制備硫代磷酸三酯的方法

專利名稱：制備硫代磷酸三酯的方法
技術領域：
本發明提供了合成硫代磷酸三酯的方法，特別是低聚核苷酸和包含低聚核苷酸的硫代磷酸酯的方法。
大約在過去的15年里，對于低聚脫氧核糖核苷酸(DNA序列)、低聚核糖核苷酸(RNA序列)及其類似物的合成已經有了巨大的進展。人們對于DNA和RNA序列在治療應用方面與日俱增的興趣使得對更大量物質的需求日益增加，大規模合成低聚核苷酸的許多工作已經進行。事實上，所有這些工作已包括制造越來越大的合成器，在一種載體上應用相同的氨基磷酸酯化學反應。用于合成低聚核苷酸的可選擇的方法公開于國際專利申請WO99/09041中，該公開的方法使用在溶液中順序偶合和硫轉移的步驟。
根據本發明的第一方面，提供一種制備硫代磷酸三酯方法，包括在偶合劑存在下將H-膦酸酯與醇進行偶合形成一種H-膦酸二酯，隨后，該H-膦酸二酯與硫轉移劑反應形成硫代磷酸三酯，其特征在于H-膦酸酯和醇之間的偶合反應在硫轉移劑的存在下發生。
在許多優選實施方案中，預計反應經由如下順序進行即，在偶合劑存在下H-膦酸酯與醇反應，形成的H-膦酸二酯與同時存在的硫轉移劑原位快速反應，如下述反應流程所示 其中，Z，Z′和Z″獨立地表示保護基，B和B′獨立地為核堿(nucleobase)，每一個Y獨立地表示H、O-烷基、O-烯基、O-保護基、C-烷基或C-烯基。
在本發明方法中，有利的是，所用的H-膦酸酯是被保護的核苷或低聚核苷酸H-膦酸酯或其類似物，優選其包括5′或3′H-膦酸酯官能團，特別優選3′H-膦酸酯官能團。優選的核苷為2′-脫氧核糖核苷和核糖核苷；優選的低聚核苷酸為低聚脫氧核糖核苷酸和低聚核糖核苷酸。
當H-膦酸酯為含有3′H-膦酸酯官能團的被保護的脫氧核糖核苷、核糖核苷、低聚脫氧核糖核苷酸或低聚核糖核苷酸衍生物時，5′-羥基官能團被適合的保護基保護是有利的。這種適合的保護基的實例包括酸活潑的保護基，特別是三苯甲基和取代的三苯甲基，如二甲氧基三苯甲基和9-苯基氧雜蒽-9-基；以及堿活潑的保護基，如FMOC。
當H-膦酸酯結構單元為含有5′H-膦酸酯官能團的被保護的脫氧核糖核苷、核糖核苷、低聚脫氧核糖核苷酸或低聚核糖核苷酸衍生物時，3′-羥基官能團被適合的保護基保護是有利的。適合的保護基包括那些以上公開的用于保護3′H-膦酸酯結構單元中5′-羥基官能團的基團和酰基，如乙酰丙酰基(levulinoyl)和取代的乙酰丙酰基。
當H-膦酸酯為保護的核糖核苷或保護的低聚核糖核苷酸時，2′-羥基官能團被適合的保護基保護是有利的，所述保護基為，如酸活潑的乙縮醛保護基，特別是1-(芳基)-4-烷氧基哌啶-4-基，如1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)或1-(2-氯苯基)-4-乙氧基哌啶-4-基(Cpep)；和三烷基甲硅烷基，優選三(C1-4烷基)甲硅烷基，如叔丁基二甲基硅烷基。作為選擇，核糖核苷或低聚核糖核苷酸可以是2′-O-烷基、2′-O-烷氧基烷基或2′-O-烯基衍生物，通常為C1-4烷基、C1-4烷氧基C1-4烷基或烯基衍生物，在這一情況下，2′位不需要更進一步的保護。可以用于本發明方法中的核苷和低聚核苷酸類似物的H-膦酸酯包括2′-氟、2′-氨基、2′-碳-烷基和2′-碳-烯基取代的核苷和低聚核苷酸衍生物。
其它可以用于本發明方法的H-膦酸酯源于其它的多元醇，特別是烷基醇，優選二醇或三醇。烷基二醇的實例包括乙烷-1，2-二醇和低分子量聚乙二醇，如分子量最多至400的聚乙二醇。烷基三醇的實例包括甘油和丁烷三醇。通常，只存在唯一的H-膦酸酯官能團，其余的羥基被適合的保護基保護，所述保護基為如上文公開的用于保護核糖核苷5′或2′位的那些保護基。
用于本發明方法的醇通常為含有游離羥基，優選游離的3′或5′-羥基，特別優選5′-羥基的保護的核苷或低聚核苷酸。
