta等人，1997；本文收入作為參考)。
盡管使用針對VEGF的中和性抗體已經在本領域取得了一些成功，本發明人意識到新的抗體，特別是以更精確確定模式與VEGFR1(Flt-1)和/或VEGFR2(KDR/Flk-1)相互作用的受體，由于多種原因將是有益的。例如，開發選擇性阻斷VEGF與VEGF受體之一相互作用的抗VEGF抗體，將能夠更精確的剖析表達VEGFR1和VEGFR2二者的細胞中由VEGF激活的途徑。
本發明人認為具有確定表位特異性、只阻斷VEGF結合一種受體(VEGFR2)的抗體可能具有臨床好處，這當然取決于其抑制作用在體內環境中的維持。Hiratsuka等人(1998)的敲除小鼠研究顯示VEGFR1和VEGFR2都具有重要的生物學作用。在本發明之前，針對抑制VEGF經兩種受體之一所介導作用的治療性干預的現實機會由于缺乏有效的、特制的抑制劑而受到牽制。
本發明人首先開發了具有各種表位特異性和特性的一系列新的抗VEGF抗體。提供了分泌針對VEGF受體(Flk-1)復合物或VEGF自身的單克隆抗體的6組雜交瘤。5個抗體組不干預VEGF與其受體的結合，1組(2C3組)阻斷這種相互作用并抑制VEGF介導的內皮細胞生長。
3E7、GV39M、和2C3組的抗體在經靜脈內注射進入攜有人類腫瘤異種移植物的小鼠后都選擇性定位于腫瘤，目前優選將它們用于靶向、成像、和治療實體瘤的血管結構或結締組織。
本發明選擇性識別VEGF受體復合物的單克隆抗體在經注射進入攜有人類腫瘤異種移植物的小鼠后定位于腫瘤內皮細胞。2C3組的單克隆抗體顯著定位于腫瘤血管周圍的結締組織，還有周圍的腫瘤血管。
識別N端的抗體通過ELISA與受體結合的VEGF發生反應。與非受體結合的VEGF相反，GV39M和11B5對受體結合的VEGF展示高特異性。大概N端上由GV39M和11B5識別的表位是構象表位，當VEGF結合其受體時產生。這兩種抗體都是IgM因而較大的事實，對于它們對VEGF受體復合物的選擇性來說可能是重要的。
抗N端抗體不抑制VEGF介導的內皮細胞生長。這說明VEGF的N端不涉及與受體的相互作用，而且針對VEGF N端的抗體不干預VEGF介導的信號傳導。
相反，2C3可抑制VEGF介導的內皮細胞生長，IC50為3nM。使用表達KDR的內皮細胞(ABAE細胞)進行的125I-VEGF結合研究證明，2C3以依賴濃度的方式阻斷VEGF結合KDR。因此，2C3在體外能夠通過干預VEGF結合其受體來中和KDR(VEGFR2)介導的VEGF活性。
免疫組織化學分析揭示，當直接應用于切片時，GV39M、11B5、3E7、和7G3與血管內皮的作用中等至強烈。GV39M展示對腫瘤內皮細胞有最高特異性，腫瘤細胞或結締組織的染色相對很少。11B5、3E7、和7G3在低濃度應用時優先染色內皮細胞，但是在較高濃度時清楚染色腫瘤細胞和結締組織。
使用11B5、3E7、和7G3觀察到的染色模式是在使用針對VEGF、對VEGF沒有特殊構象優先性的多克隆抗體時看到的典型染色類型(Lin-Ke等人，1996；Plate等人，1994；Claffey等人，1996)。GV39M對內皮的選擇性染色說明它可結合這些細胞上的VEGF受體復合物，并且與受體的內皮細胞定位和GV39M在ELISA中選擇性結合VEGFsFlk-1的事實是一致的。
相似的，3E7和7G3更廣的染色模式與它們可識別游離的和受體結合的VEGF二者的能力是一致的。然而，預計11B5具有更限制于內皮的染色模式，因為它在捕獲ELISA中強烈優選VEGFFlk-1(見表2)。考慮到11B5在腫瘤切片上更廣的反應性模式，它有可能能夠識別結合基質成分的VEGF。
3E7和GV39M在體內選擇性定位于腫瘤組織的血管內皮細胞，而2C3除了內皮之外還定位于腫瘤血管周圍的結締組織。經靜脈內注射進入攜有腫瘤的小鼠后24小時，在任何組織(除了腫瘤)的內皮上沒有檢測到3E7。另一方面，GV39M還結合腎小球系膜細胞或內皮細胞。GV39M與小鼠腎小球的反應性的原因還不清楚。可能是抗體結合腎中正常內皮細胞上的VEGF受體復合物(Takahashi等人，1995)。然而，攜有同系種系10腫瘤的豚鼠中的定位研究顯示，GV39M定位于腫瘤血管而非腎小球或其它正常組織中的小管。
3E7和GV39M特異性定位于腫瘤內皮的能力或許是至少兩個因素的結果。第一，VEGF受體復合物在腫瘤血管上相對豐富，因為缺氧的腫瘤微環境刺激腫瘤細胞表達VEGF和內皮細胞表達VEGF受體。第二，腫瘤血管比正常血管通透性更高(Yuan等人，1996)，這可能使得抗體更容易接近似乎在血管內面聚集的VEGF受體復合物(Lin-Ke等人，1996；Hong等人，1995)。
在Lin-Ke及其同事(1996)的先前研究中，發現針對大鼠VEGF N端的兔多克隆抗體在經注射進入攜有TA3/St小鼠乳癌或MOT卵巢癌的小鼠后定位于腫瘤內皮細胞。相反，針對完整VEGF蛋白質的兔多克隆抗體(Ab-618)并不特異性定位于這些腫瘤的內皮細胞或腫瘤自身內其它地方。
根據這些結果，Lin-Ke等人(1996)得出結論，VEGF的N端在VEGF與微血管內皮相連后能夠結合抗體，而且游離的或非內皮細胞相連的VEGF的集合不足以聚集針對非N端表位的抗VEGF抗體(Lin-Ke等人，1996)。使用針對VEGF N端的3E7和GV39M獲得的結果支持他們的結論。
然而，本發明的發現，即針對VEGF上非N端表位的2C3組抗體在小鼠中定位于實體瘤的血管結構和血管周圍結締組織二者，比Lin-Ke等人(1996)的工作更令人驚訝。本發明提出腫瘤基質中存在VEGF“集合”，事實上確實使得2C3在腫瘤塊中聚集。由先前發表的研究不可能預言這種腫瘤基質靶向。本發明人預計VEGF可能結合腫瘤內的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)，但是理解作用機制對于實踐本發明當然不是必需的。
本發明的早期結論是GV39M和3E7組的抗體在小鼠中選擇性定位于腫瘤內皮細胞，而2C3組的抗體定位于腫瘤內皮細胞和腫瘤血管周圍結締組織。既然VEGF及其受體的分布在小鼠中與在人中是相似的，那么預計這些抗體在癌癥患者中顯示相似的定位模式。因此，推測可將GV39M和3E7用于將治療或診斷劑投遞至人體內腫瘤血管結構，而考慮將2C3組的抗體作為載體用于將治療或診斷劑靶向腫瘤血管結構和腫瘤結締組織。
B2.阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體和2C3抗體關于2C3組抗體的進一步研究揭示了甚至更令人驚訝的特性，導致本發明的有效組合物和應用。
使用ELISA、受體結合測定法、和受體激活測定法獲得的本發明重要發現是2C3組的單克隆抗體可選擇性阻斷VEGF與VEGFR2(KDR/Flk-1)而非VEGFR1(Flt-1)的相互作用。2C3抗體可抑制VEGF誘導的VEGFR2的磷酸化并阻斷VEGF誘導的通透性，暗示VEGFR2是負責VEGF誘導的通透性的受體。2C3抗體還具有有效的抗腫瘤活性，在人類癌癥的本領域接受的動物模型中可抑制多種已成形人類實體瘤的生長。
這些發現證明了2C3在剖析表達VEGFR1和VEGFR2二者的細胞中的VEGF激活的途徑中有效性，又突出了VEGFR2活性在腫瘤生長和存活過程中的重要性。更重要的是，它們提供了治療性干預的獨特模式，從而能夠特異性抑制VEGFR2誘導的血管發生，而并不同時抑制由VEGFR1介導的巨噬細胞的趨化性、破骨細胞和破軟骨細胞的功能。
有關2C3的發現由此首次提供了制備和利用只抑制VEGF結合VEGFR2而非VEGFR1的抗VEGF抗體的動機和方法。這些抗體，簡便的稱為“阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體”，展現了本領域的進展，并在用于未綴合的或“裸露的”形式和與其它治療劑綴合或相連的兩種應用中提供了大量優勢。
本發明采用ELISA和共沉淀測定法使用純化的受體蛋白質的體外結合研究，證明了2C3可阻斷VEGF與VEGFR2的結合。令人驚訝的是，2C3在任何測定系統中不抑制VEGF與VEGFR1的結合。為了確認初步結果，在不同的構型中重復結合ELISA。在每種構型中，結果指示2C3不干預VEGF與VEGFR1的相互作用。使用單克隆抗體3E7(針對VEGF氨基末端的抗體)作為這些研究的對照，它不抑制VEGF結合VEGFR1或VEGFR2。
因此，本發明的2C3組抗體與針對VEGF的其它阻斷性抗體(包括A4.6.1)相比獲得顯著改進。A4.6.1抗VEGF抗體阻斷VEGF與兩種VEGF受體的結合。結晶學和誘變研究顯示了VEGFR2和VEGFR1的結合表位集中于VEGF二聚體的兩個對稱極(Widsmann等人，1997；Muller等人，1997)。VEGF上與兩種受體相互作用的結合決定簇部分重疊，而且分布在跨越二聚體表面的4個不同區段上(Muller等人，1998)。抗體A4.6.1結合VEGF的區域位于兩種受體的受體結合區內(Muller等人，1998)。有人提出2C3結合的區域位于VEGFR2結合位點而非VEGFR1結合位點的附近。
關于2C3對VEGF誘導的受體磷酸化的作用的研究顯示，2C3不阻斷VEGF誘導的VEGFR2的磷酸化。這還與上文討論的資料相符，進一步鞏固了VEGFR2在VEGF誘導的增殖中的作用。
與來自其它研究的結果相似，不能證明VEGF誘導VEGFR1磷酸化的一致性(De Vries等人，1992；Waltenberger等人，1994；Davis-Smyth等人，1996；Landgren等人，1998)。因此，不能可靠的判斷2C3是否抑制VEGF誘導的VEGFR1磷酸化。VEGF對VEGFR1磷酸化的低活性使別人提出，VEGFR1可能不是內皮細胞上的信號受體，但是它可能作為誘餌受體用于捕獲VEGF并經VEGFR2擴增其信號。(Hiratsuka等人，1998)。然而，Kupprion等人(1998)使用人微血管內皮細胞(HMEC)、Sawano等人(1996)使用過度表達VEGFR1的NIH 3T3細胞，已經報導了通過VEGF結合進行的VEGFR1酪氨酸磷酸化。另外，Waltenberger等人(1994)顯示可以使用體外激酶測定法來追蹤VEGF誘導的VEGFR1激活。可以使用上述細胞類型之一或體外激酶測定法來測定2C3對VEGF誘導的VEGFR1磷酸化或缺乏的影響。
圖2的ELISA數據和細胞結合數據證明2C3抗體不完全阻斷VEGF結合表達VEGFR1和VEGFR2二者的細胞。2C3不阻斷VEGF結合VEGFR1的事實意味著2C3抗體將是描繪VEGFR1在內皮細胞和其它細胞類型的生物學中作用的有效工具。
在豚鼠中進行Miles通透性測定法檢驗了2C3在阻斷VEGF激活其受體中顯示的選擇性的功能性后果。當IgG的摩爾數比VEGF過量至少10倍時，2C3和A4.6.1都抑制VEGF誘導的通透性。3E7和對照抗體甚至在摩爾數過量1000倍時都不抑制VEGF誘導的通透性。這些結果顯示VEGFR2涉及VEGF誘導的通透性。
這一發現符合最近的這一報導，即新形式的VEGF-C和兩種病毒衍生的VEGF-E變體結合VEGFR2而非VEGFR1，但是仍保留增強血管通透性的能力(Joukov等人，1998；Ogawa等人，1998；Meyer等人，1999)。或許各種形式的VEGF經VEGFR2傳送信號，引起NO生成，繼而引起血管通透性增加(Hood和Granger，1998；Hood等人，1998；Kroll和Waltenberger，1998；Murohara等人，1998；Kupprion等人，1998；Sawano等人，1996；Fujii等人，1997；Parenti等人，1998)。這間接指出涉及VEGFR2，因為已顯示NO生成是VEGFR2激活的結果。然而，還有一些相反的證據，如Couper等人(1997)發現由VEGF誘導的血管通透性增加與體內VEGFR1表達之間存在強烈的相關性。
2C3在體內抑制多種不同類型的人類腫瘤的生長。每周兩次給藥100μg 2C3的效果在攜有皮下NCI-H358 NSCLC和A673橫紋肌肉瘤的小鼠中是相同的，將腫瘤生長有效抑制在大約150mm3的小瘤。在其它腫瘤模型中也看到相似效果，諸如HT29和LS174T(都是人結腸腺癌)。
2C3抑制腫瘤生長的量級與其它研究人員使用不同中和性抗VEGF抗體報導的相似(Asano等人，1998；Mesiano等人，1998)。單克隆大鼠抗小鼠VEGFR2抗體通過抗血管發生機制也強烈阻斷惡性人角化細胞在小鼠中的生長(Skobe等人，1997)。2C3的有效性與其它研究人員使用不同抗VEGF抗體發現的相似，這進一步證明了VEGF在腫瘤血管發生和腫瘤生長中的作用。然而，根據本文討論的特異性抑制特性，2C3應當提供更安全的治療劑。
為了在接近人體狀況的環境中分析抑制VEGF活性的影響，用2C3治療攜有已成形腫瘤的小鼠。在此環境中，2C3治療顯著減緩兩種侵蝕性人腫瘤-A673橫紋肌肉瘤和LS174T結腸腺癌腫瘤的生長。2C3抗體在攜有NCI-H358 NSCLC腫瘤的小鼠中引起顯著的腫瘤退化。
用2C3或A4.6.1治療的腫瘤在治療大約10周后與其最初的大小相比分別退化30％和35％。在治療超過100天的研究中，觀察到甚至更顯著的退化。這一結果說明，VEGF不僅僅是為腫瘤內皮提供有絲分裂信號。
觀察到腫瘤退化而非停滯的事實說明，VEGF不僅僅是為腫瘤內皮提供有絲分裂信號。Benjamin等人(1999)最近報導了，腫瘤包含大量的未成熟血管以與周圍內皮細胞建立接觸，而且這些血管依賴VEGF而存活。可能VEGF的中和引起了這些未成熟血管經歷凋亡，由此降低腫瘤中存在的血管網絡。也可能腫瘤中發生涉及血管形成和血管退化的血管改造動態過程，而且VEGF的中和防止血管形成而轉向血管退化。
2C3抑制腫瘤生長就像A4.6.1一樣完全(如果不是更多的話)的發現指出了VEGFR2在腫瘤血管發生中的主要作用。血管發生的多步驟過程需要內皮細胞的趨化性、金屬蛋白酶的生成、侵入、增殖、和分化。VEGFR1可能在這些過程中不起作用，或者可能通過結合VEGF并將之呈遞給信號受體VEGFR2而在該過程中起到輔助作用。
2C3與A4.6.1在腫瘤治療中的可比性結果高度相關雖然2C3只結合VEGFR2而非VEGFR1，但是它比A4.6.1略微更有效。本研究由此指出VEGFR1在VEGF介導的腫瘤血管發生中沒有顯著作用，并進一步提出VEGFR1特異性抑制劑可能不影響腫瘤血管發生。這些結果還意味著2C3能夠比A4.6.1相同或更加有效，同時引起更小副作用。
特異性阻斷VEGF結合并激活VEGFR2的能力在與臨床有關的兩個領域中是重要的。第一，因為巨噬細胞和單核細胞表達VEGFR1(Flt-1)并經VEGFR1信號對VEGF產生趨化性應答，所以認為VEGFR1在將這些細胞募集進入腫瘤中具有重要作用(Clauss等人，1996；Hiratsuka等人，1998；Akuzawa等人，2000)。激活巨噬細胞后，經Egr-1的誘導刺激flt-1基因轉錄(Egr-1結合人flt-1啟動子中的重疊Egr-1/Spl轉錄因子結合位點)，由此提供flt-1基因是Egr-1的直接靶的證據，其中轉錄因子主要是在巨噬細胞分化時誘導的(Akuzawa等人，2000)。
為了維持產生嚴格的抗腫瘤應答所需的巨噬細胞激活，應當避免對VEGFR1信號的抑制。由于巨噬細胞浸潤不會受損，使得這些細胞能夠由壞死的腫瘤除去腫瘤細胞殘骸并促進腫瘤收縮，由本發明提供的VEGFR1的特異性阻斷由此在腫瘤治療中與A4.6.1相比提供了重要優勢。使用阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(諸如2C3)也將使得浸潤的巨噬細胞通過對腫瘤細胞產生直接殺細胞作用而能夠有助于全面的抗腫瘤效果。
事實上，本發明提供了獨特的有益試劑用于所有形式的抗血管發生療法，因為它們能夠阻斷VEGF的血管發生活性，但是不抑制經VEGFR1介導的VEGF的其它有益作用，諸如對免疫和骨細胞的作用。臨床重要性的第二個領域涉及參照本發明制備的抗體在體內發揮功能而不抑制破骨細胞和破軟骨細胞的有益作用的能力。這意味著本發明的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體治療劑(包括2C3)的使用對骨和/或軟骨將不具有副作用。
體內研究顯示VEGF在軟骨內骨化過程中偶聯肥大軟骨改造、骨化、和血管發生，而且VEGF對于軟骨改造是必需的(Gerber等人，1999；本文特別收入作為參考)。據顯示，通過施用可溶性VEGFR1受體嵌合蛋白(Flt-(1-3)-IgG)對經VEGFR1的VEGF信號滅活，可通過降低破軟骨細胞的募集和/或分化，損害小梁骨(trabecular boneformation)的形成和肥大軟骨細胞區的擴展(Gerber等人，1999)。
進一步顯示，在對破骨細胞功能的支持中，VEGF能夠在體內替代巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)(Niida等人，1999；本文特別收入作為參考)。在使用因M-CSF基因突變而破骨細胞缺陷的骨骼石化癥(op/op)小鼠的研究中，注射重組人M-CSF(rhM-CSF)可使得破骨細胞募集并存活。最近的研究顯示，一次注射重組人VEGF能夠在op/op小鼠中相似的誘導破骨細胞募集(Niida等人，1999)。
據Niida等人(1999)報導，由于破骨細胞顯著表達VEGFR1，而且重組人胎盤生長因子1對破骨細胞募集的活性與rhVEGF相當，所以骨骼石化癥(op/op)小鼠中VEGF信號的有益效果是由VEGF受體VEGFR1介導的。這些作者進一步顯示，rhM-CSF誘導的破骨細胞在使用VEGFR1受體嵌合蛋白VEGFR1/Fc抑制了VEGF后死亡，但是這些效果由伴隨的rhM-CSF注射而消除。由rhM-CSF或內源VEGF支持的破骨細胞在體內活性中不顯示顯著差異(Niida等人，1999)。
突變的op/op小鼠經歷與年齡有關的骨骼石化癥消退，伴隨著破骨細胞數目增加。在Niida等人(1999)的研究中，大多數破骨細胞在注射了抗VEGF抗體后消失，證明內源產生的VEGF在突變小鼠中負責破骨細胞的出現。另外，rhVEGF取代rhM-CSF來支持體外破骨細胞分化。這些結果證明M-CSF和VEGF在支持破骨細胞功能中功能有重疊，而且VEGF經VEGFR1受體發揮作用(Niida等人，1999)。
由此可以得出結論，本發明第一種阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體2C3不阻斷VEGF結合并激活VEGFR1，但是阻斷VEGF結合并激活VEGFR2。無疑可以證明這種VEGFR2抑制作用的抗腫瘤效果。這些結果顯示VEGFR2是介導通透性的VEGF受體，并突出其在腫瘤血管發生中的作用。本發明由此進一步證實VEGF抑制作用可以作為治療實體瘤的療法。更重要的是，本發明提供了一系列新的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體，諸如基于2C3的抗體，用于治療性干預，特別是作為安全且有效的藥物用于在腫瘤和其它疾病中抑制血管發生。
本發明的好處不限于無副作用。雖然存在具有顯著好處的重要特性，特別是在治療患有骨疾病的兒童和患者中，但是本發明的抗體具有大量的其它優勢。
例如，基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3抗體的抗體綴合物可以用于將治療劑投遞至腫瘤環境。事實上，據本文顯示，2C3抗體施用到體內后可結合腫瘤血管結構和腫瘤基質二者，但是不結合正常器官或組織中的血管結構或結締組織。基于本發明抗體的治療性構建物由此具有將兩種功能組合于一個分子內的優勢抗體或其片段的抗血管發生特性和選擇用于附著的治療劑的特性。
由于VEGFR2是內皮上的關鍵受體，阻斷VEGF結合VEGFR2對于抗血管發生效果是至關重要的。雖然VEGFR1在內皮上表達，但是在本文中，它不轉導信號或是被動的。因此，本發明抗體不能阻斷VEGF結合VEGFR1對于它們作為抗血管發生和抗腫瘤試劑的有效性無關緊要。事實上，勝過由現有技術的阻斷性抗體抑制VEGF結合VEGFR1，本發明抗體結合VEGF且基本上不擾亂VEGF-VEGFR1相互作用的能力增強了這些新抗體的藥物投遞特性。
本發明人意識到，仍然期望阻斷性抗體發揮通過結合定位于腫瘤而未結合受體的VEGF來將治療劑投遞至腫瘤環境的功能。具體的說，他們理解這些抗體將結合腫瘤基質中的VEGF并向那里投遞治療劑。這在內皮周圍提供了藥物池，引起對血管內皮細胞的殺細胞或其它破壞性效果，并發揮抗腫瘤效果。
與基質或結締組織相連的VEGF不結合經典含義的VEGF受體，即細胞表面受體。相反，VEGF經其基本區結合一種或多種結締組織成分，包括蛋白聚糖，諸如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。這些序列(和編碼它們的外顯子)在VEGF121蛋白質(和隱含的DNA)中缺失，所以這種異構體不應當在基質中以顯著量存在。腫瘤基質中的VEGF常常稱為“游離的”，但是它仍然定位于腫瘤內，所以“游離的”基本上是指非受體結合的。
發明人還推論得出，阻斷VEGF結合一種而非兩種受體的抗體通過結合血管結構上受體結合的VEGF仍然能夠將治療劑投遞至腫瘤環境。這是本發明最有益的特性之一。即，提供阻斷VEGF結合VEGFR2由此抑制來自VEGF的血管發生信號、但是不阻斷VEGF結合VEGFR1的抗體。除了通過維持經其它細胞類型和組織中VEGFR1的VEGF信號傳導來降低系統性副作用，這些抗體還能夠定位于腫瘤血管結構上的VEGF-VEGFR1復合物并直接向那里投遞治療劑。
與正常組織中的內皮細胞相反，VEGFR1和VEGFR2在腫瘤內皮細胞上都上調。VEGFR1在腫瘤血管內皮上高度表達，使得本發明的靶向方面特別有效。事實上，VEGFR1雖然在內皮中是“非信號傳導”的，但是表達水平與VEGFR2相比即使不是更高也是相同。支持這種現象的一個因素是VEGFR1在應答缺氧和VEGF時都上調，而VEGFR2只在應答VEGF時上調，不受缺氧影響。
雖然內皮上VEGFR1的作用尚不可知，但是VEGFR1可能作為誘餌受體來“捕獲”VEGF并將配體傳遞給信號受體VEGFR2。如果這是真的，那么預計誘餌受體與VEGF的親和力比信號受體更高，事實正是如此。據此，同時可能由于表達水平增強，本發明的阻斷VEGFR2、不阻斷VEGFR1的抗體是用于腫瘤治療的理想投遞劑。這些抗體的治療性綴合物能夠同時抑制經VEGFR2的血管發生并通過向VEGF-VEGFR1受體復合物投遞治療劑來破壞現存的血管結構。
發明人絕非限制上述科學推理作為對本發明抗體有益的抗血管發生和抗腫瘤定位特性的解釋。雖然本發明的效用不證自明，且不需要將理論付諸實踐，但是發明人已經考慮到阻斷VEGFR2、不阻斷VEGFR1的抗體可以有效且特異性定位于腫瘤血管結構的其它機制。
這些抗體能夠結合與Npn-1或另一種至今未鑒定的細胞表面VEGF結合蛋白相連的VEGF，或者能夠結合與內皮細胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相連的VEGF。還可以通過結合VEGF蛋白質家族的另一成員來增強抗體定位，即與血管相關的VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D，但是可能性不大。
本發明阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3抗體的另一有益特性是這些抗體能中和經VEGFR2介導的VEGF存活信號或“保護性效果”。除了使得抗體自身更有效，這一特性還使得它們在與受VEGF存活功能牽制的其它試劑的聯合中特別有用。
例如，VEGF保護內皮免于放療。因此，本發明的裸露抗體和免疫綴合物都可理想的用于與放療聯合。通過使用附著放療劑的抗體可提供甚至更多的好處。這類構建物將具有3種優勢(1)經抗體部分發揮抗血管發生效果；(2)通過投遞放療劑來發揮破壞腫瘤血管結構的效果；和(3)防止VEGF典型存活信號抵消放療劑的效果。
具有相似協同效果的其它構建物是與抗微管蛋白藥物或藥物前體、抗凋亡試劑、和其它抗血管發生試劑相連的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體。引起凋亡的試劑或藥物的作用受到VEGF的拮抗。本發明由此通過中和VEGF而改進了這些試劑的有效性。VEGF存活信號也對抗抑內皮素，限制這種療法。因此，在與抑內皮素的聯合中，本發明阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3抗體將中和VEGF，并放大抑內皮素的抗腫瘤效果。2C3或其它阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體還可以用于將膠原酶特異性投遞至腫瘤，在那里膠原酶將在原處產生抑內皮素，獲得相似好處。
在所有這些增強或協同聯合中，抗體和其它試劑可以分開施用，或者第二種試劑可以與用于特異性投遞(即靶向投遞至VEGFR1)的抗體相連。在與抑內皮素的聯合中，化學綴合物或重組融合蛋白質將是優選的，因為這樣將抵消抑內皮素的短半衰期，而這在目前限制了潛在的抑內皮素療法。還可以采用與組織型纖溶酶原激活劑(tPA)的聯合或其靶向形式。
本發明治療劑的其它優勢包括降低間質壓力的能力。由于VEGF介導的通透性增加有助于間質壓力，因此降低經VEGFR2的信號傳導將降低通透性和間質壓力二者。繼而將減少藥物橫穿全部腫瘤組織的障礙，使得能夠殺死遠離血管結構的腫瘤細胞。由于本發明組合物沒有或者僅有可忽略的或低免疫原性，所以還可以實行延長療法。
B3.2C3抗體的CDR序列如本文所用，涉及抗體的術語“可變的”指抗體序列中廣泛不同并用于每一種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性的可變結構域某些部分。然而，可變性并不是均勻分布在整個抗體可變結構域上，而是集中在輕鏈和重鏈可變結構域中都有的稱為“高變區”的三個區段中。
可變結構域中更高度保守的部分稱為框架區(framework region，FR)。天然輕鏈和重鏈的可變結構域都包含4個FR(依次為FR1、FR2、FR3、和FR4)，主要采用β-折疊構象，由3個高變區相連，它們形成環，連接(在某些情況中是構成)β-折疊結構部分。
每條鏈中的高變區由FR緊密維持在一起，并與其它鏈的高變區一起有助于形成抗體的抗原結合位點(Kabat等人，1991；本文特別收入作為參考)。恒定結構域不直接涉及抗體與抗原的結合，但是展示多種效應物功能，諸如抗體參與依賴抗體的細胞毒性。
如本文所用，術語“高變區”指抗體中負責抗原結合的氨基酸殘基。高變區包含來自“互補決定區”或“CDR”的氨基酸殘基(即輕鏈可變結構域第24-34位(L1)、第50-56位(L2)、和第89-97位(L3)殘基和重鏈可變結構域第31-35位(H1)、第50-56位(H2)、和第95-102位(H3)殘基；Kabat等人，1991，本文收入作為參考)和/或來自“高變環”的殘基(即輕鏈可變結構域第26-32位(L1)、第50-52位(L2)、和第91-96位(L3)殘基和重鏈可變結構域第26-32位(H1)、第53-55位(H2)、和第96-101位(H3)殘基)。“框架”或“FR”殘基是除了本文定義的高變區殘基以外的可變結構域殘基。
本文提供了2C3 ScFv片段的Vh和Vκ鏈的DNA和推導的氨基酸序列，見SEQ ID NO6、7、8、和9。這些序列包含抗體重鏈和輕鏈可變區的CDR1-3。
如本文討論的(C3部分)，借助為生物學分子提供的結果和功能信息，能夠產生一系列等同的或甚至改進的分子。這可應用于本發明阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體，由2C3抗體例示。雖然抗體的抗原結合和其它功能特性必須保留，但是在提供了參考抗體后產生等同的和甚至改進的抗體存在本領域極高程度的技術要求。這些技術可以根據本文提供的序列和信息應用于產生具有相似的、改進的、或其它期望特征的其它抗體。
對于等同的抗體，可以用某些氨基酸替代抗體恒定或可變結構域框架區中的其它氨基酸，而沒有可覺察的相互結合能力損失。優選在編碼抗體部分的DNA序列中進行這種改變，而且這些改變在本質上是保守的(見C3部分、表A中的密碼子信息、和關于定點誘變的技術支持細節)。自然，對可以進行改變的數目存在限制，但是本領域普通技術人員是眾所周知的可以。
其它類型的變體是由親本抗體產生、相對而言又具有改進的生物學特性的抗體。這些變體或第二代化合物通常是在親本抗體中包含一處或多處高變區殘基替代的替代變體。用于產生這些替代變體的便利方法是使用噬菌體展示的親和力成熟。
在使用噬菌體展示的親和力成熟中，突變幾個高變區位點(如6-7個位點)而在每個位點產生所有可能的氨基酸替代。由此產生的抗體變體以單價方式展示在絲狀噬菌體顆粒上，與每個顆粒內包裝的M13的基因III產物融合。然后，如本文公開的，對噬菌體展示變體篩選其生物學活性(如結合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區位點，可以進行丙氨酸掃描誘變來鑒定顯著有助于抗原結合的高變區殘基。
或者/另外，預計可以描繪并分析抗原-抗體復合物的晶體結構，從而鑒定抗體與VEGF之間的接觸點。這些接觸殘基和鄰近殘基候選用于替代。一旦產生了這些變體，如本文所述，對變體板進行篩選，選擇在一種或多種相關測定法中具有相似但是不同或甚至更好特性的抗體用于進一步的開發。
本發明的另一方面因此涉及編碼阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體重鏈和輕鏈CDR區的分離DNA片段和重組載體，和經應用DNA技術而表達這些CDR區的重組宿主細胞的制備和應用。
本發明由此涉及可由任何哺乳動物(優選人或鼠)分離的不含總基因組DNA、并能夠表達阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體重鏈和輕鏈(諸如2C3重鏈和輕鏈)CDR區的DNA片段。如本文所用，術語“DNA片段”指已分離的不含特定物種總基因組DNA的DNA分子。術語“DNA片段”包括DNA片段和這些片段的小片段，還有重組載體，包括例如質粒、粘粒、噬菌體、病毒、等等。
相似的，包含編碼阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體重鏈和輕鏈(諸如2C3重鏈和輕鏈)的純化CDR區的編碼片段或分離基因部分的DNA片段，指包含這些編碼序列而且在某些方面包含調控序列、與其它天然存在的基因或蛋白質編碼序列基本上分離開的DNA片段。在這方面，術語“基因”簡便的用于指功能性蛋白質、多肽、或肽編碼單元。本領域技術人員可以理解，這種功能性術語包括表達或可能適合于表達合適的抗原結合蛋白質、多肽、或肽的天然抗體編碼序列和更小的基因工程片段。
“與其它編碼序列基本上分離開”指感興趣的編碼片段或分離基因部分構成DNA片段編碼區的重要部分，而且DNA片段不合大部分的天然編碼DNA，諸如大染色體片段或其它功能基因或cDNA編碼區。當然，這指最初分離的DNA片段，不排除后來人工添加的基因或編碼區。
在特定實施方案中，本發明涉及分離的編碼片段或分離的基因部分，和摻入了編碼阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體重鏈和輕鏈(諸如2C3重鏈和輕鏈)CDR區的DNA序列的重組載體，所含至少第一種序列區包含與氨基酸序列SEQ ID NO7或SEQ ID NO9有至少大約75％、更優選至少大約80％、更優選至少大約85％、更優選至少大約90％、最優選至少大約95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列區；其中所述CDR區至少基本上維持氨基酸序列SEQ ID NO7或SEQ ID NO9的CDR區的生物學特性。
如本文公開的，序列可以包含某些生物學功能等同的氨基酸或“保守性替代”。其它序列可以包含功能非等同的氨基酸或“非保守性替代”，其特意經基因工程改造以改進CDR或含CDR抗體的特性，本領域普通技術人員是知道的，本文將進一步描述。
也可以理解，氨基酸和核酸序列可以包含額外殘基，諸如額外的N或C端氨基酸或者5’或3’序列而仍然符合本發明的序列，條件是序列符合上文提出的標準，優選包括涉及蛋白質表達時生物學蛋白質活性得到維持或改進。末端序列的添加包括位于編碼區5’或3’部分側翼的各種非編碼序列以及控制區。
因此，本發明的核酸片段可以與其它DNA序列聯合，諸如啟動子、多聚腺苷酸化信號、額外的限制酶位點、多克隆位點、其它編碼片段、等等，使得它們的整體長度可能顯著變化。因此預計可以采用幾乎任何長度的核酸片段，總長度優選限制于在意欲采用的重組DNA方案中制備和使用的難易程度。
因此，重組載體形成本發明的另一方面。特別有用的載體預計是將DNA片段編碼部分置于啟動子控制之下的載體。通常，但是也不排外，將采用重組或異源啟動子，即在天然環境中與編碼序列通常不相連的啟動子。這些啟動子可以包括細菌、病毒、真核、和哺乳動物啟動子，只要啟動子有效指導DNA片段在選擇用于表達的細胞類型、生物體、或甚至動物中的表達即可。
用于蛋白質表達的啟動子和細胞類型組合的使用對于分子生物學領域技術人員而言是知道的。采用的啟動子可以是組成性的或可誘導的，而且可以在指導導入的DNA片段高水平表達的適當條件下使用，這在諸如大量生產重組蛋白質或肽中是有益的。
本發明核酸序列的表達可以方便的通過本領域普通技術人員知道的、本文進一步描述的任何一種或多種標準技術來實現。例如，關于融合蛋白質重組表達的后來描述同樣可以應用于在核酸水平上不與另一種編碼序列可操作相連的抗體和抗體片段。
B4.多克隆抗體本領域眾所周知用于制備并鑒定抗體的方法(參閱如《抗體實驗室手冊》(AntibodiesA Laboratory Manual)冷泉港實驗室，1988；本文收入作為參考)。為了制備多克隆抗血清，用免疫原性VEGF組合物免疫動物，并由經免疫動物收集抗血清。廣泛的動物物種可以用于生產抗血清。用于生產抗血清的動物通常是兔、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、或山羊。因為兔的血量相對較大，所以優選兔用于生產多克隆抗體。
用于生成多克隆抗體的VEGF免疫原組合物的量隨免疫原的本質以及用于免疫的動物而變化。多種途徑可以用于施用本發明VEGF免疫原包括皮下、肌肉內、真皮內、靜脈內、腹膜內、和脾內。可以通過在免疫后多個時間點由經免疫動物取血樣來監控多克隆抗體的生成。還可以給予第二次加強注射。重復加強和測效價過程，直至達到合適的效價。當獲得期望效價水平時，可以給經免疫動物放血，分離并保存血清。動物還可用于產生單克隆抗體。
正如本領域眾所周知的，特定組合物的免疫原性可以通過使用稱為佐劑的免疫應答非特異性刺激劑而獲得增強。例示性佐劑包括完全弗氏佐劑，其包含殺死的結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的免疫應答非特異性刺激劑；不完全弗氏佐劑；和氫氧化鋁佐劑。
還可能期望加強宿主的免疫系統，這可以通過將VEGF與載體相連或偶聯來實現。例示性載體是鑰孔血藍蛋白(KLH)和牛血清清蛋白(BSA)。其它清蛋白，諸如卵清蛋白、小鼠血清清蛋白、或兔血清清蛋白，也可以作為載體使用。正如本領域眾所周知的，指定組合物的免疫原性可以變化。然而，產生針對VEGF的抗體并不特別困難。
B5.單克隆抗體現在本領域還眾所周知用于產生單克隆抗體(MAb)的各種方法。大多數標準單克隆抗體生成技術通常符合制備多克隆抗體的路線(《抗體實驗室手冊》(AntibodiesA Laboratory Manual)，冷泉港實驗室，1988；本文收入作為參考)。通過用免疫原性VEGF組合物免疫動物來起始多克隆抗體應答，當獲得期望的效價水平時，經免疫動物可以用于生產MAb。
通過使用眾所周知的技術，諸如美國專利號4,196,265(本文收入作為參考)中例示的技術，可很容易制備MAb。這種技術通常涉及用選定的VEGF免疫原組合物免疫合適的動物。以能有效刺激抗體生成細胞的方式施用免疫組合物。優選動物是嚙齒類動物，諸如小鼠和大鼠，但是也可以使用兔、綿羊、和蛙的細胞。使用大鼠可能有些好處(Goding，1986，第60-61頁；本文收入作為參考)，但是優選小鼠，最優選BALB/c小鼠，因為它是最常規使用的且通常具有較高的穩定融合百分比。
