專利名稱：二次結晶的超純天花粉蛋白的制備和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及有機化學領域，特別是涉及到生物化學領域中二次結晶的超純天花粉蛋白的制備和應用。
在本發明中，天花粉蛋白是指從栝蔞屬植物栝蔞的塊根——天花粉(中藥)采用有機試劑沉淀或鹽沉淀等方法提取出的一種核糖體失活蛋白。研究表明，天花粉蛋白是一種單鏈核糖體失活蛋白，具有RNA N-糖苷酶活性、引產蛋白活性、抗腫瘤抗病毒特別是抗艾滋病毒活性。該蛋白是寡聚的單肽鏈的簡單蛋白。
二次丙酮沉淀所得到的粗制天花粉蛋白，經二次CM-葡聚糖凝膠C-25分離得到層析天花粉蛋白，但分離周期長且易變性(汪猷主編，天花粉蛋白(第二版)P24)。粗制天花粉蛋白的凍干粉可以在巴比妥緩沖液或檸檬酸緩沖液中結晶，結晶天花粉蛋白已獲得高分辯率結果(潘克楨、林玉娟、周康靖、傅珠璣、陳明晃，Pure & Appl.Chem.1994，66(1)，57-64；周康靖、傅珠璣、陳明晃等，PROTEINSStruct Funct.Genet.1994，19(1)4-13)。同時從天花粉塊根中，Sylvia et at又分離到TAP29(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991，88 6570-6574)和金善煒等又分離到Trichobitacin(Chinese J.chemistry.1997，15(2)160-168)。
本發明的目的，就是首先優化了天花粉蛋白的結晶條件，獲得一次結晶天花粉蛋白，結晶天花粉蛋白再經離子交換結合親和色譜方法，可以純化到二個以上單組分的更高純度的結晶天花粉蛋白，而這二個組分又可以分別結晶得到二次結晶的超純天花粉蛋白。
在本發明中，天花粉蛋白的一次結晶是指提純的天花粉蛋白在醋酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、磷酸緩沖液、巴比妥緩沖液中，以NaCl、NaNO3、KCl、朽檬酸鈉等為沉淀劑而獲得的結晶天花粉蛋白。
在本發明中，一次結晶的天花粉蛋白經溶解后，經SP-瓊脂糖、S-瓊脂糖、CM-瓊脂糖、CM-纖維素等陽離子交換介質和Blue、Red染料親和介質的層析分離，可以分離到二個以上單組分更高純度的結晶天花粉蛋白。
在本發明中，上述二種單組分更高純度的結晶天花粉蛋白，在醋酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、磷酸緩沖液、巴比妥緩沖液中，以NaCl、NaNO3、KCl、檸檬酸鈉等為沉淀劑，可以獲得二次結晶的超純天花粉蛋白。
使用本發明的純化和結晶技術，可以從括蔞塊根(天花粉)中分離出二種以上單組分二次結晶的超純天花粉蛋白制劑。
本發明的二次結晶的超純天花粉蛋白具有結晶天花粉的各項生物學活性，在引產、治療腫瘤及艾滋病方面具有潛在的應用價值，同時，由于純度更高，可以減輕或消除天花粉蛋白在臨床試驗和應用中的副作用。
本發明與現有技術相比，具有以下積極效果1.本發明是在結晶天花粉蛋白的工作基礎上，經溫和離子交換結合親和層析，分離到二種以上更高純度的單組分的結晶天花粉蛋白。并在此基礎上，采用結晶技術，可以獲得這二種單組分的二次結晶的超純天花粉蛋白；2.二種單組分的二次結晶的超純天花粉蛋白已分別培養出大單晶，可以深入開展X-射線分析和結構分析工作，可以探討這二個組分的細微差別——包括個別氨基酸殘基的胺酰化或脫胺酰等作用；3.活性蛋白能夠獲得二次結晶，增加了活性蛋白的穩定性。并且可以選擇適當的緩沖液和鹽類型，以利于應用。
附圖
是結晶天花粉蛋白的層析洗脫圖。