當醇為保護的核苷或保護的低聚核苷酸時，優選的核苷為脫氧核糖核苷和核糖核苷，優選的低聚核苷酸為低聚脫氧核糖核苷酸和低聚核糖核苷酸。
當醇為含有游離5′-羥基的脫氧核糖核苷、核糖核苷、低聚脫氧核糖核苷酸或低聚核糖核苷酸衍生物時，3′-羥基官能團被適合的保護基保護是有利的。這種保護基的實例包括酰基，通常含有最高達16個碳原子，如源自γ-酮酸的那些酰基，例如乙酰丙酰基和取代的乙酰丙酰基，和類似的基團。取代的乙酰丙酰基尤其包括5-鹵代乙酰丙酰基，例如5，5，5-三氟乙酰丙酰基；類似的基團包括，例如苯甲酰基丙酰基。其它的這種保護基包括脂肪族烷酰基，尤其包括直鏈或支鏈的C6-16烷酰基，例如月桂酰基；苯甲酰基和取代的苯甲酰基，例如烷基(通常為C1-4烷基)和鹵素(通常為氯或氟)取代的苯甲酰基；以及甲硅烷基醚，例如烷基(通常為C1-4烷基)和芳基(通常為苯基)甲硅烷基醚，尤其是叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基。
當醇為含有游離3′-羥基的脫氧核糖核苷、核糖核苷、低聚脫氧核糖核苷酸或低聚核糖核苷酸衍生物時，5′-羥基官能團被適合的保護基保護是有利的。適合的保護基為那些以上公開的用于保護脫氧核糖核苷、核糖核苷，低聚脫氧核糖核苷酸和低聚核糖核苷酸3′H-膦酸酯中5′-羥基的保護基。
當醇為核糖核苷或低聚核糖核苷酸時，2′-羥基官能團被適合的保護基保護是有利的，所述保護基為，如乙縮醛保護基，特別是1-(芳基)-4-烷氧基哌啶-4-基，如1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)或1-(2-氯苯基)-4-乙氧基哌啶-4-基(Cpep)；和三烷基甲硅烷基，優選三(C1-4烷基)甲硅烷基，如叔丁基二甲基硅烷基。作為選擇，核糖核苷或低聚核糖核苷酸可以是2′-O-烷基、2′-O-烷氧基烷基或2′-O-烯基衍生物，通常為C1-4烷基、C1-4烷氧基C1-4烷基或烯基衍生物，在這一情況下，2′位不需要更進一步的保護。在本發明方法中，可以用作醇的核苷和低聚核苷酸類似物包括2′-氟、2′-氨基、2′-碳-烷基和2′-碳-烯基取代的核苷和低聚核苷酸衍生物。
其它可以用于本發明方法的醇為非糖類多元醇，特別是烷基多元醇，優選二元醇或三元醇。烷基二元醇的實例包括乙烷-1，2-二醇和低分子量聚乙二醇，如分子量最多至400的聚乙二醇。烷基三醇的實例包括甘油和丁烷三醇。通常，只存在唯一的游離羥基官能團，其余的羥基被適合的保護基保護，所述保護基為如上文公開的用于保護核糖核苷5′或2′位的那些保護基。但是，如果需要在一個以上的羥基上進行相同的偶合的話，可以存在一個以上游離的羥基。
當使用含有游離羥基的低聚核苷酸H-膦酸酯或低聚核苷酸之一或二者均使用時，優選將核苷酸間鍵保護起來，所述核苷酸間鍵可以包括磷酸酯鍵、硫代磷酸酯鍵或者磷酸酯和硫代磷酸酯鍵兩者都包括。這種保護基的實例在本領域中是眾所周知的，包括芳基、甲基或取代的烷基，優選2-氰乙基和烯基。
本發明的方法可以在溶液中進行。當使用這種液相合成法時，可以用于本發明方法的有機溶劑包括鹵代烷，特別是二氯甲烷；酯，特別是烷基酯，如乙酸乙酯、丙酸甲酯或丙酸乙酯；酰胺，例如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮和N，N′-二甲基咪唑啉酮；和堿性親核溶劑，例如吡啶。用于偶合和硫轉移步驟的優選的溶劑是吡啶、二氯甲烷及其混合物，特別優選吡啶。使用的有機溶劑優選基本上無水。