免疫后，選擇有潛力生成VEGF抗體的體細胞，具體而言是B淋巴細胞(B細胞)，用于產生mAb。這些細胞可以由脾、扁桃體、和淋巴結活組織切片或者由外周血樣品獲得。優選脾細胞和外周血細胞，因為前者是處于成漿細胞分裂階段的抗體生成細胞的豐富來源，而后者易于獲得。通常，需要免疫一組動物，切下具有最高抗體效價的動物脾臟，并用注射器對獲得的脾進行勻漿而獲得淋巴細胞。來自經免疫小鼠的脾通常包含大約5×107-2×108個淋巴細胞。
然后將來自經免疫動物、生成抗VEGF抗體的B淋巴細胞與永生化骨髓瘤細胞融合，永生化骨髓瘤細胞通常與免疫的動物屬于相同物種。適用于雜交瘤生產融合程序的骨髓瘤細胞系優選不產生抗體的，具有高融合效率，并具有酶缺陷，使其不能在只支持期望的融合細胞(雜交瘤)生長的某些選擇性培養基中生長。
正如本領域技術人員知道的，可以使用大量的骨髓瘤細胞中的任一種(Goding，第65-66頁，1986；Campbell，第75-83頁，1984；本文收入作為參考)。例如，當經免疫動物是小鼠時，可以使用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7、和S194/5XX0 Bul；對于大鼠，可以使用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F、4B210、或上文所列的小鼠細胞系；對于人細胞融合，可使用U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2、和UC729-6。
用于產生抗體生成脾細胞或淋巴結細胞與骨髓瘤細胞的雜交細胞的方法通常包括在存在促進細胞膜融合的(化學的或電學的)試劑的條件下將體細胞與骨髓瘤細胞以4∶1的比例混和，但是比例可以在約20∶1與約1∶1之間變化。Kohler和Milstein(1975；1976；本文收入作為參考)已經描述了使用仙臺病毒(Sendai virus)的融合方法，Gefter等人(1977；本文收入作為參考)已經描述了使用聚乙二醇(PEG)，諸如37％(v/v)PEG的方法。電誘導融合方法的使用也是合適的(Goding，第71-74頁，1986；本文收入作為參考)。
融合程序常常以大約1×10-6-1×10-8的低頻率產生能存活的雜交細胞。然而這不是問題所在，因為通過在選擇性培養基進行培養，能夠區分能存活的融合雜交細胞與親本未融合細胞(特別是通常可持續進行無限期分裂的未融合的骨髓瘤細胞)。選擇性培養基通常是在組織培養基中包含阻斷核苷酸從頭合成的試劑的培養基。例示性和優選的試劑是氨基蝶呤、氨甲喋呤、和重氮絲氨酸。氨甲喋呤和氨甲喋呤阻斷嘌呤和嘧啶二者的從頭合成，而重氮絲氨酸只阻斷嘌呤合成。當使用氨甲喋呤或氨甲喋呤時，要向培養基中添加次黃嘌呤和胸苷作為核苷酸來源(HAT培養基)。當使用重氮絲氨酸時，要向培養基中添加次黃嘌呤。
優選的選擇性培養基是HAT。只有能夠進行核苷酸補救途徑的細胞才能夠在HAT培養基中存活。在骨髓瘤細胞中補救途徑的關鍵酶是缺陷的，如次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)，因此它們不能存活。B細胞能夠進行該途徑，但是它們在培養中的壽命是有限的，通常在大約2周內死亡。因此，能夠在選擇性培養基中存活的細胞只有由骨髓瘤與B細胞形成的雜交細胞。
這種培養提供了雜交瘤細胞群，由此可選擇特定的雜交瘤。通常在微量滴定板中培養由單克隆稀釋的細胞，隨后在大約2-3周后對各個克隆的上清液檢驗期望的抗VEGF活性，從而選擇雜交瘤。測定法應當是靈敏的、簡單的、且快速的，諸如放射性免疫測定法、酶免疫測定法、細胞毒性測定法、噬斑測定法、斑點免疫結合測定法、等等。
然后對選擇的雜交瘤進行系列稀釋，并克隆形成產生抗VEGF抗體的細胞系，可以無限繁殖這些克隆來提供mAb。可以以兩種基本方式用這些細胞系產生mAb。其一是將雜交瘤樣品注射(通常為腹腔內)進入組織相容性動物，這些動物與提供體細胞和骨髓瘤細胞用于最初融合的動物種類相同。經注射動物形成的腫瘤分泌由融合的雜交細胞產生的特定單克隆抗體。然后可以對動物進行穿刺來吸取體液(諸如血清或腹水)，提供高濃度的mAb。另一種方法是在體外培養單個細胞系，此時通常分泌mAb進入培養基，由此可容易的獲得高濃度的mAb。
通過每種方法產生的mAb通常將進一步純化，如使用過濾、離心、和各種層析法，諸如HPLC或親和層析法，本領域技術人員眾所周知所有純化技術。這些純化技術都涉及將期望抗體與混和物其它成分分開。特別適用于抗體制備的分析方法包括例如蛋白A-Sepharose和/或蛋白G-Sepharose層析法。
B6.來自噬菌粒文庫的抗體重組技術現在能夠由編碼一系列抗體的重組基因制備具有期望特異性的抗體(Van Dijk等人，1989；本文收入作為參考)。某些重組技術涉及對使用由經免疫動物的脾分離的RNA而制備的組合免疫球蛋白噬菌體表達文庫進行免疫學篩選來分離抗體基因(Morrison等人，1986；Winter和Milstein，1991；本文收入作為參考)。
對于這些方法，使用由經免疫動物的脾分離的RNA來制備組合型免疫球蛋白噬菌粒文庫，并通過使用表達抗原的細胞和對照細胞的淘選來選擇表達適當抗體的噬菌粒。這種方法相對于傳統雜交瘤技術的優勢是可以在一輪中產生并篩選多達大約104倍的抗體，而且通過H鏈與L鏈的組合產生了新的特異性，進一步增加了產生適當抗體的可能性。
用于在細菌中產生多樣性抗體分子大型文庫的一種方法是利用細菌噬菌體λ作為載體(Huse等人，1989；本文收入作為參考)。使用λ載體的抗體生成涉及將重鏈和輕鏈DNA序列群克隆到不同的起始載體中。隨后隨機組合載體形成單一載體，來指導重鏈和輕鏈共表達形成抗體片段。由用選定抗原免疫的動物的脾細胞(或其雜交瘤)分離mRNA并進行擴增，優選通過PCRTM或相關擴增技術，獲得重鏈和輕鏈DNA序列。重鏈和輕鏈序列通常使用引物進行擴增，所述引物將限制性位點引入擴增DNA片段末端，有助于將重鏈和輕鏈片段克隆到起始載體中。
用于產生并篩選全部或部分合成的抗體結合位點或互補位的大型文庫的另一種方法利用由絲狀噬菌體(諸如M13、fl、或fd)衍生的展示載體。這些稱為“噬菌粒”的絲狀噬菌體展示載體可產生具有不同的和新的免疫特異性的單克隆抗體大型文庫。這種技術使用絲狀噬菌體外殼蛋白膜錨定結構域作為在絲狀噬菌體復制裝配階段過程中聯系基因產物與基因的方法，而且已經用于由組合型文庫克隆并表達抗體(Kang等人，1991；Barbas等人，1991；本文收入作為參考)。
美國專利號5,658,727描述了這種用于絲狀噬菌體展示的常用技術，本文收入作為參考。在最常用的方面，這種方法為使用單一載體系統由抗體基因庫同時克隆并篩選預先選定的配體結合特異性提供了系統。對文庫的分離成員篩選預先選定的配體結合能力能夠將表達的抗體分子的結合能力與用于分離文庫成員編碼基因的便利方法聯系起來。
通過將進入細菌細胞周質從而能夠裝配功能性抗體的融合多肽靶向與噬菌體裝配過程中融合多肽靶向絲狀噬菌體顆粒外殼上從而能夠方便的篩選感興趣文庫成員進行組合，可以實現表達與篩選的聯系。通過融合多肽中存在的分泌信號結構域來提供周質靶向。通過融合多肽中存在的絲狀噬菌體外殼蛋白膜錨定結構域(即cpIII或cpVIII衍生的膜錨定結構域)來提供噬菌體顆粒靶向。
可以通過重鏈和輕鏈基因的改組，通過改變克隆的文庫重鏈基因的一個或多個互補決定區、或通過易錯聚合酶鏈式反應將隨機突變導入文庫，來增加基于絲狀噬菌體的組合型抗體文庫的多樣性。美國專利號5,580,717、5,427,908、5,403,484、和5,223,409描述了用于篩選噬菌粒文庫的其它方法，本文收入作為參考。
已經開發了用于篩選大型組合型抗體文庫的另一種方法，其中利用不同重鏈和輕鏈序列群在絲狀噬菌體(諸如M13、fl、或fd)表面的表達(美國專利號5,698,426，本文收入作為參考)。通過聚合酶鏈式反應(PCRTM)合成了兩套多樣性重鏈(Hc)和輕鏈(Lc)序列群。將這些序列群克隆到不同的含表達必需元件的基于M13的載體中。重鏈載體包含基因VIII(gVIII)外殼蛋白序列，使得重鏈序列的翻譯產生gVIII-Hc融合蛋白質。隨機組合兩套載體群，使得只有包含Hc和Lc序列的載體部分連接成單個環狀載體。
組合型載體指導Hc與Lc序列二者的共表達，用于兩種多肽的裝配和M13表面表達(美國專利號5,698,426，本文收入作為參考)。組合步驟將兩套多樣性序列群的不同Hc和Lc編碼序列隨機帶入單個載體。來自每個獨立載體的載體序列對于產生能存活噬菌體是必需的。另外，既然兩種起始載體中只有一種包含假的gVIII序列，那么在噬菌體表面不能夠實現功能性抗體片段作為Lc相關性gVIII-Fc融合蛋白質的共表達，除非載體序列連接成單個載體。
在琥珀抑制子菌株中進行抗體文庫的表面表達。Hc序列與gVIII序列之間的琥珀終止密碼子在無抑制子菌株中拆開了兩種成分。分離由無抑制子菌株產生的噬菌體并感染抑制子菌株，將在表達過程中將Hc序列與gVIII序列聯系起來。感染后培養抑制子菌株能夠在M13表面以gVIII融合蛋白質(gVIII-Fab融合蛋白質)形式共表達文庫內所有抗體種類。或者，可以由無抑制子菌株分離DNA，然后導入抑制子菌株來實現相同效果。
通過標準親和分離程序對表面表達文庫篩選可結合預先選定分子的特異性Fab片段。這些方法包括例如淘選(Parmley和Smith，1988；本文收入作為參考)、親和層析法、和固相印跡程序。優選淘選，因為可以在小體積中容易的、快速的篩選高效價噬菌體。而且，該程序可以選擇群體中用其它方法檢測不到的較少Fab片段種類，并擴增成基本上同質的群體。可以在擴增噬菌體群后對編碼多肽的核酸進行測序來鑒定選定的Fab片段。
美國專利號5,667,988和5,759,817描述了用于產生多樣性抗體文庫并篩選期望結合特異性的另一種方法，本文收入作為參考。該方法涉及使用簡并寡核苷酸和引物延伸反應將簡并性引入免疫球蛋白可變的重鏈和輕鏈可變結構域CDR區，并將誘變的多肽展示在噬菌顆粒表面，由此以噬菌粒文庫的形式制備雜二聚體免疫球蛋白分子文庫。此后，對展示蛋白篩選結合預先選定抗原的能力。
用于產生雜二聚體免疫球蛋白分子的方法通常涉及(1)將感興趣的重鏈或輕鏈V區編碼基因導入噬菌粒展示載體；(2)通過使用包含抗體V區基因CDR同源區且包含產生隨機化編碼序列的簡并區的寡核苷酸進行引物延伸，將隨機化結合位點導入噬菌粒展示蛋白載體，形成展示載體的大型群體，其中的每一個都能夠表達在噬菌粒表面展示蛋白上展示的不同的假定結合位點；(3)在絲狀噬菌體顆粒表面表達展示蛋白和結合位點；并(4)使用親和技術來分離(篩選)表面表達的噬菌體顆粒，諸如針對預先選定抗原的噬菌體顆粒淘選，由此分離所含展示蛋白包含可結合預先選定抗原的結合位點的一種或多種噬菌粒。
美國專利號5,702,892描述了用于產生多樣性抗體文庫并篩選期望結合特異性的這種方法的另一種形式，本文收入作為參考。在這種方法中只采用重鏈序列，對重鏈序列中編碼CDRI或CDRIII高變區的所有核苷酸位置進行隨機化，并獨立于任何生物學過程產生CDR遺傳變異性。
在這種方法中，對兩個文庫進行改造，即對重鏈基因結構框架內的寡核苷酸基序進行遺傳改組。通過CDRI或CDRIII的隨機突變，重建重鏈基因高變區產生高度多樣序列集合。由突變基因序列集合編碼的重鏈蛋白有可能具有免疫球蛋白的所有結合特征，而只需要兩條免疫球蛋白鏈之一。
具體而言，在不存在免疫球蛋白輕鏈蛋白的情況中實踐這種方法。將展示經修飾重鏈蛋白的噬菌體文庫與已固定配體一起溫育，來選擇編碼可特異性結合已固定配體的重組蛋白質的克隆。然后將結合噬菌體與已固定配體解離，通過在細菌宿主細胞中的生長進行擴增。擴增表達不同重組蛋白質的各個病毒斑，然后可以對各個克隆測定結合活性。
B7.來自人淋巴細胞的抗體體外免疫或抗原刺激也可以用于產生人抗VEGF抗體。這些技術可以用于刺激來自正常、健康主體的外周血淋巴細胞，其中僅僅需要用VEGF對抗體生成細胞進行體外刺激。
這種“體外免疫”涉及通常為淋巴細胞混和群(混和淋巴細胞培養物，MLC)內的未免疫B淋巴細胞的抗原特異性激活。體外免疫還可以由B細胞生長和分化因子及淋巴因子獲得支持。由這些方法產生的抗體常常是IgM抗體(Borrebaeck等人，1986；本文收入作為參考)。
美國專利號5,681,729描述了能夠獲得主要產生IgG或IgA抗體的人淋巴細胞的另一種方法，本文收入作為參考。一般地，這種方法涉及將人淋巴細胞移植到免疫缺陷型動物中，使得人淋巴細胞“接受”該動物體；用期望抗原免疫動物，使得生成可產生對抗原具有特異性的抗體人淋巴細胞；并由動物回收產生抗體的人淋巴細胞。由此產生的人淋巴細胞可以用于產生單克隆抗體即使產生抗體的人淋巴細胞永生化，克隆獲得的永生化、人起源、產生抗體的淋巴細胞，并由克隆的永生化、人起源淋巴細胞回收對期望抗原具有特異性的單克隆抗體。
在這種技術中可采用的免疫缺陷型動物是那些在移植了人淋巴細胞后不展示排異的動物。這些動物可以通過物理的、化學的、或生物學的處理而人工制備。可以采用任何免疫缺陷型動物。人淋巴細胞可以由人外周血、脾、淋巴結、扁桃體、等等獲得。
動物中移植的人淋巴細胞的“接受”可以通過僅僅對動物施用人淋巴細胞來實現。施用途徑不限于且可以是例如皮下、靜脈內、或腹膜內。人淋巴細胞的劑量不受限制，通常可以是每只動物106-108個淋巴細胞。然后用期望的VEGF抗原免疫免疫缺陷型動物。
免疫后，通過任何傳統方法由血液、脾、淋巴結、或其它淋巴組織回收人淋巴細胞。例如，單核細胞可以通過Ficoll-Hypaque(比重1.077)離心法進行分離，并通過塑料盤吸附法除去單核細胞。來自免疫缺陷型動物的污染細胞可以通過使用對該動物細胞具有特異性的抗血清而除去。可以通過例如用該免疫缺陷型動物的脾細胞免疫第二種不同動物并由該不同的經免疫動物回收血清來獲得抗血清。可以在任何階段進行抗血清處理。也可以通過采用在細胞表面表達作為標記物的人免疫球蛋白的免疫學方法來回收人淋巴細胞。
通過這些方法，可以獲得主要產生對一種或多種選定VEGF表位具有特異性的IgG和IgA抗體的人淋巴細胞。然后通過永生化、選擇、細胞培養、和抗體生成，由人淋巴細胞獲得單克隆抗體。
B8.含人抗體文庫的轉基因小鼠重組技術現在可用于制備抗體。除了上文公開的組合型免疫球蛋白噬菌體表達文庫，另一種分子克隆方法是由含人抗體文庫的轉基因小鼠制備抗體。美國專利號5,545,807描述了這些技術，本文收入作為參考。
在最常用的方面，這些方法涉及產生在其種系中插入了遺傳物質的轉基因動物，所述遺傳物質編碼至少部分的人起源免疫球蛋白，或者可以重排而編碼免疫球蛋白集合。可以由人來源產生所述插入的遺傳物質，或者可以人工合成。遺傳物質可以編碼至少部分的已知免疫球蛋白，或者可以經修飾編碼至少部分的經改變免疫球蛋白。
插入的遺傳物質在轉基因動物中表達，導致至少部分由插入的人免疫球蛋白遺傳物質衍生的免疫球蛋白的生成。發現遺傳物質在轉基因動物中發生重排，使得可以產生部分由插入的遺傳物質衍生的免疫球蛋白集合，甚至有時插入的遺傳物質以錯誤位置或錯誤幾何學摻入種系。
可以以DNA的形式將插入的遺傳物質克隆到原核載體中，諸如質粒和/或粘粒。使用酵母人工染色體載體(Burke等人，1987；本文收入作為參考)，或者通過導入染色體片段(Richer和Lo，1989；本文收入作為參考)，來插入較大的DNA片段。可以以傳統方式將插入的遺傳物質導入宿主，例如通過注射或其它程序進入受精卵或胚胎干細胞。
在優選方面，可利用最初不攜帶編碼免疫球蛋白恒定區的遺傳物質的宿主動物，使得產生的轉基因動物在產生免疫球蛋白時將只使用插入的人遺傳物質。這可以通過使用天然存在的缺乏相關遺傳物質的突變宿主，或者通過人為制備突變體(如在細胞系中產生最終除去了相關遺傳物質的宿主)來實現。
當宿主動物攜帶編碼免疫球蛋白恒定區的遺傳物質時，轉基因動物將攜帶天然存在的遺傳物質和插入的遺傳物質，并將產生由天然存在的遺傳物質、插入的遺傳物質、和這兩種遺傳物質的混和物衍生的免疫球蛋白。在這種情況中，可以通過篩選由轉基因動物衍生的雜交瘤來獲得期望的免疫球蛋白，如利用抗體基因表達的等位基因排斥或差異染色體丟失現象。
一旦制備了合適的轉基因動物，即可簡單地用期望免疫原免疫動物。根據插入物質的本質，動物可能產生嵌合免疫球蛋白，如混和小鼠/人起源的免疫球蛋白，其中外源遺傳物質只編碼部分免疫球蛋白；或者，動物可能產生完全外來的免疫球蛋白，如完全人起源的免疫球蛋白，其中外源遺傳物質編碼完整免疫球蛋白。
可以由免疫后的轉基因動物產生多克隆抗血清。可以由動物獲得免疫球蛋白生成細胞來產生感興趣的免疫球蛋白。優選由轉基因動物產生單克隆抗體，如融合來自該動物的脾細胞與骨髓瘤細胞，并篩選產生的雜交瘤以選擇產生期望抗體的雜交瘤。本文描述了用于這些過程的適用技術。
在另一種方法中，可以以這樣一種方式將遺傳物質摻入動物，使得在體液中產生期望抗體，諸如血清或動物的外部分泌物，諸如乳汁、初乳、或唾液。例如，在體外將編碼至少部分的人免疫球蛋白的遺傳物質插入編碼乳蛋白的哺乳動物基因，然后通過如注射將該基因導入哺乳動物受精卵，由此卵可能發育成產生乳汁的成年雌性哺乳動物，乳汁中包含至少部分由插入的人免疫球蛋白遺傳物質衍生的免疫球蛋白。然后可以由乳汁收獲期望抗體。本領域技術人員知道用于進行這些過程的適用技術。
通常采用上述轉基因動物來產生單一同種型的人抗體，更具體的說是B細胞成熟必需的同種型，諸如IgM，可能還有IgD。用于產生人抗VEGF抗體的另一種優選方法是使用美國專利號5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、和5,770,429(本文收入作為參考)中描述的技術，其中轉基因動物據描述能夠由B細胞發育需要的同種型轉變成其它同種型。
在B淋巴細胞的發育過程中，細胞最初產生IgM，其結合特異性由有效重排的VH和VL區決定。隨后，每個B細胞及其后代合成具有相同L和H鏈V區的抗體，但是它們可能轉變H鏈的同種型。μ或δ恒定區的使用很大程度上是通過改變剪接決定的，使得IgM和IgD在單個細胞中共表達。其它重鏈同種型(γ、α、和ε)只在基因重排事件刪除了Cμ和Cδ外顯子后天然表達。這一基因重排過程，稱為同種型轉變，通常通過位于緊鄰每個重鏈基因(除了δ)上游的所謂轉變片段之間的重組而發生。各個轉變片段的長度為2-10kb，主要包含短重復序列。
由于這些原因，優選轉基因在用來進行同種型轉變的每個轉變區上游大約1-2kb內摻入轉錄調控序列。這些轉錄調控序列優選包括啟動子和增強子元件，更優選包括與轉變區天然相連(即存在于種系結構中)的5’側翼(即上游)區。雖然來自一個轉變區的5’側翼區可以可操作連接用于轉基因構建的不同轉變區，但是在一些實施方案中，優選轉基因構建物中摻入的每個轉變區具有在天然種系結構中緊接著上游的5’側翼區。涉及免疫球蛋白轉變區序列的序列信息是知道的(Mills等人，1990；Sideras等人，1989；本文收入作為參考)。
在美國專利號5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、和5,770,429描述的方法中，轉基因動物所含的人免疫球蛋白轉基因在B細胞發育的整個途徑中正確發揮功能，導致同種型轉變。因此，在這種方法中，構建這些轉基因來產生同種型轉變和下列一項或多項(1)高水平和細胞類型特異性表達，(2)功能性基因重排，(3)等位基因排斥的應答和激活，(4)足夠大的初級庫的表達，(5)信號轉導，(6)體細胞超突變，和(7)免疫應答過程中轉基因抗體基因座的控制。
對轉基因功能的重要要求是產生的初級抗體庫的多樣性足以觸發針對廣泛抗原的再次免疫應答。重排的重鏈基因包含信號肽外顯子、可變區外顯子、和一列串聯的多結構域恒定區(其中的每一個都由幾個外顯子編碼)。每個恒定區基因編碼不同種類免疫球蛋白的恒定部分。在B細胞發育過程中，刪除了V區近端恒定區，導致重鏈新種類的表達。對于每種重鏈，RNA剪接的不同模式產生跨膜的和分泌的免疫球蛋白二者。
人重鏈基因座包含大約200個V基因片段，跨越2Mb；大約30個D基因片段，跨越大約40kb；6個J片段，群集于大約3kb內；和9個恒定區基因片段，跨越大約300kb。整個基因座在14號染色體長臂遠端部分跨越大約2.5Mb。包含所有6種已知VH家族成員，D和J基因片段，以及μ、δ、γ3、γ1、和α1恒定區的重鏈轉基因片段是知道的(Berman等人，1988；本文收入作為參考)。相似構建了包含所有來自人輕鏈基因座的必需基因片段和調控序列的基因組片段。
成功重排的免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉基因的表達常常通過在轉基因非人動物中抑制內源免疫球蛋白基因的重排而具有顯性效果。然而，在某些實施方案中，期望達到內源Ig基因座的完全滅活，使得不能通過例如轉基因與內源Ig序列之間的轉變而形成包含人可變區和非人(如鼠)恒定區的雜合免疫球蛋白鏈。使用胚胎干細胞技術和同源重組，可以容易的消除內源免疫球蛋白庫。例外，可以使用多種技術(諸如反義技術)來實現內源Ig基因的抑制。
在本發明的其它方面，可能期望產生反式轉變的(trans-switched)免疫球蛋白。包含這些嵌合的反式轉變的免疫球蛋白的抗體可用于期望具有非人(如鼠)恒定區的多種應用，如用于在宿主中保留效應物功能。鼠恒定區的存在相對于人恒定區能夠提供優勢，例如提供鼠效應物功能(如ADCC、鼠補體固定)，從而能夠在小鼠疾病模型中檢驗嵌合抗體。在動物檢驗后，可以通過如由來源(雜交瘤克隆)進行PCRTM擴增或cDNA克隆來分離人可變區編碼序列，并剪接成編碼期望的人恒定區的序列，編碼更適用于人治療性用途的序列抗體。
B9.人化抗體人抗體用于人的治療通常具有至少3個潛在優勢。第一，因為效應物部分是人的，所以它與人免疫系統其它部分的相互作用可能更好，如通過依賴補體的細胞毒性(CDC)或依賴抗體的細胞的細胞毒性(ADCC)更有效的破壞靶細胞。第二，人免疫系統不會將抗體識別成外來物質。第三，人體循環中的半衰期將與天然產生的人抗體相似，使得所需劑量較小，給藥頻率較低。
本文提供了用于制備人抗VEGF抗體的多種方法。除了人抗體，“人化”抗體也具有許多優勢。“人化”抗體通常是來自小鼠、大鼠、倉鼠、兔、或其它物種并包含人恒定區和/或可變區結構域或特定變化的嵌合或突變單克隆抗體。本領域技術人員眾所周知用于產生所謂的“人化”抗VEGF抗體的技術。
人化抗體也享有上述優勢。第一，效應物部分仍是人的。第二，人免疫系統不會將框架或恒定區識別成外來的，因此針對這種注射抗體的抗體應答應當比針對完全外來的小鼠抗體的低。第三，與注射的小鼠抗體相反，注射的人化抗體的半衰期與天然產生的人抗體大概更相似，也使得所需劑量較小且頻率較低。
已經描述了用于產生人化抗體的大量方法。可以利用通過二硫鍵結合在一起的抗體結構域的受控重排，形成新的人造蛋白質分子或“嵌合”抗體(Konieczny等人，1981；本文收入作為參考)。重組DNA技術也可以用于構建編碼小鼠抗體輕鏈和重鏈可變結構域與人抗體輕鏈和重鏈恒定結構域的DNA序列之間的融和基因(Morrison等人，1984；本文收入作為參考)。
可以通過分子方法將編碼鼠單克隆抗體抗原結合部分或互補決定區(CDR)的DNA序列移植到編碼人抗體重鏈和輕鏈框架的DNA序列中(Riechmann等人，1988)。表達的重組產物稱為“重塑(reshaped)”或人化抗體，其包含人抗體輕鏈和重鏈的框架和鼠單克隆抗體的抗原識別部分CDR。
美國專利號5,639,641描述了用于產生人化抗體的另一種方法，本文收入作為參考。這種方法經重新鋪面(resurfacing)提供了因可變區展現人表面而具有改進的治療功效的人化嚙齒類抗體。在這種方法中(1)產生抗體重鏈和輕鏈可變區群的位置比對，給出一組重鏈和輕鏈可變區框架表面暴露位置，其中所有可變區的比對位置至少大約98％是相同的；(2)對嚙齒類抗體(或其片段)確定一組重鏈和輕鏈可變區框架表面暴露的氨基酸殘基；(3)鑒定與一組嚙齒類表面暴露的氨基酸殘基最近似相同的一組重鏈和輕鏈可變區框架表面暴露的氨基酸殘基；(4)用步驟(3)中鑒定的重鏈和輕鏈可變區框架表面暴露的氨基酸殘基組替代步驟(2)中確定的重鏈和輕鏈可變區框架表面暴露的氨基酸殘基組，不作改變的是距嚙齒類抗體互補決定區的任何殘基的任何原子5以內的那些氨基酸殘基；和(5)產生具有結合特異性的人化嚙齒類抗體。
美國專利號5,693,762、5,693,761、5,585,089、和5,530,101描述了用于產生人化抗體的類似方法，本文收入作為參考。這些方法涉及產生具有一個或多個互補決定區(CDR)和來自免疫球蛋白供者的可能的額外氨基酸和來自人免疫球蛋白受者的框架區的人化免疫球蛋白。每一條人化免疫球蛋白鏈除了CDR之外，通常還包含來自能夠與該CDR相互作用而影響結合親和力的免疫球蛋白供者框架的氨基酸，諸如與免疫球蛋白供者內CDR緊鄰或者據分子模擬預測相距大約3以內的一個或多個氨基酸。重鏈和輕鏈都可以通過使用美國專利號5,693,762、5,693,761、5,585,089、和5,530,101描述的多種位置標準中的任一項、任意組合、或所有標準來進行設計，本文收入作為參考。當組合形成完整抗體時，人化免疫球蛋白在人中基本上沒有免疫原性，并基本上保留與免疫球蛋白供者相同的針對最初抗原的親和力。
美國專利號5,565,332和5,733,743描述了用于產生人化抗體的另一種方法，本文收入作為參考。這種方法將人化抗體的概念與也在本文詳細描述的噬菌粒文庫結合起來。一般地說，這種方法利用來自針對感興趣抗原的抗體或抗體群的抗原結合位點的序列。由此，對于單一的嚙齒類抗體，可以將包含抗體中部分抗原結合位點的序列與能夠在組合時產生完整抗原結合位點的人抗體序列多樣性文庫聯合起來。
由這一方法產生的抗原結合位點與由PCR移植產生的不同，只有原始嚙齒類抗體的部分序列有可能以相似方式接觸抗原。選擇的人序列有可能在序列和與抗原的接觸方面與最初的結合位點不同。然而，由部分原始序列與抗原的結合和抗原及其抗原結合位點的形狀造成的約束，有可能驅動人序列與抗原相同區域或表位的新接觸。這一過程因此稱為“表位蓋印選擇”(epitope imprinted selection，EIS)。
由動物抗體開始，一種方法可以選擇出對部分人源抗體。這些抗體可能與人抗體在序列方面足夠相似，可直接或在改變少數關鍵殘基后用于治療。可以通過各個殘基的定點誘變或通過整個環的CDR移植來取代那些與人序列殘基不同的殘基，從而將選定抗體的嚙齒類成分與人序列之間的序列差異降至最低。然而，也可以產生完全為人序列的抗體。EIS由此提供了用于產生結合的表位與動物或部分人源抗體相同的部分人源或完全人源抗體的方法。在EIS中，可以將抗體片段庫展示在絲狀噬菌體表面，并通過噬菌體與抗原的結合來選擇具有抗原結合活性的片段的編碼基因。
美國專利號5,750,078、5,502,167、5,705,154、5,770,403、5,698,417、5,693,493、5,558,864、4,935,496、和4,816,567描述了在本發明中試圖用于人化抗體的其它方法，本文收入作為參考。認為WO 98/45331和WO 98/45332特別具有指導意義，本文收入作為參考，通過應用于抗VEGF抗體進一步例示人化原理。
B10.經PCRTM的誘變定點誘變是一種有用的技術，可通過其DNA的特異性誘變而用于制備各種抗體。通過將一個或多個核苷酸序列變化導入DNA，本技術還能夠容易的用于制備并檢驗體現了一個或多個上述考慮的序列變體。
雖然有許多方法適用于誘變，但是目前通常優選使用聚合酶鏈反應(PCRTM)。此技術提供了快速、有效的將期望突變導入給定DNA序列中的方法。下文具體描述了如何使用PCRTM將點突變導入序列中，這可以用于改變由給定序列編碼的氨基酸。此方法經改動也適于將限制性酶位點導入DNA分子。
在此方法中，可將合成的寡核苷酸設計成能在擴增片段的一端摻入點突變。PCRTM之后，通過用Klenow片段處理使擴增片段成為平端，然后連接平端片段并亞克隆至載體中以便于序列分析。
為了制備期望誘變的模板DNA，可使用待突變區側翼的限制性位點將DNA亞克隆至高拷貝數的載體，如pUC19中。然后使用質粒微量制備法制備模板DNA。使用自動合成儀合成適當的寡核苷酸引物，該引物基于親本序列，但含有期望的點突變，其5’端側翼是限制性酶位點。通常要求引物與模板DNA有大約15個堿基是同源的。可通過變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化引物，但用于PCRTM中時，并不絕對需要這么做。然后，應使寡核苷酸的5’末端磷酸化。
應使用含有期望點突變的寡核苷酸引物，通過PCRTM擴增模板DNA。擴增緩沖液中的MgCl2濃度通常為大約15mM。通常應如下進行大約20-25輪PCRTM循環95℃變性35秒；50℃雜交2分鐘；72℃延伸2分鐘。PCRTM通常包括于72℃最后一次延伸循環約10分鐘。在最后的延伸步驟之后，應在反應混合物中加入約5個單位的Klenow片段，于約30℃再保溫15分鐘。需要有Klenow片段的外切核酸酶活性，以使末端成為平端并適于平端克隆。
通常通過非變性的瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳分析得到的反應混合物，以證實擴增已產生預定的產物。通過除去大多數礦物油，用氯仿抽提以除去殘留的油，用經緩沖的酚抽提，然后用100％乙醇沉淀濃縮來處理反應混合物。接著，用能夠切割寡核苷酸側翼序列的限制性酶消化大約一半的擴增片段。在低融點瓊脂糖凝膠上純化經消化的片段。
為了亞克隆片段和檢查點突變，可通過平端連接將兩種擴增片段亞克隆至經適當消化的載體中。然后用于轉化大腸桿菌，隨后使用微量制備法從中制備質粒DNA。通過DNA測序分析質粒DNA中的擴增部分以確認產生了正確的點突變。這一點至關重要，因為Taq DNA聚合酶能夠將額外的突變導入DNA片段。
使用連續的PCRTM步驟也可實現點突變的導入。在此程序中，使包含突變的兩種片段互相退火，并通過相互引發的合成而延伸。然后通過第二個PCRTM步驟擴增此片段，從而避免上述方案中需要的平端連接。在此方法中，如上所述進行模板DNA的制備、寡核苷酸引物的產生、和第一次PCRTM擴增。然而，在此方法中，選定的寡核苷酸與模板DNA應有大約15-大約20個堿基的一段序列是同源的，它們互相之間還必須重疊大約10個堿基或更多。
在第二次PCRTM擴增中，可使用各個擴增片段和各個側翼序列引物，并使用上述條件進行大約20-25輪PCRTM循環。可使用上述步驟再次亞克隆片段并檢查點突變是否正確。
在使用上述任一方法時，通常優選通過擴增盡可能小的片段來導入突變。當然，也應仔細考慮如寡核苷酸的解鏈溫度這樣的參數，該參數通常受寡核苷酸的GC含量和長度的影響。本領域技術人員眾所周知這些方法的實施及其優化(必要時)，多種出版物進一步描述了有關內容，如《分子生物學現行方案》(Current Protocol in MolecularBiology)(1995，本文收入作為參考)。
當進行定點誘變時，可以采用表A作為參考。
表A氨基酸 密碼子丙氨酸Ala A GCA GCC GCG GCU半胱氨酸 Cys C UGC UGU天冬氨酸 Asp D GAC GAU谷氨酸Glu E GAA GAG苯丙氨酸 Phe F UUC UUU甘氨酸Gly G GGA GGC GGG GGU組氨酸His H CAC CAU異亮氨酸 Ile I AUA AUC AUU賴氨酸Lys K AAA AAG亮氨酸Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU甲硫氨酸 Met M AUG天冬酰胺 Asn N AAC AAU脯氨酸Pro P CCA CCC CCG CCU谷氨酰胺 Gln Q CAA CAG精氨酸Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU絲氨酸Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU蘇氨酸Thr T ACA ACC ACG ACU纈氨酸Val V GUA GUC GUG GUU色氨酸Trp W UGG酪氨酸Tyr Y UAC UAUB11.抗體片段和衍生物不管最初的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體的來源是什么，完整的抗體、抗體多聚體、或抗體多種功能性抗原結合區之任一種都可用于本發明。例示性功能區包括抗VEGF抗體的diabody、線性抗體、和scFv、Fv、Fab’、Fab、F(ab’)2片段。本領域技術人員眾所周知用于制備這些構建物的技術，本文進一步例示。
抗體構建物的選擇可能受到多種因素的影響。例如，腎內完整抗體的積極再吸附能夠延長半衰期，這是免疫球蛋白Fc片段的特性。由此預計基于IgG的抗體展示的血液清除率比其Fab’對應物低。然而，基于Fab’的組合物通常展示更好的組織滲透能力。
可以由完整免疫球蛋白經非特異性硫醇蛋白酶木瓜蛋白酶進行蛋白水解獲得抗體片段。木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為“Fab片段”，每個片段含有一個抗原結合位點；和一個殘余的“Fc片段”。
首先必需用半胱氨酸、2-巰基乙醇、或二硫蘇糖醇還原活性位點中的巰基而激活木瓜蛋白酶。應當用EDTA(2mM)的螯合作用除去酶原液中的重金屬，以確保最大酶活性。通常以1∶100的重量比混和酶和底物。溫育后，可以通過碘乙酰胺對巰基的不可逆烷化或僅通過透析來終止反應。應當通過SDS-PAGE來監控消化是否完全，并通過蛋白A-Sepharose或離子交換層析來分離各種片段。
用于由兔和人來源的IgG制備F(ab’)2片段的常用程序包括用胃蛋白酶進行有限的蛋白水解。反應條件是，100倍(w/w)抗體過量，在pH4.5的醋酸鹽緩沖液中，37℃，這說明抗體是在重鏈間二硫鍵的C端被切割。小鼠IgG的消化速率隨亞類而變化，選擇的條件應當避免顯著的完全降解IgG。具體而言，IgG2b易被完全降解。其它亞類要求不同的溫育條件以產生最佳結果，這些本領域都是知道的。
胃蛋白酶對完整抗體的處理產生具有兩個抗原結合位點、仍能夠交聯抗原的F(ab’)2片段。用胃蛋白酶消化大鼠IgG要求的條件包括在0.1M醋酸鹽緩沖液(pH4.5)中透析，然后與1％(w/w)胃蛋白酶溫育4小時；如果首先在0.1M甲酸鹽緩沖液(pH2.8)中于4℃透析16小時，然后換成醋酸鹽緩沖液，則可以改進IgG1和IgG2a的消化。將IgG2b在含葡萄球菌V8蛋白酶(3％w/w)的0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.8)中于37℃溫育4小時，將給出更一致的結果。
Fab片段也包含輕鏈的恒定結構域和重鏈的第一個恒定結構域(CH1)。Fab’片段與Fab片段不同，前者在重鏈CH1結構域的羧基末端多幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。F(ab’)2抗體片段最初以成對的Fab’片段產生，相互之間有鉸鏈半胱氨酸。還知道抗體片段的其它化學偶聯。
“Fv”片段是包含完整的抗原識別和結合位點的最小抗體片段。該區包含一個重鏈可變區與一個輕鏈可變區緊密共價相連的二聚體。正是在這個構象中，每個可變結構域的3個高變區相互作用，在VH-VL二聚體表面形成抗原結合位點。總而言之，6個高變區賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使是單一可變結構域(或只包含3個具有抗原特異性的高變區的半個Fv)也能夠識別并結合抗原，只是親和力比完整結合位點低。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結構域，這些結構域存在于一條多肽鏈中。通常，Fv多肽在VH與VL結構域之間還包含多肽接頭，使得scFv能夠形成結合抗原的所需結構。
為了進一步補充關于抗VEGF抗體功能性抗原結合區(包括scFv、Fv、Fab’、Fab、和F(ab’)2片段)的制備及使用的教授，本文特別收入下列專利和專利申請作為參考美國專利5,855,866；5,965,132；6,051,230；6,004,555；和5,877,289；和1998年10月20日交納頒證費的美國申請流水號08/482,369。為了進一步描述并傳授抗體可變區、高變區、和互補決定區(CDR)的制備，本文還收入WO 98/45331作為參考。