下面結合附圖通過實施例來進一步描述本發明實施例1.結晶天花粉蛋白的制備一定量的丙酮沉淀的天花粉蛋白凍干粉，溶于雙蒸餾水中，加入0.01～0.1M檸檬酸緩沖液(含0.5～2M的NaCl或KCl)，靜置，結晶天花粉蛋白就會以晶體形式沉淀析出。
實驗例2.更高純度的二個組分的結晶天花粉蛋白的制備將例1得到的結晶天花粉蛋白，用飽和NaCl洗凈后，用稀醋酸或稀鹽酸溶解，加蒸餾水到20ml，加到經緩沖液平衡的離子交換結合親和層析柱上，用NaCl梯度洗脫，分離出二個峰，即為二個單組分的更高純度的結晶天花粉蛋白(見附圖)。
實施例3將例2獲得的二個單組分的更高純度的結晶天花粉蛋白收集液，在0.01～0.2M磷酸鹽緩沖液(含0.5～2M的NaCl或KCl)，用懸滴法、坐滴法、自由界面擴散法，可以培養出該二個單組分的二次結晶的超純天花粉蛋白晶體。
實施例4將例3獲得的單組分1的蛋白質單晶，在四園衍射儀上以銅靶衍射，測得的晶體學參數為P212121晶型，a＝38.6，b＝76.7，c＝79.7，α＝β＝γ＝90°，與文獻(周康靖、傅珠璣、陳明晃等，PROTEINSStruct.Funct.Genet.1994，19(1)，4-13)所報道的天花粉蛋白晶體學參數相當。
實施例5從懸滴法培養的天花粉蛋白(一次)的晶體(例2)中，挑選2顆線度大于1mm的大單晶，加蒸餾水洗后，用少量稀HCl溶解，配成結晶天花粉蛋白溶液，在HPLC上(SP15HR柱，美國Waters公司產品)，以0.02mol/L，pH6.5磷酸鹽緩沖液為洗脫液，0～0.5mol/L NaCl進行線性梯度洗脫，流速1ml/min，時間40min，280nM檢測，結晶天花粉蛋白溶液在保留時間(RT)22.5’，24.1’，出現二個峰，二個峰面積比為1∶9，與例2的相同。
權利要求
1.一種二次結晶的超純天花粉蛋白的制備，該超純天花粉蛋白是從結晶天花粉蛋白制備出來的，其特征在于，該制備方法包括下列步驟(1).結晶天花粉蛋白是從葫蘆科植物栝蔞的塊根——天花粉的汁中經有機試劑沉淀或鹽沉淀后制成的凍干粉，在醋酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、磷酸緩沖液、巴比妥緩沖液中，以NaCl、NaNO3、KCl或朽檬酸鈉為沉淀劑而獲得的晶體；(2).將(1)所得的結晶天花粉蛋白溶解后，經SP-瓊脂糖、S-瓊脂糖、CM-瓊脂糖或纖維素等陽離子交換介質和Blue、Red染料親和介質層析，可以分離到二種以上單組分更高純度的結晶天花粉蛋白；(3).將(2)所得的二種以上單組分更高純度的結晶天花粉蛋白，在醋酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、磷酸緩沖液、巴比妥緩沖液中，以NaCl、NaNO3、KCl或檸檬酸鈉為沉淀劑，可以獲得二次結晶的超純的天花粉蛋白；(4).將(3)所得的二次結晶的超純天花粉蛋白，可以選擇上述某種適當的緩沖液系統和鹽類型獲得結晶，更適合于應用。
2.一種權利要求1的二次結晶的超純天花粉蛋白的應用，其特征在于，該蛋白作為藥物原料應用于引產、治療腫瘤和艾滋病方面。
全文摘要
一種二次結晶的超純天花粉蛋白的制備和應用，涉及到生物化學領域，它是從結晶天花粉蛋白制備出來的。結晶天花粉蛋白經陽離子交換層析或親和層析可以純化為二種以上單組分的更高純度的結晶天花粉蛋白。每一單組分的更高純度的結晶天花粉蛋白又可經結晶純化為二次結晶的超純天花粉蛋白。因為超純天花粉蛋白穩定性好、純度高，所以它作為藥物原料在引產、治療腫瘤和艾滋病方面具有更大的應用價值。
文檔編號C07K1/14GK1424323SQ0114323
公開日2003年6月18日 申請日期2001年12月14日 優先權日2001年12月14日
發明者陳明晃, 王梓壬, 葉曉明 申請人:中國科學院福建物質結構研究所