在本發明的某些實施方案中，H-膦酸酯或醇，優選乙醇，鍵接到一種載體上。最優選，鍵接到載體上的醇為在5′-位上含有游離羥基的核苷或核苷酸，并通過3′-位鍵接到載體上。可以使用的載體在所使用的溶劑中基本上不溶，并且包括低聚核苷酸固相合成領域中眾所周知的載體。其實例包括二氧化硅、受控的小孔玻璃、聚苯乙烯、含有聚苯乙烯的共聚物，例如聚苯乙烯-聚乙二醇共聚物以及如聚乙酸乙烯酯的聚合物。另外，如果需要的話，也可以使用聚丙烯酰胺載體，例如通常用于肽固相合成中的那些載體。
當使用載體時，醇或H-膦酸酯，往往是醇，通常通過可裂連接劑(linker)，優選通過3′-位鍵合到載體上。可以使用的連接劑的實例包括低聚核苷酸固相合成領域中眾所周知的那些，例如尿烷，草酰、琥珀酰和氨基衍生的連接劑。
本發明的方法可以通過分別在H-膦酸酯或醇溶液中攪拌鍵合到固體上的醇或H-膦酸酯、偶合劑和硫轉移劑的漿液而進行。作為選擇，可以將載體裝到一個柱中，使H-膦酸酯、偶合劑和硫轉移劑的溶液經過該柱。
當H-膦酸酯和醇兩者都是保護的核苷低聚核苷酸時，本發明提供了一種以H-膦酸酯偶合反應為基礎，逐步和分段合成低聚脫氧核糖核苷酸、低聚核糖核苷酸及其類似物的改進方法。根據本發明的一個優選方面，帶有3′-端H-膦酸酯官能團的保護的核苷或低聚核苷酸和帶有5′-端羥基官能團的保護的核苷或低聚核苷酸在適合的偶合劑和適合的硫轉移劑兩者都存在的情況下反應，其中形成保護的二核苷或低聚核苷酸H-膦酸酯中間產物，所述中間產物通過與適合的硫轉移劑原位反應實現硫轉移。
除存在羥基保護基外，當必要時，存在于本發明使用的核苷/核苷酸中的堿也優選用適合的保護基給以保護。可以存在的有機堿包括核堿，如天然的和非天然的核堿，特別是嘌呤，例如次黃嘌呤，尤其是A和G，和嘧啶，尤其是T、C和U。使用的保護基為這種堿保護領域中已知的那些保護基，例如，A和/或C可以用如下的基團給以保護，所述基團為苯甲酰基，包括取代的苯甲酰基，如烷基或烷氧基(常常是C1-4烷基或C1-4烷氧基-)苯甲酰基；新戊酰基；和脒，特別是二烷基氨基亞甲基，優選二(C1-4-烷基)氨基亞甲基，如二甲基或二丁基氨基亞甲基。在0-6上時，G可可以用苯基，包括取代的苯基，例如2，5-二氯苯基保護，在N-2上時，可以用例如酰基，如異丁酰基保護。T和U通常不需要保護，但是在某些實施方案中，將其進行保護可能是有利的，例如，在0-4上時，可以用苯基，包括取代的苯基，如2，4-二甲苯基保護，或在N-3上時，用新戊酰氧甲基、苯甲酰基、烷基或烷氧基取代的苯甲酰基，如C1-4烷基或C1-4烷氧基苯甲酰基保護。
當醇和/或H-膦酸酯是含有被保護羥基的保護的核苷或低聚核苷酸時，為了在該點上進一步偶合，可以在進行本發明的方法之后除去一個羥基保護基，除去的保護基和隨后在該點上進行的反應將取決于要制備的分子的類型。當在溶液中發生偶合時，去除的保護基可以是3′-羥基官能團上的保護基。在合成所需要的低聚核苷酸序列中，由此形成的低聚核苷酸可以轉化為H-膦酸酯，然后可以根據本發明的方法進一步偶合，例如與含有5′-羥基的核苷或低聚核苷酸進一步偶合。優選，當在溶液中發生偶合時，除去5′-保護基，其可以轉變成H-膦酸酯結構部分，然后與游離羥基，如3′-羥基更進一步偶合。但是，優選脫保護的5′-羥基與含有3′-H-膦酸酯結構部分的核苷或低聚核苷酸反應。當使用固相合成法時，優選與通過3′-位鍵接到載體上的低聚核苷酸發生偶合，除去的保護基優選在5′-位上。游離的5′-羥基可以轉變成H-膦酸酯結構部分并用于更進一步的偶合。但是，最優選游離的5′-羥基與核苷或低聚核苷酸H-膦酸酯偶合，最優選3′-H-膦酸酯。應該承認，當低聚核苷酸通過5′-位鍵接到載體上時，可以使用相應的反應。當需要的時候，可以使用本領域已知的方法將游離的羥基轉變成H-膦酸酯結構部分。當所需的偶合完成后，可以繼續進行下面的步驟，以從核苷酸間鍵、3′和5′-羥基以及堿上除去保護基，并且，如果合適的話，從載體上分離出產物。