“diabody”是包含兩個抗原結合位點的小抗體片段，各片段包含在同一多肽鏈(VH-VL)中相連的重鏈可變結構域(VH)與輕鏈可變結構域(VL)。通過在同一條鏈上兩個結構域之間使用短得不能配對的接頭，使得結構域與另一條鏈上的互補結構域配對，并產生兩個抗原結合位點。EP 404,097和WO 93/11161(本文特別收入作為參考)描述了diabody。如Zapata等人(1995，本文收入作為參考)所述，抑或雙特異性抑或單一特異性的“線性抗體”，包含一對串連的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，形成一對抗原結合區。
在使用伴隨組織滲透優勢的抗體Fab’或抗原結合片段時，可以通過修飾片段而衍生得到額外優勢，即延長半衰期。可以采用多種技術，諸如對抗體分子自身的操作或修飾，以及與惰性載體的綴合。對于僅僅為了延長半衰期而非為了靶向投遞試劑而進行的綴合，應當小心選擇Fab’和其它片段以滲透組織。盡管如此，已經嘗試了與非蛋白質聚合物的綴合，諸如PEG等等。
因此，除綴合以外的其它修飾是基于修飾抗體片段的結構從而使其更穩定和/或降低體內代謝速率。用于這些修飾的一種機制是使用D-氨基酸來取代L-氨基酸。本領域普通技術人員將理解，導入這些修飾后需要對產生的分子進行嚴格的檢驗以確保它仍然保留了期望的生物學特性。其它穩定修飾包括在N末端或C末端之一或二者添加通常用于延長生物學分子半衰期的穩定部分。作為范例，可以通過酰化或胺化來修飾末端。
用于本發明的適度綴合型修飾包括在抗體片段中摻入挽救型(salvage)受體結合表位。用于實現該目的的技術包括抗體片段適當區域的突變或將表位作為肽標簽附著于抗體片段由此摻入表位。為了進一步例示這些技術，本文特別收入WO 96/32487作為參考。挽救型受體結合表位通常是由Fc結構域的一個或兩個環轉移至抗體片段上類似位置的3個或更多氨基酸的區域。為了用于本發明，本文收入WO98/45331的挽救型受體結合表位作為參考。
B12.結合和功能測定法本發明不但在動物和人的治療方案中具有顯著效用，而且它還具有許多其它實踐用途，包括許多體外應用。某些應用涉及抗體或免疫綴合物的特異性結合特性。由于本發明的所有化合物都包含至少一種抗體成分，因此事實上它們可用于使用原始抗體的所有結合方案。
盡管相關時存在的附著試劑提供了有益特性，但是不否定第一種抗體區域在任何結合測定法中的效用。因此，適用的結合測定法包括常常被本領域所采用的方法，諸如免疫印漬、Western印漬、點印漬、RIA、ELISA、免疫組織化學、熒光激活細胞分揀術(FACS)、免疫沉淀、親和層析、等等，本文進一步描述。
某些標準結合測定法將抗原固定在固體支持物基質上，如硝酸纖維素、尼龍、或其組合，諸如免疫印漬、Western印漬、和相關測定法。其它重要的測定法是ELISA。所有這些測定法可以容易的改動用于檢測VEGF，如可以應用于血管發生性疾病的診斷。本發明的試劑還可在免疫組織化學中與新鮮冷凍的和福爾馬林固定、石蠟包埋的組織塊相結合使用；用于熒光激活的細胞分揀術、流式細胞計、或流式顯微熒光測定法；用于免疫沉淀；用于抗原純化實施方案，諸如親和層析，甚至在雙特異性抗體的情況中包括一步同時快速純化一種或多種抗原；和用于本領域技術人員根據本文提供的信息將了解的其它結合測定法。
本發明的其它實用性用途是在功能測定法中作為對照，包括許多體外和離體(exvivo)測定法和系統，以及動物模型研究。由于本發明抗體的結合和功能特性特別有特異性，即它們抑制VEGF結合VEGFR2(而非VEGFR1)以及經其發出的信號，因此這種“對照”用途事實上極有價值。受益于本發明的這種實用性用途的測定法包括例如關注VEGF介導的內皮細胞生長、VEGF誘導的磷酸化、和VEGF誘導的血管通透性的測定法，以及新血管形成的角膜微囊測定法和雞尿囊絨毛膜測定法(CAM)。這些測定系統還可以發展成體外或離體藥物篩選測定法，其中本發明提供的具有詳細描述特性的生物學物質特別重要。C.免疫綴合物本發明不但提供了非常有效的裸露的或未綴合的抗體用于抗血管發生方法，還提供了基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的免疫綴合物、免疫毒素、和凝血配體。目前優選用于基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療性綴合物的試劑是放療劑(由本文公開的放射性診斷劑例示)、抗血管發生試劑、誘導凋亡試劑、抗微管蛋白藥物、抗細胞或細胞毒性試劑、和凝血劑(凝血因子)。
為了產生免疫綴合物、免疫毒素、和凝血配體，可以采用重組表達來產生融合蛋白質，正如本領域技術人員知道的和本文進一步公開的。同樣的，可以使用抗生物素蛋白生物素橋或為抗體綴合物而開發的任何化學綴合和交聯劑技術來產生免疫綴合物、免疫毒素、和凝血配體。
C1.毒性劑和抗細胞的試劑對于某些應用，治療劑是毒害細胞的試劑或藥理學試劑，特別是毒害細胞、抑制細胞、或者能夠殺死細胞或抑制內皮細胞生長或分裂的其它抗細胞試劑。通常，本發明的這些方面涵蓋能夠與阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3樣抗體綴合并以活性形式投遞至靶內皮的任何藥理學試劑的應用。
抗細胞試劑的范例包括化療劑，以及細胞毒素。可以使用的化療劑包括激素，諸如類固醇；抗代謝物，諸如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氨甲喋呤、或氨基喋呤；蒽環霉素；絲裂霉素C；長春花生物堿；地美可辛(demecolcine)；依托泊甙(etoposide)；光輝霉素；抗腫瘤烷化試劑，諸如苯丁酸氮芥或苯丙氨酸氮芥。其它實施方案可以包括諸如細胞因子等試劑。基本上可以使用任何抗細胞試劑，條件是它能夠以某種方式成功的綴合或連接抗體從而能夠對靶向的內皮細胞位點血液成分進行靶向、內化、釋放、和/或展現。
可能會有這樣的情況，比如靶抗原沒有通過與有毒化合物的有效去毒一致的途徑發生內在化，需要靶向化療劑，諸如抗腫瘤藥物、細胞因子、抗代謝物、烷化劑、激素、等等。目前多種化療劑和其它藥理學試劑已經成功的綴合于抗體，并顯示藥學功能，包括羥基紅比霉素(doxorubicin)、道諾霉素、氨甲喋呤、長春花堿、新抑癌蛋白(neocarzinostatin)、大分子霉素、三亞胺醌、和α-鵝膏菌素。
在其它情況中，可以通過使用DNA合成抑制劑來消除來自基于細胞毒素療法的任何潛在副作用，諸如道諾霉素、羥基紅比霉素(doxorubicin)、阿霉素、等等。因此這些試劑是用于本發明的抗細胞試劑的優選范例。
至于抑制細胞的試劑，這些化合物通常擾亂靶細胞的正常細胞周期，優選使得細胞退出細胞周期。
已知多種細胞毒性劑可以綴合于基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體。范例包括大量有用的植物、真菌、或細菌衍生毒素，作為范例，只說出其中的一些，包括各種A鏈毒素，特別是蓖麻毒蛋白A鏈；核糖體滅活蛋白，諸如皂草素或gelonin；α-帚曲菌素；曲霉素；局限曲霉菌素；核糖核酸酶，諸如胎盤核糖核酸酶；白喉毒素；和假單胞菌外毒素。
在毒素中，優選蓖麻毒蛋白A鏈。最優選用于本文的毒素部分是經處理而修飾或除去碳水化合物殘基的蓖麻毒蛋白A鏈，即所謂的脫糖基A鏈(dgA)。脫糖基蓖麻毒蛋白A鏈是優選的，因為它極有效、半衰期較長，而且進行臨床等級和規模的制備在經濟上是可行的。
從制藥學的立場出發，可能希望采用盡可能小的分子而又提供適當的生物學應答。由此可能希望采用提供適當的抗細胞應答的較小A鏈肽。為了這個目標，已經發現蓖麻毒蛋白A鏈可以通過Nagarase(Sigama)除去30個N末端氨基酸而“截短”，但仍保留適當的毒素活性。建議需要時可以將這種截短的A鏈用于本發明的綴合物。
或者，可發現對毒素A鏈部分應用重組DNA技術可以提供本發明的額外好處。實現了有生物學活性的蓖麻毒蛋白A鏈的克隆和表達后，現在有可能鑒定并制備仍展示適當毒素活性的更小的肽或變體肽。此外，蓖麻毒蛋白A鏈已被克隆的事實使得能夠應用定點誘變，由此容易的制備并篩選A鏈衍生肽，獲得可用于本發明的其它有用部分。
C2.凝血因子本發明的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體可以連接能夠直接或間接刺激凝血的成分，從而形成凝血配體。在這里，抗體可以直接連接凝血劑或凝血因子，或者可以連接可結合而后釋放凝血劑或凝血因子的第二種結合區。如本文所用，術語“凝血劑”和“凝血因子”都用于指在適當條件下，優選當到達特定體內環境(諸如腫瘤血管結構)時，能夠直接或間接刺激凝血的成分。
優選的凝血因子是組織因子組合物，諸如截短的TF(tTF)、二聚體、多聚體、和突變TF分子。“截短的TF”(tTF)指通過除去足夠多的影響膜結合特性的氨基酸序列從而變成膜結合缺陷的TF構建物。文章中的“足夠量”指最初足以使TF分子進入膜或介導TF蛋白質功能性膜結合的跨膜氨基酸序列的量。通過除去“足夠量的跨膜序列”而產生的截短的組織因子蛋白質或多肽，結合磷脂膜的能力是缺陷的，使得蛋白質基本上不結合磷脂膜，而基本上可溶。因此，截短的TF在標準TF測定法中基本上不能夠將因子VII轉變成因子VIIa，但是仍然保留所謂的催化活性，包括在存在因子VIIa時激活因子X。
美國專利5,504,067(本文特別收入作為參考)進一步描述了這些截短的組織因子蛋白質。優選用于本發明這些方面的組織因子通常不含該蛋白質的跨膜和胞質區(第220-263位氨基酸)。但是，也不需要將截短的TF分子限制于長度恰好是219個氨基酸的分子。
二聚體的組織因子組合物也是有用的。可以以二聚體的形式制備任何截短的、突變的、或其它組織因子構建物以用于本發明。本領域普通技術人員可以理解，通過分子生物學和重組表達的標準技術，在同一讀碼框中制備兩個編碼區并由表達載體進行表達，由此可以制備這些TF二聚體。同樣，可以將各種化學綴合技術用于制備TF二聚體。可以在綴合前衍生個別TF單體。本領域技術人員清楚的知道所有這些技術。
如果需要，可以經生物學可釋放鍵連接組織因子二聚體或多聚體，諸如可選擇性切割的接頭或氨基酸序列。例如，可使用包含酶的可切割位點的肽接頭，所述酶優先定位于腫瘤環境或在腫瘤環境內有活性。這些肽接頭的例示性形式是供尿激酶、纖溶酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa、或金屬蛋白酶(諸如膠原酶、明膠酶、或溶基質素)切割的肽接頭。
在某些實施方案中，組織因子二聚體還可以包含受阻的疏水性膜插入部分，以便在后面促進組織因子與磷脂酶的功能性聯合，但是這只發生于某些特定條件下。正如關于截短的組織因子的內容中所述，疏水性膜聯合序列通常是由于其疏水本質可驅動與磷脂環境的聯合的氨基酸段。同樣，脂肪酸可以用于提供潛在的膜插入部分。
這些膜插入序列可以位于TF分子的N末端或C末端，或者通常附著于該分子的任何其它位點，只要它們的附著不阻礙TF構建物的功能特性即可。受阻插入部分的意圖是在TF構建物定位于腫瘤環境前保持無功能，并使得疏水性附著物能夠接近并進一步驅動與膜的物理學聯合。此外，預計生物學可釋放鍵和可選擇性切割序列在這方面特別有用，其中所述鍵或序列只在定位于腫瘤環境內并暴露于特定酶或其它生物活性分子時才受到切割或修飾。
在其它實施方案中，tTF構建物可以是多聚體。在此內容中，“多聚體構建物”包含3個或更多組織因子構建物。“多聚體TF構建物”指包含第一TF分子或衍生物可操作附著至少第二個和第三個TF分子或衍生物的構建物。多聚體可以包含大約3個-大約20個TF分子。多聚體中的各TF單元也可以通過可選擇性切割肽接頭或其它生物學可釋放鍵相連。此外，正如上文就TF二聚體所述，可以使用重組操作和表達或使用標準合成化學來生成構建物。
可用于本發明的其它TF構建物是激活因子VII的能力缺陷的突變體。本文通常將這些“因子VII激活突變體”定義為可結合功能性因子VII/VIIa，通過蛋白水解激活因子X，但是基本上不能通過蛋白水解激活因子VII的TF突變體。因此，這些構建物是缺乏因子VII激活活性的TF突變體。
這些因子VII激活突變體啟動腫瘤特異性凝血的能力基于它們對腫瘤血管結構的特異性投遞和血漿中存在的低水平因子VIIa。在施用了這些因子VII激活突變體綴合物后，突變體將定位于血管化腫瘤的血管結構內。在定位前，由于TF突變體不能將因子VII轉變成因子VIIa，因此它通常不能夠在任何其它身體部位啟動凝血。但是，在定位于腫瘤區并積累后，突變體將遭遇來自血漿的足夠因子VIIa，從而起始外在凝血途徑，導致腫瘤特異性血栓癥。也可以對患者施用外源因子VIIa。
可以制備多種組織因子VII激活突變體并用于本發明。現在有了關于TF上因子VII/VIIa識別位點的充足知識。由此可以理解，因子VII結合區通常位于TF分子的大約第157位-大約第167位氨基酸之間。但是，預計該區域外的殘基也與因子VII激活活性有關，由此可考慮在TF序列大約第106位-大約第209位氨基酸之間的一個或多個殘基處導入突變(WO 94/07515；WO 94/28017；本文收入作為參考)。
多種其它凝血因子可以用于本發明，例示性試劑見下文。凝血酶、因子V/Va及其衍生物、因子VIII/VIIIa及其衍生物、因子IX/IXa及其衍生物、因子X/Xa及其衍生物、因子XI/XIa及其衍生物、因子XII/XIIa及其衍生物、因子XIII/XIIIa及其衍生物、因子X激活劑、和因子V激活劑可用于本發明。
Russell蝰蛇毒因子X激活劑預計可用于本發明。已生成了對Russell蝰蛇毒液中存在的因子X激活劑具有特異性的單克隆抗體，并可作為雙特異性結合配體的一部分用于特異性投遞試劑。
血栓烷A是由內過氧化物通過血小板微粒體中的環加氧酶和血栓烷合成酶的連續反應形成的。血栓烷A2是由血小板產生的，而且由于其能夠引起血小板聚集還是有效的血管收縮劑。血栓烷A2及其活性類似物預計可用于本發明。
血栓烷合酶和合成激活血小板的前列腺素的其它酶也可在本文中作為“凝血劑”使用。針對血栓烷合酶的單克隆抗體和血栓烷合酶的免疫親和純化是已知的，人血栓烷合酶的cDNA也是已知的。
α2-抗纖溶酶或α2-纖溶酶抑制劑是人血漿中天然存在的蛋白酶抑制劑，能夠有效抑制由纖溶酶原激活劑誘導的纖維蛋白凝塊的裂解。α2-抗纖溶酶是特別有效的抑制劑，預計可用于本發明。
由于可以獲得α2-抗纖溶酶的cDNA序列，因此優選重組表達和/或融合蛋白質。還可以獲得針對α2-抗纖溶酶的單克隆抗體，可用于本發明的雙特異性結合配體實施方案。這些抗體可用于將外源α2-抗纖溶酶投遞至靶位點或儲存外源α2-抗纖溶酶，并使其在靶區內濃縮。
C3.抗微管蛋白藥物一系列藥物可經干擾微管蛋白活性來展現其效果。由于微管蛋白的功能是有絲分裂和細胞生存所必需的，所以某些“抗微管蛋白藥物”是強有力的化療劑。目前了解得更清楚也更優選用于本發明的抗微管蛋白藥物包括秋水仙素；taxanes，諸如紫杉醇；長春花生物堿，諸如長春花堿、長春花新堿、和長春堿酰胺；和combretastatin。其它合適的抗微管蛋白藥物是細胞松弛素(包括B、J、E)、dolastatin、auristatin PE、paclitaxel、ustiloxin D、根膽酸(rhizoxin)、1069C85、秋水仙胺、阿苯達唑(albendazole)、azatoxin、和諾考達唑(nocodazole)。
如美國專利5,892,069、5,504,074、和5,661,143(本文特別收入作為參考)中所述，combretastatin是通常抑制細胞有絲分裂的雌二醇衍生物。可用于本發明的例示性combretastatin包括基于combretastatin A、B、和/或D的combretastatin和美國專利5,892,069、5,504,074、和5,661,143中所述的combretastatin。combretastatin A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、B-1、B-2、B-3、和B-4是上述類型的范例。
美國專利5,569,786和5,409,953(本文收入作為參考)描述了combretastatin A-1、A-2、A-3、B-1、B-2、B-3、和B-4的分離、結構特征、和合成，以及使用這些combretastatin來治療腫瘤生長的配方和方法。這些combretastatin都可用于本發明。
如美國專利5,892,069、5,504,074、5,661,143、和4,996,237(本文特別收入作為參考)中所述，combretastatin A-4也可用于本文。美國專利5,561,122(本文收入作為參考)進一步描述了合適的combretastatin A-4藥物前體，預計可與本發明聯合使用。
美國專利4,940,726(本文特別收入作為參考)特別描述了命名為combretastatin D-1和combretastatin D-2、可與本發明的組合物和方法聯合使用的大環內酯。美國專利5,430,062(本文特別收入作為參考)涉及具有抗癌活性、可與本發明聯合使用的芪衍生物和combretastatin類似物。
C4.抗血管發生試劑本發明特別提供了聯合型抗血管發生劑。促血管生成素，與VEGF家族成員一樣，是血管內皮的特異性生長因子(Davis和Yancopoulos，1999；Holash等，1999；本文收入作為參考)。首先被描述的促血管生成素是天然存在的受體激活劑或激動劑--促血管生成素-1(Ang-1)，和天然存在的受體拮抗劑--促血管生成素-2(Ang-2)，二者都是通過內皮細胞酪氨酸激酶受體Tie2來發揮作用的。
兩種新的促血管生成素--促血管生成素-3(小鼠)和促血管生成素-4(人)也已經得到鑒定(Valenzuela等人，1999)。促血管生成素-3似乎作為拮抗劑(像Ang-2)發揮作用，而促血管生成素-4似乎作為激動劑(像Ang-1)發揮作用(Valenzuela等人，1999)。還由人的心臟克隆了稱為促血管生成素-3的蛋白質，而且據報導對內皮細胞沒有促有絲分裂的效果(Kim等人，1999)。
VEGF是血管發育早期所必需的，而促血管生成素-1是血管化晚期通常需要的。由此，VEGF促進內皮細胞分化、增殖、和原始血管形成。促血管生成素-1經Tie2受體促進成熟血管的維持和穩定。因此，促血管生成素-1是成熟或穩定因子，認為它通過促進內皮細胞與周圍支持細胞之間的相互作用將未成熟血管轉變成成熟血管(Holash等人，1999)。
已顯示促血管生成素-1可增加缺血組織中的血管形成(Shyu等人，1998)，且增加暴露于VEGF或一種形式的aFGF的血管網絡的存活(Papapetropoulos等人，1999)。這些作者還顯示，促血管生成素-1可防止HUVEC中由停止服用相同形式的aFGF而觸發的凋亡(Papapetropoulos等人，1999)。這些資料與促血管生成素-1對人內皮細胞的直接作用及其與其它血管發生性分子通過促進已分化內皮細胞的存活來穩定血管結構的相互作用是一致的。
由于促血管生成素-1傳達成熟和穩定信號，因此發明人已經仔細的設想了本發明中涉及促血管生成素-1靶向投遞的方面。發明人推理認為，因為促血管生成素-1是成熟因子，所以它將使得腫瘤血管不依賴生長因子。因此，本發明的一個方面涉及靶向腫瘤的促血管生成素-1的應用，從而鞏固靶血管的VEGF無應答特性。
推理認為，使用結合腫瘤的配體將促血管生成素-1投遞至腫瘤血管，能夠將大約500,000個促血管生成素-1分子投遞至血管腔。這將覆蓋Tie2受體系統，用促血管生成素-1配體使Tie2受體完全飽和。由此，促血管生成素-2不再能夠結合，從而促血管生成素-2與VEGF的聯合效果(見下文討論)將受到抑制。
使促血管生成素-1趨向腫瘤(優選腫瘤血管結構)的投遞，也可以與本文詳細公開的多種其它抗癌策略聯合使用，以實現聯合治療效果。腫瘤對誘導至少一些壞死的療法的典型應答是啟動血管再生。由于促血管生成素-1信號促使血管成熟，它們因而不能進行改造且不能補償由主要治療劑誘導的腫瘤塊損失。因此，這些觀察結果提供了促血管生成素投遞的另一個優選方面，即促血管生成素-1靶向與任何一種或多種抗癌試劑(包括傳統的化療藥物)的聯合使用。
促血管生成素-1在投遞后的作用從根本上說是防止血管改造。無論它是單獨使用還是聯合使用，促血管生成素-1靶向的價值因這種治療方法的固有安全性而獲得了顯著提高。促血管生成素-1療法沒有顯著的不利之處。甚至在一些靶向Ang-1錯誤指向非腫瘤組織這種不太可能的情況中，所有可能發生的后果也就是靶向區域內的血管結構將變得更穩定和/或靜止。在這點上，Ang-1也可以作為抗炎癥劑使用。
促血管生成素-2目前優選用于腫瘤靶向療法，特別是與本發明的VEGF抑制聯合使用。但是，由于促血管生成素-2在不同條件(特別是不同的VEGF水平)下的效果也不同，因此發明人再次仔細的設想了本發明中涉及促血管生成素-2靶向投遞的方面。
促血管生成素-2還是Tie2受體的配體，但是通常對抗由促血管生成素-1介導的血管成熟/穩定。因而它是促血管生成素-1的拮抗劑，且擾亂毛細血管結構。在適當條件下，促血管生成素-2向靶細胞傳達負信號，且由促血管生成素-2誘導的去穩定作用導致血管退化。這是試圖將促血管生成素-2投遞至腫瘤(優選腫瘤血管結構)的第一個特性。
預計通過使用阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(諸如2C3)而易于實現的簡單投遞足夠的促血管生成素-2，將掩蓋腫瘤環境中可能存在的所有其它信號并促進血管退化。由于天然環境中的促血管生成素之間存在精細控制的相互影響，因此通過不斷的促血管生成素-2信號傳導使系統極度傾向退化，可以徹底消除促血管生成素-1和VEGF的影響。
靶向腫瘤的促血管生成素-2的單獨使用因而可有利的用于誘導腫瘤血管退化，特別是作為治療性干預的早期機制。不過由促血管生成素-2誘導的去穩定作用通常可以導致血管退化或再生。當不存在其它血管發生性刺激(特別是VEGF)時，去穩定作用導致血管退化；而當存在高水平VEGF時，去穩定作用促進血管發生性應答(Holash等人，1999)。
應答促血管生成素-2而經歷去穩定的血管可以通過暴露于其它刺激而由退化獲得“挽救”。促血管生成素-2因而能夠在特定條件下使內皮細胞對其它血管發生性刺激產生應答并促進血管發生性應答。特別是VEGF能夠促進因Ang-2而去穩定的細胞進行增殖并形成新的原始血管(Asahara等人，1998；Holash等人，1999)。事實上，已經報導了促血管生成素-2在腫瘤組織中的表達(Tanaka等人，1999)，在此推定它與VEGF聯合作用，促進血管發生(Stratmann等人，1998)。由促血管生成素-2和VEGF啟動的新血管形成使得這些分子成為“共血管發生”(co-angiogenic)。
目前已經報導的經調整模型，解釋了促血管生成素-2對某些腫瘤類型中血管的正的和負的作用(Holash等人，1999)。在這種模型中，由促血管生成素-2誘導的去穩定作用最初通過由周圍宿主血管結構占有(coopting)腫瘤血管從而在腫瘤中引起顯著的血管退化。由腫瘤相關內皮細胞產生的高水平促血管生成素-2抵消顯然由低水平、組成性表達的促血管生成素-1提供的存活信號。促血管生成素-2由此使被占(coopted)血管進行凋亡性退化(Holash等人，1999)。但是，不管產生的腫瘤壞死，存活的腫瘤細胞上調VEGF以確保其存活。由于VEGF使來自促血管生成素-2的退化信號變得無效并實際上促進血管結構發育，于是VEGF與促血管生成素-2的一致表達在腫瘤周圍導致旺盛的血管發生(Holash等人，1999)。
雖然第一眼從表面上看是矛盾的，但是可以根據存在的其它信號，特別是VEGF，來預測并解釋促血管生成素-2的作用。當不存在另一種血管發生信號時，促血管生成素-2引起血管去穩定并變得不成熟，導致退化。當存在刺激，特別是VEGF時，由促血管生成素-2引起的去穩定確實導致血管發生，血管“被引發”接受第二種血管發生性刺激。由此認為，通過調控微血管內皮細胞中促血管生成素-2活性的自分泌環，至少部分實現了大量調控劑的血管發生效果(Mandriota和Pepper，1998)。
促血管生成素-2的雙重生物學作用促使發明人發展能夠利用腫瘤環境中其它信號(特別是VEGF)的其它治療性策略。由于促血管生成素-2與VEGF協同刺激血管發生，因此本發明的優選方面是聯合投遞靶向腫瘤的促血管生成素-2與現有的VEGF抑制性抗體。這將確保促血管生成素-2起到退化作用而非血管發生作用。
根據上述解釋，可以理解本發明提供了可操作附著或功能性連接促血管生成素-1、促血管生成素-2、促血管生成素-3、和/或促血管生成素-4之任一種或多種的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(諸如2C3)。例示性的促血管生成素-1組合物顯示于SEQ ID NO1(DNA)和SEQ ID NO2(蛋白質)，而促血管生成素-2組合物例示于SEQ ID NO3(DNA)和SEQ ID NO4(蛋白質)。作為拮抗劑，促血管生成素-3通常如促血管生成素-2一樣使用；而激動劑促血管生成素-4可以以促血管生成素-1的方式使用。Valenzuela等人(1999；本文特別收入作為參考)的論文進一步補充了本文關于促血管生成素-3和促血管生成素-4的傳授。
另外，還設想將促血管生成素的融合蛋白質用于本發明。一個范例是本文所包括的穩定Ang-1-Ang-2融合蛋白質，見SEQ ID NO5。該蛋白質包含促血管生成素-2的最初73個氨基酸，直至DAPLEY序列，并融合了促血管生成素-1自第77位氨基酸開始的序列。它還在促血管生成素-1的第265位包含突變，Cys被Ser取代。
其它可用于本文的抗血管發生劑包括制管張素和抑內皮素。美國專利5,776,704、5,639,725、和5,733,876(本文收入作為參考)描述了制管張素。制管張素是分子量在大約38kDa-大約45kDa之間的蛋白質(通過還原性聚丙烯酰胺凝膠電泳測定)，大致包含纖溶酶原分子的第1-4個Kringle區。制管張素的氨基酸序列通常與完整鼠纖溶酶原分子自第98位氨基酸開始的片段基本上相似。
制管張素的氨基酸序列在物種間略有變化。例如，在人的制管張素中，氨基酸序列與上述鼠纖溶酶原片段的序列基本上相似，但是有活性的人制管張素序列可以自完整人纖溶酶原氨基酸序列的第97位或第99位氨基酸開始。而且，人纖溶酶原在小鼠腫瘤模型中具有相似的抗血管發生活性，因而可以使用。
由于制管張素和抑內皮素是最早在小鼠中證明不僅能夠抑制腫瘤生長而且能夠引起腫瘤退化的血管發生抑制劑，因此它們已經成為深入研究的焦點。已經顯示多種蛋白酶由纖溶酶原產生制管張素，包括彈性蛋白酶、巨噬細胞金屬彈性蛋白酶(MME)、基質溶素(MMP-7)、和92kDa的明膠酶B/IV類膠原酶(MMP-9)。
MME能夠在腫瘤中由纖溶酶原產生制管張素，而粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)通過上調巨噬細胞的MME表達而誘導制管張素生成。MME在制管張素生成中的作用受到MME確實在來自患者的肝細胞癌臨床樣品中表達這一發現的支持。認為能夠產生制管張素的另一種蛋白酶是溶基質素-1(MMP-3)。MMP-3顯示在體外由纖溶酶原產生制管張素樣片段。制管張素的作用機制目前還不清楚，猜測它結合內皮細胞上尚未鑒定的細胞表面受體，誘導內皮細胞經歷程序化細胞死亡或有絲分裂阻滯。
抑內皮素似乎是甚至更強有力的抗血管發生和抗腫瘤試劑，且特別優選用于連接阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(諸如2C3)。抑內皮素在大量的小鼠腫瘤模型中能夠有效引起退化。腫瘤沒有形成針對抑內皮素的抗性，而且腫瘤在多個治療周期后進入體積不再增加的休眠階段。在此休眠階段，經歷凋亡的腫瘤細胞百分比上升，產生基本上保持相同大小的群體。
授予Folkman和O’Reilly的美國專利5,854,205(本文特別收入作為參考)涉及抑內皮素及其作為內皮細胞增殖和血管發生抑制劑的應用。抑內皮素蛋白質對應于XVIII型膠原的C末端片段，而且可以由多種來源分離該白質。美國專利5,854,205還講授了，抑內皮素具有XVIII型膠原、XV型膠原、或BOVMPE1 pregastric酯酶片段的氨基酸序列。美國專利5,854,205還描述了抑內皮素與其它抗血管發生蛋白質(特別是制管張素)的聯合，這些聯合的組合物能夠有效的使依賴血管發生的腫瘤塊消退。
抑內皮素和制管張素是優選用于參照本發明投遞至腫瘤的試劑。抑血管素、制霉菌素、和maspin也是優選的試劑。特別是抑內皮素，它是最優選的試劑之一。可以如本文所述制備抑內皮素-2C3融合蛋白質。本申請還描述了化學連接的抑內皮素-2C3構建物的各種形式。
C5.誘導凋亡試劑本發明還可用于投遞在腫瘤內任何細胞(包括腫瘤細胞和腫瘤血管內皮細胞)中誘導凋亡的試劑。雖然許多抗癌試劑可能具有誘導凋亡的效果作為其作用機制的一部分，但是如下文所述，已經發現、設計、或選擇了以此作為主要機制的某些試劑。
據報導，許多形式的癌癥在腫瘤抑制基因中包含突變，諸如p53。p53的滅活導致不能促進凋亡。由于這一失敗，癌細胞進行腫瘤發生，而非注定的細胞死亡。本發明因此還試圖通過投遞腫瘤抑制基因來刺激細胞死亡。例示性的腫瘤抑制基因包括(但不限于)p53、成視網膜細胞瘤基因(Rb)、Wilm氏腫瘤(WT1)、baxα、白介素-1β-轉換酶及其家族、MEN-1基因、1型神經纖維瘤(NF1)、cdk抑制劑p16、結腸直腸癌基因(DCC)、家族性多發性腺癌基因(FAP)、多瘤抑制基因(MTS-1)、BRCA1、和BRCA2。
優選使用的是p53(美國專利5,747,469、5,677,178、和5,756,455，本文收入作為參考)、成視網膜細胞瘤、BRCA1(美國專利5,750,400、5,654,155、5,710,001、5,756,294、5,709,999、5,693,473、5,753,441、5,622,829、和5,747,282，本文收入作為參考)、MEN-1(GenBank編號U93236)、和腺病毒E1A(美國專利5,776,743，本文收入作為參考)基因。
可以由阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(諸如2C3)投遞的其它組合物包括腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(稱為TRAIL)的編碼基因及TRAIL多肽(美國專利5,763,223，本文收入作為參考)；24kD凋亡相關蛋白酶(美國專利5,605,826，本文收入作為參考)；Fas相關因子1(FAF1)(美國專利5,750,653，本文收入作為參考)。本發明的這些方面還包括提供白介素-1β-轉換酶及其家族成員，據報導，它們也刺激凋亡。
還可以使用諸如2-羥基喹啉衍生物(美國專利5,672,603和5,464,833，本文收入作為參考)、branched apogenic peptide(美國專利5,591,717，本文收入作為參考)、磷酸酪氨酸抑制劑及不可水解的磷酸酪氨酸類似物(美國專利5,565,491和5,693,627，本文收入作為參考)、RXR類視黃酸受體激動劑(美國專利5,399,586，本文收入作為參考)、和甚至抗氧化劑(美國專利5,571,523，本文收入作為參考)等化合物。還可以將酪氨酸激酶抑制劑(諸如染料木黃酮)連接至本發明靶向細胞表面受體VEGFR1的試劑(正如美國專利5,587,459所支持的，本文收入作為參考)。
C6.生物學功能等同物現在(通常)使用上文提供的材料作為起點，可以生成基于2C3的抗體或任何其它阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體的等同物或甚至改進。可以對這種抗體的結構進行修飾和改變，但是仍然能夠獲得具有類似或所需特征的分子。例如，可以用某些氨基酸替代蛋白質結構中的其它氨基酸，而在相互作用的結合能力方面沒有明顯損失。這些考慮也可應用于毒素、抗血管發生試劑、誘導凋亡試劑、凝血劑、等等。
由于蛋白質相互作用的能力和本質確定了該蛋白質的生物學功能活性，因此可以在蛋白質序列(當然也可以是根本的DNA序列)中進行某些氨基酸序列替代，從而得到具有類似(激動劑)特性的蛋白質。因此，預計可在以抗體或治療劑的序列(或根本的DNA序列)中進行多種改變，而不會使其生物學效用或活性明顯損失。可以根據本文表A提供的密碼子信息和關于定點誘變的支持性技術細節，通過突變根本的DNA序列而產生生物學功能等同物。
本領域技術人員也深入領會到，“生物學功能等同的”蛋白質或肽這一定義的內在含義是，在分子確定部分內可以進行的、仍然導致分子具有可接受水平的等同生物活性的改變數目存在限制。因此，本文將生物學功能等同的蛋白質和肽定義為某些而非大多數或所有氨基酸可被替代的蛋白質和肽。當然，根據本發明可以容易的制備和使用具有不同替代的多種不同的蛋白質/肽。
氨基酸替代通常基于氨基酸側鏈取代基的相對相似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小、等等。對氨基酸側鏈取代基大小、形狀、和類型的分析揭示了精氨酸、賴氨酸、和組氨酸都是帶正電的殘基；丙氨酸、甘氨酸、和絲氨酸大小相似；苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸都具有基本上相似的形狀。因此，根據這些考慮，本文將精氨酸、賴氨酸、和組氨酸；丙氨酸、甘氨酸、和絲氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸確定為生物學功能等同物。
在進行更多的量變時，可以考慮氨基酸的水性指數(hydropathicindex)。根據其疏水性和帶電特性確定了各種氨基酸的水性指數，即異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本領域技術人員通常都理解氨基酸水性指數在賦予蛋白質相互作用性生物學功能方面的重要性(Kyte和Doolittle，1982，本文收入作為參考)。已知某些氨基酸可以被具有相似水性指數或評分的其它氨基酸替代，而仍保留相似的生物學活性。在根據水性指數進行改變時，優選水性指數為±2之間的氨基酸替代，特別優選水性指數為±1之間的氨基酸替代，甚至更特別優選水性指數為±0.5之間的氨基酸替代。
因此，可以理解，氨基酸可以用具有相似親水性值的另一種氨基酸取代，而仍得到生物學等同的蛋白質。如美國專利4,554,101(本文收入作為參考)中所述，已經為氨基酸殘基指定了下列親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。
在根據親水性值進行改變時，優選親水性值為±2之間的氨基酸替代，特別優選親水性值為±1之間的氨基酸替代，甚至更特別優選親水性值為±0.5之間的氨基酸替代。
C7.融合蛋白質和重組表達可以使用分子生物學技術以融合蛋白質的形式容易的制備本發明的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的免疫綴合物。使用本文公開的和本領域技術人員知道的任何治療劑，可以設計并產生任何融合蛋白質。融合蛋白質技術可以容易的應用于制備其中通過可選擇性切割的肽序列連接兩個部分的融合蛋白質。目前優選的融合蛋白質是包含抑內皮素的融合蛋白質。與任何其它治療劑一樣，抑內皮素可以附著于抗體的末端或CDR以外的任意點。也可以“整體的”制備諸如抑內皮素等治療劑，其中治療劑優選與可選擇性切割的肽相連，從而能夠在靶向之后釋放試劑。
使用重組DNA技術來實現這些目標現在對于本領域技術人員而言已是標準實踐。這些方法包括例如體外重組DNA技術、合成技術、和體內重組/基因重組。還可以使用自動合成儀來進行DNA和RNA合成(參閱例如Sambrook等人描述的技術，1989，本文收入作為參考)。
這種融合蛋白質的制備通常必需制備第一個和第二個DNA編碼區，并在同一讀碼框中功能性連接這些區從而產生編碼所需融合蛋白質的單個編碼區。在本文中，阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3樣抗體DNA序列將在同一讀碼框中連接編碼治療劑的DNA序列。通常不認為構建物的哪個部分作為N末端區或C末端區特別有關系。
一旦產生了所需編碼區，就可產生表達載體。表達載體在插入的DNA區上游包含一種或多種啟動子，該啟動子啟動DNA的轉錄并由此啟動編碼的重組蛋白質的表達。這就是“重組表達”。
為了獲得所謂的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的免疫綴合物的“重組”形式，在重組細胞中進行表達。可以通過重組表達領域技術人員通常知道的技術對用于在原核或真核系統中表達的DNA片段進行改造。我們認為事實上可以采用任何表達系統來表達基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的免疫綴合物構建物。
這些蛋白質可以在真核表達系統中成功的表達，如CHO細胞，但是預計細菌表達系統(諸如大腸桿菌pQE-60)對于基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的免疫綴合物的大量制備及隨后純化將是特別有用的。cDNA也可以在細菌系統中進行表達，所編碼的蛋白質表達為與β-半乳糖苷酶、泛素、日本裂體吸蟲(Schistosoma japonicum)谷胱甘肽S轉移酶、等等的融合形式。我們認為細菌表達系統相對于真核表達系統在易于使用和由此獲得的物質的量方面具有優勢。
關于微生物表達，美國專利5,583,013、5,221,619、4,785,420、4,704,362、和4,366,246(本文收入作為參考)進一步補充了本公開書關于重組宿主細胞中基因表達的內容。
可以純化重組產生的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的免疫綴合物，并配制施用于人。或者，可以經基因療法投遞編碼免疫綴合物的核酸。雖然可以采用裸露的重組DNA或質粒，但是優選使用脂質體或載體。某些病毒經受體介導的內吞作用進入細胞的能力，和整合到宿主細胞基因組并穩定的、有效的表達病毒基因的能力，使得它們成為將外來基因轉移至哺乳動物細胞內的引人注目的候選者。優選用于本發明的基因治療載體通常是病毒載體。
逆轉錄病毒有希望作為基因投遞載體，因為它們能夠將它們的基因整合宿主基因組中，從而轉移大量的外來遺傳物質，感染廣泛的物種和細胞類型，且在特定細胞系中包裝。其它病毒，諸如腺病毒、單純皰疹病毒(HSV)、巨細胞病毒(CMV)、和腺伴隨病毒(AAV)，諸如美國專利5,139,941(本文收入作為參考)中描述的病毒，也可以改造作為基因轉移的載體。
雖然有些能夠接受外來遺傳物質的病毒所能夠容納的核苷酸的量受到限制，且它們感染的細胞范圍也受到限制，但是這些病毒已經證明能夠成功的實現基因表達。然而，腺病毒不將其遺傳物質整合到宿主基因組中，因而基因表達不需要宿主復制，這使得它們特別適用于快速、有效的異源基因表達。本領域眾所周知用于制備復制缺陷的感染性病毒的技術。
在其它實施方案中，基因治療載體是HSV。使HSV成為引人注目的載體的一個因素是基因組的大小和組織。因為HSV比較大，所以與其它較小的病毒系統相比，摻入多個基因或表達盒不太會成問題。另外，與其它系統相比，具有不同性能(如時間、強度)的不同病毒控制序列的可用性使得它有可能更大程度的控制表達。病毒具有相對較少的剪接信息，進一步簡化基因操作，這也是優點。HSV還相對易于操作，而且可以生長至高滴度。
當然，在使用病毒投遞系統時，需要充分純化病毒粒子使它基本上不含不需要的污染物，諸如缺陷型感染性病毒顆粒或內毒素和其它熱原，由此不會在接受載體構建物的細胞、動物、或個體中引起任何不恰當的反應。純化載體的優選方法包括使用有浮力的密度梯度，諸如氯化銫梯度離心。
C8.抗體綴合物基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體可以綴合抗細胞的或毒害細胞的試劑，由此制備“免疫毒素”；或者可操作連接能夠直接或間接刺激凝血的成分，由此形成“凝血配體”。在凝血配體中，抗體可以直接連接直接的或間接的凝血因子，或者可以連接第二個結合區，由該第二個結合區結合然后釋放直接的或間接的凝血因子。“第二個結合區”的方法通常使用凝血劑結合抗體作為第二個結合區，由此產生雙特異性抗體構建物。本領域通常眾所周知雙特異性抗體的制備和應用，本文進一步公開。
在免疫毒素、凝血配體、和雙特異性抗體的制備中，可以采用重組體表達。在同一讀碼框中，將編碼選定抗體的核酸序列附著編碼選定毒素、凝血劑、或第二個結合區的核酸序列，從而產生表達單元或載體。重組表達導致新核酸的翻譯，產生所需蛋白質產物。雖然采用的是編碼抗體的核酸而非蛋白質結合配體，但是重組方法與上文所述基本上相同。
回到綴合物技術，本領域通常眾所周知免疫毒素的制備。但是，通過在制備免疫毒素和純化該毒素以供隨后臨床施用的過程中使用某些優選的技術可獲得某些好處。例如，盡管基于IgG的免疫毒素與其Fab’對應物相比通常展示更好的結合能力和更慢的血液清除速率，但是基于Fab’片段的免疫毒素與基于IgG的免疫毒素相比通常展示更好的組織穿透能力。
另外，盡管已知多種類型的含二硫鍵的接頭可以成功的用于將毒素部分綴合于基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體，但是基于不同的制藥學特征和能力，某些接頭通常優于其它接頭。例如，優選含有空間上“受阻”的二硫鍵的接頭，因為這種接頭在體內更加穩定，可防止毒素部分在結合至作用位點之前就被釋放下來。
已知多種毒害細胞的試劑可以綴合于基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體，包括來自植物、真菌、和細菌的毒素，諸如蓖麻毒蛋白A鏈或脫糖基A鏈。在某些情況中，毒素A鏈與抗體的交聯需要具有二硫鍵功能的交聯劑。這樣做的原因尚不清楚，但可能是由于需要在試劑將毒素“投遞至”被靶向細胞時某些毒素部分能夠容易地從抗體上釋放下來。
交聯劑的類型，以及如何進行交聯將會改變所得綴合物的藥物動力學。歸根結底，在希望毒素可以釋放的情況中，期望的綴合物是在除了預定作用位點以外的所有身體部位中的條件下能夠保持完整，而在所述作用位點處具有良好的“釋放”特性。因此，具體交聯方案，特別包括所用的具體交聯劑和被交聯的結構，具有一定的意義。
取決于作為融合蛋白一部分使用的特定毒素化合物，可能會需要提供抗體和毒素化合物可操縱附著的肽間隔區，所述間隔區能折疊成以二硫鍵鍵合的環結構。然后，環內的蛋白水解切割會產生異二聚體多肽，其中抗體和毒素化合物僅通過單個二硫鍵連接。這種毒素的范例是蓖麻毒蛋白A鏈毒素。
當利用其它一些毒素化合物時，可以提供不能被切割的肽間隔區，以可操作附著融合蛋白質中基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體與毒素化合物。可以與不能被切割的肽間隔區結合使用的毒素是自身可通過蛋白水解切割而轉變成毒害細胞的二硫鍵鍵合形式的毒素。這種毒素化合物的范例是假單胞菌外毒素化合物。
可能存在這些情況，如靶抗原沒有通過與免疫毒素產生的有效去毒一致的途徑發生內在化，需要靶向化療劑，諸如抗腫瘤藥物、其它細胞因子、抗代謝物、烷化劑、激素、等等。目前多種化療劑和其它藥物學試劑已經成功的綴合于抗體，并顯示制藥學功能。已經研究過的例示性抗腫瘤試劑包括羥基紅比霉素(doxorubicin)、道諾霉素、氨甲喋呤、長春花堿、和其它多種試劑。此外，已經描述了諸如新抑癌蛋白、大分子霉素、三亞胺醌、和α-鵝膏菌素等其它試劑的附著。
當將凝血因子用于本發明時，與抗體的任何共價連接應當在功能性凝血位點以外的位點進行。組合物由此以任何可操作方式“連接”，使得每個部分都能夠發揮預定功能而無顯著削弱。由此，抗體可結合VEGF，而凝血因子可促進血液凝血。
C9.生化交聯劑除了本文提供的一般信息，可以使用某些優選的生化交聯劑使基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體綴合一種或多種治療劑。交聯劑用于形成將兩種不同分子的官能團維系在一起的分子橋接。為了以分步方式連接兩種不同的蛋白質，可以使用雜雙功能交聯劑來消除不需要的同多聚體形成。例示性的雜雙功能交聯劑可以參考表B1。
表B1.雜雙功能交聯劑接頭 對下列基團 優點和應用交聯后的具有反應性間隔物臂長SMPT 伯胺較高的穩定性 11.2A巰基SPDP 伯胺硫化 6.8A巰基可切割交聯LC-SPDP 伯胺間隔物臂延長 15.6A巰基Sulfo-LC-SPDP伯胺間隔物臂延長 15.6A巰基可溶于水SMCC 伯胺穩定的馬來酰亞胺反應基團 11.6A巰基酶-抗體綴合半抗原-載體蛋白質綴合Sulfo-SMCC 伯胺穩定的馬來酰亞胺反應基團 11.6A巰基可溶于水酶-抗體綴合MBS 伯胺酶-抗體綴合 9.9A巰基半抗原-載體蛋白質綴合Sulfo-MBS伯胺可溶于水 9.9A巰基SIAB 伯胺酶-抗體綴合 10.6A巰基Sulfo-SIAB 伯胺可溶于水 10.6A巰基SMPB 伯胺間隔物臂延長 14.5A巰基酶-抗體綴合Sulfo-SMPB 伯胺間隔物臂延長 14.5A巰基可溶于水EDC/Sulfo-NHS伯胺半抗原-載體綴合 0羧基ABH 碳水化合物 與糖基發生反應11.9A無選擇性雜雙功能交聯劑包含兩個反應基團一個通常與伯胺基團發生反應(如N-羥基琥珀酰亞胺)，而另一個通常與硫醇基發生反應(如吡啶二硫化物(pyridyldisulfide)、馬來酰亞胺、鹵素、等等)。交聯劑通過伯胺反應基團與一種蛋白質(如選定的抗體或其片段)的賴氨酸殘基發生反應，而通過硫醇反應基團，已經與第一種蛋白質連接的交聯劑與另一種蛋白質(如凝血劑)的半胱氨酸殘基(游離的巰基)發生反應。
由此，組合物通常具有或經衍生具有可用于交聯目的的官能基。并不認為這一要求構成限制，因為多種基團可用于這種方式。例如，伯胺或仲胺基、酰肼或肼、羧基醇、磷酸酯(phosphate)、或烷化基團可用于結合或交聯。
交聯劑的兩種反應基團之間的間隔臂可以具有不同的長度和化學組成。較長的間隔臂能夠使綴合物成分獲得較好的柔性，而橋接中的有些特定成分(如苯基)可以給反應基團帶來額外的穩定性或使化學連接對各方面作用的抗性增加(如二硫鍵對還原劑的抗性)。還包括使用諸如L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala等肽間隔物。
優選采用在血液中具有合理穩定性的交聯劑。已知大量類型的含二硫鍵接頭能夠成功的用于綴合物靶向和毒性劑或凝血劑。可以證明含空間受阻的二硫鍵的接頭能夠帶來較好的體內穩定性，防止試劑在結合作用位點前釋放。這些接頭因而成為一組優選的連接劑。
最優選用于免疫毒素的交聯劑之一是SMPT，這是一種含二硫鍵的雙功能交聯劑，二硫鍵因鄰近的苯環和甲基而“空間受阻”。認為二硫鍵的空間位阻有助于保護該鍵免受硫醇陰離子(諸如組織和血液中可能存在的谷胱甘肽)的攻擊，由此有助于防止在綴合物將附著的試劑投遞至腫瘤位點前發生脫偶聯。預計SMPT試劑也可用于本發明的雙特異性配體。
與許多其它已知的交聯劑一樣，SMPT交聯劑帶來了交聯官能基(諸如半胱氨酸的SH或伯胺如賴氨酸的ε-氨基)的能力。另一種可能類型的交聯劑包括含可切割二硫鍵的雜雙功能光反應性疊氮基苯，諸如磺基琥珀酰亞胺基-2-(對疊氮水楊酰氨基)-1，3’-二硫丙酸乙酯。N-羥基-琥珀酰亞胺基團與伯胺基團發生反應，而疊氮基苯(在光分解作用后)無選擇性的與任何氨基酸殘基發生反應。
除了受阻的交聯劑，本文還可以采用不受阻的接頭。認為不含或不產生受保護二硫鍵的其它有用交聯劑包括SATA、SPDP、和2-亞氨基硫雜戊環(2-iminothiolane)。本領域完全理解這些交聯劑的應用。
一旦完成綴合，將綴合物與未綴合的靶向和治療劑以及其它污染物分開。大量的純化技術可用于提供足夠純的綴合物，從而能夠用于臨床。使用最多的通常是基于大小分離的純化方法，諸如凝膠過濾、凝膠滲透、或高效液相層析。也可以使用其它層析技術，諸如Blue-Sepharose分離。
C10.生物學可釋放接頭雖然任何連接部分優選具有合理的血液穩定性以防止在靶向疾病或腫瘤位點前顯著釋放附著的試劑，但是在某些方面，也可以使用生物學可釋放鍵和/或可選擇性切割間隔物或接頭。“生物學可釋放鍵”和“可選擇性切割間隔物或接頭”仍然具有合理的循環穩定性。
本發明的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(諸如2C3樣抗體)由此可以經生物學可釋放鍵連接一種或多種治療劑。可以采用任何形式的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或者“靶向抗體或試劑”，包括完整抗體。在某些實施方案中，優選scFv片段。
“生物學可釋放鍵”或“可選擇性水解鍵”包括只有或優先在某些條件下可釋放的、可切割的、或可水解的所有鍵合。這包括二硫鍵和三硫鍵和酸不穩定鍵，正如美國專利5,474,765和5,762,918(本文收入作為參考)所述。
特別涵蓋使用對酸敏感的間隔物將治療劑或藥物附著于本發明的抗體。在這些實施方案中，治療劑或藥物在細胞的酸性區室內釋放。預計使酸敏感性釋放發生于細胞外，但是是在特異性靶向(優選)腫瘤位點之后。目前優選的某些范例包括經酸敏感間隔物連接了秋水仙素或羥基紅比霉素(doxorubicin)的2C3樣抗體。還涵蓋經抗體的碳水化合物部分進行附著。在這些實施方案中，治療劑或藥物在細胞的酸性區室內釋放。
靶向的抗VEGF抗體還可以經衍生導入能夠經生物學可釋放鍵附著治療劑的官能基。靶向抗體由此可以經衍生導入以酰肼、肼、伯胺、或仲胺基終止的側鏈。治療劑可以經Schiff堿連接、腙或酰腙鍵、或酰肼接頭而進行綴合(美國專利5,474,765和5,762,918，本文特別收入作為參考)。
同樣如美國專利5,474,765和5,762,918(本文特別收入作為參考)所述，靶向的抗VEGF抗體可以經一種或多種對酶敏感的生物學可釋放鍵可操作附著治療劑，包括肽鍵、酯鍵、酰胺鍵、磷酸二酯鍵、和糖苷鍵。
本發明的優選方面涉及包含肽酶和/或蛋白酶的至少第一種切割位點的肽接頭的使用，而所述肽酶和/或蛋白酶優先定位于疾病位點，特別是腫瘤環境內。由抗體介導的附著治療劑的投遞導致疾病位點和腫瘤環境內的特異性切割，繼而導致活性試劑的特異性釋放。某些肽接頭包含由改造中涉及的一種或多種酶可識別的切割位點。
特別優選包含尿激酶、尿激酶原、纖溶酶、纖溶酶原、TGFβ、鏈激酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa、或金屬蛋白酶(諸如間質膠原酶、明膠酶、或溶基質素)的切割位點的肽接頭。本文特別引入美國專利6,004,555、美國專利5,877,289、和美國申請流水號08/482,369(1998年10月20日交納頒證費)作為參考，以進一步描述如何產生并使用包含生物學可釋放鍵和可選擇性切割接頭和肽的靶向劑-治療劑構建物。本文特別收入美國專利5,877,289(1999年3月2日頒證)作為參考，以進一步描述如何產生并使用包含可被腫瘤環境內尿激酶、纖溶酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa、或金屬蛋白酶(諸如間質膠原酶、明膠酶、或溶基質素)切割的可選擇性切割肽接頭的靶向劑-治療劑構建物。
目前優選的可選擇性切割肽接頭是包含纖溶酶或金屬蛋白酶(也稱為“基質金屬蛋白酶”或“MMP”)(諸如間質膠原酶、明膠酶、或溶基質素)的切割位點的肽接頭。可有利用于本發明的其它肽接頭包括例如表2中所列的肽接頭。
表B2.可切割接頭序列可切割序列的種類 氨基酸序列SEQ ID NO纖溶酶可切割序列尿激酶原PRFKIIGG 15PRFRIIGG 16TGFβ SSRHRRALD 17纖溶酶原RKSSIIIRMRDVVL18鏈激酶 SSSFDKGKYKKGDDA 19SSSFDKGKYKRGDDA 20因子Xa可切割序列IEGR 21IDGR 22GGSIDGR 23MMP可切割序列明膠酶A PLGLWA24膠原酶可切割序列小牛皮膚膠原(α1(I)鏈) GPQGIAGQ 25小牛皮膚膠原(α2(I)鏈) GPQGLLGA 26牛軟骨膠原(α1(II)鏈) GIAGQ 27人肝膠原(α1(III)鏈)GPLGIAGI 28人α2M GPEGLRVG 29人PZP YGAGLGVV 30AGLGVVER 31AGLGISST 32大鼠α1M EPQALAMS 33QALAMSAI 34大鼠α2M AAYHLVSQ 35MDAFLESS 36大鼠α1I3(2J) ESLPVVAV 37大鼠α1I3(27J)SAPAVESE 38人成纖維細胞膠原酶 DVAQFVLT 39(自溶切割)VAQFVLTE 40AQFVLTEG 41PVQPIGPQ 42
C11.雙特異性抗體雙特異性抗體在本發明的凝血配體和聯合抗血管發生方面特別有用。通常可以采用雙特異性抗體，條件是一條臂結合VEGF，任選結合的表位與2C3基本上相同，且雙特異性抗體附著治療劑，通常附著位點與抗原結合位點不同。
一般而言，本領域眾所周知雙特異性抗體的制備。一種方法涉及分開制備對靶向的抗原具有特異性的抗體，另一方面(在此)對凝血劑有特異性的抗體。由兩種選定抗體制備F(ab’γ)2肽片段，隨后還原以提供分開的Fab’γSH片段。然后用交聯劑(諸如鄰-亞苯基二馬來酰亞胺)烷化待偶聯的兩種配偶體之一的SH基團，從而在一種配偶體上提供游離的馬來酰亞胺基團。然后通過硫醚鍵使這種配偶體綴合另一種配偶體，從而產生所需F(ab’γ)2雜綴合物。還知道使用SPDP或蛋白A進行交聯的其它方法，或者制備三特異性構建物。
產生雙特異性抗體的另一種方法是通過融合兩種雜交瘤以形成四倍體瘤。如本文所用，術語“四倍體瘤”用于描述兩種B細胞雜交瘤的生產性融合體。使用目前的標準技術，將兩種產生抗體的雜交瘤融合在一起，得到子代細胞，然后選擇出維持表達兩套克隆型免疫球蛋白基因的那些細胞。
產生四倍體瘤的優選方法包括選擇出至少一種親代雜交瘤的酶缺陷突變體。然后，將第一種突變型雜交瘤細胞系與經致死暴露于如碘乙酰胺以防其持續存活的第二種雜交瘤的細胞融合。通過細胞融合，通過從經致死性處理的雜交瘤處獲得補償酶缺陷的基因，從而挽救第一種雜交瘤，而通過與第一種雜交瘤的融合也挽救了第二種雜交瘤。優選相同同種型、不同亞類的免疫球蛋白融合，但并非必需。如果用其它測定法分離優選的四倍體瘤，則可使用混合亞類的抗體。
更詳細的說，培育和篩選四倍體瘤的一種方法包括獲得分泌第一種選定mAb的雜交瘤細胞系，并使其缺陷必需的代謝酶，即次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)。為了獲得該雜交瘤的缺陷突變體，在濃度漸增的8-氮雜鳥嘌呤(1×10-7M至1×10-5M)的存在下培養細胞。通過有限稀釋亞克隆突變體，并測試其對次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸苷(HAT)的敏感性。培養基可由例如添加了10％FCS/2mM L-谷氨酰胺/1mM青霉素-鏈霉素的DMEM組成。
通過標準的細胞融合技術，使用產生第二種所需mAb的互補雜交瘤細胞系來產生四倍體瘤。簡單的說，將4.5×107個HAT敏感型的第一種細胞與2.8×107個HAT抗性的第二種細胞混合，所述第二種細胞已于融合前，在冰上用致死劑量的不可逆生化抑制劑碘乙酰胺(5mM于磷酸鹽緩沖鹽水中)預處理30分鐘。使用聚乙二醇(PEG)誘導細胞融合，將細胞平鋪在96孔微量培養板上。使用含有HAT的培養基選擇四倍體瘤。使用例如固相同種型特異性ELISA和同種型特異性免疫熒光染色鑒定含有雙特異性抗體的培養物。
在一個鑒定雙特異性抗體的鑒定實施方案中，用一種試劑包被微量培養板(Falcon，Becton Dickinson Labware)的孔，所述試劑可與親代雜交瘤抗體之一特異性相互作用，但缺乏與兩種抗體的交叉反應性。清洗培養板，封閉，并向每個孔中加入待測上清液(SN)。將培養板于室溫溫育2小時，棄去上清液，清洗板，加入經稀釋的堿性磷酸酶-抗抗體綴合物并于室溫溫育2小時。清洗板，向每個孔中加入磷酸酶底物，如對硝基苯基磷酸(p-nitrophenyl phosphate)(Sigma，St.Louis)。將培養板溫育，向每個孔中加入3N NaOH以終止反應，并使用ELISA讀數器測定OD410的值。
在另一個鑒定實施方案中，使用經聚-L-賴氨酸預處理的微量滴定板將靶細胞之一結合至每個孔中，然后使用例如1％的戊二醛固定細胞，檢測雙特異性抗體結合完整細胞的能力。另外，本發明中也可結合使用FACS、免疫熒光染色、獨特型特異性抗體、抗原結合競爭測定法、和抗體鑒定領域知道的其它方法來鑒定優選的四倍體瘤。
分離四倍體瘤之后，從其它細胞產物中純化出雙特異性抗體。通過免疫球蛋白純化領域技術人員知道的多種蛋白質分離方法可實現純化目的。本領域眾所周知制備和鑒定抗體的方法(參閱如《抗體實驗室手冊》，1988)。
例如，可以將來自選定四倍體瘤的上清液流經蛋白質A或蛋白質GSepharose柱以結合IgG(取決于其同種型)。然后用例如pH5.0的檸檬酸鹽緩沖液洗脫結合的抗體。將含BsAb的洗脫級分在等滲的緩沖液中進行透析。或者，也可將洗脫液流經抗免疫球蛋白-Sepharose柱。然后用3.5M氯化鎂洗脫BsAb。然后如上所述，可通過例如同種型特異性ELISA和靶細胞的免疫熒光染色測定法來檢測以此方式純化的BsAb的結合活性。
也可以通過SDS-PAGE電泳，隨后用銀或考馬斯藍染色，從而鑒定和分離經純化的BsAb和親代抗體。當親代抗體之一的分子量比另一種更高時即有可能如此，其中BsAb帶遷移至兩種親代抗體的中間。樣品的還原證實了其中存在兩種不同表觀分子量的重鏈。D.藥物組合物本發明的藥物組合物通常包含有效量的至少第一種基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物，它們溶解或散布于制藥學可接受的載體或水性介質中。還包括聯合治療劑，而相同類型的基本藥物組合物可用于單一和聯合藥物。
術語“制藥學或藥理學可接受的”指當適當施用于動物或人后不會產生不利的、過敏的、或其它不良反應的分子實體和組合物。本發明同樣包括獸醫應用，且“制藥學可接受的”配方包括可用于臨床和/或獸醫應用的配方。
如本文所用，“制藥學可接受的載體”包括任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌試劑、等滲和吸收遲滯試劑、等等。本領域眾所周知這些介質和試劑對制藥學活性物質的應用。在此范圍內，除了活性成分與任何常規介質或試劑不相容，否則，預計它們能用于治療組合物中。為了施用于人，制劑應當達到FDA局生物試劑標準要求的無菌、熱原性、全面安全性、和純度標準。組合物中還可以摻入補充的活性成分。
“單位劑量”配方包含所施用成分適用于特定定時投遞的一份劑量或亞劑量。例如，例示性的“單位劑量”配方包含每日劑量或單位或每日亞劑量、每周劑量或單位或每周亞劑量、等等。
D1.可注射配方本發明的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體綴合物常常經配制供非腸道施用，如經配制供靜脈內、肌肉內、皮下、穿真皮、或其它這種途徑的注射，包括蠕動施用和直接滴注至腫瘤或疾病位點(腔內施用)。本領域技術人員參照本公開書將知道含有抗體或免疫綴合物作為活性成分的水性組合物的制備。這些組合物通常制備成可注射的液體溶液或懸浮液；也可以制備成適用于在注射前通過加入液體而制成溶液或懸浮液的固體形式；而且制品也可進行乳化。
適于注射使用的制藥學形式包括無菌水溶液或分散液；包括麻油、花生油、或水性丙二醇的制劑；和用于即時制備無菌注射液或分散液的無菌粉末。在所有情況下都必須是無菌形式，并且流動程度必須易于注射。制劑在制備和儲存條件下必須很穩定，而且必須能夠防止微生物(諸如細菌和真菌)的污染作用。
基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物組合物可配制成中性或鹽形式的無菌水性組合物。可以在與表面活性劑(諸如羥丙基纖維素)適當混合的水中制備溶液作為游離堿或制藥學可接受鹽。制藥學可接受的鹽包括酸加成的鹽(與蛋白質的游離氨基基團形成)，以及與無機酸(諸如鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、三氯乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的鹽。與游離羧基基團形成的鹽也可衍生自無機堿(諸如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣、或鐵)和有機堿(諸如異丙基胺、三甲基胺、組氨酸，普魯卡因、等等)。
合適的載體包括含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇、等等)、其適當混和物、和植物油的溶劑和分散介質。在許多情況中，優選包含等滲劑，例如糖或氯化鈉。通過使用包衣，諸如卵磷脂，(在分散劑的情況中)通過維持所需顆粒大小，和/或通過使用表面活性劑，可以維持適當流動性。
在普通的儲存和使用條件下，所有這些制劑應當包含防腐劑以防止微生物的生長。通過多種抗細菌和抗真菌試劑，例如對羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、乙基汞硫代水楊酸鈉、等等，可以防止微生物的作用。通過在組合物中使用遲滯吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可以延長可注射組合物的吸收。
在配制之前或之后，基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物應當徹底透析以除去不需要的小分子量分子，和/或適當時凍干，從而更易于配制到所需載體中。通過將所需量的溶于適當溶劑的活性試劑與各種上述其它成分混和，隨后過濾除菌，由此制備無菌的可注射溶液。通常，通過將各種無菌的活性成分摻入含基本分散介質和所需的上述其它成分的無菌載體來制備分散劑。
在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況中，優選的制備方法是真空干燥和凍干技術，由先前無菌過濾的溶液產生活性成分加上任何其它所需成分的粉末。
本發明的合適藥物組合物通常包含與可接受的制藥學稀釋劑或賦形劑(諸如無菌水溶液)混合以達到所需終濃度范圍(取決于預定用途)的一定量的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物。本領域通常眾所周知制備技術，例如可參閱《雷明頓制藥科學》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第16版，Mack出版公司，1980(本文收入作為參考)。應當理解，內毒素污染應該控制到最低程度，達到安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白質。另外，為了施用于人，制劑應當達到FDA局生物制劑標準要求的無菌、致熱性、全面安全性、和純度標準。配制后，以與劑型相容的方式，以治療有效量施用抗體或免疫綴合物溶液。
D2.緩釋配方可以以多種劑型容易的施用基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物溶液的配方，諸如上述可注射溶液的形式，還包括其它制藥學可接受形式，如片劑、丸劑、膠囊或用于口服的其它固體、栓劑、陰道栓劑、滴鼻液或噴霧劑、氣霧劑、吸入劑、局部配方、脂質體形式、等等。施用形式的類型應與治療的疾病或紊亂匹配。
可以使用制藥學“慢釋”膠囊或“緩釋”組合物或制劑，而且是常規適用的。慢釋配方通常被設計成在較長的一段時間內維持恒定的藥物水平，并可用于投遞本發明的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物。通常將慢釋配方植入疾病位點(例如腫瘤位點)附近。
緩釋制劑的合適范例包括含抗體或免疫綴合物的固體疏水性聚合物半透性基質，該基質為有形物品的形式，如薄膜或微囊。緩釋基質的范例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(如美國專利3,773,919)、L-谷氨酸與L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(諸如Lupron DepotTM，由乳酸-乙醇酸共聚物與乙酸亮丙瑞林組成的可注射微球體)、和聚D-(-)-3-羥基丁酸。
諸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等共聚物能夠在長達100天的時間里釋放分子時，而某些水凝膠釋放蛋白質的時間要短一些。當包囊的抗體在體內維持了較長時間后，它們可能因暴露于37℃的潮濕環境而變性或聚集，導致生物學活性降低和/或免疫原性改變。根據涉及的機制，可采用合理的策略來進行穩定。例如，若聚集機制涉及經硫-二硫鍵交換形成分子間S-S鍵，則可以通過修飾巰基殘基、由酸性溶液凍干、控制水氣含量、使用適當添加劑、開發特異性聚合物基質組合物、等等來實現穩定。
D3.脂質體和納米顆粒(nanoparticle)在某些實施方案中，可以將脂質體和/或納米顆粒用于基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物。本領域技術人員通常知道脂質體的制備和使用，見下文概述。
由分散于水性介質的磷脂形成脂質體，自發形成多層同心雙層囊泡(也稱為多層囊泡，MLV)。MLV的直徑通常為25nm-4μm。對MLV的超聲波處理導致形成小型單層囊泡(SUV)，直徑為200-500，其核心含有水性溶液。
當分散于水中時，根據脂質與水的摩爾比，磷脂還能夠形成除脂質體以外的多種結構。在低比率，脂質體是優選結構。脂質體的物理特征取決于pH、離子強度、和二價陽離子的存在。脂質體能夠對離子和極性物質顯示低通透性，但是當溫度升高時發生相變，顯著改變其通透性。相變涉及由緊密的有序結構(稱為凝膠態)變成松散的無序結構(稱為流體態)。這發生于特征性相變溫度，并導致對離子、糖、和藥物的通透性增加。
脂質體經四種不同的機制與細胞發生相互作用網狀內皮系統吞噬細胞的內吞作用，諸如巨噬細胞和嗜中性細胞；細胞表面的吸收，通過非特異性弱疏水作用或靜電作用，或者通過與細胞表面成分的特異性相互作用；脂質體的脂雙層通過嵌入原生質膜而與細胞膜的融合，同時將脂質體內容物釋放進入細胞質；和脂質體磷脂轉移至細胞或亞細胞膜，或反向轉移，無脂質體內容物的任何結合。改變脂質體配方能夠改變起作用機制，但是可能同時有超過一種機制起作用。
納米顆粒通常能夠以穩定且可重現的方式俘獲化合物。為了避免因細胞內聚合物過多引起的副作用，應當使用體內可降解的聚合物來設計這些超微顆粒(大小為大約0.1μm)。預計符合這些要求的生物可降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯納米顆粒可用于本發明，而且這些顆粒易于制備。
D4.眼科配方具有血管發生成分的許多疾病與眼有關。例如，能夠參照本發明進行治療的與角膜新血管形成有關的疾病包括(但不限于)糖尿病性視網膜病變、早產兒視網膜病變、角膜移植排斥、新血管性青光眼和晶體后纖維增生癥、流行性角膜結膜炎、維生素A缺乏、隱形眼鏡佩戴過度、特應性角膜炎、上緣角膜炎、翼狀角膜炎干燥癥、Sjogren癥(干燥癥)、玫瑰痤瘡(酒糟鼻)、phylectenulosis、梅毒、分支桿菌感染、脂肪變性、化學燒傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純性皰疹感染、帶狀皰疹感染、原生動物感染、Kaposi氏肉瘤、Mooren潰瘍、Terrien氏邊緣變性、邊緣角質層分離、外傷、類風濕性關節炎、系統狼瘡、多動脈炎、Wegeners類肉瘤、鞏膜炎、Steven’s Johnson病、角膜放射狀切開術、和角膜移植排斥。
能夠參照本發明進行治療的與視網膜/脈絡膜新血管形成有關的疾病包括(但不限于)糖尿病性視網膜病變、黃斑變性、鐮刀形紅細胞貧血病、結節病、梅毒、彈性假黃色瘤、Pagets病、靜脈堵塞、動脈堵塞、頸動脈梗阻性疾病、慢性眼色素層炎/玻璃體炎、分支桿菌感染、Lyme氏病、系統性紅斑狼瘡、早產兒視網膜病變、Eales病、Bechets病、引起視網膜炎或脈絡膜炎的感染、推測的眼組織胞漿菌病、Bests病、近視、視窩、Stargarts病、平坦部睫狀體炎、慢性視網膜脫落、高粘度綜合癥、弓形體病、外傷、和激光后并發癥。
能夠參照本發明進行治療的其它疾病包括(但不限于)與發紅有關的疾病(虹膜角的新血管形成)和由纖維血管或纖維組織異常增殖引起的疾病，包括所有形式的增殖性玻璃體視網膜病變，無論是否與糖尿病有關。
本發明基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體和免疫綴合物由此可以有利的用于制備適合作為眼科用液使用的藥物組合物，包括玻璃體內和/或眼房內(intracameral)施用的眼科用液。為了治療任何上述或其它疾病，參照傳統制藥學實踐，參閱例如《雷明頓制藥科學》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第15版，第1488-1501頁(Mack出版公司，Easton，PA)，將本發明基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體組合物配制成眼科制劑，施用于需要治療的主體的眼部。
眼科制劑在制藥學可接受的溶液、懸浮液或油膏中已含基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體，其濃度為大約0.01-大約1％(重量百分比)，優選大約0.05-大約0.5％。根據采用的具體化合物、待治療主體的狀況、諸如此類，可能需要改變濃度。負責治療的人員將為個別主體確定最適濃度。眼科制劑通常優選無菌水性溶液的形式，如果需要，還可以包含額外成分，例如防腐劑、緩沖液、張力劑、抗氧化劑和穩定劑、非離子濕潤劑或澄清劑、增稠劑、等等。
適用于這種溶液的防腐劑包括氯化芐烷銨、苯索氯銨、氯代丁醇、硫柳汞、等等。合適的緩沖液包括硼酸、碳酸氫鈉和碳酸氫鉀、硼酸鈉和硼酸鉀、碳酸鈉和碳酸鉀、醋酸鈉、磷酸氫鈉、等等，其量足以將pH維持在大約pH6-pH8，優選大約pH7-pH7.5。合適的張力劑是dextran40、dextran70、右旋糖、甘油、氯化鉀、丙二醇、氯化鈉、等等，使得眼科用液的氯化鈉當量為0.9±0.2％。
合適的抗氧化劑和穩定劑包括亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、硫代亞硫酸鈉、硫脲、等等。合適的濕潤劑和澄清劑包括polysorbate80、polysorbate 20、poloxamer282、和泰洛沙泊(tyloxapol)。合適的增稠劑包括dextran40、dextran70、明膠、甘油、羥乙基纖維素、羥甲基丙基纖維素、羊毛脂、甲基纖維素、凡士林、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素、等等。眼科制劑將通過傳統方法局部施用于需要治療的主體的眼部，例如以滴液的形式或以眼科用液洗眼。
D5.局部配方在最廣的意義上，局部施用配方包括用于經口(口腔)和經皮膚投遞的配方。“局部投遞系統”還包括含待施用成分的穿真皮貼劑。如果需要，還可以通過離子電滲或電轉移來實現經皮膚的投遞。
適用于口局部施用的配方包括在調味基質(通常是蔗糖與阿拉伯膠或黃芪膠)中包含活性成分的錠劑、在惰性基質(諸如明膠與甘油或蔗糖與阿拉伯膠)中包含活性成分的軟錠劑、和在合適液態載體中包含待施用成分的漱口劑。
適用于皮膚局部施用的皮膚包括在制藥學可接受載體中包含待施用成分的油膏、乳膏、凝膠、和糊劑。正如本領域眾所周知的，用于局部施用的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體的配方，諸如乳膏、油膏、和凝膠，包括油質或水溶性油膏基底的制劑。例如，這些組合物可以包含植物油、動物脂肪、和更優選的得自石油的半固體碳氫化合物。所用具體成分可以包括白色油膏、黃色油膏、十六烷基酯蠟、油酸、橄欖油、石蠟、凡士林、白色凡士林、鯨蠟、甘油淀粉、白蠟、黃蠟、羊毛脂、無水羊毛脂、和甘油單硬脂酸酯。還可以使用各種水溶性油膏基底，包括乙二醇醚及其衍生物、聚乙二醇、硬脂酸40聚烴氧基酯、和polysorbate。