在一個特別優選的實施方案中，本發明提供了一種方法，其包括在適合的偶合劑和適合的硫轉移劑均存在的情況下，將5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脫氧核糖核苷或核糖核苷3′-H-膦酸酯或保護的低聚脫氧核糖核苷酸或低聚核糖核苷酸3′-H-膦酸酯和含有游離的5′-羥基官能團的組分偶合。
在本發明的方法中，可以使用任何適用于先有技術的適合的偶合劑和硫轉移劑。
適合的偶合劑的實例包括烷基和芳基酰氯、烷烴和芳烴磺酰氯、烷基和芳基氯甲酸酯、烷基和芳基氯亞硫酸酯和烷基和芳基氯代磷酸酯。
可以使用的適合的烷基酰氯的實例包括C2-C16烷酰基氯，包括直鏈和環烷酰氯，特別是新戊酰氯和金剛烷碳酰氯。可以使用的芳基酰氯的實例包括取代和未取代的苯甲酰氯，如C1-4烷氧基、鹵素，特別是氟，氯和溴，以及C1-4烷基取代的苯甲酰氯。當被取代時，往往存在1-3個取代基，特別是在烷基和鹵取代基的情況下。
可以使用的適合的烷基磺酰氯的實例包括C1-C16烷基磺酰氯。可以使用的芳基酰氯的實例包括取代和未取代的苯磺酰氯，如C1-4烷氧基、鹵素，特別是氟，氯和溴，以及C1-4烷基取代的苯磺酰氯。當被取代時，往往存在1-3個取代基，特別是在烷基和鹵取代基的情況下。
可以使用的適合的烷基氯甲酸酯的實例包括C2-C16烷基氯甲酸酯。可以使用的芳基氯甲酸酯的實例包括取代和未取代的苯基氯甲酸酯，如C1-4烷氧基、鹵素，特別是氟，氯和溴，以及C1-4烷基取代的苯基氯甲酸酯。當被取代時，往往存在1-3個取代基，特別是在烷基和鹵取代基的情況下。
可以使用的適合的烷基氯亞硫酸酯的實例包括C1-C16烷基氯亞硫酸酯。可以使用的芳基氯亞硫酸酯的實例包括取代和未取代的苯基氯亞硫酸酯，如C1-4烷氧基、鹵素，特別是氟，氯和溴，以及C1-4烷基取代的苯基氯亞硫酸酯。當被取代時，往往存在1-3個取代基，特別是在烷基和鹵取代基的情況下。
可以使用的適合的烷基氯代磷酸酯的實例包括二(C1-C6烷基)氯代磷酸酯。可以使用的芳基氯代磷酸酯的實例包括取代和未取代的二苯基氯代磷酸酯，如C1-4烷氧基、鹵素，特別是氟，氯和溴，以及C1-4烷基取代的二苯基氯代磷酸酯。當被取代時，往往存在1-3個取代基，特別是在烷基和鹵取代基的情況下。
可以使用的另外的偶合劑為氯、溴和(苯并三唑-1-基氧)-鏻和正碳化合物，由Wada等人公開于J.A.C.S.，1997，119，12710-12721頁中(其在此引入作為參考)。
優選的偶合劑為二芳基氯代磷酸酯，特別是符合(ArO)2POCl的那些，其中Ar優選為苯基、2-氯苯基、2，4，6-三氯苯基或2，4，6-三溴苯基。
硫轉移劑的性質將取決于是否需要低聚核苷酸、硫代磷酸酯類似物或混合低聚核苷酸/低聚核苷酸硫代磷酸酯。用于本發明方法的硫轉移劑往往具有如下通式L----S----D其中，L表示離去基團，D表示芳基、甲基或取代的烷基，優選2-氰乙基，或烯基。通常選擇包含N-S鍵的離去基團。適合的離去基團的實例包括酰亞胺，如嗎啉，例如嗎啉-3，5-二酮；酞酰亞胺、琥珀酰亞胺和順丁烯二酰亞胺；吲唑，特別是帶有吸電子取代基的吲唑，如4-硝基吲唑；和三唑。
當最終產物中需要標準的磷酸二酯鍵時，硫轉移劑的結構部分D表示芳基，例如苯基或萘基。適合的芳基的實例包括取代和未取代的苯基，特別是鹵代苯基和烷代苯基，尤其是4-鹵代苯基和4-烷代苯基，通常為4-(C1-4烷基)苯基，最優選4-氯苯基和對甲苯基。能得到標準磷酸二酯的適合的硫轉移劑種類的實例為N-(芳基硫烷基)酞酰亞胺，或N-(芳基硫烷基)琥珀酰亞胺，比如N-(苯基硫烷基)琥珀酰亞胺(或也可以使用其它的酰亞胺，例如順丁烯二酰亞胺)。