用于直腸施用的配方可以是在合適基底中包含例如可可脂或水楊酸酯的栓劑。適用于陰道施用的配方可以是除了活性成分之外還包含本領域已知的適當載體的陰道栓劑、塞子、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧劑配方。
D6.鼻科配方經鼻和呼吸路徑的局部投遞可用于治療各種狀況。這些投遞路徑還適用于將試劑投遞到系統循環中。本發明因此包括在適用于鼻施用的載體中包含活性成分的配方，例如鼻科用液、噴霧劑、氣霧劑、和吸入劑。當載體是固體時，配方包括具有20-500微米顆粒大小的粗粉，當施用時，將裝有粉末的容器置于鼻下由鼻孔快速吸入。
載體是液體的合適配方可用于鼻施用。鼻科用液常常是設計并制備成滴液或噴霧劑、經鼻孔施用的水性溶液，它們在許多方面與鼻分泌物相似，使得能夠維持正常的纖毛作用。由此，水性鼻科用液通常是等滲并略有緩沖的，維持于pH5.5-6.5。另外，如果需要，配方中可以包含與用于眼科制劑相似的抗微生物防腐劑和合適的藥物穩定劑。已知多種商品化的鼻科制劑，包括例如抗生素和抗組胺劑，并用于預防哮喘。
吸入劑是設計用于將藥物或化合物投遞至患者呼吸樹的藥物制劑。施用水汽或水霧并使之到達受疾病侵襲區域。此路徑還可用于將試劑投遞至系統循環中。可以通過鼻或口呼吸路徑施用吸入劑。只有當小液滴足夠細小且大小均一從而水霧能夠到達細支氣管時，吸入液的施用才會有效。
同樣稱為吸入劑、有時稱為吹入劑的另一組產品包含精細粉狀或液體藥物，并由特殊投遞系統(諸如在液化氣體推進劑中包含藥物溶液或懸浮液的藥物氣霧劑)攜帶進入呼吸通路。當經合適閥門和口接管釋放時，將計量劑量的吸入劑推進到患者呼吸道中。顆粒大小在這種類型制劑的施用中特別重要。據報導，滲透進入肺腔的最佳顆粒大小范圍為0.5-7μm。通過對氣霧劑增壓而產生精細水霧，由此使其應用具有上述優點。E.治療劑盒本發明還提供了包含基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物的治療劑盒，用于本發明的治療方法。這些試劑盒通常在合適的容器裝置中包含至少一種基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物的制藥學可接受配方。試劑盒還可以包含用于診斷/成像或聯合療法的其它制藥學可接受配方。例如，這些試劑盒可以包含任何一種或多種化療或放療藥物、抗血管發生試劑、抗腫瘤細胞抗體、和/或抗腫瘤血管結構或抗腫瘤基質的免疫毒素或凝血配體。
試劑盒中可以只有單一容器(容器裝置)，其中裝有基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物，含或不含其它成分；或者，試劑盒中可以有不同容器，其中裝有各種所需試劑。當提供聯合治療劑時，可以以等摩爾或一種成分過量的聯合方式預先混和單一溶液；或者，可以在施用于患者前，在不同容器中分開保存試劑盒中基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物與其它抗癌試劑成分。
當以一種或多種液態溶液提供試劑盒成分時，液態溶液優選水性溶液，特別優選無菌水性溶液。但是，也可以以干粉形式提供試劑盒成分。當以干粉形式提供試劑或成分時，可以通過向干粉中加入合適溶劑來進行重建。預計還可以在其它容器中提供溶劑。
試劑盒的容器通常包括至少一種小瓶、試管、燒瓶、玻璃瓶、注射器、或其它容器裝置，其中裝有基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物和任何其它所需試劑，且優選適當分裝。當包含分開的成分時，試劑盒通常包含至少第二種小瓶或其它容器，其中裝有這些成分，能夠施用分開的所需劑量。試劑盒還可以包含第二種/第三種容器裝置，用來包裝制藥學可接受的無菌緩沖液或其它稀釋劑。
試劑盒還可以包含對動物或患者施用基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物的裝置，如一套或多套針頭或注射器、眼滴瓶、取液器、或其它這類裝置，由此將配方注射到動物體內或應用于體內疾病區域。本發明的試劑盒通常還包含裝這些小瓶等和其它成分以供出售的密封裝置，諸如注射或吹制成型的塑料容器，其中裝有所需小瓶和其它裝置。F.抗血管發生療法本發明可用于治療患有異常血管發生的動物和患者，諸如促成多種疾病和紊亂的異常血管發生。在癌癥治療領域之外，最普遍和/或在臨床上重要的疾病和紊亂包括關節炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、動脈粥樣硬化、糖尿病性視網膜病變、與年齡有關的黃斑變性、Grave氏病、血管再狹窄(包括血管成形術后再狹窄)、動靜脈畸形(AVM)、腦(脊)膜瘤、血管瘤、和新血管性青光眼。其它潛在的干預靶包括血管纖維瘤、動脈粥樣硬化病斑、角膜移植物新血管形成、血友病性關節、肥大性瘢痕、Osler-Weber綜合癥、膿性肉芽腫、晶狀體后纖維增生癥、硬皮病、沙眼、血管粘連、滑膜炎、皮炎、各種其它炎癥性疾病和紊亂、和甚至子宮內膜異位癥。下文列出了本發明可以治療的其它疾病和紊亂，以及這些血管發生性疾病的統一基礎。
涉及血管發生的一種疾病是類風濕性關節炎，其中關節滑膜內層的血管經歷血管發生。除了形成新血管網絡，內皮細胞還釋放導致血管翳生長和軟骨破壞的因子和活性氧類。血管發生中涉及的因子可以積極促成并維持類風濕性關節炎的慢性發炎狀態。與血管發生有關的因子在骨關節炎中也有作用，促成關節的破壞。
Harada等人(1998，本文特別收入作為參考)顯示，VEGF涉及類風濕性關節炎的發病機理，而且血清VEGF濃度的測量是用于監測類風濕性關節炎疾病活性的有用的非侵入式方法。這支持本發明對類風濕性關節炎的治療性和診斷性應用。
Nagashima等人(1999，本文特別收入作為參考)描述了在培養的風濕性滑膜細胞中抗風濕藥物對VEGF的抑制效果。VEGF在類風濕性關節炎的滑膜中組成性表達。據顯示，已知的抗風濕藥物，布西拉明(bucillamine，BUC)，在其作用機制中包括抑制由滑膜細胞的VEGF生成。由此，BUC的抗風濕效果是由關節炎滑膜中經抑制滑膜細胞的VEGF生成來抑制血管發生和滑膜增殖介導的。本發明作為抗關節炎療法的應用受到這一現存治療劑對VEGF抑制作用的支持。
由血管發生介導的另一種疾病范例是眼部新血管性疾病。該疾病的特征為新血管侵入眼結構，諸如視網膜或角膜。這是失明的最常見原因，并涉及大約20種眼科疾病。在與年齡有關的黃斑變性中，相關視覺問題是由脈絡膜毛細血管經Bruch氏膜(玻璃膜)的缺陷向內生長，同時視網膜色素上皮下纖維血管組織增殖引起的。血管發生性損傷還涉及糖尿病性視網膜病變、早產兒視網膜病變、角膜移植排斥、新血管性青光眼、和晶狀體后纖維組織形成。
與角膜新血管形成有關的其它疾病包括(但不限于)流行性角膜結膜炎、維生素A缺乏、隱形眼鏡過度佩戴、特應性角膜炎、上緣角膜炎、翼狀胬肉干燥性角膜炎、Sjogren癥(干燥癥)、玫瑰痤瘡(酒糟鼻)、phylectenulosis、梅毒、分支桿菌感染、脂肪變性、化學燒傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純性皰疹感染、帶狀皰疹感染、原生動物感染、Kaposi氏肉瘤、Mooren潰瘍、Terrien氏邊緣變性、邊緣角質層分離、外傷、類風濕性關節炎、系統狼瘡、多動脈炎、外傷、Wegeners類肉瘤、鞏膜炎、Steven’s Johnson病、角膜放射狀切開術、和角膜移植排斥。
與視網膜/脈絡膜新血管形成有關的疾病包括(但不限于)糖尿病性視網膜病變、黃斑變性、鐮刀形紅細胞貧血病、結節病、梅毒、彈性假黃色瘤、Pagets病、靜脈堵塞、動脈堵塞、頸動脈梗阻性疾病、慢性色素層炎/玻璃體炎、分支桿菌感染、Lyme氏病、系統性紅斑狼瘡、早產兒視網膜病變、Eales病、Bechets病、引起視網膜炎或脈絡膜炎的感染、推測的眼組織胞漿菌病、Bests病、近視、視窩、Stargarts病、平坦部炎、慢性視網膜脫落、高粘滯性綜合癥、弓形體病、外傷、和激光后并發癥。
其它疾病包括(但不限于)與發紅有關的疾病(虹膜角的新血管形成)和由纖維血管或纖維組織異常增殖引起的疾病，包括所有形式的增殖性玻璃體視網膜病變。
慢性炎癥也涉及病理性血管發生。這些疾病狀態(如潰瘍性結腸炎和Crohn氏病)顯示組織學變化，其中有新血管進入發炎組織的向內生長。巴爾通體病(在南美洲發現的細菌性感染)能夠導致特征為血管內皮細胞增殖的慢性階段。
在動脈粥樣硬化中發現了與血管發生有關的另一種病理學作用。在血管內腔內形成的病斑顯示具有血管發生刺激活性。Inoue等人(1998，本文特別收入作為參考)證明了人冠狀動脈粥樣硬化損傷中的VEGF表達。這證明了VEGF在人冠狀動脈粥樣硬化發展中，以及在冠脈梗阻性疾病的血管再成形過程中有病理生理學重要性。本發明為這些狀況提供了有效治療。
血管瘤是兒童時期最頻繁的血管發生性疾病之一。在大多數情況中，腫瘤是良性的，并在沒有干預的條件下就退化。在更嚴重的情況中，腫瘤發展成大型海綿狀和滲透性形式并產生臨床并發癥。血管瘤的系統形式，血管瘤病，具有較高的死亡率。存在耐受治療的血管瘤，不能用目前使用的治療劑進行治療。
血管發生還與在遺傳性疾病(諸如Osler-Weber-Rendu病或遺傳性出血性毛細管擴張癥)中發現的損傷有關。遺傳性出血性毛細管擴張是特征為多處小型血管瘤、血管或淋巴管腫瘤的遺傳病。血管瘤存在于皮膚和粘膜中，常常伴隨鼻出血或胃腸出血，有時伴隨肺或肝動靜脈瘺管。
血管發生還與正常的生理學過程有關，諸如再生和創傷愈合。血管發生是排卵還有受精后囊胚著床中的重要步驟。預防血管發生可用于誘導閉經，阻斷排卵或防止囊胚著床。
在創傷愈合中，過度修復或纖維增生成為手術治療的有害副作用，而且可能由血管發生引起并惡化。粘附是手術后頻繁的并發癥，并導致諸如小型腸梗阻等問題。
本發明還可以治療特征為不良血管通透性的疾病和紊亂。這包括與腦瘤有關的浮腫、與惡性腫瘤有關的腹水、Meigs氏綜合癥、肺炎、腎病綜合癥、心包積液、和胸膜積液，正如WO 98/16551(本文特別收入作為參考)所公開的。
參照如美國專利5,712,291(本文特別收入作為參考)中公開的本領域知識(該專利歸納了將抗血管發生策略應用于治療血管發生性疾病的好處)，本發明可以有效治療上述每種疾病和紊亂，以及下文所述所有類型的腫瘤。
本發明的抗體和/或免疫綴合物最優選用于治療腫瘤。血管發生占有重要地位的腫瘤包括惡性腫瘤，和良性腫瘤，諸如聽神經瘤、神經纖維瘤、沙眼、和膿性肉芽腫。血管發生在實體瘤的形成和轉移中特別顯著。但是，血管發生還與血液腫瘤(諸如白血病)有關，還有發生白血球無限制增殖的各種急性或慢性腫瘤性骨髓疾病，常常伴隨貧血、血液凝血受損、和淋巴結、肝、和脾腫大。血管發生在引起白血病樣腫瘤的骨髓異常中也具有重要作用。
血管發生在腫瘤轉移的兩個階段占有重要地位。在原發性腫瘤的血管形成中，血管發生使得細胞能夠進入血流并循環全身。在腫瘤細胞離開原發性位點并進入繼發性位點即轉移位點后，血管發生必須在新腫瘤能夠生長并擴張前啟動。因此，預防血管發生也就能夠預防腫瘤轉移，并包括原發性位點的腫瘤生長，使得能夠用其它治療劑進行治療，特別是治療劑-靶向劑構建物(見下文)。
由本發明提供的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物方法由此可以廣泛的應用于治療具有血管成分的任何惡性腫瘤。在使用本發明的抗體和/或免疫綴合物治療腫瘤(特別是血管化惡性腫瘤)時，可以單獨使用試劑，或者與如化療劑、放療劑、誘導凋亡試劑、抗血管發生試劑、和/或免疫毒素或凝血配體聯合使用。
需要治療的典型血管化腫瘤是實體瘤，特別是需要血管成分提供氧和營養的癌。使用本發明可以治療的例示性實體瘤包括(但不限于)肺癌、乳癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睪丸癌、肝癌、腮腺癌、膽管癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、甲狀腺癌、鱗狀上皮細胞癌、腺癌、小細胞癌、黑素瘤、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、神經母細胞瘤、等等。WO 98/45331(本文收入作為參考)進一步例示了使用抗VEGF抗體可以有效治療的多種腫瘤類型。
關于血管發生在腫瘤維持和轉移中作用的知識可以為諸如乳癌等癌癥提供預后指示劑。通過計數侵入性乳癌中新血管形成最強區域的微血管密度來測定在原發性腫瘤中發現的新血管形成的量。發現高水平的微血管密度與腫瘤復發有關。通過本發明的療法來控制血管發生將減少或消除這些腫瘤的復發。
本發明預計可用于治療患有實體瘤的任何患者。根據基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體的組合物的特異性特性，本發明的治療劑將減少副作用。特定優勢是將導致由巨噬細胞介導的針對腫瘤的宿主免疫應答的維持或增強，而對骨組織沒有不利影響。本發明將因此成為治療小兒科癌癥和患有或有風險形成骨質疏松癥和其它骨缺陷患者的抗血管發生療法選擇。
雖然通過本發明可以治療所有的惡性腫瘤和實體瘤，但是本發明未綴合的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體和2C3抗體特別預計可用于治療患有更多血管發生性腫瘤的患者或有風險轉移的患者。
本發明還意欲作為預防性治療。本發明的這些方面包括本發明治療患有原發性腫瘤且可能具有腫瘤轉移或者腫瘤細胞處于轉移性腫瘤植入早期階段的患者的能力。作為抗血管發生策略，本發明還可用于在根據預后性檢驗和/或近親患有遺傳性癌癥判定有中等或高風險形成腫瘤的主體內預防腫瘤發展。
本發明阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體和2C3抗體的綴合或免疫毒素形式特別預計用于破壞或減小實體瘤。本發明的這些方面可以與本發明的未綴合抗血管發生抗體或其它抗血管發生方法聯合使用。
本領域技術人員將容易的認識到，本發明治療方法的免疫綴合物和藥物前體具有獨特優點，即在單一治療劑中提供兩種特性抗體固有的抗血管發生特性和附著試劑的治療特性(如毒害細胞、凝血、凋亡、等等)。本發明抗體的綴合和藥物前體治療形式由此在整個癌癥治療領域中具有不可想象的廣泛應用。
本文提供的關于使用本發明不同方面治療更合適患者的指導意欲指出，某些患者特征可能有助于選擇可用本發明治療的患者。預先選擇某些患者，或將患者分類，并不否定本發明可用于治療患有血管化腫瘤或上述其它血管發生性疾病的所有患者。進一步考慮的事實是本發明對腫瘤的攻擊可能使腫瘤易于接受進一步的治療從而使隨后的治療導致全面協同效果或甚至導致完全消除或治愈。
不認為任何特定類型的腫瘤應當排除在本發明治療以外。但是，腫瘤細胞的類型可能與本發明與其它治療劑的聯合使用有關，特別是化療劑和抗腫瘤細胞免疫毒素。本發明療法的未綴合和綴合方面都包括抑制腫瘤血管結構增殖的抗血管發生效果。綴合和藥物前體治療方面將進一步破壞或堵塞腫瘤血管結構。由于所有實體瘤中的血管結構基本上或完全相同，所以可以理解，本發明方法學廣泛或完全適用于治療所有實體瘤，無論腫瘤細胞自身是哪種特定的表型或基因型。
使用來自動物模型的資料，如本文詳細顯示的研究，可以容易的確定基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物構建物的治療有效劑量。在轉移到臨床環境之前，攜有實體瘤的實驗動物被頻繁用于優化合適的治療劑量。已知這些模型能夠很可靠的預測有效的抗癌策略。例如，攜有實體瘤的小鼠(諸如實施例中使用的)被廣泛用于臨床前檢驗。發明人已經使用這些技術上可接受的小鼠模型確定治療劑給出有益抗腫瘤效果而伴隨最低毒性的工作范圍。
在抗血管發生療法中使用未綴合的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體時，還可以利用其它已發表資料，從而有助于設計用于臨床治療的劑量。例如，雖然本發明的抗體相對于本領域其它抗體具有獨特優勢，但是本申請的資料和傳授也可以與關注使用其它抗VEGF抗體進行治療的文獻資料聯合用于設計和/或優化治療方案和劑量。
例如，Borgstrom等人(1999，本文特別收入作為參考)描述了VEGF在使用mAb A4.6.1的體內乳癌血管發生中的重要性。由于本發明的2C3樣抗體相對于A4.6.1的研究展示等同的甚至改進的抗腫瘤應答，所以這些抗體在治療乳癌中也將具有顯著效果。發明人進一步意識到，本領域普通技術人員也將認識到，患有乳癌的患者通常是中年或老年女性，她們顯然還關注骨質疏松癥。本發明基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體和2C3的抗體由此具有額外優勢，即不會引起對骨代謝的不利影響，由此不會優選用于患有或有風險形成骨質疏松癥的乳癌患者。
相同類型的好處使得基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體和2C3的治療劑成為用于治療小兒癌癥的優選藥物。在患有癌癥的兒童中，顯然需要保持健康和基本的骨生長。由于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(諸如2C3)不會顯著損害在形成骨中占有重要地位的破骨細胞和破軟骨細胞的活性，所以2C3相對于其它抗體(諸如A4.6.1)具有重要優勢。
Borgstrom等人(1999，本文特別收入作為參考)也報導了，mAbA4.6.1在與羥基紅比霉素聯合使用時導致顯著的腫瘤退化。他們還報導了為了在治療各種癌癥中實現顯著臨床效果而進行的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體與傳統的細胞毒性試劑或化療劑的聯合應用。包括與未綴合的羥基紅比霉素和羥基紅比霉素藥物前體的聯合。
Ferrara及其同事也報導了鼠抗VEGF單克隆抗體在攜有腫瘤小鼠中和外推至人治療時的功效和濃度-應答(Mordenti等人，1999，本文特別收入作為參考)。該研究被設計成用于評價鼠抗VEGF單克隆抗體的濃度-應答相互關系，由此可估計抗體的重組人化形式在癌癥患者中的有效血漿濃度。Mordenti等人(1999)得出結論，使用幾劑可以容易應用于人系統的鼠抗體在裸鼠中可實現滿意的腫瘤抑制，由此可確定將用于人的治療性抗體有效維持在有效范圍內的臨床給藥方案。從而，使用本文所述熟練技術人員知道的技術，以及Mordenti等人(1999)報導的分析方法，還可以將來自現有技術可接受的小鼠模型的數據轉變成適當的人劑量。
來自Genentch公司抗VEGF抗體的重組人化形式在猴中的臨床前安全性評價的結果(Ryan等人，1999，本文特別收入作為參考)例示了該特定候選治療劑的缺點。雖然該抗體在這種動物中具有藥理學活性，但是這些研究中的猴展示特征為肥大軟骨細胞的劑量相關增加、軟骨下骨盤形成、和血管侵入生長盤受抑制的physeal發育異常。使用不抑制破軟骨細胞和軟骨細胞中由VEGFR1介導的VEGF結合和信號傳導的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體和2C3的治療劑時，不會有這些缺點。
Lin等人(1999，本文特別收入作為參考)報導了來自關于Genentch公司人化單克隆抗VEGF抗體的臨床前藥代動力學、種間縮放比例、和組織分布的其它研究的資料。這些研究是在小鼠、大鼠、猴、和兔中進行的，后者使用了125I標記的抗體。來自小鼠、大鼠、和猴的藥代動力學資料被用于使用人異速生長比例來預測人化對應物的藥代動力學。由此，可以得到用于治療人病理學狀況(諸如類風濕性關節炎、眼新血管形成、和癌癥)的適當劑量信息。
抗VEGF抗體A4.6.1的人化形式已經作為抗癌試劑用于臨床試驗(Brem，1998；Baca等人，1997；Presta等人，1997；本文收入作為參考)。因此，當設計本發明阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體和2C3治療的治療性劑量時，這些臨床資料也可以作為參考來源。本發明顯示，2C3在攜有腫瘤的小鼠中與A4.6.1一樣有效，但是只抑制由VEGFR2介導的VEGF作用的特異性是一種優勢。WO 98/45331(本文收入作為參考)進一步例示了可用于治療的人化抗VEGF抗體的劑量。
關于在腫瘤療法中使用基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的免疫綴合物，可以參考關于成功的向腫瘤血管結構投遞廣泛的治療劑從而實現有益效果的科學和專利文獻。作為例示，美國專利5,855,866、5,877,289、5,965,132、6,051,230、6,004,555、5,776,427、6,004,554、和6,036,955；和美國流水號08/482,369(1998年10月20日交納頒證費)(本文收入作為參考)進一步描述了這些治療劑-靶向劑構建物的應用。在本發明的情況中，治療劑-靶向劑構建物包括展現抗血管發生效果的靶向劑部分，它將放大或增強附著的治療劑的抗腫瘤活性。
正如本領域知道的，在進行臨床治療前的臨床前檢驗中存在現時目標可以作為指導方針。然而，根據其它抗VEGF抗體進入臨床的過程、本文顯示的在可接受模型中已證明的抗腫瘤效果、和本發明策略增強的安全性，本發明提供了快速進入臨床治療的治療劑。因此，臨床前檢驗可用于選擇最有利的抗體、劑量、或聯合。
導致任何一貫可檢測的抗血管發生效果、抑制轉移、破壞腫瘤血管結構、腫瘤血栓癥、壞死、和/或全面抗腫瘤效果的任何基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物藥物或其聯合藥物都將成為有用的發明。本發明還對腫瘤下游的脈管有效，即靶向至少一類引流脈管，特別是當由腫瘤釋放的細胞因子作用于這些脈管，改變它們的抗原特性時。
還可以理解，甚至在基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物藥物或其聯合療法的抗血管發生和/或抗腫瘤效果為預定治療范圍低端值，與特定腫瘤靶或患者中的其它已知療法相比，這種療法仍然可能同樣甚至更加有效。不幸的是，臨床醫生知道某些腫瘤和狀況不能在中期或長期中獲得有效治療，但是這并不否定本發明療法的有效性，當它與通常建議的其它策略至少大致一樣有效時尤其如此。
在為治療血管化腫瘤設計基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物構建物或其聯合治療劑的適當劑量時，可以容易的由本文所述動物研究和文獻中的知識進行外推，從而獲得臨床施用的適當劑量。為了實現由動物向人劑量的轉變，需要考慮對單位質量的實驗動物所施用的試劑量，優選考慮實驗動物與人患者之間的體表面積(m2)差異。所有這些計算對于本領域普通技術人員而言是眾所周知的，而且是常規的。
例如，采用小鼠研究中2C3的成功劑量，并通過應用基于質量和表面積的標準計算得出，用于人患者的有效劑量是大約1mg/m2-大約1000mg/m2，優選大約50mg/m2-大約500mg/m2，最優選大約10mg/m2-大約100mg/m2。這些劑量對于基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的裸露抗體和基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的免疫綴合物是適當的，但是這些劑量優選用于作為抗血管發生試劑使用的裸露的或未綴合的抗體。
由此，根據這一信息，發明人預計，基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物施用于人的有用低劑量將是大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、或大約50mg/m2；這些抗體或免疫綴合物施用于人的有用高劑量將是大約600、650、700、750、800、850、900、925、950、975、或大約1000mg/m2。預計基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物施用于人的有用中間劑量是介于低范圍與高范圍之間的任何劑量，諸如大約55、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、525、550、或大約575mg/m2。
使用上文記錄的例示性劑量的任何特定范圍或介于上述范圍之間的任何特定值都包括在內。還可以理解，當使用基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的免疫綴合物時，凝血劑免疫綴合物的劑量通常高于毒素免疫綴合物的劑量。
基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物的劑量范圍通常優選大約10-100mg/m2、大約10-90mg/m2、大約10-80mg/m2、大約20-100mg/m2、大約20-90mg/m2、大約20-80mg/m2、大約30-100mg/m2、大約30-90mg/m2、大約30-80mg/m2、大約15-100mg/m2、大約25-100mg/m2、大約35-100mg/m2、大約15-90mg/m2、大約25-90mg/m2、大約35-90mg/m2。可以理解，除了上述范圍，根據本文所述參數和詳細指導，本發明還涵蓋對活性或最佳范圍做進一步的變化。
因此，可以理解，較低劑量更適于與其它試劑聯合，而且仍然可以耐受高劑量，特別是考慮到由于只結合VEGFR2，所以基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體和2C3的抗體的安全性獲得增強，并進一步增強基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體和2C3的凝血劑和抗血管發生免疫綴合物的安全性。人或人化抗體(任選人凝血劑或抗血管發生蛋白質)的應用使得本發明在臨床應用中甚至更安全，可進一步降低在健康組織中產生顯著毒性或副作用的機會。
本發明治療方案的意圖通常是產生顯著的抗腫瘤效果，同時將劑量維持在與不可接受的毒性相關的水平以下。除了改變劑量本身以外，還可以改變施用方案以優化治療策略。一種治療方案是施用大約1mg/m2-大約1000mg/m2，優選大約50mg/m2-大約500mg/m2，最優選大約10mg/m2-大約100mg/m2，基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或免疫綴合物或其治療性混和藥物，大約1-3次/周，優選靜脈內或肌肉內施用，最優選靜脈內施用。
在施用特定劑量時，優選給患者全身性提供制藥學可接受的組合物(符合FDA關于無菌、致熱性、純度、和全面安全性的標準)。通常優選靜脈內注射。還包括在大約1或2小時的時間內進行連續灌注。
自然，在廣泛應用前需要進行臨床試驗。本領域技術人員參照本公開書將知道進行臨床試驗的多種要素，包括患者治療和監測。提供下列資料作為建立這些試驗的一般性指導。
選擇用于第一種基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療研究的患者應是對至少一個療程的傳統療法沒有應答，而且通過體格檢查、實驗室技術、和/或放射顯影方法測定出該患者患有可見的可測量疾病。在開始研究前2周應當停止任何化療。當使用鼠單克隆抗體或抗體部分時，患者應當對小鼠免疫球蛋白沒有變態反應史。
發現使用具有三聯腔門的內置式中樞靜脈導管具有某些優點。應當使用例如0.22μm的濾器過濾基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的試劑，并用諸如生理鹽水適當稀釋至終體積100ml。使用前，也應當以相似方式過濾待測樣品，過濾之前和之后通過測定A280評估其濃度。預計回收率應當在87％-99％范圍內，然后可以根據蛋白質的損失進行調整。
基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體或綴合物可以在大約4-24小時的時間內施用，而且每個患者以2-7天的間隔接受2-4次輸液。也可以在7天的時間內以穩定的輸液速率施用。輸液的劑量水平應當取決于是否觀察到任何毒性。因此，如果任何單次輸液后或穩定速率輸液的特定時間點達到II級毒性，那么應當停止進一步的給藥或停止穩定速率輸液直至毒性改善為止。應當將劑量逐漸增加的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療劑施用于患者組直至任一組中大約60％的患者顯示不可接受的III級或IV級毒性。將該值2/3的劑量確定為安全劑量。
當然，治療之前和治療后每隔不超過1個月應當進行體格檢查、腫瘤測量、和實驗室檢驗。實驗室檢驗應當包括全血計數、血清肌酸酐、肌酸激酶、電解質、脲、氮、SGOT、膽紅素、白蛋白、和總血清蛋白。應當通過放射免疫測定法評價治療后不超過60天取的血清樣品中所施用的治療劑和針對其任何部分的抗體的存在。使用任何標準測定法，諸如ELISA或RIA，對血清進行免疫學分析，能夠評價基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療劑的藥代動力學和清除情況。
為了評價抗腫瘤應答，應當在最后一次輸液后48小時-1周內和第30天檢查患者。當存在可觸知的疾病時，應當在治療過程中的每一天、治療完成后的1周內、和第30天測定所有腫瘤塊的兩個正交直徑。為了測量不可觸知的疾病，應當在48小時-1周內和第30天，遍及胸、腹、和骨盆以1cm為間隔進行系列CT掃描。還應當使用疾病位點活組織切片或適當時使用血液或流體樣品，在組織學上和/或通過流式細胞術評價組織樣品。
可以通過可接受的測量來確定臨床應答。例如，治療后1個月所有可測量腫瘤消失可以確定為完全應答。而治療后1個月所有可評估的腫瘤結的正交直徑乘積的總和降低50％或更多，并且無腫瘤位點顯示增大，可以確定為部分應答。相似的，治療后1個月所有可測量病變的正交直徑乘積減少50％或更多，并且一個或多個位點發生惡化，可以確定為混合應答。
根據來自臨床試驗的結果(諸如上文所述)，可以設計甚至更精確的治療方案。雖然如此，根據治療主體的狀況，后來可能必須對劑量做一些改變。負責施用的醫師參照本公開書將能夠為各個受試者確定適當劑量。這些優化和調整在本領域是常規的，絕非反映需要過多實驗。G.聯合療法無論是用于治療血管發生性疾病，諸如關節炎、牛皮癬、動脈粥樣硬化、糖尿病性視網膜病變、與年齡有關的黃斑變性、Grave氏病、血管再狹窄、血管瘤、和新血管性青光眼(或上述其它疾病)，還是用于治療實體瘤，本發明都可以聯合其它療法。
本發明基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療方法可以聯合常用于治療患者展示的特定腫瘤、疾病或紊亂的任何其它方法。只要知道特定的治療方法自身對患者狀況無害，且不顯著抵消基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療，那么就可以與本發明聯合使用這種方法。
對于實體瘤的治療，本發明可以聯合經典方法，諸如手術、放療、化療、等等。本發明由此提供了聯合療法，即在手術或放療之前、之時、或之后使用基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的構建物；或者，在傳統的化療、放療、或抗血管發生試劑、或者靶向免疫毒素或凝血配體之前、之時、或之后對患者進行施用。
特別優選本發明與放療、放療劑、抗血管發生試劑、誘導凋亡試劑、和抗微管蛋白藥物的聯合應用。上文中本發明關于免疫綴合物的部分已經描述了這些試劑的許多范例。最初描述作為治療性綴合物一部分使用的任何試劑也可以分開使用，但是仍與本發明有效組合。
當一種或多種試劑與基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的療法聯合使用時，不要求聯合結果是分開進行每種治療時觀察到的效果的加和。雖然通常希望獲得至少加和的效果，但是抗腫瘤效果相對于一種單一療法有任何增長也是有益的。同樣，沒有特別要求聯合治療展示協同效果，盡管這當然是可能的且有益的。
為了實踐聯合的抗腫瘤療法，可以以在動物體內有效導致聯合抗腫瘤作用的方式，簡單的對動物施用基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的構建物聯合另一種抗癌試劑。應以有效量和足夠時間提供試劑，使得它們聯合存在于腫瘤血管結構內并導致對腫瘤環境的聯合作用。為了實現這一目標，可以以單一組合物或者兩種不同組合物(使用不同施用路徑)對動物同時施用基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療劑與抗癌劑。
或者，可以在抗癌劑治療之前或之后間隔幾分鐘-幾周和幾月進行基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療。應確保抗癌劑和基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的試劑對腫瘤展現有利的聯合效果。
大多數抗癌劑應在基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗血管發生療法之前給藥。但是，當使用基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的免疫綴合物時，可以同時或隨后施用各種抗癌劑。
眾所周知物質聯合在癌癥治療中的一般性應用。例如，美國專利5,710,134(本文收入作為參考)公開了與無毒物質或“藥物前體”聯合時在腫瘤中誘導壞死的成分。由壞死過程釋放的酶切割無毒的“藥物前體”變成有毒的“藥物”，從而導致腫瘤細胞死亡。同樣，美國專利5,747,469(本文收入作為參考)公開了編碼p53的病毒載體與DNA破壞劑的聯合應用。任何這些相似方法都可用于本發明。
在有些情況中，當各次施用間隔幾天(2、3、4、5、6、或7)、幾周(1、2、3、4、5、6、7、或8)、或甚至幾月(1、2、3、4、5、6、7、或8)時，甚至可能需要顯著延長治療時間。這對于其中一種治療(諸如手術或化療)意欲充分破壞腫瘤而另一種治療(諸如基于抗血管發生的療法)意欲防止微轉移或腫瘤再生長的情況也是有益的。應當注意在手術后一段安全時間施用抗血管發生劑以確保有效的創傷愈合。
也可以預計可不止一次的施用基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的試劑或抗癌劑。可以在不同的日子或星期交替施用藥劑；或者先進行一系列的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療，隨后再進行一系列的抗癌劑治療。在為了實現腫瘤退化而使用聯合療法的任何情況中，只需要以有效展現抗腫瘤效果的聯合量投遞兩種試劑，而不用管施用的次數。
至于手術，任何手術干預都可以與本發明聯合實踐。至于放療，包括用于在腫瘤細胞內局部誘導DNA損傷的任何機制，諸如γ照射、X射線、UV照射、微波、和甚至電子發射等。也包括將放射性同位素直接投遞至腫瘤細胞，這可以與靶向抗體或其它靶向方法(優選阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體，諸如2C3)聯合使用。
已經證明細胞因子療法是聯合治療方案的有效配對方法。多種細胞因子可用于這些聯合療法。細胞因子的范例包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、TGF-β、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNFα、TNFβ、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ。根據與諸如患者狀況和細胞因子相對毒性等臨床指征一致的標準方案施用細胞因子。子宮珠蛋白也可用于防止或抑制轉移(美國專利5,696,092，本文收入作為參考)。
G1.化療劑在某些實施方案中，本發明基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療劑可以與化療劑聯合施用。多種化療劑可用于本文公開的聯合治療方法中。作為范例的化療劑包括如阿霉素、更生霉素、絲裂霉素、洋紅霉素、道諾霉素、羥基紅比霉素、它莫西芬(tamoxifen)、紫杉酚、泰素帝(taxotere)、長春花新堿、長春花堿、vinorelbine、依托泊甙(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、環磷酰胺、噻替派(thiotepa)、氨甲蝶呤、喜樹堿、放線菌素D、絲裂霉素C、順鉑(CDDP)、氨基喋呤、combretastatin、及其衍生物和藥物前體。
本領域普通技術人員可以理解，化療劑的適當劑量通常就是化療劑單獨施用或與其它化療劑聯合施用的臨床療法中已采用的大致劑量。例如，可以使用諸如順鉑等試劑和其它DNA烷基化劑。順鉑被廣泛用于治療癌癥，其臨床應用的有效劑量為每3周5天給藥20mg/m2，共3個療程。順鉑不能口服吸收，因此必須經靜脈內、皮下、腫瘤內、或腹膜內注射。
其它有用的試劑包括干擾DNA復制、有絲分裂、和染色體分離的化合物。這些化療化合物包括阿霉素、也稱為羥基紅比霉素、依托泊甙、異搏定(verapamil)、鬼臼毒素等。在廣泛用于治療腫瘤的臨床環境中，對于阿霉素而言，以25-75mg/m2的劑量范圍，每隔21天通過大劑量靜脈內注射給藥；對于依托泊甙而言，以35-50mg/m2的劑量靜脈內給藥或以雙倍于靜脈內劑量的劑量口服。
也可以使用破壞多核苷酸前體的合成和精確性的試劑。特別有用的是已經過深入檢驗并容易獲得的試劑。例如，致瘤性組織優先使用諸如5-氟尿嘧啶(5FU)等試劑，使得此試劑對靶向致瘤性細胞特別有用。盡管5-FU毒性很大，但它可用于寬范圍的載體，包括局部使用，然而，常用劑量范圍是3-15mg/kg/天的靜脈內施用。
表C列出了可用于聯合療法的例示性化療劑，其中所列的各種試劑僅作為例示而非限制。熟練技術人員可參照《雷明頓制藥科學》，第15版，第33章，特別是第624-652頁。根據治療對象的病情必需對劑量作一些改變。負責治療的醫師能夠為各個受試者確定適當劑量。
G2.抗血管發生試劑在正常生理學條件下，人或動物只在非常特殊的有限情況中才經歷血管發生。例如，通常在創傷愈合、胚胎發育、卵巢黃體、子宮內膜、和胎盤形成中觀察到血管發生。不受控制的(持續的和/或不受調控的)血管發生涉及多種疾病狀態，并發生于腫瘤轉移過程中。
受到控制和不受控制的血管發生被認為是以相似方式進行的。由基底膜包圍的內皮細胞和外膜細胞形成毛細血管。血管發生從由內皮細胞和白細胞釋放的酶對基底膜的侵蝕開始。然后沿血管腔排列的內皮細胞凸出基底膜。血管發生刺激物誘導內皮細胞遷移出受侵蝕的基底膜。遷移細胞在親本血管外形成“萌芽”，內皮細胞在此經歷有絲分裂和增殖。內皮萌芽彼此匯合形成毛細血管環，從而形成新的血管。
基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的本發明可用于聯合任何一種或多種其它抗血管發生療法，包括與抑制VEGF的其它試劑的聯合，諸如其它中和性抗體(Kim等人，1992；Presta等人，1997；Sioussat等人，1993；Kondo等人，1993；Asano等人，1995)、可溶性受體構建物(Kendall和Thomas，1993；Aiello等人，1995；Lin等人，1998；Millauer等人，1996)、酪氨酸激酶抑制劑(Siemeister等人，1998)、反義策略、RNA aptamer、和針對VEGF或VEGF受體的核酶(Saleh等人，1996；Cheng等人，1996；Ke等人，1998；Parry等人，1999；本文收入作為參考)。正如WO 98/16551(本文特別收入作為參考)所述，還可以采用具有拮抗劑特性的VEGF變體。
抗血管發生療法可以基于提供抗血管發生試劑或抑制血管發生試劑。可以通過為抑制VEGF而描述的一種或多種方法來實現對血管發生試劑的抑制，包括中和性抗體、可溶性受體構建物、小分子抑制劑、反義、RNA aptamer、和核酶在內的方法都可以采用。例如，如美國專利5,520,914(本文特別收入作為參考)所述，可以采用針對血管生成素的抗體。由于FGF涉及血管發生，因此也可以使用FGF抑制劑。范例是序列中以交替的N-乙酰葡糖胺與2-O-硫酸化糖醛酸作為主要重復單元的化合物，包括葡糖胺基聚糖，諸如archaran sulfate。美國專利6,028,061(本文特別收入作為參考)描述了這些化合物，它們可用于與本文的聯合。
現在已知大量的酪氨酸激酶抑制劑可用于治療在多種疾病狀態中出現的血管發生，包括例如美國專利5,639,757(本文特別收入作為參考)描述的4-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶，它也可以與本發明聯合使用。能夠調節經VEGFR2受體的酪氨酸激酶信號轉導的有機分子的其它范例是美國專利5,792,771(本文特別收入作為參考)的喹唑啉化合物和組合物，這項專利可以與本發明聯合用于治療血管發生性疾病。
其它化學類化合物也已經顯示可抑制血管發生，而且可用于與本發明的聯合。例如，聯合療法中可以采用類固醇，諸如美國專利5,972,922(本文特別收入作為參考)中描述的抑血管的4，9(11)-類固醇和C21-氧合類固醇。美國專利5,712,291和5,593,990(本文特別收入作為參考)描述了瑟利德米(thalidomide)及相關化合物、前體、類似物、代謝物和水解產物，它們也可以與本發明聯合用于抑制血管發生。美國專利5,712,291和5,593,990中的化合物可以口服施用。表D列出了可用于聯合療法的其它例示性抗血管發生試劑，其中列出的每一種試劑只是例示絕非限制。
表D.血管發生的抑制劑和負調控劑
某些優選用于抑制血管發生的成分是制管張素、抑內皮素、抑血管素、制霉菌素、和maspin。這些試劑如上所述綴合于本發明免疫綴合物，但是也可以以未綴合形式聯合應用。上述免疫綴合物形式的其它優選試劑是促血管生成素，特別是促血管生成素-2，預計可與本發明聯合應用。
某些抗血管發生療法早就顯示可引起腫瘤退化，包括細菌多糖CM101和抗體LM609。CM101是已經詳細鑒定其在腫瘤中誘導新血管炎癥能力的細菌多糖。CM101結合并交聯在去分化內皮上表達的受體，刺激補體系統的激活。它還啟動由細胞因子驅動的、選擇性靶向腫瘤的炎癥應答。它是下調VEGF及其受體表達的唯一抗病理性血管發生試劑。CM101目前作為抗癌劑正在進行臨床試驗，而且可用于與本文的聯合。
血小板反應蛋白(TSP-1)和血小板因子4(PF4)也可用于與本發明的聯合。它們都是與肝素有關的血管發生抑制劑，并在血小板α顆粒中發現。TSP-1是細胞外基質成分的450kDa大型多結構域糖蛋白。TSP-1結合在細胞外基質中發現的許多蛋白聚糖分子，包括HSPG、纖連蛋白、層粘連蛋白、和不同類型的膠原。TSP-1在體外抑制內皮細胞遷移和增殖，在體內抑制血管發生。TSP-1還抑制經轉化內皮細胞的惡性表型和腫瘤發生。腫瘤抑制基因p53顯示直接調控TSP-1的表達，使得p53活性的喪失引起TSP-1生成顯著降低，伴隨著由腫瘤起始的血管發生增加。
PF4是含70個氨基酸的蛋白質，是CXC ELR趨化因子家族的成員，能夠在體外有效抑制內皮細胞增殖，在體內有效抑制血管發生。腫瘤內施用或通過腺病毒載體投遞的PF4能夠引起對腫瘤生長的抑制。
干擾素和金屬蛋白酶抑制劑是能夠聯合本發明的另外兩類天然存在的血管發生抑制劑。20世紀80年代早期就已經知道干擾素的抗內皮活性，但是抑制機制仍然不清楚。已知它們能夠抑制內皮細胞遷移，而且它們在體內確實具有一些抗血管發生活性，這可能是由抑制腫瘤細胞產生血管發生性促進劑的能力介導的。特別是血管腫瘤對干擾素較敏感，例如用IFNα可以成功的治療增殖血管瘤。
金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)是天然存在的基質金屬蛋白酶(MMP)抑制劑家族，它們也能夠抑制血管發生，而且可用于聯合治療方案。MMP在血管發生過程中具有重要作用，它們降解內皮細胞和成纖維細胞在延伸或改造血管網絡時遷移經過的基質。事實上，MMP的一個成員MMP-2顯示與推測為此目的經整聯蛋白αvβ3激活的內皮有關。若這種相互作用被MMP-2片段破壞，則血管發生下調，腫瘤生長受抑制。
存在大量抑制血管發生的制藥學試劑，其中任何一種或多種都可用于與本發明的聯合。這包括AGM-1470/TNP-470、瑟利德米(thalidomide)、和羧基酰胺三唑(CAI)。1990年發現煙曲霉素是血管發生的有效抑制劑，從此開發了煙曲霉素的合成類似物AGM-1470和TNP-470。這兩種藥物可抑制體外內皮細胞增殖和體內血管發生。在人臨床試驗中對TNP-470進行了廣泛研究，結果表明進行長期給藥是最佳的。
瑟利德米最初作為鎮靜劑使用，但是發現是有效的致畸劑，因而停用。1994年發現瑟利德米是血管發生抑制劑。瑟利德米目前作為抗癌劑和血管性眼疾病的治療正在進行臨床試驗。
CAI是血管發生的小分子量合成抑制劑，作為鈣通道阻斷劑防止肌動蛋白再組織、內皮細胞遷移、和在膠原IV上的展開。CAI在生理學可達到濃度抑制新血管形成，而且癌癥患者口服后耐受較好。CAI的臨床試驗在49％的治療前患有進行性疾病的癌癥患者中穩定了疾病。
在存在肝素或肝素片段時，可的松在小鼠中顯示通過阻斷內皮細胞增殖來抑制腫瘤生長。類固醇和肝素的其它抑制效果所涉及的機制尚不清楚，但是認為肝素可能增加內皮細胞對類固醇的攝取。混和物顯示可增加新形成的毛細血管下基底膜的解體，這也是其它血管抑制性效果的可能解釋。肝素-可的松綴合物在體內還具有有效的血管抑制性和抗腫瘤效果活性。
預計其它特異性血管發生抑制劑也可作為抗血管發生組合物用于本發明的聯合應用，包括(但不限于)抗侵入因子、視黃酸和paclitaxel(美國專利5,716,981，本文收入作為參考)、AGM-1470(Ingber等人，1990；本文收入作為參考)、鯊魚軟骨提取物(美國專利5,618,925，本文收入作為參考)、陰離子聚酰胺或聚脲寡聚物(美國專利5,593,664，本文收入作為參考)、羥吲哚衍生物(美國專利5,576,330，本文收入作為參考)、雌二醇衍生物(美國專利5,504,074，本文收入作為參考)、和噻唑并嘧啶衍生物(美國專利5,599,813，本文收入作為參考)。
包含αvβ3整聯蛋白拮抗劑的組合物也可以與本發明聯合用于抑制血管發生。正如美國專利5,766,591(本文收入作為參考)所公開的，含RGF多肽及其鹽，包括環狀多肽，是αvβ3整聯蛋白拮抗劑的合適范例。
針對αvβ3整聯蛋白的抗體LM609也誘導腫瘤退化。整聯蛋白αvβ3的拮抗劑，諸如LM609，誘導血管發生性內皮細胞的凋亡，而對靜止(休眠)血管沒有影響。LM609或其它αvβ3拮抗劑還可以通過抑制αvβ3與MMP-2的相互作用來發揮作用，認為MMP-2是在內皮細胞和成纖維細胞遷移中具有重要作用的蛋白水解酶。美國專利5,753,230(本文特別收入作為參考)描述了可以與本發明聯合用于抑制血管發生的針對αvβ3(玻連蛋白αvβ3)的抗體。
血管發生性內皮的凋亡在這種情況中可能對剩余血管網絡具有級聯效果。抑制腫瘤血管網絡對腫瘤擴張信號產生完全應答，事實上可能啟動網絡的部分或全部崩潰，導致腫瘤細胞死亡和腫瘤體積損失。可能抑內皮素和制管張素以相似方式發揮功能。LM609不影響靜止(休眠)血管但能夠引起腫瘤退化的事實，強烈說明為了獲得抗腫瘤效果而進行的治療不需要靶向腫瘤中所有血管。
基于改變經Tie2受體的信號傳導的其它治療性干預方法也可用于與本發明的聯合，諸如使用能夠阻斷Tie2激活的可溶性Tie2受體(Lin等人，1998)。據顯示，使用重組體腺病毒基因療法來投遞這種構建物在治療癌癥和降低轉移中是有效的(Lin等人，1998)。
G3.誘導凋亡試劑基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的治療劑還可以有利地與誘導凋亡的方法聯合。上文關于本發明免疫綴合物的方面描述了多種誘導凋亡試劑。任何這些誘導凋亡試劑可用于與本發明的聯合，而無需連接本發明抗體。
除了上述作為免疫綴合物的誘導凋亡試劑，已鑒定了大量的癌基因，可抑制凋亡或程序性細胞死亡。這類癌基因的范例包括(但不限于)bcr-abl、bcl-2(與bcl-1、細胞周期蛋白D1不同；GenBank編號M14745、X06487；美國專利5,650,491和5,539,094；本文收入作為參考)、和家族成員，包括Bcl-xl、Mcl-1、Bak、A1、A20。bcl-2的過度表達最初是在T細胞淋巴瘤中發現的。bcl-2通過結合并激活Bax(凋亡途徑中的一種蛋白質)來發揮癌基因的功能。對bcl-2功能的抑制可防止Bax的激活，并使得凋亡途徑能夠進行。
本發明包括通過如使用反義核苷酸序列來抑制這類癌基因，由此增強凋亡(美國專利5,650,491、5,539,094、和5,583,034，本文收入作為參考)。
G4.免疫毒素和凝血配體本發明的治療方法可以與(其它)免疫毒素和/或凝血配體聯合應用，其中免疫毒素和/或凝血配體的靶向部分(如抗體或配體)指向腫瘤細胞、腫瘤血管結構、或腫瘤基質上相對特異性的標記物。與上文討論的化療劑和抗血管發生劑一樣，靶向毒素或凝血劑的聯合應用通常導致加和的、顯著高于結合的、或甚至協同的抗腫瘤效果。
一般而言，用于本發明這些額外方面的抗體或配體優選識別優先或特異性表達于腫瘤位點的可接近腫瘤抗原。抗體或配體還優選展示高親和力特性；而且抗體、配體、或其綴合物在人體內對維持生命的正常組織(諸如選自下組的一種或多種組織)不展示顯著體內副作用心、腎、腦、肝、骨髓、結腸、乳房、前列腺、甲狀腺、膽囊、肺、腎上腺、肌肉、神經纖維、胰、皮膚、或人體內其它維持生命的器官或組織。如本文所用，術語“顯著副作用”指當體內施用抗體、配體、或其綴合物時只產生可忽略的或臨床上易處理的副作用，諸如在化療過程中經常遭遇的那些副作用。
用于與本發明聯合應用的這些第二種抗癌試劑的至少一個結合區是能夠將毒素或凝血因子投遞至腫瘤區域(即能夠定位于腫瘤位點內)的成分。這些靶向試劑可以針對腫瘤細胞、腫瘤血管結構、或腫瘤基質的成分。靶向試劑通常結合腫瘤細胞、腫瘤血管結構或腫瘤基質上的表面表達、表面可接近、或表面定位的成分。然而，一旦開始破壞腫瘤血管結構和腫瘤細胞，將釋放內在成分，從而能夠進一步靶向事實上任何腫瘤成分。
已經描述了許多腫瘤細胞抗原，其中的任何一種都可以作為靶用于本發明的聯合方面。適用于額外免疫毒素和凝血配體進一步靶向的腫瘤細胞抗原包括由抗體B3(美國專利5,242,813，本文收入作為參考)；ATCC HB 10573；KSI/4(美國專利4,975,369，本文收入作為參考)；由包含載體NRRL B-18356和/或NRRL B-18357的細胞獲得的抗體；260F9(ATCC HB 8488)；D612(美國專利5,183,756，本文收入作為參考)；和ATCC HB 9796識別的抗原。還可以參考隨后任何年份的ATCC目錄來鑒定產生抗腫瘤細胞抗體的其它適當細胞系。
為了靶向腫瘤血管結構，靶向抗體或配體常常結合血管化腫瘤內血管表達、吸收、誘導、或定位其上的標記物。適當的表達靶分子包括例如endoglin、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白、VCAM-1、ICAM-1、PSMA(Liu等人，1997)、TIE、與LAM-1有反應性的配體、VEGF/VPF受體、FGF受體、αvβ3整聯蛋白、pleiotropin、和內皮唾液酸蛋白。合適的吸收靶是諸如VEGF、FGF、TGFβ、HGF、PF4、PDGF、TIMP、結合TIE的配體、和腫瘤相關纖連蛋白異構體。也可以靶向天然或者可用細胞因子和凝血劑人工誘導的抗原，諸如ELAM-1、VCAM-1、ICAM-1、與LAM-1有反應性的配體、endoglin、和甚至II類MHC(細胞因子可誘導的，如用IL-1、TNF-α、IFN-γ、IL-4、和/或TNF-β誘導)；和E-選擇蛋白、P-選擇蛋白、PDGF、和ICAM-1(凝血劑可誘導的，如凝血酶、因子IX/IXa、因子X/Xa、和/或纖溶酶可誘導的)。
本文特別收入下列專利和專利申請作為參考，進一步補充本發明關于制備和使用針對腫瘤血管結構的表達、吸收、誘導、或定位標記物的免疫毒素的傳授美國申請流水號08/482,369(1998年10月20日交納頒證費)、美國專利5,855,866、5,965,132、6,051,230、6,004,555、5,877,289、6,004,554、5,776,427、5,863,538、5,660,827、和6,036,955。
其它腫瘤血管結構靶向組合物和方法包括靶向最近發現可接近的腫瘤血管特異性標記物氨基磷脂，諸如磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺。單獨施用抗氨基磷脂抗體足以誘導血栓形成和腫瘤退化。本發明由此能夠有效聯合未綴合的抗磷脂酰絲氨酸和/或磷脂酰乙醇胺抗體；或者可以使用這些抗體的免疫綴合物。
本文收入下列臨時專利申請作為參考，進一步補充本發明關于制備和使用抗氨基磷脂抗體和免疫毒素的傳授臨時申請流水號60/092,672(1998年7月13日提交)和臨時申請流水號60/092,589(1998年7月13日提交)。本文再次收入申請流水號60/092,589作為參考，進一步補充本發明關于將氨基磷脂結合抗體綴合物(諸如膜聯蛋白綴合物)用于將毒素和凝血劑投遞至腫瘤血管并誘導血栓形成和腫瘤退化的傳授。
合適的腫瘤基質靶包括腫瘤基質或細胞外基質的成分，或其結合的成分；包括基底膜標記物、IV型膠原、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素、蛋白聚糖、纖連蛋白、激活的血小板、LIBS、和肌腱蛋白。優選用于這些用途的靶是RIBS。
本文特別收入下列專利和專利申請作為參考，進一步補充本發明關于制備和使用腫瘤基質靶向劑的傳授美國申請流水號08/482,369(美國專利5,＿＿,＿＿；1998年10月20日交納頒證費)、08/485,482、08/487,427(美國專利6,004,555)、08/479,733(美國專利5,877,289)、08/472,631、08/479,727、和08/481,904(美國專利6,036,955)。
第二種抗癌治療劑可以可操作附著本文描述用于基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的免疫毒素的任何毒害細胞的或其它抗細胞的試劑。然而，合適的抗細胞試劑還包括放射性同位素。優選毒素部分，諸如蓖麻毒蛋白A鏈和脫糖基A鏈(dgA)。
本發明任選使用的第二種靶向劑可以包含能夠促進凝血的靶向成分，即凝血配體。由此，靶向抗體或配體可以直接或間接(如經另一種抗體)連接直接或間接刺激凝血的任何因子，包括本文所述用于基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的凝血配體中所述的任一種。優選用于這些用途的凝血因子是組織因子(TF)及其衍生物，諸如截短的TF(tTF)、二聚體和多聚體的TF、和激活因子VII能力缺陷的突變體TF。
在治療癌癥時，經靜脈內途徑以大約1周1次的頻率聯合使用免疫毒素和凝血配體的有效劑量為大約0.1-2mg/kg，優選大約0.8-1.2mg/kg。根據治療對象的狀態必須對劑量做一些改動。負責施用的醫師將為各個受試者確定適當劑量。
G5.ADEPT和藥物前體療法本發明基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體可以與藥物前體聯合應用，其中基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體可操作連接激活藥物前體的成分，諸如激活藥物前體的酶，它只有在接觸抗體時才將藥物前體轉變成更有活性的形式。這項技術通常稱為“ADEPT”，并描述于如WO 95/13095、WO 97/26918、WO 97/24143、美國專利4,975,278和5,658,568(本文特別收入作為參考)。
如本文所用，術語“藥物前體”指生物學或制藥學活性物質的前體或衍生物形式，與作為基礎的親本藥物相比，它對靶細胞(包括腫瘤血管內皮細胞)的毒害細胞的或其它抗細胞的效果下降。優選的是，藥物前體或前體形式與“天然”或親本形式相比毒害細胞的或抗細胞的效果顯著降低，或者更優選可以忽略。“藥物前體”能夠被激活或轉變成更有活性的藥物親本形式。
用于制備并使用藥物前體的技術屬于普通技術人員的技術范圍之內。Willman等人(1986)和Stella等人(1985)在本文特別收入作為參考，以補充關于如何制備并使用各種藥物前體的描述和傳授。可用于本發明的藥物前體構建物的范例包括(但不限于)含磷酸的藥物前體(美國專利4,975,278)、含硫代磷酸的藥物前體、含硫酸的藥物前體、基于肽的藥物前體(美國專利5,660,829、5,587,161、5,405,990、WO 97/07118)、D-氨基酸修飾的藥物前體、糖基化的藥物前體(美國專利5,561,119、5,646,298、4,904,768、5,041,424)、含β-內酰胺的藥物前體、任選含取代的苯氧基乙酰胺的藥物前體(美國專利4,975,278)、任選含取代的苯乙酰胺的藥物前體、甚至5-氟胞嘧啶(美國專利4,975,278)和5-氟尿嘧啶藥物前體等等(本文特別收入每一項專利作為參考)。
可以以藥物前體形式使用的治療劑或毒性細胞毒性藥物的類型事實上是無限的。優選以這種形式投遞的細胞毒性劑比凝血劑多，凝血劑較不優選以藥物前體的形式使用。在制備藥物前體中需要的只是對構建物進行設計，使得藥物前體基本上無活性，而“釋放的”或激活的藥物具有顯著活性或者至少足以達到預定目的的活性。
正如WO 95/03830、EP 751,144(蒽環霉素)、WO 97/07097(環丙基吲哚(cyclopropylindole))、和WO 96/20169中公開的，還知道對原始藥物前體的多種改進，本文也涵蓋其使用。例如，美國專利5,621,002(本文特別收入作為參考)中描述了Km降低的藥物前體，可用于本發明的內容。正如WO 96/03151(本文特別收入作為參考)所例示的，還知道在細胞內進行的藥物前體療法，本文可以進行實踐。
為了用于ADEPT，將激活或轉變藥物前體形成更有活性藥物的試劑可操作附著于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3樣抗體。阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3樣抗體由此將藥物前體轉變能力定位于血管發生位點，優選腫瘤血管結構和基質內，從而只在這些區域產生有活性的藥物，循環或健康組織中卻沒有。
可附著于基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體從而發揮激活藥物前體功能的酶包括(但不限于)與含磷酸的藥物前體聯合使用的堿性磷酸酶(美國專利4,975,278)；與含硫酸的藥物前體聯合使用的芳香硫酸酶(美國專利5,270,196)；與基于肽的藥物前體聯合使用的肽酶和蛋白酶，諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶(美國專利5,660,829、5,587,161、5,405,990)、和組織蛋白酶(包括組織蛋白酶B和L)、與D-氨基酸修飾的藥物前體聯合使用的D-丙氨酰羧肽酶；與糖基化的藥物前體聯合使用的碳水化合物切割酶，諸如β-半乳糖苷酶和神經氨酸酶(美國專利5,561,119和5,646,298)；與含β-內酰胺的藥物前體聯合使用的β-內酰胺酶；與在氨基氮處用苯氧基乙酰胺或苯基乙酰胺基團衍生的藥物聯合使用的青霉素酰胺酶，諸如青霉素V酰胺酶(美國專利4,975,278)或青霉素G酰胺酶；和與基于5-氟胞嘧啶的藥物前體(美國專利4,975,278)聯合使用的胞嘧啶脫氨酶(美國專利5,338,678和5,545,548)(本文特別收入每一項專利作為參考)。
具有酶活性的抗體(稱為催化性抗體或“抗體酶(abzyme)”)也可用于將藥物前體轉變成有活性的藥物。基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3樣抗體的抗體酶由此構成本發明的另一方面。用于制備抗體酶的技術屬于本領域普通技術人員的技術范圍之內，例如Massey等人(1987，本文特別收入作為參考)以補充關于抗體酶的傳授。正如EP745,673(本文特別收入作為參考)所述，還進一步包括能夠催化藥物前體在氨基甲酸酯處斷裂的催化性抗體。H.診斷學和成像本發明還提供了供體外和體內使用的診斷和成像方法。這些方法可用于產生任何血管發生性疾病的診斷、預后、或成像信息，以關節炎、牛皮癬、和實體瘤為例示，但是還包括本文公開的所有血管發生性疾病。除腫瘤診斷和成像領域之外，本發明的這些方面最優選用于體外診斷性檢驗，優選的情況是以非侵入方式獲得樣品并在高通量測定法中進行檢驗，和/或臨床診斷不明且需要確認時。
H1.免疫檢測方法和試劑盒在其它實施方案中，本發明涉及用于結合、純化、除去、量化、或一般性檢測VEGF和用于診斷血管發生性疾病的免疫檢測方法。本發明阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(諸如2C3)可用于在體內對分離的組織樣品、活組織樣品或swab和/或勻漿組織樣品檢測VEGF(見下文)。這些免疫檢測方法具有明顯的診斷效用，而且還可用于非臨床樣品，諸如抗原樣品的滴定等。
諸如Nakamura等人(1987，本文收入作為參考)等科學文獻已經描述了各種有用的免疫檢測方法的步驟。免疫結合方法通常包括獲得懷疑含有VEGF的樣品，并在能夠有效形成免疫復合物的條件下使樣品接觸阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體(諸如2C3)。在這些方法中，抗體可以連接在固相支持物上，諸如柱基質的形式，并將懷疑含有VEGF的樣品應用于固定化的抗體。
免疫結合方法更優選的包括用于檢測或量化樣品中VEGF的方法，這些方法要求檢測或量化結合過程中形成的任何免疫復合物。這時，先獲得懷疑含有VEGF的樣品，并使該樣品接觸本文的抗體，然后檢測或量化在特定條件下形成的免疫復合物的量。
分析的生物學樣品可以是懷疑含有VEGF的任何樣品，通常來自懷疑患有血管發生性疾病的動物或患者。樣品可以是組織切片或標本、活組織樣品、待測樣品條或涂片、勻漿組織提取物、或者其分離的或純化的形式。
在能夠形成免疫復合物(初級免疫復合物)的有效條件和足夠時間下使選定的生物學樣品接觸抗體，通常也就是簡單的向樣品中加入抗體組合物，并且將混合物溫育足夠長的時間以使抗體能夠形成免疫復合物(即結合存在的任何VEGF)。而此后，通常清洗樣品-抗體組合物，諸如組織切片、ELISA板、點印漬、或Western印漬，從而除去任何非特異性結合的抗體，使得只能檢測到初級免疫復合物中特異性結合的抗體。
本領域眾所周知免疫復合物形成的檢測，而且可以通過多種方法來實現。這些方法通常基于標志或標記物的檢測，諸如本領域已知的放射性、熒光、生物學、或酶學標簽或標記。關注這些標記物應用的美國專利包括3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149、和4,366,241(本文收入作為參考)。通常優選使用在接觸顯色底物后產生有色產物的酶。正如本領域知道的，也可以使用第二種結合配體，諸如二抗或生物素/抗生物素蛋白配體結合安排。
在檢測中采用的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體自身可以連接可檢測標記物，然后可以通過簡單的檢測這種標記物來測定組合物中初級免疫復合物的量。
優選通過使用對本發明抗體具有結合親和力的第二種結合配體的方法來檢測初級免疫復合物。在這些情況中，第二種結合配體可以連接可檢測標記物。第二種結合配體自身常常是抗體，因此可以稱為“二抗”。在能夠形成次級免疫復合物的有效條件和足夠時間下，使初級免疫復合物接觸經標記的第二種結合配體或抗體。然后通常清洗次級免疫復合物以除去任何非特異性結合的經標記第二種配體或抗體，并檢測次級免疫復合物中的剩余標記物。
其它方法包括通過兩步法來檢測初級免疫復合物。如上所述，使用對一抗具有結合親和力的第二種結合配體(諸如抗體)來形成次級免疫復合物。清洗后，再次在能夠形成免疫復合物(三級免疫復合物)的有效條件和足夠時間下，使次級免疫復合物接觸對二抗具有結合親和力的第三種結合配體或抗體。第三種配體或抗體連接了可檢測標記物，能夠檢測由此形成的三級免疫復合物。如果需要，該系統可以提供信號放大。
在對患有血管發生性疾病的患者的臨床診斷或監測中，相對于來自正常主體的相應生物學樣品，檢測到VEGF的存在或VEGF水平的升高指示患者患有血管發生性疾病。
但是，正如本領域技術人員所知道的，不能孤立的根據這種方法來進行臨床診斷。本領域技術人員非常熟悉任何區分代表陽性鑒定的生物標記的顯著表達與生物標記的低水平或背景表達。事實上，常常將背景表達水平作為“取舍點”(cut-off)，比它更多的染色將評為顯著或陽性。
H2.成像本發明的這些方面優選用于腫瘤成像方法和聯合腫瘤治療與成像方法。預計連接了一種或多種可檢測試劑的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體可用于成像本身，或者用于在治療前對腫瘤預先成像形成可靠的影像。這些組合物和方法還可用于任何其它血管發生性疾病或狀況的成像和診斷，特別是非惡性腫瘤、動脈粥樣硬化、和為了診斷或預后目的或者為了設計治療而需要內部影像的狀況。
基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的成像抗體通常包含基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體，以及與之有效附著或綴合的可檢測標記物。“可檢測標記物”指能夠根據其特定功能特性或化學特征而進行檢測的化合物或元素，其使用使得能夠檢測所附著的成分，如果需要，還可以進一步量化。在用于體內診斷方案或“成像方法”的抗體綴合物中，要求能夠使用非侵入式方法來檢測的標記物。
本領域知道許多適當的成像劑，以及將它們附著于抗體或結合配體的方法(參閱如美國專利5,021,236和4,472,509，本文收入作為參考)。某些附著方法涉及使用金屬螯合復合物將例如有機螯合劑(諸如DTPA)附著于抗體(美國專利4,472,509)。在存在偶聯劑(諸如戊二醛或高碘酸鹽)時，也可以使單克隆抗體與酶發生反應。在存在這些偶聯劑時，或者通過與異硫氰酸酯的反應，來制備包含熒光素標記物的綴合物。
可檢測標記物的范例是順磁離子。在這種情況中，合適的離子包括鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)、和鉺(III)，特別優選的是釓。
可用于其它內容(諸如X射線成像)的離子包括(但不限于)鑭(III)、金(III)、鉛(II)、和特別是鉍(III)。熒光標記物包括若丹明、熒光素、和腎造影劑。常常經異硫氰酸酯中間介質來連接若丹明和熒光素。
在用于診斷性應用的放射性同位素的情況中，合適的范例包括14碳、51鉻、36氯、57鈷、58鈷、銅67、152銪、鎵67、3氫、碘123、碘125、碘131、銦111、59鐵、32磷、錸186、錸188、75硒、35硫、锝99m、和釔90。125I常常優選用于某些實施方案，而锝99m和銦111因它們的低能量和對長期檢測的適應性也常常是優選的。
可以參照本領域眾所周知的方法產生用于本發明的放射性標記的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體。例如，常用于使放射性同位素金屬離子結合在抗體上的中介官能基是二乙撐三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。
也可以通過接觸碘化鈉或碘化鉀與化學氧化劑(諸如次氯酸鈉)或酶氧化劑(諸如乳過氧化物酶)使單克隆抗體碘化。可以通過配體交換方法用锝99m標記本發明的抗體，例如，通過用亞錫溶液還原過锝酸鹽，將還原的锝螯合到Sephadex柱上，并將抗體應用于該柱；或者通過直接標記技術，如將過锝酸鹽、還原劑(諸如SNCl2)、緩沖液(諸如鄰苯二甲酸鈉鉀溶液)、與抗體一起溫育。
任何上述類型的經可檢測標記的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體都可用于本發明的成像或聯合成像/治療方面。它們同樣適用于體外診斷。用于體內成像方案的劑量通常低于治療劑量，但是同樣取決于患者的年齡和體重。一次劑量應當是足夠的。
體內診斷或成像方法通常包括對患者施用診斷有效量的綴合了非侵入式方法可檢測的標記物的基于阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體或2C3的抗體。給予足夠時間使抗體-標記物綴合物定位并結合腫瘤內的VEGF。然后將患者暴露于檢測裝置，以鑒定可檢測標記物，由此形成腫瘤影像。
H3.診斷劑盒在其它實施方案中，本發明提供了用于上述免疫檢測和成像方法的診斷劑盒，包括免疫檢測和成像試劑盒兩種。因此，試劑盒中提供了阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體，諸如2C3，通常裝在合適的容器中。
對于免疫檢測，抗體可以結合在固相支持物上，諸如微量滴定板的孔，但是優選抗體溶液或用于重建的粉劑。免疫檢測試劑盒優選包含至少一種免疫檢測試劑。試劑盒中的免疫檢測試劑可以采取多種形式，包括連接或結合了指定抗體的可檢測標記物。還包括連接或附著了第二種結合配體的可檢測標記物。例示性的第二種配體是對一抗具有結合親和力的二抗。
適用于本試劑盒的其它免疫檢測試劑包括二組分試劑，其中包含對一抗具有結合親和力的二抗，對二抗具有結合親和力的三抗，其中三抗連接了可檢測標記物。如上所述，本領域已知大量的例示性標記物，而且所有這些標記物都可用于本發明。這些試劑盒可以以完全綴合形式、中間體形式、或分開的部分(由試劑盒使用者進行綴合)提供抗體-標記物綴合物。
成像試劑盒優選包含已附著體內可檢測標記物的阻斷VEGFR2的抗VEGF抗體，諸如2C3。但是可以分開提供標記物和附著方法。
這兩種試劑盒還可以包含對照試劑，諸如適當分裝的VEGF組合物，已標記或未標記的均可，可用于繪制檢測測定法的標準曲線。可以以水性溶劑或凍干形式包裝試劑盒成分。
試劑盒的容器裝置通常包括至少一種藥水瓶、試管、燒瓶、玻璃瓶、注射器、或其它容器，其中裝有抗體或抗原，且優選適當分裝。當提供第二種或第三種結合配體或其它成分時，試劑盒通常還包含第二種、第三種、或其它容器，其中裝有該配體或成分。試劑盒還可以包含用于診斷任何一種或多種血管發生性疾病的其它診斷劑。優選使用不基于VEGF結合的第二種診斷劑。
本發明的試劑盒通常還包括用于包裝抗體的方法和裝有任何其它試劑以供出售的密封容器。這些容器可以包括注射或吹制成型的塑料容器，其中裝有所需藥水瓶。
實施例下列實施例演示了本發明的優選實施方案。本領域技術人員應當認識到，下列實施例中公開的技術代表了發明人發現的技術在本發明的實踐中運作良好，由此認為構成了其實踐的優選方法。然而，本領域技術人員根據本公開書應當認識到，在公開的特點實施方案中可以進行許多變化而仍獲得相同或相似的結果，不偏離本發明的精神和范圍。實施例1.抗VEGF抗體2C3的產生和獨特特征A.材料和方法1.免疫原使用達拉斯UT西南醫學中心Howard Hughes醫學院的生物聚合物設備，合成了對應于人VEGF N端26個氨基酸的肽(huVEGF；SEQ ID NO10)和對應于豚鼠VEGF N端25個氨基酸的肽(gpVEGF；SEQ ID NO11)。這兩種肽的序列如下(N→C)APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYC；SEQ ID NO10；和APMAEGEQKPREVVKFMDVYKRSYC；SEQ ID NO11.