當最終產物中需要硫代磷酸二酯鍵時，結構部分D表示甲基、取代的烷基或烯基。適合的取代烷基的實例包括取代的甲基，特別是芐基和取代的芐基，例如烷基，通常是C1-4烷基；烷氧基，通常是C1-4烷氧基；硝基；和鹵素，通常是氯；取代的芐基和取代的乙基，特別是在2-位上被吸電子取代基取代的乙基，如2-(4-硝基苯基)乙基和2-氰乙基。適合的烯基的實例是烯丙基、2-丁烯基和4-氰基丁-2-烯基。能得到硫代磷酸酯的適合的硫轉移劑的實例是，例如，(2-氰乙基)硫烷基衍生物，如4-[(2-氰乙基)-硫烷基]嗎啉-3，5-二酮或相應的試劑，如3-(苯二甲酰亞氨基硫烷基)丙腈，或更優選3-(丁二酰亞胺基硫烷基)丙腈。
在許多實施方案中，硫轉移劑的選擇應使其能更快速地與H-膦酸二酯反應，特別是與由H-膦酸酯和醇偶合形成的H-膦酸二酯的反應比起與H-膦酸單酯和/或由H-膦酸單酯與偶合劑反應形成的活化物質的反應更快。
本發明的方法可以方便地在約-55℃-約35℃的溫度范圍內進行。在約0℃-約30℃的溫度范圍內更有利，最優選采用的溫度為室溫(通常為10-25℃，如約20-25℃)。
在本發明的方法中，H-膦酸酯與醇的摩爾比往往選擇在約0.9∶1-約3∶1范圍內，通常為約1∶1-約2∶1，優選約1.1∶1-約1.5∶1，如當制備二聚物時為摩爾比約1.2∶1，當制備更大的單元時為約1.4∶1。但是，當同時進行一個以上游離羥基的偶合時，摩爾比將成比例地增加。偶合劑和醇的摩爾比往往選擇在約1∶1-約10∶1的范圍內，通常為約1.5∶1-約6∶1，優選約2∶1-約4∶1。硫轉移劑和醇的摩爾比往往選擇在約1∶1-約10∶1的范圍內，通常為約1.5∶1-約5∶1，優選約2∶1-約3∶1。
在本發明的方法中，H-膦酸酯和醇可以在溶液中進行預混，然后在該混合物中加入偶合劑和硫轉移劑的混合物。在加料時間內，通常連續或逐漸加入反應劑。
在溶液中使用的偶合劑和硫轉移劑的濃度往往取決于所使用溶劑的性質。通常使用的濃度最高為0.5M，例如，在0.05M-0.35M范圍內。在許多實施方案中，可以使用的硫轉移劑的濃度為約0.2M，偶合劑的濃度為約0.3M。
當H-膦酸酯和醇之一或兩者均以溶液形式使用時，所使用的濃度將取決于溶劑的性質，特別是H-膦酸酯或醇的分子量。盡管在許多實施方案中使用的濃度為約0.1M，但是對偶合劑和硫轉移劑來說，可以使用上述濃度范圍。
在本發明的方法中，通過選擇適當的硫轉移劑可以制備在相同分子中含有磷酸二酯和硫代磷酸二酯核苷酸間鍵的低聚核苷酸，特別是當該方法以多步方法進行時。
本發明的方法優選用于制備通常含有兩個或多個核苷酸殘基的低聚核苷酸。其上限取決于所希望制備的低聚核苷酸的長度。往往，通過本發明的方法制備的低聚核苷酸含有最多至40個核苷酸殘基，通常最多至35個核苷酸殘基，優選含有5-25，如8-20個核苷酸殘基。為得到所需的長度和序列，可將本發明方法的偶合和硫轉移步驟重復足夠多的次數。本發明的方法特別適于制備含有2、3、4、5或6個核苷酸殘基的低聚核苷酸，特別是二聚物、三聚物和四聚物。
正如前面所述，本發明的方法可用于合成RNA、2′-O-烷基-RNA、2′-O-烷氧基烷基-RNA和2′-O-烯基RNA序列。可以，例如由相應保護的核苷結構單元、對羥甲苯基銨的H-膦酸酯和新戊酰氯制備2′-O-(保護基，如fpmp)-5′-O-(4，4-二甲氧基三苯甲基)-核糖核苷的3′-H-膦酸酯(9)和2′-O-(烷基、烷氧基烷基或烯基)-5′-O-(4，4-二甲氧基三苯甲基)-核糖核苷的3′-H-膦酸酯(10a-c)。 10a R＝Me10b R＝CH2CH＝CH210c R＝CH2CH2OMe對于化學治療有用的核糖酶序列來說，相對大規模的RNA合成是現實中相當重要的一個問題。將2′-O-烷基、2′-O-取代烷基和2′-O-烯基[特別是2′-O-甲基、2′-O-烯丙基和2′-O-(2-甲氧基乙基)]-核糖核苷(Sproat，B.S.在Methods in Molecular Biology，第20卷，Protocolsfor Oligonucleotides and Analogs′，Agrawal，S.，Ed.，HumanaPress，Totowa，1993中提到)引入到低聚核苷酸中是目前非常重要的一個問題，因為這些改性使得所得低聚物既對核酸酶消化具有抵抗力又具有優良的雜交性質。