經C端半胱氨酸，使用琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己酯烷-1-羧酸(SMCC)接頭(Pierce，Rockford，IL)，將肽與甲狀腺球蛋白綴合。還制備了對照綴合物，其包含連接了甲狀腺球蛋白的L-半胱氨酸。通過大小排阻層析，將綴合物與游離肽或接頭分開。
重組人VEGF也單獨作為免疫原使用(由明尼蘇達大學的S.Ramakrishnan博士處獲得，Minneapolis，MN)。
2.雜交瘤為了產生生成抗gpVEGF抗體的雜交瘤，用于TiterMax佐劑(CytRX公司，Norcross，GA)中的gpVEGF肽-甲狀腺球蛋白綴合物免疫C57/B1-6小鼠。為了產生抗人VEGF抗體，用于TiterMax中的huVEGF肽-甲狀腺球蛋白綴合物或重組人VEGF免疫BALB/c小鼠。最后一次加強后3天，將脾細胞與骨髓瘤P3X63AG8.653(美國典型培養物收藏中心，Rockville，MD)細胞進行融合，并如Morrow等人(1990；本文收入作為參考)所述進行培養。
3.抗體純化通過硫酸銨沉淀和蛋白A層析(使用Pierce ImmunoPure結合/純化緩沖系統(Pierce)，由此由組織培養液上清純化IgG抗體(2C3、12D7、3E7)。
通過50％飽和硫酸銨沉淀、將沉淀重懸于PBS(pH7.4)、并對dH2O進行透析以沉淀優球蛋白，由此由組織培養液上清純化IgM抗體(GV39M、11B5、7G3)。將dH2O沉淀重懸于PBS，并通過大小排阻層析在Sepharose S300層析柱(Pharmacia)上進行分離。IgM部分為85-90％純(由SDS-PAGE鑒定)。
4.對照抗體貫穿這些研究使用了多種對照抗體，包括mAb4.6.1(來自Genentech公司的小鼠抗人VEGF)、Ab-3(來自OncogeneScience公司的小鼠抗人VEGF)、A20(來自Santa Cruz Biotechnology公司的兔抗人VEGF)、OX7(小鼠抗大鼠Thy1.1，來自A.F.Williams博士，MRC細胞免疫學部，牛津，英國)、MTSA(具有無關特異性的小鼠骨髓瘤IgM，來自UT西南醫學中心的E.S.Vitetta博士，達拉斯，TX)、1A8(小鼠抗小鼠Flk-1，來自Philip E.Thorpe及其同事)、MECA 32(大鼠抗小鼠內皮，來自斯坦福大學的E.Butcher博士，斯坦福，CA)、和TEC 11(小鼠抗人endoglin，美國專利號5,660,827)。
5.初步篩選對于初步篩選，用250ng VEGF肽或VEGF-Cys-甲狀腺球蛋白綴合物包被96孔ELISA平板(Falcon，Franklin Lakes，NJ)，并用5％酪蛋白酸性水解物(Sigma，圣路易斯，MO)進行封閉。在抗原包被平板上，通過雙重間接技術(Crowther，1995)，對來自抗gpVEGF雜交瘤和最初的抗人VEGF雜交瘤的上清液進行篩選。
對顯示與VEGF肽-甲狀腺球蛋白優先反應、與Cys-甲狀腺球蛋白不反應或微弱反應的雜交瘤，通過免疫組織化學(下文所述)在腫瘤組織的冷凍切片上進行進一步的篩選。
6.免疫組織化學將豚鼠系10肝細胞癌腫瘤細胞(由NIH的Ronald Neuman博士處獲得，Bethesda，MD)在豚鼠株2(NCI，Bethesda，MD)中進行培養。將人腫瘤NCI-H358非小細胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)、NCI-H460 NSCLC(二者都由UT西南醫學中心的Adi Gazdar博士處獲得，達拉斯，TX)、HT29結腸腺癌(美國典型培養物收藏中心)、和L540CY Hodgkin氏淋巴瘤(由V.Diehl教授處獲得，Cologne，德國)作為異種移植物在CB17 SCID小鼠(Charles River，Wilmington，MA)中進行培養。
將腫瘤在液氮中快速冷凍，并保存于-70℃。來自患者的腫瘤標本的冷凍樣品是由國家癌癥學會人類組織協作網(National CancerInstitute Cooperative Human Tissue Network)(南方分部，伯明翰，AL)獲得的。如Burrows等人(1995)所述，進行免疫組織化學。
7.ELISA分析通過采用3種不同抗原(人VEGF單用；VEGFFlk-1/SEAP復合物；和Flk-1/SEAP單用)的差異間接ELISA技術，對來自用VEGF免疫的動物的雜交瘤上清液進行篩選。對于人VEGF單用，用100ng VEGF包被某些ELISA平板。
對于Flk-1/SEAP單用，用500ng Flk-1/SEAP包被其它ELISA平板，Flk-1/SEAP是小鼠VEGF受體的可溶性形式(分泌Flk-1/SEAP的細胞由普林斯頓大學的Ihor Lemischka博士處獲得，普林斯頓，NJ)。如Tessler等人(1994)所述，生成并純化Flk-1/SEAP蛋白質。基本上，在Spodopterafrugiperda(Sf9)細胞中生成Flk-1細胞外結構域(sFlk-1)，并通過免疫親和技術利用單克隆抗Flk-1抗體(1A8)進行純化。然后將sFlk-1進行生物素化，并結合到抗生物素蛋白包被平板上。
為了制備用VEGFFlk-1/SEAP復合物包被的平板，將純化的sFlk-1進行生物素化，并與VEGF于4℃在結合緩沖液(10mM HEPES、150mM NaCl、20μg/ml牛血清清蛋白、和0.1μg/ml肝素)中反應過夜，以促進二聚體的形成，sFlk-1VEGF摩爾比為2.5∶1。然后將VEGFsFlk-1復合物在抗生物素蛋白包被的96孔板的孔中進行溫育，以產生用與其受體結合的VEGF包被的平板。
然后，在抗生物素蛋白包被平板上用3種抗原在受控研究中測定抗體與單獨的VEGF、生物素化的sFlk-1、和VEGFsFlk-1復合物的反應性。如上文初步篩選所述測定反應性。
還開發了捕獲ELISA。在捕獲ELISA中，用100ng指定抗體于4℃包被微量滴定板過夜。清洗孔，并如上所述封閉，然后與各種濃度的生物素化VEGF或VEGFsFlk-1-生物素一起溫育。將鏈霉親和素與過氧化物酶的綴合物(Kirkegaard & Perry Laboratories，Inc.)以1∶2000稀釋，并開發作為第二層使用。
首先用過氧化物酶按照制造商的指示(EZ-Link ActivatedPeroxidase，Pierce)進行競爭性ELISA研究。用于12D7、3E7、2C3、和7G3的競爭性研究的抗原是由ELISA板上的抗生物素蛋白捕獲的VEGF-生物素。將大約0.5-2.0μg/ml過氧化物酶標記的待測抗體在平板上在僅存在緩沖液、或存在無關IgG、或過量10-100倍其它抗VEGF競爭性抗體的情況中進行溫育。
加入3，3′，5，5′-四甲聯苯胺(TMB)底物(Kirkegaard and PerryLaboratories公司)來評價經標記抗體的結合。15分鐘后用1M H3PO4終止反應，并于450nm讀取分光光度計讀數。進行3次測定，經標記抗體與競爭抗體的每種組合至少2次。如果兩種抗體之間交叉阻斷對方的結合超過了80％，則認為這兩種抗體屬于相同表位組。
GV39M和11B5在過氧化物酶標記后喪失了結合活性，但是耐受生物素化。對GV39M和11B5進行生物素化，并針對由抗Flk-1抗體(1A8)捕獲的或在ELISA板上直接包被的VEGFsFlk-1進行檢驗。
8.Western印漬分析通過還原和非還原條件下的12％SDS-PAGE分離存在5％胎牛血清中的純化的重組VEGF，并轉移至硝酸纖維素膜。使用Sea-BlockPP82-41(East Coat Biologics，Berwick，ME)封閉硝酸纖維素膜，并使用微型印漬裝置(Immunetics，劍橋，MA)用一抗(primaryantibody)進行探查。溫育后用合適的過氧化物酶綴合的二抗(secondary antibody)通過ECL增強型化學發光法對膜進行顯色。B.結果1.2C3具有獨特的表位特異性表1概述了關于不同抗VEGF抗體類/亞類、它們在VEGF上識別的表位組、和它們優先結合VEGF或VEGF受體(VEGFFlk-1)復合物的信息。在所有情況中，抗體與VEGF121和VEGF165的結合一樣好，基本上產生相同結果。下面是VEGF165的結果，除非另有規定。
表1.抗VEGF抗體性質的概述表位 VEGF組1克隆 同種型免疫原2主要活性31GV39M IgM，kGp N端VEGFFlk-1111B5 IgM，kHu N端VEGFFlk-123E7 IgG1，1 Hu N端VEGF和VEGFFlk-127G3 IgM，kHu N端VEGF和VEGFFlk-1312D7 IgG1，k Hu N端VEGF42C3 IgG2a，k rHu VEGF VEGF4集中于第 A4.6.1IgG1 VEGF89-94位氨基酸附近1.表位組是通過競爭ELISA確定的。2.用對應于人VEGF N端26個氨基酸(11B5、3E7、7G3、和12D7)、豚鼠VEGF N端25個氨基酸(GV39M)、或全長的重組人VEGF(2C3)的合成肽免疫小鼠。3.在間接和捕獲ELISA中對抗體篩選與VEGF或與sFlk-1相連的VEGF(VEGFFlk-1)的反應性。4.A4.6.1具有精確確定表位，與2C3識別的第4表位組不同。Kim等人(1992)、Wiesmann等人(1997)、Muller等人(1998)、和Keyt等人(1996)(本文都收入作為參考)報導了A4.6.1研究。
使用生物素化或過氧化物酶標記的待測抗體和10至100倍過量的未標記競爭抗體的競爭結合研究，顯示2C3結合唯一表位。這些研究首先揭示了GV39M和11B5相互之間交叉阻斷與VEGFFLK-1的結合，3E7和7G3相互之間交叉阻斷對方結合抗生物素蛋白捕獲的VEGF-生物素。任意的將GV39M和11B5指定為第1表位組，將3E7和7G3指定為第2表位組。
2C3和剩余抗體12D7不顯著干預對方或剩余抗體結合VEGF或VEGF受體。將12D7指定為第3表位組，將2C3指定為第4表位組(表1)。
如上文列表，2C3與抗體A4.6.1識別不同表位。發明人的競爭研究顯示，2C3與A4.6.1沒有交叉反應性。由A4.6.1識別的表位也已精確確定，是集中于第89-94位氨基酸附近的連續表位(Kim等人，1992；Wiesmann等人，1997；Muller等人，1998；Keyt等人，1996；本文都收入作為參考)。在2C3與A4.6.1之間還存在大量的已知差異(見下文)。
2.2C3能夠結合游離的VEGF這些抗體結合游離和復合形式的可溶性VEGF的能力存在顯著差異(表2)。這些研究提供了2C3獨特本質的進一步證據。表2顯示了GV39M和11B5強烈偏愛VEGF受體復合物，與VEGFFlk-1的最大結合半值分別在5.5和2nM達到，相比之下，與溶液中游離VEGF的最大結合半值分別在400和800nM達到。
正相反，2C3和12D7偏愛游離的VEGF，最大結合半值分別在1和20nM達到，相比之下，與VEGFFlk-1復合物的最大結合半值分別在150和250nM達到。然而，2C3在注射到體內后定位于腫瘤血管結構和腫瘤基質(見下文)。
3E7結合游離VEGF和VEGFFlk-1復合物的能力同樣好，二者的最大結合半值均在1nM達到。
表2.VEGF與VEGFFlk-1的ELISA捕獲克隆 達到最大結合50％VEGF/VEGFFlk-1的濃度(nM)1的比值2VEGFVEGFFlk-1GV39M400*5.5 72.711B5 800*2 400.03E7 0.9 1 0.912D7 20 250*0.12C3 1 150 0.007mAb4.6.130.3 500*0.00061A8 NR41.5對照 NR 600**外推值。1.用生物素化的VEGF和生物素化的sFlk-1與VEGF的復合物3次滴定用指定抗體包被的孔，然后用過氧化物酶標記的抗生物素蛋白顯色，由此測定最大結合半值。2.大于1.0的比值指示抗體偏愛復合物(VEGFFlk-1)，而小于1.0的比值指示偏愛VEGF。3.所用對照抗體包括1A8(小鼠抗Flk-1)、mAb 4.6.1(來自Genentech的小鼠抗人VEGF)、和作為陰性對照的無關IgM。4.NR＝沒有檢測到反應。
3.2C3識別不依賴構象的表位Western印漬分析顯示，在還原和非還原條件下，12D7、2C3、和7G3與變性的VEGF121和VEGF165發生反應。因此這些抗體看來是識別非構象依賴型表位的。
正相反，GV39M、11B5、和3E7不與Western印漬上的VEGF發生反應，可能因為它們識別VEGF N末端上的構象依賴型表位，該表位在變性條件下變形。
進行了抗VEGF抗體的Western印漬分析，即12％凝膠上進行SDS-PAGE分離VEGF165含5％FCS的，并通過標準Western印漬方案使用ECL檢測進行分析。將一抗與硝酸纖維素膜一起在多道微型雜交儀中溫育。對照抗體包括Ab-3、來自Oncogene Science的VEGF特異性單克隆抗體IgG(1μg/ml)、來自Santa Cruz Biotechnology公司的兔抗VEGF抗體(5μg/ml)、和具有無關特異性的IgG(10μg/ml)。
不同抗體(包括5μg/ml的2C3)的典型Western印漬顯示大約42kDa的二聚體VEGF大條帶。12D7、7G3、和陽性對照抗體顯示大約130kDa的多聚體VEGF。
4.腫瘤免疫組織化學通過免疫組織化學檢驗的腫瘤是來自癌癥患者的各種類型的人腫瘤、到小鼠中生長的各種類型的可移植人腫瘤異種移植物、在豚鼠中生長的豚鼠系10腫瘤、和小鼠中的小鼠3LL腫瘤(詳情見表3的說明)。
測定了3E7、GV39M、和11B5對NCI-H358人NSCLC異種移植物的免疫組織化學反應性，并與對照抗體(具有無關特異性的IgG；A-20，兔抗VEGF抗體；和MECA 32，大鼠抗小鼠內皮細胞抗體)進行比較。使用間接免疫過氧化物酶技術對SCID小鼠中NCI-H358人NSCLC的8μm冷凍切片進行染色，并蘇木精進行復染。
測定發現，識別VEGF上表位組1的GV39M和11B5在檢驗的所有腫瘤中使血管內皮細胞強烈染色，使血管周圍結締組織中度染色。表位組1抗體與腫瘤細胞的反應性是不同的，GV39M與腫瘤細胞只微弱反應，而11B5的反應更強烈。被MECA 32(小鼠)或TEC 11(人)染色的內皮細胞中有大約80％也被GV39M和11B5染色。
識別VEGF表位組2的3E7和7G3在檢驗的所用腫瘤中顯示與血管內皮細胞、結締組織、和腫瘤細胞有反應性(表3)。內皮細胞的染色強度通常比腫瘤細胞或結締組織強烈，特別是以低濃度(1-2μg/ml)應用抗體時，對血管內皮的選擇性顯著增加。
表3.抗VEGF抗體在腫瘤切片上的免疫組織化學反應性內皮細胞染色組 克隆1反應性2異種移植物3人腫瘤4豚鼠腫瘤5小鼠腫瘤6(多種)(多種) (系10)(3LL)1GV39M EC＞CT＞TC3-4+ 2-3+ 4+ 3+111B5EC＞CT＝TC3+3+3+ 3+23E7 EC＞CT＝TC2+2+2+ 1-2+27G3 EC＞CT＝TC3+2-3+ 3+ 2+312D7NR- - - -42C3 NR- - - -通過標準免疫組織化學技術在丙酮固定的腫瘤組織冷凍切片上進行免疫組織化學分析。對切片進行顯微鏡檢查，并如下對反應性進行評分-，陰性；+/-，很微弱；1+，微弱；2+，中等；3+，強烈；4+，很強烈。1.2C3和12D7以20μg/ml應用；所有其它抗體以5-10μg/ml應用。2.反應性定義EC＝內皮；CT＝結締組織；TC＝腫瘤細胞；NR＝沒有反應。3.檢驗的人腫瘤異種移植物NCI-H358 NSCLC、NCI-H460 NSCLC、HT29結腸腺癌、L540Hodgkin氏淋巴瘤。4.檢驗的人腫瘤軟組織肉瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、腎癌、乳房癌、腮腺癌、結腸癌、肺癌、和子宮內膜癌。5.與系10豚鼠腫瘤切片中豚鼠VEGF的反應性。6.與小鼠3LL Lewis肺癌腫瘤切片中小鼠VEGF的反應性。
12D7和2C3不使任何腫瘤組織的冷凍切片染色，大概是因為組織的丙酮固定破壞了抗體結合。然而，2C3在注射到體內后定位于腫瘤組織(見下文)。
GV39M、11B5、3E7、和7G3與在豚鼠中生長的豚鼠系10腫瘤和在小鼠中生長的小鼠3LL腫瘤的冷凍切片上的嚙齒類血管結構發生反應。GV39M、11B5、和7G3與豚鼠和小鼠腫瘤血管結構的反應性和它們與人腫瘤標本中人血管結構的反應性一樣強烈。3E7使小鼠3LL腫瘤的染色強度低于它使豚鼠或人腫瘤切片的染色強度，說明3E7與小鼠VEGF的親和力較低。這些結果與間接ELISA分析是一致的。在間接ELISA中，除2C3以外的所有抗體均與小鼠VEGF發生反應。實施例2.2C3抑制內皮細胞遷移A.材料和方法內皮細胞生長測定將成年牛主動脈內皮(adult bovine aortic endothelial，ABAE)細胞以1500細胞/孔的濃度鋪在96孔組織培養板中，并在存在0.5nM人VEGF、加入各種樣品和對照抗體的情況中進行培養。對照孔接受含或不含VEGF的培養基。
溫育4天后，通過MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓鹽，內鹽)轉變測定法進行量化，其中MTS轉變成甲的量與細胞數目成比例，而且可以通過490nM的吸光率進行追蹤(Cell Titer 96 Aqueous One Solution CellProliferation Assay，Promega，Madison，WI)。參照制造商的指示進行測定。
通過減去未加入VEGF培養物的MTS轉變來評估細胞生長。結果以相對于只加入VEGF的對照培養物的MTS轉變的百分比來表述(Buttke等人，1993)。B.結果對VEGF介導的內皮細胞生長的抑制識別VEGF上表位組1-3的IgG抗體3E7和12D7不抑制VEGF介導的ABAE細胞生長(圖1)，說明它們是非阻斷性的抗VEGF抗體，這類抗體的表位不涉及VEGFKDR相互作用。同樣識別VEGF上表位組1-3的IgM抗體GV39M也不抑制VEGF介導的ABAE細胞生長，也是非阻斷性的抗VEGF抗體。
相反的，針對VEGF上表位4的2C3和參考的中和性抗VEGF抗體mAb4.6.1分別在3nM和1nM將VEGF介導的ABAE細胞生長抑制了50％(圖1)。這說明2C3能夠中和VEGF的促有絲分裂活性。
2C3作為阻斷性mAb的定義區別了2C3與GV39M、3E7、和12D7以及其它一系列抗體。已知多種抗VEGF抗體(諸如Ab-3)是非阻斷性的單克隆，與2C3明顯不同。
IgM抗體之一，11B5，在8nM或更高濃度對ABAE細胞有毒性。細胞在30分鐘內分離，并在24小時內攝取錐蟲藍染料。這種效果似乎具有細胞種類特異性，因為甚至當11B5的濃度達到40nM時，HUVEC、豬主動脈內皮細胞、和bEND.3細胞也不受11B5的影響。11B5的有毒效果似乎不依賴生長因子，因為它在不加入VEGF時和存在堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)時均發生。實施例3.2C3在體內特異性定位于腫瘤A.材料和方法趨向人腫瘤異種移植物的體內定位在免疫缺損的小鼠的皮下培養腫瘤(NCI-H358 NSCLC在nu/nu小鼠中，HT29結腸腺癌在SCID小鼠中)直至腫瘤體積達到大約1cm3。經尾靜脈給SCID小鼠靜脈內注射100μg未標記抗體，給裸鼠靜脈內注射100μg生物素化抗體。24小時后，麻醉小鼠，用PBS灌注，收集腫瘤和器官，包括心、肺、肝、腎、腸、和脾，并在液氮中快速冷凍。
在低溫恒溫器上對來自每只小鼠的腫瘤和器官進行切片，并如上所述對抗體進行免疫組織化學染色，其中不同處是來自裸鼠的切片用過氧化物酶標記的鏈霉親和素-生物素復合物(Dako，Carpinteria，CA)進行顯色，來自SCID小鼠的切片用兩種過氧化物酶綴合的二抗進行顯色，其中先用山羊抗小鼠IgG+IgM，隨后是兔抗山羊IgG。B.結果在攜有腫瘤的小鼠中的體內定位測定了2C3、3E7、和GV39M在人腫瘤異種移植物中的體內定位。將100μg生物素化的2C3或同種型匹配的對照IgG靜脈內注射到攜有NCI-H358人NSCLC的nu/nu小鼠中。將100μg GV39M和3E7或同種型匹配的對照IgG注射到攜有HT29人結腸腺癌的SCID小鼠中。24小時后，處死小鼠，放血，并切下腫瘤和組織。對腫瘤和組織的冷凍切片進行免疫組織化學分析，以測定抗體的結合和分布(表4)。
表4.抗VEGF抗體在攜有腫瘤小鼠中的組織分布抗體 免疫組織化學反應性心 肺肝腎1腸脾腫瘤22C3 -- - - - - 3+3E7 -- - - - - 1-2+GV39M-- - 2+ - - 2+對照3-- - - - - -在丙酮固定的組織冷凍切片(包括腫瘤)上進行免疫組織化學分析。作為切片來源的攜有腫瘤小鼠在靜脈內接受100mg指定抗體后24小時處死。對切片進行顯微鏡檢查，并如下對特異反應性進行評分-，陰性；+/-，很微弱；1+，微弱；2+，中等；3+，強烈；4+，很強烈。1.GV39M特異性結合腎小球內皮或系膜細胞。2.3E7和GV39M特異性結合腫瘤血管內皮，而2C3特異性結合腫瘤基質。3.對照＝具有無關特異性的IgM。
3E7特異性定位于腫瘤內的血管內皮。大約70％的MECA 32陽性血管被注射到體內的3E7染色。供給微血管結構的較大血管是3E7陽性的。基質束和腫瘤巢中的小型微血管也都是3E7陽性的。3E7的染色強度在病灶壞死區域內或附近增強。在腫瘤的壞死區域內，血管外抗體是明顯的；但是在腫瘤的健康區域內，血管外染色很不明顯。在檢驗的所有正常組織(包括腎)中，血管內皮未被3E7染色。
GV39M也特異性定位于腫瘤的血管內皮。腫瘤中大約80％的MECA32陽性血管被GV39M染色。GV39M陽性血管均勻分布于腫瘤內，包括大型血管和小型毛細血管。與3E7相同的是，GV39M陽性血管的染色強度在腫瘤中的病灶壞死區域內增強。但是，與3E7不同的是，腎小球內皮細胞或系膜細胞也被染色。GV39M對腎小球的染色似乎具有抗原特異性，因為具有無關特異性的對照IgG對腎小球不染色。除腎以外組織中的血管內皮不被GV39M染色。
生物素化的2C3在靜脈內注射后使H358人NSCLC腫瘤血管結構周圍的結締組織強烈染色。連接腫瘤細胞巢的大片基質組織被2C3染色，在最大的基質片中觀察到最強烈的定位。想要區別這些區域內的血管內皮與周圍結締組織是不可能的。然而，未由基質包圍的血管中的內皮細胞是染色的，諸如穿過腫瘤細胞巢本身的血管。在檢驗的任何正常組織中，沒有檢測到2C3的染色。
在HT29人腫瘤模型中，2C3還強烈定位于結締組織，但是在腫瘤的壞死區域內觀察到最大染色強度。實施例4.2C3抑制VEGF結合VEGFR2而非VEGFR1A.材料和方法1.細胞系和抗體由Johannes Waltenberger博士(Ulm，德國)處獲得轉染了VEGFR1(PAE/FLT)或VEGFR2(PAE/KDR)的豬主動脈內皮(PAE)細胞，如Waltenberger等人(1994，本文特別收入作為參考)所述制備，并在含5％FCS/L-谷氨酰胺/青霉素/鏈霉素(GPS)的F-12培養基中進行培養。由Werner Risau博士(Bad Nauheim，德國)處獲得bEND.3細胞，并在含5％FCS/GPS的DMEM培養基中進行培養。在含10％FCS/GPS的DMEM培養基中培養NCI-H358 NSCLC(由Adi Gazdar博士處獲得，CIT-SouthWestern，達拉斯，TX)、A673人橫紋肌肉瘤、和HT1080人纖維肉瘤(二者由美國典型培養物保藏中心獲得)。
2C3和3E7(抗VEGF單克隆抗體)、1A8(單克隆抗Flk-1抗體)、和T014(多克隆抗Flk-1抗體)如上文實施例1和Brekken等人(1998)和Huang等人(1998)所述(本文特別收入作為參考)。A4.6.1(小鼠抗人VEGF單克隆抗體)由Jin Kim博士(Genentech公司，CA)處獲得，且以前已有描述(Kim等人，1992；本文特別收入作為參考)。所用陰性對照抗體是由A.F.Williams處(MRC Cellular Immunology Unit，牛津，英國)處獲得的OX7(小鼠抗大鼠Thy1.1抗體)(Bukovsky等人，1983)和由ATCC獲得的C44(小鼠抗秋水仙素抗體)(Rouan等人，1990)。
2.ELISA分析將VEGFR1(Flt-1/Fc，R&D Systems，Minneapolis)細胞外結構域直接包被到微量滴定板的孔上，將VEGFR2(sFlk-1-生物素)細胞外結構域由NeutrAvidin(Pierce，Rockford，IL)包被的孔捕獲。在存在或不存在100-1000nM(15-150μg/ml)對照或待測抗體的情況中，在孔中溫育濃度為1nM(40ng/ml)的VEGF。然后在孔中溫育1μg/ml兔抗VEGF抗體(A-20，Santa Cruz生物技術公司，Santa Cruz，CA)。
通過加入過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體(Dako，Carpinteria，CA)和3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺(TMB)底物(Kirkegaard and PerryLaboratories公司)使反應顯色。15分鐘后用1M H3PO4終止反應，并用分光光度計讀取450nm讀數。
還進行了如下實驗用對照或待測IgG包被微量滴定板的孔，與VEGFFlt-1/Fc或VEGFsFlk-1-生物素一起溫育，然后分別用過氧化物酶標記的山羊抗人Fc(Kirdegaard and Perry Laboratories公司)或過氧化物酶標記的鏈霉親和素如上所述進行顯色和可視化。
3.共沉淀測定將40ng VEGF與2C3(20μg)或A4.6.1(10和1μg)的F(ab’)2在結合緩沖液(含1mM CaCl2/0.1mM CuSO4/0.5％胰蛋白胨的DMEM)中預先溫育30分鐘。然后加入200ng可溶性形式的VEGFR1(Flt/Fc)或VEGFR2(KDR/Fc，R&D Systems，Minneapolis，MN)，總體積50μl，并溫育2小時。使用蛋白A-Sepharose珠沉淀受體/Fc構建物，并用結合緩沖液將獲得的沉淀清洗4次。
向每個反應的上清液和沉淀中加入還原樣品緩沖液，將二者在12％SDS-PAGE上進行分析并轉移至PVDF膜。然后用小鼠抗VEGF抗體12D7(1.0μg/ml)探查膜，并在與過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(Kirkegaard and Perry Laboratories公司)溫育后通過超強信號化學發光底物(Pierce，Rockford，IL)進行顯色。也使用過氧化物酶綴合的山羊抗人Fc(Kirkegaard and Perry Laboratories公司)檢測可溶性受體/Fc構建物。B.結果1.2C3在ELISA中阻斷VEGF結合VEGFR2而非VEGFR1抗VEGF抗體2C3在ELISA實驗中阻斷VEGF結合VEGFR2(KDR/Flk-1)，但不阻斷VEGF結合VEGFR1(Flt-1)。當2C3摩爾數過量100倍和1000倍時，結合至VEGFR2包被孔的VEGF的量分別降至不存在2C3時結合量的26％和19％(圖2)。相反，當2C3摩爾數過量100倍和1000倍時，結合至VEGFR1包被孔的VEGF的量分別為不存在2C3時結合量的92％和105％(圖2)。
當非阻斷性單克隆抗VEGF抗體3E7或具有無關特異性的對照IgG過量100-1000倍時，結合VEGFR1或VEGFR2的VEGF的量不受影響(圖2)。A4.6.1阻斷VEGF結合VEGFR2(KDR/Flk-1)和VEGFR1(Flt-1)二者。
2.2C3在溶液中阻斷VEGF結合VEGFR2但不阻斷結合VEGFR1在共沉淀測定法中評價2C3阻斷VEGF結合溶液中VEGFR1/Fc或VEGFR2/Fc的能力。在存在或不存在2C3或4.6.1的F(ab’)2的情況中，將40ng VEGF與200ng連接Fc部分的VEGFR1細胞外結構域(Flt-1/Fc)或連接Fc部分的VEGFR2(KDR/Fc)一起溫育。通過與蛋白A Sepharose珠的溫育來沉淀受體/Fc構建物。用還原性樣品緩沖液清洗并重懸沉淀，在12％SDS-PAGE上分離，并轉移至PVDF。用PP82封閉膜，用小鼠抗VEGF抗體12D7(1μg/ml)探查，并在標準化學發光條件下顯色。檢測到與F(ab’)2一起的VEGF單體和二聚體。
將與VEGFR1/Fc或VEGFR2/Fc混和的VEGF通過蛋白A Sepharose共沉淀，顯示VEGF結合這兩種受體。加入的2C3 F(ab’)2阻斷VEGF結合VEGFR2/Fc，但不阻斷結合VEGFR1/Fc。相反，4.6.1 F(ab’)2阻斷VEGF結合VEGFR2/Fc和VEGFR1/Fc二者。這些結果確認了2C3可抑制VEGF結合VEGFR2但不抑制其結合VEGFR1，而4.6.1抗體抑制VEGF結合VEGFR2和VEGFR1二者。實施例5.2C3阻斷VEGF誘導的VEGFR2磷酸化A.材料和方法免疫共沉淀和Western印漬分析將PAE/KDR、PAE/FLT、和bEND.3細胞在100mm組織培養皿中在含5％血清的培養基中培養至80-90％匯合。然后將細胞在含0.1％血清的培養基中進行24小時的血清過饑。用溶于PBS的100nM原釩酸鈉預處理30分鐘后，在存在或不存在對照或待測抗體的情況中，將細胞與5nM(200ng/ml)VEGF165、5nM(100ng/ml)bFGF(R&D Systems，Minneapolis，MN)、或A673腫瘤條件培養基再溫育15分鐘。
然后用含10mM EDTA/2mM氟化鈉/2mM原釩酸鈉的冰冷PBS清洗細胞，并在裂解緩沖液(50mM Tris/150mM NaCl/1％Nonidet P-40/0.25％脫氧膽酸鈉/0.1％CHAPS/5mM EDTA/1.5mM MgCl2/2mM氟化鈉/2mM原釩酸鈉/10％甘油/蛋白酶抑制劑(完全蛋白酶抑制劑混和片劑，Boehringer Mannheim))中裂解。通過離心澄清裂解物，并將獲得的上清液用于免疫沉淀。
通過將細胞裂解物與5μg雞抗FLT-1 N末端抗體(Upstate生物技術公司，Lake Placid，NY)或10μg T014(親和純化的抗Flk-1)一起于4℃溫育過夜來分別免疫沉淀VEGFR1和VEGFR2。隨后將使用雞抗FLT-1抗體的反應體系與橋接的山羊抗雞抗體(Kirkegaard and PerryLaboratories公司)一起于4℃溫育1小時。然后用蛋白A/G Sepharose來沉淀免疫復合物，用溶于PBS-吐溫(0.2％)的10％裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑)清洗多次，并在含100mM β-巰基乙醇/8M尿素的SDS加樣緩沖液中煮沸。
然后通過SDS-PAGE分離樣品并轉移至PVDF膜。將膜用PP81(EastCoast Biologics，Berwick，ME)封閉30-60分鐘，并用0.5μg/ml 4G10(Upstate生物技術公司，Lake Placid，NY)于4℃探查磷酸酪氨酸殘基過夜。與過氧化物酶標記的兔抗小鼠IgG(Dako，Carpinteria，CA)溫育后，通過超強信號化學發光底物(Pierce，Rockford，IL)使PVDF膜顯色。然后將PVDF膜用ImmunoPure洗脫緩沖液(Pierce，Rockford，IL)于55℃剝離30分鐘，并用0.5μg/ml雞抗FLT-1抗體或1.0μg/mlT014再次探查受體水平，與合適的過氧化物酶綴合的二抗溫育后如上所述進行顯色。B.結果對VEGF誘導的磷酸化的阻斷在這些研究中，將PAE/KDR細胞用PBS、bGFG(5nM，100ng/ml)、VEGF165(5nM，210ng/ml)、A673條件培養基(CM)、CM與特定抗體(分別與CNTL、2C3、3E7、A4.6.1，100nM，15μg/ml)的聯合、或T014(100nM，15μg/ml)刺激15分鐘。PAE/FLT細胞也用PBS、VEGF165(5nM，210ng/ml)、A673條件培養基(CM)、CM與特定抗體(分別與2C3、3E7、A4.6.1，100nM，15μg/ml)的聯合、或T014(100nM，15μg/ml)刺激15分鐘。然后將細胞在裂解緩沖液中溫育，免疫沉淀受體，通過還原條件的SDS-PAGE分離，轉移至PVDF膜，用小鼠抗磷酸酪氨酸抗體4G10(0.5μg/ml)探查，并在標準化學發光條件下顯色。然后將膜剝離并用免疫沉淀IgG再次探查，以測定每條泳道中受體蛋白質的水平。
結果顯示，2C3與對照中和性抗VEGF抗體A4.6.1一起阻斷PAE/KDR細胞中VEGF誘導的VEGFR2磷酸化。這與以前證明2C3和A4.6.1都阻斷VEGF介導的內皮細胞生長的結果(實施例2；Brekken等人，1998)是一致的。對免疫沉淀物中的VEGFR2進行了Western印漬以證明每條泳道中VEGFR2蛋白質的量。識別VEGF氨基末端表位的3E7不阻斷VEGF誘導的VEGFR2磷酸化，具有無關特異性的對照IgG也不阻斷。
2C3對VEGF誘導的VEGFR1磷酸化的影響還不清楚。正如其他研究人員已經顯示的，想要演示PAE/FLT細胞中VEGF誘導的VEGFR1磷酸化是困難的，這可能是因為VEGFR1的內在激酶活性較低(De Vries等人，1992；Waltenberger等人，1994；Davis-Smyth等人，1996；Landgren等人，1998)。實施例6.2C3抑制VEGF誘導的通透性A.材料和方法Miles通透性測定遵循的方案是由Murohara等人(1998；本文特別收入作為參考)描述的。簡而言之，將400-450g雄性IAF無毛豚鼠(Charles River，Wilmington，MA)麻醉，然后經耳靜脈靜脈內注射0.5ml溶于無菌PBS的0.5％Evan氏藍色染料。20分鐘后，在存在或不存在對照或待測抗體的情況中，真皮內(i.d.)注射20ng VEGF。真皮內注射30分鐘后，對豚鼠背部出現的藍色斑點進行拍照，并用測徑器進行測量。B.結果2C3阻斷VEGF誘導的通透性為了調查2C3對VEGF誘導的通透性的影響，將體重400-450g的IAF無發豚鼠(Hartley種系)麻醉，并經耳靜脈靜脈內注射0.5ml溶于無菌PBS的0.5％Evan氏藍色染料。20分鐘后，在存在或不存在對照或待測抗體的情況中，真皮內注射25ng VEGF。真皮內注射30分鐘后，對豚鼠背部出現的藍色斑點進行拍照，并用測徑器進行測量。
使用這種Miles通透性測定法發現，阻斷VEGF激活VEGFR2的2C3在豚鼠中抑制VEGF誘導的通透性。當2C3摩爾數比VEGF過量10倍、100倍、或1000倍時，這種影響是明顯的。阻斷VEGF激活VEGFR1和VEGFR2二者的A4.6.1在摩爾數過量10倍時阻斷VEGF誘導的通透性(本項研究和Kim等人，1992)。3E7和不阻斷VEGFVEGFR2相互作用的對照IgG在豚鼠的Miles通透性測定法中也不阻斷VEGF誘導的通透性。
這些結果說明，由VEGF介導的內皮通透性至少部分是由VEGFR2激活介導的。這些結果與其他研究人員顯示的“VEGFR2的酪氨酸激酶活性對于VEGF誘導的通透性是必需的”結果是一致的(Murohara等人，1998；Joukov等人，1998；Ogawa等人，1998)。實施例7.2C3的抗腫瘤效果A.材料和方法1.體內腫瘤生長抑制在第0天給nu/nu小鼠皮下注射1×107個NCI-H358 NSCLC細胞或5×106個A673橫紋肌肉瘤細胞。在第1天和隨后每周2次給小鼠腹膜內注射1、10、或100μg 2C3或指定對照。然后每周2次測量腫瘤，攜有NCI-H358的小鼠進行大約6周，攜有A673的小鼠進行4周。按照公式計算腫瘤體積體積＝L×W×H，其中L＝長度，W＝寬度，H＝高度。
2.體內腫瘤療法給皮下攜有200-400mm3的NCI-H358腫瘤或HT1080纖維肉瘤的雄性nu/nu小鼠腹膜內注射待測抗體或對照抗體。給攜有NCI-H358的小鼠第1周注射3次，第2周和第3周各注射2次，每次注射100μg抗體。然后給小鼠每5天注射1次，每次50μg。給攜有HT1080的小鼠在研究期間隔天用100μg指定抗體或生理鹽水進行處理。在這兩項研究中，在腫瘤達到2500mm3之時或之前(如果腫瘤開始潰爛)處死小鼠。B.結果1.新植入的人腫瘤異種移植物的2C3生長抑制2C3以依賴劑量方式抑制NCI-H358 NSCLC和A673橫紋肌肉瘤在nu/nu小鼠中的體內生長(圖3A和圖3B)。對1天前皮下注射腫瘤細胞的小鼠每周2次腹膜內給藥100μg 2C3，可抑制兩種人腫瘤的生長。在兩種腫瘤系統中，2C3接受者中腫瘤的最后體積為大約150mm3，作為對比，對照接受者為大約1000mm3。
每周2次使用10或1μg 2C3進行的治療對于防止腫瘤生長效果較低。但是，與未處理小鼠相比，這兩種較低劑量的2C3確實將A673腫瘤的生長減慢了相似程度。由10μg劑量2C3引起的腫瘤生長遲滯在NCI-H358腫瘤模型中較不顯著。這兩種腫瘤模型之間及其對2C3抑制VEGFR2活性的應答之間的差異與這兩種腫瘤的體內侵入性有關。NCI-H358在體內的生長速度比A673慢得多，顯得對低劑量的2C3較不敏感；而A673腫瘤生長得很快，顯得對較低劑量的2C3更敏感。
結合VEGF但不阻斷其活性的3E7對NCI-H358腫瘤的生長沒有影響。然而，每周2次給予100μg 3E7可刺激A673腫瘤的生長(圖3B)，說明它可增加腫瘤內VEGF信號傳導的效率。
2.用2C3治療成形的人腫瘤異種移植物給皮下攜有長至大約300-450mm3的NCI-H358 NSCLC腫瘤的小鼠腹膜內注射2C3、A4.6.1、3E7、或具有無關特異性的IgG(圖4)。劑量為每3-5天50-100μg。A4.6.1作為陽性對照，因為其他研究人員顯示它在體內阻斷VEGF活性，導致腫瘤生長抑制(Kim等人，1993；Mesiano等人，1998)。除了測量平均腫瘤體積(圖4)，還對每個治療組的小鼠進行拍照，以顯示腫瘤大小和研究結束時外觀的差異。
使用2C3或A4.6.1進行的治療導致腫瘤在研究期間緩慢退化。研究結束時的平均腫瘤體積為最初平均腫瘤體積的30％(2C3)和35％(4.6.1)(圖4)。然而，因為在注射腫瘤細胞后40-60天之間在對照組小鼠中觀察到自發的腫瘤生長遲滯，這使得這些結果復雜化。在自發生長遲滯之前的40天，結果是明顯的，顯示使用2C3和A4.6.1的治療防止了腫瘤生長。
圖5A顯示了使用100μg 2C3或3E7在延長療程中治療攜有NCI-H358小鼠的進一步研究。在這項研究中，自發的退化較不顯著。2C3治療小鼠在治療開始時的平均腫瘤體積是480mm3，治療大約14周后平均腫瘤體積降至84mm3，體積縮小了大約80％。3E7治療小鼠開始治療時的平均腫瘤體積為428mm3并在大約14周后增加至1326mm3，體積增加了300％。
圖5B顯示了攜有人纖維肉瘤HT1080、隔天給藥100μg 2C3、3E7、對照IgG、或鹽水的小鼠的腫瘤生長曲線。只要繼續治療，2C3就抑制腫瘤生長。使用3E7、對照IgG、或鹽水治療的小鼠攜有的腫瘤日益生長，并在注射腫瘤細胞后不到4周就需要處死小鼠。實施例8.2C3與A4.6.1不同2C3與A4.6.1之間存在大量的差異(如表5)。根據ELISA交叉阻斷研究(實施例1)，這兩種抗體識別VEGF上的不同表位。更早的誘變和X射線結晶學研究顯示，A4.6.1結合的VEGF上集中于第89-94位氨基酸附近的表位(Muller等人，1998)。
特別感興趣的的事實是，A4.6.1阻斷VEGF結合VEGFR1和VEGFR2二者(Kim等人，1992；Wiesmann等人，1997；Muller等人，1998；Keyt等人，1996)，而2C3只阻斷VEGF結合VEGFR2(實施例4)。關于A4.6.1抑制VEGF結合VEGFR2和VEGFR1的引人注目的已發表證據來自詳細的結晶學和結構研究(Kim等人，1992；Wiesmann等人，1997；Muller等人，1998；Keyt等人，1996；本文收入作為參考)。已發表的資料指出，A4.6.1通過競爭VEGF上對結合VEGFR2重要的表位來抑制VEGF結合VEGFR2，并最可能通過空間位阻來阻斷VEGF結合VEGFR1(Muller等人，1998；Keyt等人，1996)。
人化形式的A4.6.1目前正進行臨床試驗(Brem，1998；Baca等人，1997；Presta等人，1997；本文收入作為參考)。巨噬細胞/單核細胞趨化性和VEGF經VEGFR1介導的其它內源功能很有可能在A4.6.1試驗中受損。相反，由于2C3能夠特異性阻斷VEGFR2介導的效果，所以認為2C3是更好的。由此，2C3是潛在更安全的抗體，特別是對于人的長期施用。使用2C3進行治療的好處包括，通過使得巨噬細胞能夠遷移至腫瘤，同時阻斷VEGF誘導的腫瘤血管結構擴張，從而使宿主能夠發動更強的抗腫瘤應答。同樣不應當忽視維持巨噬細胞的趨化性和由VEGFR1介導的其它效果的許多系統優勢。
表5.抗VEGF抗體2C3和A4.6.1的特征特征2C3A4.6.1同種型 IgG2a，k IgG11VEGF上的表位未描述，但是與 連續的，集中于A4.6.1不同2第89-94位氨基酸附近親和力 1×10-9(M)38×10-10(M)阻斷VEGF結合VEGFR1 否 是阻斷VEGF結合VEGFR2 是 是阻斷VEGF誘導的通透性是 是阻斷VEGF誘導的增殖 是 是冷凍腫瘤切片上的直接IHC NR 與有些BV有微弱反模式 應性4體內腫瘤定位模式與CT有中等-強烈的反應性與少數BV有中等反應性，與CT有微弱-無反應性體內正常小鼠組織定位檢測不到 檢測不到所用縮寫IHC，免疫組織化學；NR，無反應性；BV，血管；CT，結締組織。1.關于A4.6.1資料的參考文獻包括Kim等人，1992；Wiesmann等人，1997；Muller等人，1998；和Keyt等人，1996，本文收入作為參考。2.2C3在VEGF上識別的表位尚未描述，但是已經由ELISA交叉阻斷研究顯示與A4.6.1識別的表位不同。3.2C3與VEGF的親和力通過ELISA和表面激元共振分析估計。4.A4.6.1只與略微固定的丙酮固定冷凍切片發生反應。實施例9.關節炎組織中的VEGF染色血管發生與疾病之間的聯系要超出在血管化腫瘤中所觀察到的。例如，在關節炎中清楚的記錄了涉及異常血管發生。已經將1組不同的抗VEGF抗體和針對胸苷磷酸化酶的抗體用于使關節炎組織染色并與匹配對照區分開來。使用針對VEGF抗體的研究顯示，在類風濕性關節炎血管翳中有驚人表達。實施例10.2C3-抑內皮素綴合物A.抑內皮素的克隆和表達由小鼠肝分離RNA，并在使用下列引物的RT-PCRTM中作為模板5’引物aga cca tgg gtc ata ctc atc agg act ttc a(SEQ ID NO43)；3’引物ctac cat ggc tat ttg gag aaa gag gtc a(SEQ ID NO44)。
產生的cDNA片段具有DNA序列SEQ ID NO12和氨基酸序列SEQ IDNO13。作為參考，人抑內皮素氨基酸序列顯示于SEQ ID NO14。將小鼠cDNA片段克隆到表達載體H6pQE60(Qiagen)中，該載體編碼N末端6組氨酸標簽。然后在大腸桿菌M15中表達。當大腸桿菌細胞密度在560nm的光密度達到0.6時，加入0.1M異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)4小時來誘導6His-抑內皮素表達。通過離心收獲細胞，并在裂解緩沖液B-PER細菌蛋白質提取試劑(Pierce，Rockord，IL)中裂解。
通過離心沉淀包含6-His-抑內皮素的包涵體，并溶解于緩沖液A(pH8.0，6M胍-HCl(GuHCl)/100mM NaH2PO4/10mM Tris/10mM咪唑/10mM β-2巰基乙醇)。用過量的5，5’-二硫化-二-(2-硝基苯甲酸)(Ellman氏試劑)(20mM)處理含還原態6-His-抑內皮素的溶液，并上樣到Ni-NTA柱上。用清洗緩沖液(6M GuHCl/100mM NaH2PO4/10mMTris/500mM NaCl，pH7.3)清洗柱子，并用溶于清洗緩沖液的0.2M咪唑由柱子洗脫6His-抑內皮素。
用等體積的重新折疊緩沖液(3M尿素/1M Tris pH7.3/0.5M L-精氨酸/0.5M NaCl/0.1M Na2HPO4/1mM還原態谷胱甘肽(GSH))稀釋洗脫的不溶性6His-抑內皮素，并于室溫溫育過夜。將重新折疊的6His-抑內皮素在PBS(pH7.4)中于室溫長時間透析。獲得的蛋白質6His-抑內皮素是可溶性的，而且根據非還原條件下的SDS-PAGE分析顯示是高度純的，為20kDa的單一條帶。B.抑內皮素的功能活性除了表達的蛋白質是完全可溶的事實，表明大腸桿菌表達的6His-抑內皮素具有生物學活性的其它證據包括與內皮細胞的結合。制備生物素化的6His-抑內皮素，并與3種不同的內皮細胞(Bend3小鼠內皮細胞；ABAE，牛主動脈內皮細胞；和HUVEC，人臍靜脈內皮細胞)一起在體外溫育。使用鏈霉親和素-過氧化物酶與鄰亞苯基二胺(OPD)檢測結合，并讀取490nm的吸光率。
直接結合研究顯示，(生物素化的6His-)抑內皮素以可飽和方式在體外結合這3種不同內皮細胞。同樣，表達的抑內皮素(無標記)顯示可與生物素化的抑內皮素競爭與Bend3內皮細胞的結合。C.抑內皮素與2C3經SMPT和2-IT的綴合向2C3 IgG中以摩爾比5∶1(SMPT∶2C3)加入溶于N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)的4-琥珀酰亞胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(SMPT)，并在含5mM EDTA的PBS(PBSE)中于室溫溫育1小時。通過在PBSE中進行G25大小排阻層析除去游離的SMPT。同時將小鼠6His-抑內皮素與2-亞氨基硫戊環(2-IT，Traut氏試劑)以摩爾比1∶5(抑內皮素∶2-IT)一起于室溫溫育1小時。通過在PBSE中進行G25大小排阻層析除去游離的2-IT。
將SMPT修飾的2C3與2-IT修飾的6His-抑內皮素混和，濃縮至3-5ml，并于室溫溫育24小時，輕微搖動。通過SDS-PAGE分析反應。通過肝素親和層析由綴合物除去未綴合的2C3-SMPT，由此提供2C3-抑內皮素。D.抑內皮素與2C3經SMCC和SATA的綴合將N-琥珀酰亞胺S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)與6His-抑內皮素以摩爾比6∶1(SATA∶抑內皮素)一起于室溫溫育30分鐘。通過在PBSE中進行的G25大小排阻層析除去游離的SATA。將溶于PBSE的SATA修飾的6His-抑內皮素濃縮至4.0ml，并加入0.4ml脫乙酰化溶液(0.1M羥胺)。將混和物于室溫溫育2小時。同時將2C3 IgG與琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)以摩爾比1∶5(2C3∶SMCC)一起在PBSE中溫育。通過在PBSE中進行的G25大小排阻層析除去游離的SMCC。
然后將脫乙酰化SATA修飾的抑內皮素與SMCC修飾的2C3一起溫育，在氮氣中將總蛋白質濃縮至大約5mg/ml，并于室溫溫育過夜，輕微搖動。通過SDS-PAGE分析反應。通過在PBSE中進行的肝素親和層析由2C3-抑內皮素綴合物除去未綴合的2C3-MCC，由此提供2C3-抑內皮素。使用2-亞氨基硫戊環而非SATA作為硫化試劑也能實現成功的綴合。E.2C3與抑內皮素的融合蛋白由于可以獲得(且本文提供)小鼠和人抑內皮素以及2C3的DNA序列，因此可以容易的制備2C3-抑內皮素融合蛋白質。如上所述，抑內皮素的表達和重新折疊顯示這一分子的重組表達完全可能成功。
2C3-抑內皮素融合蛋白質的制備形式可以是抑內皮素存在于2C3重鏈的C末端，或者連接至2C3 scFv片段。在這些情況中，重組技術能夠容易的改變連接，而且特別希望使用選擇性可切割序列來連接兩個功能部分。目前優選纖溶酶或MMP可切割的序列。
選擇性可切割序列的有效性和重組技術的適應性還提供了抑內皮素替代2C3構建物中另一點的2C3-抑內皮素融合蛋白質。抑內皮素將保持包埋在2C3內，直至接觸了作用于選擇性可切割序列的酶，在該點由融合蛋白質釋放功能性抑內皮素。實施例11.2C3-Ang-2綴合物A.Ang-2的表達為了構建2C3-Ang-2綴合物，優選使用重組形式的Ang-2，可以使用桿狀病毒表達系統在昆蟲細胞中進行生產。目前優選用于Ang-2表達和純化的方案包括由小鼠胎盤RNA通過RT-PCRTM克隆Ang-2 cDNA并將Ang-2 cDNA克隆到pFastBac1表達載體中。用重組質粒轉化DH10Bac大腸桿菌感受態細胞。
抗生素選擇后，挑取包含重組桿粒(Bacmid)的大腸桿菌菌落，培養，并純化重組桿粒DNA。用重組桿粒DNA使用Cellfectin試劑轉染昆蟲細胞SF9。由經轉染SF9細胞的上清液收獲重組桿狀病毒。擴增重組桿裝病毒，并用于感染SF9細胞，被感染的SF9細胞將表達Ang-2。由這些經感染SF9細胞的上清液通過親和純化來純化Ang-2。B.Ang-2與2C3的綴合使用化學接頭SMPT，通常如上所述使純化的2C3綴合重組Ang-2。以5∶1的摩爾比(SMPT∶2C3)向2C3 IgG中加入溶于N’，N-二甲基甲酰胺(DMF)的SMPT，并在含5mM EDTA的PBS(PBSE)中于室溫溫育1小時。通過在PBSE中進行的G25大小排阻層析除去游離的SMPT。同時，將重組Ang-2與2-IT于室溫一起溫育。通過在PBSE中進行的G25大小排阻層析除去游離的2-IT。
將SMPT修飾的2C3與2-IT修飾的Ang-2混和，濃縮，并于室溫溫育24小時，輕微搖動。通過SDS-PAGE分析反應。通過凝膠過濾層析由綴合物除去未綴合的2C3-SMPT，由此提供2C3-抑內皮素。實施例12.2C3-組織因子綴合物如上文實施例所述，用SMPT修飾2C3。如上所述通過G25層析除去游離的SMPT，不同之處是在氮氣中收集洗脫峰(2C3-SMPT)。取600μl 2C3-SMPT，在加入二硫蘇糖醇(DTT)至50mM后，對硫代吡啶基(thiopyridyl)進行定量。平均每個IgG中導入了3個MPT基團。用5mMβ2-ME還原在N末端導入了一個半胱氨酸殘基的人截短的組織因子(tTF)。通過G25層析除去β2-ME。
將還原的N-Cys-tTF與2C3-SMPT以2.5∶1(tTF∶IgG)的摩爾比合并，并于室溫溫育24小時。使用裝備了截留分子量(MWCO)50,000的膜的Amicon，將反應體系濃縮至1-2ml。通過Superdex 200大小排阻層析將未綴合的tTF和IgG與綴合物分開，因此提供2C3-tTF。實施例13.2C3-CRM107綴合物用SMPT修飾2C3。如上文實施例所述，用2-IT修飾細胞毒性劑CRM107(來自Jerry Fulton博士，Inland Laboratories，DeSoto，TX)。將SMPT修飾的2C3與2-IT修飾的CRM107以1∶5(IgG∶CRM107)的摩爾比率于室溫溫育24小時，輕微搖動。通過Superdex 200大小排阻層析將綴合的2C3與游離反應物分開，由此提供2C3-CRM107。實施例14.2C3藥物前體研究A.β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的克隆和表達包含大腸桿菌GUS基因的質粒(pBacgus-1)是由Novagen公司獲得的。將質粒在PCR中作為模板用于將GUS基因克隆到H6pQE60表達載體中，該表達載體編碼N末端6×組氨酸標簽。培養攜帶該質粒的大腸桿菌M15細胞直至細胞密度在560nm的光密度達到0.6。加入0.1mM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)來誘導6His-GUS的表達。4小時后，通過離心收獲細胞。
將大腸桿菌沉淀在細胞裂解緩沖液(B-PER細菌蛋白質提取試劑(Pierce，Rockford，IL))中進行裂解。將溶液上樣到Ni-NTA柱上，用清洗緩沖液(6M CuHCL/100mM NaH2PO4/10mM Tris/500mM NaCl，pH7.3)清洗柱子，并用溶于相同緩沖液的0.2M咪唑洗脫結合的6His-GUS。
根據SDS-PAGE，6His-GUS是純的，顯示為75kDa的單一條帶。在凝膠過濾柱上，6His-GUS顯示為大約300kDa的四聚體。根據6His-GUS切割底物對-硝基苯基-β-D-葡糖苷酸(PNPG)的能力判斷它具有酶活性。B.2C3與β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的綴合將N-琥珀酰亞胺S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)與GUS以摩爾比6∶1(SATA∶GUS)一起于室溫溫育30分鐘。通過在PBSE中進行的G25大小排阻層析除去游離的SATA。將PBSE中SATA修飾的GUS濃縮至4.0ml，并加入0.4ml脫乙酰化溶液(0.1M羥胺)。將混和物于室溫溫育2小時。同時將2C3 IgG與琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)以摩爾比1∶5(2C3∶SMCC)一起在PBSE中溫育。通過在PBSE中進行的G25大小排阻層析除去游離的SMCC。
然后將脫乙酰化的SATA修飾的GUS與SMCC修飾的2C3一起于室溫溫育過夜，并輕微攪拌。通過Q-Sepharose的離子交換層析除去游離的GUS，而游離的2C3和2C3-GUS綴合物在溶于PBS的0.5M NaCl中洗脫下來。通過Superdex 200大小排阻層析分離獲得的溶液，產生純度90％的2C3-GUS。C.2C3-GUS綴合物的生物學活性確認了2C3-GUS綴合物中每種成分的生物學活性。根據HRP標記的抗小鼠IgG(二抗)和OPD的檢測結果，2C3-GUS在適當控制的ELISA中特異結合VEGF包被的孔。在0.1nM觀察到最大結合半值。由此，2C3的結合部分功能發揮正常。GUS部分也保留了酶活性。
用125I標記2C3-GUS，比活5×106cpm/μg。靜脈內注射到小鼠體內后，放射性碘化的2C3-GUS由血液清除的速率為t1/2α大約6小時，t1/2β大約25小時。D.GUS可切割藥物前體基本上如美國專利5,561,119(本文特別收入作為參考)所述制備β-葡糖苷酸的藥物前體，諸如羥基紅比霉素-β-葡糖苷酸和卡西霉素-β-葡糖苷酸。這些藥物前體被設計成只有在受到糖苷酶(諸如GUS)降解時才釋放細胞毒性成分，諸如羥基紅比霉素或卡西霉素。通過將GUS附著于2C3，從而將GUS特異性靶向腫瘤血管結構和基質，由此提供對藥物前體的特異性切割并在腫瘤位點內特異性釋放細胞毒性成分。E.2C3-GUS綴合物的生物學活性2C3-GUS在靜脈內注射到皮下攜有人NCI-H358 NSCLC腫瘤的SCID小鼠體內后特異性定位于腫瘤血管結構和周圍腫瘤基質。通過使用HRP標記的抗小鼠IgG或使用HRP標記的抗GUS的免疫組織化學，在腫瘤冷凍切片上檢測到2C3-GUS的存在。在注射2C3-GUS后24-48小時后觀察到最大定位。正常組織未被染色。2C3-GUS趨向腫瘤血管結構和周圍腫瘤基質的特異性定位使得能夠系統施用藥物前體，諸如羥基紅比霉素-葡糖苷酸或卡西霉素-葡糖苷酸，并將只有在腫瘤內被激活。
本文所述雜交瘤細胞系已經依照布達佩斯條約的規定保藏于美國典型培養物收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，Manassas，VA，美國；編號ATCC No.PTA 1595。本文描述和要求的發明不限于所保藏的PTA 1595細胞系的范圍，因為所保藏的實施方案只是本發明的一個方面的例示，產生功能上等同的單克隆抗體的任何等同的雜交瘤細胞系都屬于本發明的范圍。事實上，無需過多實驗，根據本公開書即可以生成和執行本文公開和要求的所有組合物和方法。
在以優選實施方案的形式描述了本發明的組合物和方法之后，對于本領域技術人員顯而易見的是，可以在本文所述的組合物、方法、和方法的步驟或一系列步驟中采用變異，而不偏離本發明的概念、精神、和范圍。更具體的說，顯而易見的是，可以用涉及化學和物理學的某些試劑替代本文所述的試劑而仍獲得相同或相似的結果。對于本領域技術人員而言顯而易見的所有這些相似替代和修飾，被認為是屬于由所附權利要求書定義的本發明的精神、范圍和概念。
參考文獻本文特別收入下列參考文獻作為參考，它們提供了例示性方案或其它細節作為本說明書的補充。Abrams和Oldham，在《人類癌癥的單克隆抗體療法》(MonoclonalAntibody Therapy of Human Cancer)中，Foon和Morgan編，Martinus Nijhoff出版社，波士頓，第103-120頁，1985。Aiello、Pierce、Foley、Takagi、Chen、Riddle、Ferrara、King、Smith，“使用可溶性VEGF受體嵌合蛋白質抑制血管內皮生長因子(VEGF)從而在體內抑制視網膜新血管形成”，美國國家科學院進展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9210457-10461，1995。Akuzawa、Kurabayashi、Ohyama、Arai、Nagai，“在THP-1細胞中誘導巨噬細胞分化時鋅指轉錄因子Egr-1激活Flt-1基因表達”，動脈硬化、血栓、和血管生物學(Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology)20(2)377-84，2000。Alon、Hemo、Itin、Pe’er、Stone、Keshet，“血管內皮生長因子擔當新形成的視網膜血管的存活因子并指示早熟性視網膜病變”，自然醫學(Nature Med.)11024-1028，1995。《抗體實驗室手冊》(AntibodiesA Laboratory Manual)，冷泉港實驗室，1988。Anthony、Wheeler、Elcock、Pickett、Thomas，“簡短報告人胎盤和培養胎盤成纖維細胞中血管內皮生長因子mRNA表達的特殊模式的鑒定”，胎盤(Placenta)15557-61，1994。Asahara等人，“血管發生的推斷起源內皮細胞的分離”，科學(Science)275(5302)964-967，1997。Asahara、Chen、Takahashi、Fujikawa、Kearney、Magner、Yancopoulos、Isner，“Tie2受體配體、促血管生成素-1、和促血管生成素-2調控VEGF誘導的出生后新血管形成”，循環研究(Circ.
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權利要求
1.包含生物學有效量的抗VEGF抗體或其抗原結合片段的組合物，該抗體或其抗原結合片段結合的表位與單克隆抗體ATCC PTA 1595基本上相同，并顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2(KDR/Flk-1)而不顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR1(Flt-1)。
2.權利要求1的組合物，其中所述抗體是單克隆抗體或其抗原結合片段。
3.權利要求1或2的組合物，其中所述抗體是IgG抗體或IgM抗體。
4.權利要求1或2的組合物，其中所述抗體是抗體的scFv、Fv、Fab’、Fab、diabody、線性抗體、或F(ab’)2抗原結合片段。
5.任何上述權利要求的組合物，其中所述抗體是該抗體或其抗原結合片段的二聚體、三聚體、或多聚體。
6.任何上述權利要求的組合物，其中所述抗體是人、人化、或部分人化的抗體或其抗原結合片段。
7.權利要求6的組合物，其中所述抗體包含可操作附著人抗體框架或恒定區的該抗體抗原結合區。
8.任何上述權利要求的組合物，其中所述抗體是嵌合抗體。
9.任何上述權利要求的組合物，其中所述抗體是重組抗體。
10.任何上述權利要求的組合物，其中所述抗體包含至少第一個可變區，該可變區包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或SEQ ID NO9的氨基酸序列區。
11.任何上述權利要求的組合物，其中所述抗體是單克隆抗體ATCC PTA 1595。
12.任何上述權利要求的組合物，其中所述抗體可操作附著至少第一種生物學試劑。
13.權利要求12的組合物，其中所述抗體可操作附著至少第一種試劑，該試劑可切割基本上無活性的藥物前體而釋放基本上有活性的藥物。
14.權利要求13的組合物，其中所述抗體可操作附著堿性磷酸酶，該酶可切割基本上無活性的磷酸-藥物前體而釋放基本上有活性的藥物。
15.權利要求12的組合物，其中所述抗體可操作附著至少第一種治療劑或診斷劑。
16.權利要求15的組合物，其中所述抗體可操作附著至少第一種治療劑。
17.權利要求16的組合物，其中所述抗體可操作附著至少第一種和第二種治療劑。
18.權利要求16或17的組合物，其中所述抗體可操作附著至少第一種化療劑、放療劑、抗血管發生試劑、誘導凋亡試劑、類固醇、抗代謝物、蒽環霉素、長春花生物堿、抗微管蛋白藥物、抗生素、細胞因子、烷化劑、或凝血劑。
19.權利要求18的組合物，其中所述抗體可操作附著能夠殺死內皮細胞或抑制內皮細胞生長或細胞分裂的毒害細胞、抑制細胞、或抗細胞的試劑。
20.權利要求19的組合物，其中所述抗體可操作附著由植物、真菌、或細菌衍生的毒素。
21.權利要求20的組合物，其中所述抗體可操作附著A鏈毒素、核糖體滅活蛋白、α-帚曲菌素、gelonin、曲霉菌素、局限曲菌素、核糖核酸酶、表鬼臼毒素、白喉毒素、或假單胞菌外毒素。
22.權利要求21的組合物，其中所述抗體可操作附著蓖麻毒蛋白A鏈或脫糖基蓖麻毒蛋白A鏈。
23.權利要求18的組合物，其中所述抗體可操作附著抗血管發生試劑。
24.權利要求23的組合物，其中所述抗體可操作附著促血管生成素。
25.權利要求24的組合物，其中所述抗體可操作附著促血管生成素-2。
26.權利要求23的組合物，其中所述抗體可操作附著制管張素、抑血管素、制霉菌素、或maspin。
27.權利要求23的組合物，其中所述抗體可操作附著抑內皮素。
28.權利要求18的組合物，其中所述抗體可操作附著抗微管蛋白藥物。
29.權利要求28的組合物，其中所述抗體可操作附著選自下組的抗微管蛋白藥物秋水仙素、紫杉醇、長春花堿、長春花新堿、長春堿酰胺、和combretastatin。
30.權利要求18的組合物，其中所述抗體可操作附著凝血劑。
31.權利要求30的組合物，其中所述抗體可操作附著選自下組的凝血劑因子II/IIa、因子VII/VIIa、因子IX/IXa、因子X/Xa、缺乏Gla修飾的維生素K依賴性凝血因子、Russell蝰蛇毒因子X激活劑、血栓烷A2、血栓烷A2合酶、和α2-抗纖溶酶。
32.權利要求30的組合物，其中所述抗體可操作附著組織因子、人組織因子、激活因子VII能力缺陷的突變型組織因子、截短的組織因子，或者二聚體、三聚體、或多聚體形式的組織因子或組織因子衍生物。
33.權利要求32的組合物，其中所述抗體可操作附著截短的組織因子。
34.權利要求15的組合物，其中所述抗體可操作附著診斷性、成像性、或可檢測性試劑。
35.權利要求34的組合物，其中所述抗體可操作附著X射線可檢測化合物、放射性離子、或核磁旋轉共振同位素。
36.權利要求34的組合物，其中所述抗體可操作附著生物素、抗生物素蛋白、或在接觸顯色底物后產生有色產物的酶。
37.權利要求12-33任一項的組合物，其中所述抗體可操作附著所述生物學試劑，其作為融合蛋白質，通過對在相同讀碼框中包含編碼所述抗體的DNA片段及與之可操作附著的編碼所述生物學試劑的DNA片段的重組載體進行表達來制備。
38.權利要求12-33任一項的組合物，其中所述抗體經生物學可釋放鍵或選擇性可切割接頭而可操作附著所述生物學試劑。
39.權利要求38的組合物，其中所述抗體經肽接頭可操作附著所述生物學試劑，該肽接頭包含尿激酶、尿激酶原、纖溶酶、纖溶酶原、TGFβ、鏈激酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa、金屬蛋白酶、間質膠原酶、明膠酶、或溶基質素的切割位點。
40.權利要求12-36任一項的組合物，其中所述抗體直接附著所述生物學試劑。
41.權利要求15-36任一項的組合物，其中所述抗體附著可結合所述治療劑或診斷劑的第二種抗體或其抗原結合區。
42.任何上述權利要求的組合物，其中所述組合物是制藥學可接受的組合物。
43.權利要求42的組合物，其中所述制藥學可接受的組合物配制用于胃腸外或靜脈內施用。
44.任何上述權利要求的組合物，其中所述組合物還包含第二種治療劑。
45.權利要求44的組合物，其中所述第二種治療劑是第二種抗癌試劑。
46.權利要求45的組合物，其中所述第二種抗癌試劑是化療劑、放療劑、抗血管發生試劑、誘導凋亡試劑、抗微管蛋白藥物；或者化療劑、放療劑、抗血管發生試劑、誘導凋亡試劑、或抗微管蛋白藥物的藥物前體或靶向腫瘤形式。
47.權利要求46的組合物，其中所述第二種抗癌試劑是促血管生成素或靶向腫瘤的促血管生成素。
48.權利要求47的組合物，其中所述第二種抗癌試劑是促血管生成素-2或靶向腫瘤的促血管生成素-2。
49.權利要求46的組合物，其中所述第二種抗癌試劑是抑內皮素或靶向腫瘤的抑內皮素。
50.權利要求46的組合物，其中所述第二種抗癌試劑是抗微管蛋白藥物或靶向腫瘤的抗微管蛋白藥物。
51.權利要求46的組合物，其中所述第二種抗癌試劑是包含治療劑及與之可操作附著的第二種抗體或其抗原結合片段的抗體-治療劑構建物，所述第二種抗體或其抗原結合片段結合腫瘤細胞、腫瘤血管結構、或腫瘤基質的表面表達、表面可接近、或表面定位的成分。
52.任何上述權利要求的組合物，用于治療。
53.權利要求1-11或34-36任一項的組合物，用于診斷。
54.權利要求1-11或23-27任一項的組合物，用于對動物施用后抑制血管發生。
55.權利要求12-41任一項的組合物，用于對患有血管化腫瘤的動物施用后向血管化腫瘤投遞生物學試劑。
56.任何上述權利要求的組合物，用于治療癌癥。
57.任何上述權利要求的組合物在治療中的應用。
58.權利要求1-11或23-27任一項的組合物在用于通過抑制血管發生來治療疾病的藥物制備中的應用。
59.權利要求12-41任一項的組合物在通過向血管化腫瘤投遞生物學試劑來治療癌癥的藥物制備中的應用。
60.權利要求1-56任一項的組合物在用于治療癌癥的藥物制備中的應用。
61.包含生物學有效量的抗VEGF抗體或其抗原結合片段的組合物，用于抑制血管發生而基本上不抑制巨噬細胞、破骨細胞、或破軟骨細胞的用途，該抗體或其抗原結合片段結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)基本上相同。
62.包含生物學有效量的抗VEGF抗體或其抗原結合片段的組合物在用于通過抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2(KDR/Flk-1)而不顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR1(Flt-1)來治療癌癥的藥物制備中的應用，該抗體或其抗原結合片段結合的表位與單克隆抗體2C3(ATCC PTA1595)基本上相同。
63.包含權利要求1-56任一項的至少第一種組合物的試劑盒。
64.包含權利要求13或14的至少第一種組合物和含基本上無活性的藥物前體的至少第二種組合物的試劑盒，該藥物前體可由附著于所述第一種組合物中的抗體的生物學試劑切割而釋放基本上有活性的藥物。
65.包含權利要求14的至少第一種組合物和含combretastatinphosphate的至少第二種組合物的試劑盒。
66.產生權利要求2-11任一項定義的單克隆抗體的雜交瘤。
67.單克隆抗體ATCC PTA 1595。
68.用于制備抗VEGF抗體的方法，該抗體結合的表位與單克隆抗體ATCC PTA 1595基本上相同，該方法包括用包含至少第一種免疫原性VEGF成分的免疫組合物免疫非人動物，并由經免疫動物選擇與單克隆抗體ATCC PTA 1595充分發生交叉反應的抗體。
69.權利要求68的方法，其中所述非人動物是包含人抗體文庫的轉基因小鼠。
70.權利要求68或69的方法，包括獲得編碼所述抗VEGF抗體的核酸，并表達所述核酸以獲得重組抗VEGF抗體。
71.權利要求68-70任一項所述的方法，包括a)對非人動物施用免疫有效量的包含至少第一種免疫原性VEGF成分的組合物；b)制備組合型免疫球蛋白噬菌粒文庫，該文庫表達由經免疫動物的脾分離的RNA；c)由噬菌粒文庫選擇表達抗VEGF抗體的克隆，該抗體與單克隆抗體2C3(ATCC PTA 1595)充分發生交叉反應；并d)表達來自所述選定克隆的抗VEGF抗體編碼核酸以提供重組抗VEGF抗體。
72.用于檢測VEGF的方法，包括在能夠有效形成VEGF/抗體復合物的條件下，使懷疑含有VEGF的組合物接觸權利要求1-56任一項的組合物，并檢測由此形成的復合物。
73.用于抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR2而不顯著抑制VEGF結合VEGF受體VEGFR1的方法，包括使表達VEGFR2(KDR/Flk-1)和VEGFR1(Flt-1)的同種或異種細胞群接觸生物學有效量的權利要求1-56任一項的組合物。
74.用于特異性抑制VEGF誘導的內皮細胞增殖的方法，包括使內皮細胞群接觸生物學有效量的權利要求1-56任一項的組合物。
75.用于抑制VEGF誘導的內皮細胞增殖而不顯著抑制VEGF刺激的巨噬細胞、破骨細胞、或破軟骨細胞功能的方法，包括使包含內皮細胞以及巨噬細胞、破骨細胞、和破軟骨細胞三者中至少一種的組織接觸生物學有效量的權利要求1-56任一項的組合物。
76.用于抑制血管發生的方法，包括使潛在的血管發生性血管群接觸包含生物學有效量的權利要求1-56任一項的組合物的抗血管發生組合物。
77.用于治療血管發生性疾病的方法，包括對患有血管發生性疾病的動物施用包含治療有效量的權利要求1-56任一項的組合物的至少第一種藥物組合物。
78.用于將診斷劑或治療劑投遞至血管化腫瘤的方法，包括對患有血管化腫瘤的動物施用生物學有效量的權利要求12-41任一項的組合物。
79.用于治療癌癥的方法，包括對患有或有風險形成血管化實體瘤、轉移性腫瘤、或原發性腫瘤轉移的動物施用至少第一種藥物組合物，其中所述至少第一種藥物組合物包含治療有效量的權利要求1-56任一項的組合物。
80.權利要求78或79的方法，還包括對所述動物進行放療。
81.用于治療癌癥的方法，包括a)對患有血管化實體瘤、轉移性腫瘤、或原發性腫瘤轉移的動物施用權利要求13或14的第一種組合物，由此將所述組合物的抗體定位于腫瘤血管結構或基質；并b)隨后對所述動物施用包含基本上無活性的藥物前體的第二種組合物，該藥物前體可被附著于所述第一種組合物中的抗體的生物學試劑切割，由此在所述腫瘤血管結構或基質內特異性釋放基本上有活性的藥物。
82.權利要求78-81任一項的方法，其中所述動物是人類患者。
全文摘要
本發明公開了可特異性抑制VEGF結合兩種VEGF受體之一VEGFR2的抗體。該抗體有效抑制血管發生并誘導腫瘤退化,而且改善了安全性,這要歸功于它們的特異性。本發明由此提供了用于治療癌癥和其它血管發生性疾病的新的基于抗體的組合物、方法、和聯合方案。還提供了使用新的VEGF特異性抗體的有益免疫綴合物和藥物前體組合物和方法。
文檔編號C07K16/24GK1358197SQ00809417
公開日2002年7月10日 申請日期2000年4月28日 優先權日1999年4月28日
發明者P·E·索普, R·A·布里肯 申請人:德克薩斯大學董事會