硫轉移步驟在H-膦酸酯原位偶合的產物上進行，即，對于經偶合反應制備的中間產物不進行分離和純化。優選硫轉移劑與偶合劑同時加入。對所使用的硫轉移劑和偶合劑進行選擇以將副反應減到最小，這樣會有助于使偶合速率大于H-膦酸單酯與硫轉移劑的副反應速率。反應劑的選擇受到將要偶合的H-膦酸酯和醇的性質的影響。
這一偶合方法與下述H-膦酸酯進行固相合成(Froehler等人，Methods in Molecular Biology，1993)中的偶合方法的不同之處在于在每一偶合步驟中都進行硫轉移，而不是僅僅在全部低聚物序列組合之后進行一次。
可以使用本領域已知的除去具體保護基和官能團的方法除去保護基。例如，暫時的保護基，尤其是γ-酮酸，如乙酰丙酰基類型保護基，可以通過用肼，如緩沖的肼進行處理除去，例如，在非常溫和的條件下用肼進行處理(由van Boom.J.H.；Burgers，P.M.J.在TetrahedronLett.，1976，4875-4878中公開)，然后，所得帶有游離3′-羥基官能團的部分保護的低聚核苷酸可以被轉化為相應H-膦酸酯，它是一種可用于低聚核苷酸和其硫代磷酸酯類似物嵌段合成的中間體。
一旦產生所需的產物，當對其進行脫保護時，通常首先除去產生硫代磷酸酯鍵的磷上的保護基。例如，通過用強堿性的胺，如DABCO、1，5-二氮雜雙環[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、1，8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)或三乙胺進行處理可以除去氰乙基。
硫代磷酸酯核苷酸間鍵和堿殘基上的苯基和取代苯基可以通過進行肟鹽處理，例如用醛肟的共軛堿，優選E-2-硝基苯醛肟或吡啶-2-醛肟(carboxaldoxime)的共軛堿進行處理除去(Reese等人，Nucleic AcidsRes.1981)。Kamimura，T.等人在J.Am.Chem.Soc.，1984，106，4552-4557中，Sekine，M.等人在Tetrahedron，1985，41，5279-5288中描述的以S-苯基硫代磷酸酯為中間體，在溶液中通過膦酸三酯方式合成低聚核苷酸的方法中，以及van Boom及其同事在以S-(4-甲基苯基)硫代磷酸酯為中間體合成低聚核苷酸的方法(Wreesman，C.T.J.等人，Tetrahedron Lett.，1985，26，933-936)中都闡述了用肟鹽離子將S-苯基硫代磷酸酯去保護(使用Reese等人1978年的方法；Reese、C.B.；Zard，L.，Nucleic Acids Res.，1981，9，4611-4626)得到天然的磷酸二酯核苷酸間鍵。在本發明中，使用E-2-硝基苯醛肟的共軛堿對S-苯基保護的硫代磷酸酯進行脫保護可以很順利地進行，沒有發現任何核苷酸間鍵的開裂。
其它的堿保護基，例如苯甲酰基、新戊酰基和脒基團可以通過用濃氨水處理除去。
存在的三苯甲基(包括單甲氧基-和二甲氧基三苯甲基)可以通過用酸處理除去。在低聚脫氧核糖核苷酸合成中的整體脫保護策略中，本發明需要考慮的另一個重要因素是三苯甲基(經常是5′-端DMTr)保護基的去除(脫三苯甲基作用)應該在沒有相應的脫嘌呤作用的情況下進行，特別是在不存在任何6-N-酰基-2′-脫氧腺苷殘基的情況下進行。根據本發明的一個實施方案，本發明人已經發現這種在固相合成中也許很難完全避免的脫嘌呤作用可以通過在低溫下用鹽酸稀溶液，尤其是在-50℃下，用0.45M氯化氫的二氧六環-二氯甲烷(1∶8v/v)溶液進行處理得以完全的抑制。在這種反應條件下，脫三苯甲基作用可以迅速完成，而且在某些情況下，脫三苯甲基作用可以在5分鐘后或更少的時間里完成。例如，在這種條件下，當用氯化氫的二氧六環-二氯甲烷溶液處理6-N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脫氧腺苷時，脫三苯甲基作用在2分鐘后完成，而甚至在4小時后也沒有發現脫嘌呤作用。
通過用氟化物處理，例如用如四丁基氟化銨的四烷基氟化銨鹽溶液處理可以除去甲硅烷基保護基。
Fpmp保護基可以通過在溫和條件下進行酸性水解而除去。
本發明的方法可以用于制備(a)只含有磷酸二酯，(b)只含有硫代磷酸二酯和(c)含有磷酸二酯和硫代磷酸二酯核苷酸間鍵的低聚核苷酸序列。
很顯然，當本發明的方法用于嵌段合成時，對于如何得到所需的產物可以有許多選擇性的路線，這將取決于所需的產品性質。例如，制備八聚物時可以通過制備二聚物，然后將其偶合得到四聚物，之后再偶合得到所需的八聚物；或者，可以將二聚物和三聚物偶合形成五聚物，然后將其與另外一種三聚物偶合制備所需的八聚物。策略的選擇由用戶決定，但是，這種嵌段偶合的共有特征是含有兩個或更多單元的H-膦酸酯與同樣含有兩個或更多單元的低聚物醇偶合。最通常的是低聚核苷酸3′-H-膦酸酯與含有游離5′-羥基官能團的低聚核苷酸偶合。
本發明的方法也可以用于制備環狀低聚核苷酸，特別是環狀低聚脫氧核糖核苷酸和環狀核糖核苷酸。在制備環狀低聚核苷酸的過程中，制備含有H-膦酸酯官能團，往往是3′或5′H-膦酸酯的低聚核苷酸，然后通過適當的脫保護引入游離的羥基官能團。游離羥基官能團位置的選擇通常與H-膦酸酯相適應，例如，5′-羥基官能團將與3′H-膦酸酯偶合，而3′-羥基官能團將與5′H-膦酸酯偶合，然后，羥基和H-膦酸酯官能團可以在偶合劑的存在下，在溶液中進行分子內偶合，之后進行原位硫轉移。
所需的產物，尤其是脫保護的低聚核苷酸，如只含有磷酸二酯或只含有硫代磷酸酯核苷酸間鍵，或含有磷酸二酯和至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵的混合物的脫保護低聚核苷酸通過本領域已知的方法進行純化是有利的，如用一個或多個離子交換色譜、反相色譜、從適當的溶劑中沉淀的方法進行純化。也可以使用其他方法，如超濾。
現在，將參考以下實施例對本發明的方法進行闡述，其目的不在于對本發明的方法進行限定。
應當指出，在實施例中，當核苷殘基和核苷酸間鍵用斜體字印刷時，表示它們被以某種方式進行了保護。在本發明中，A，C、G，T和T(這一個未用斜體字印刷)表示在N-6上用苯甲酰基保護的2′-脫氧腺苷，在N-4上用苯甲酰基保護的2′-脫氧胞苷，在N-2和O-6上用異丁酰基和2，5-二氯苯基保護的2′-脫氧鳥苷，在0-4上用苯基保護的胸腺嘧啶和未保護的胸腺嘧啶。例如，正如在反應方案3中所表示的一樣，p(s)和p(s′)分別表示S-(2-氰乙基)和S-(苯基)硫代磷酸酯，而p(H)(它沒有被保護，因此不用斜體字印刷)，如果它位于序列末尾或連到單體上時表示H-膦酸單酯，其他情況下則表示H-膦酸二酯。
本發明方法的其他實施例按如下方法進行在室溫下，5分鐘內，向攪拌的H-膦酸酯單體(1.2或1.4mmol)和5′-OH組分(1.0mmol)的無水吡啶(6ml)溶液中滴加二苯基氯代膦酸酯5b(2.5mmol)和N-[(2-氰乙基)硫烷基]-或N-(苯基硫烷基)-琥珀酰亞胺(8a或8b，2.5mmol)的無水吡啶(6ml)溶液，5-25分鐘后(參見總反應時間)，收集產物，用色譜進行分離，結果示于表1
表權利要求
1.一種制備硫代磷酸三酯方法，包括在偶合劑存在下將H-膦酸酯與醇偶合形成一種H-膦酸二酯，隨后，H-膦酸二酯與硫轉移劑反應形成硫代磷酸三酯，其特征在于H-膦酸酯和醇之間的偶合反應在硫轉移劑的存在下發生。
2.根據權利要求1的方法，其中H-膦酸酯是含有3′-H-膦酸酯官能團的保護的核苷或低聚核苷酸。
3.根據權利要求1或2的方法，其中醇是含有游離5′-羥基官能團的保護的核苷或低聚核苷酸。
4.根據前述權利要求中任一項的方法，其中偶合劑為具有分子式(ArO)2POCl的二芳基氯代膦酸酯，其中Ar表示苯基、2-氯苯基、2，4，6-三氯苯基或2，4，6-三溴苯基。
5.根據前述權利要求中任一項的方法，其中硫轉移劑具有以下通式L------S------D其中L表示離去基團，D表示芳基、甲基、取代的烷基或烯基。
6.根據權利要求5的方法，其中離去基團為嗎啉-3，5-二酮、酞酰亞胺、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺或吲唑，D表示4-鹵代苯基，4-烷基苯基、甲基、芐基、烷基芐基、鹵代芐基、烯丙基、2-丁烯基、2-氰乙基或2-(4-硝基苯基)乙基。
7.根據前述權利要求中任一項的方法，其中H-膦酸酯和醇獨立地選自脫氧核糖核苷、低聚脫氧核糖核苷、核糖核苷、2-O′-(烷基、烷氧基烷基或烯基)核糖核苷、低聚核糖核苷酸和2-O-(烷基、烷氧基烷基或烯基)低聚核糖核苷酸。
8.根據前述權利要求中任一項的方法，其中H-膦酸酯或醇，優選醇鍵接到載體上。
9.根據權利要求8的方法，其中醇鍵接到載體上，所述醇為在5′-位上含有游離羥基的核苷或核苷酸，其通過3′-位鍵接到載體上。
10.根據權利要求8或9的方法，其中鍵接到載體上的醇和含有H-膦酸酯，偶合劑和硫轉移劑的溶液接觸。
11.權利要求1-7中任何一項的方法，其中所述方法在液相中進行。
12.根據權利要求11的方法，其中將含有偶合劑和硫轉移劑的溶液加入到含有H-膦酸酯和醇的溶液中。
13.根據前述權利要求中任一項的方法，其中使用含有游離3′或5′-羥基官能團的低聚核苷酸H-膦酸酯和/或低聚核苷酸，并且該含有游離3′或5′-羥基官能團的低聚核苷酸H-膦酸酯和低聚核苷酸之一或兩者均含有一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
14.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述膦酸三酯含有2-8，優選2-4個核苷酸殘基。
15.一種制備脫保護的低聚核苷酸、低聚核苷酸硫代磷酸酯或混合的低聚核苷酸/低聚核苷酸硫代磷酸酯的方法，包括a)在偶合劑的存在下，將含有3′或5′-H-膦酸酯官能團的保護的核苷或低聚核苷酸H-膦酸酯與含有游離3′或5′-羥基官能團的保護的核苷或低聚核苷酸偶合形成H-膦酸二酯，和將該H-膦酸二酯與硫轉移劑原位反應制備硫代磷酸三酯，其中H-膦酸酯和醇之間的偶合反應在硫轉移劑的存在下發生；和b)將a)中制備硫代磷酸三酯脫保護以形成脫保護的低聚核苷酸、低聚核苷酸硫代磷酸酯或混合的低聚核苷酸/低聚核苷酸硫代磷酸酯。
16.根據權利要求15的方法，其中隨后對脫保護的低聚核苷酸、低聚核苷酸硫代磷酸酯或混合的低聚核苷酸/低聚核苷酸硫代磷酸酯進行純化。
全文摘要
本發明提供了一種合成硫代磷酸三酯的方法，所述方法包括H－膦酸酯和醇在既含有偶合劑又含有硫轉移劑的溶液存在下進行偶合，優選H－膦酸酯和醇為被保護的核苷或低聚核苷酸。
文檔編號C07F9/165GK1406242SQ01805890
公開日2003年3月26日 申請日期2001年2月23日 優先權日2000年3月1日
發明者C·B·雷斯 申請人:艾夫西亞有限公司