作為免疫調節劑和抗癌劑的雷公藤內酯醇衍生物的制作方法

專利名稱：作為免疫調節劑和抗癌劑的雷公藤內酯醇衍生物的制作方法
技術領域：
本發明涉及對免疫抑制、抗炎和抗癌劑均有效的化合物。
參考文獻Gleichmann，E.等，Immunol.Today 5324(1984).
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背景技術：
免疫抑制劑可以廣泛地用于自身免疫性疾病的治療以及治療或預防移植排斥(transplantation rejection)，包括治療移植物抗宿主病(GVHD)中。通常的免疫抑制劑包括硫唑嘌呤、皮質類固醇、環磷酰胺、氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、長春新堿和環孢菌素A。一般來說，這些藥物并不是完全有效的，而且大多數會受到嚴重毒性的限制。例如，環孢菌素A，一種廣泛使用的藥劑，對于腎臟具有顯著毒性。此外，作為有效治療所需的劑量可能會增加病人對由多種條件性病原微生物侵入病菌引起感染的易感性。
已經在例如自身免疫性疾病的治療，以及治療或預防移植排斥，包括移植物抗宿主病(GVHD)的治療中，其中的情況為一種移植骨髓細胞攻擊受者細胞的病癥，鑒別出大量的源于中藥材雷公藤(Tripterygiumwilfordii(TW))的化合物具有免疫抑制活性。參見，例如共有的美國專利第6,150,539號(具有高水溶性的雷公藤內酯醇前藥)，第5,962,516號(免疫抑制化合物和方法)，第5,843,452號(免疫治療組合物和方法)，第5,759,550號(抑制異種移植排斥的方法)，第5,663,335號(免疫抑制化合物和方法)，和第5,648,376號(免疫抑制劑二萜化合物)，且其中引用的參考文獻。而且所報道的這些化合物還顯示出抗癌活性。參見，例如，Kupchan等人，1972，1977，以及共同未決的和共有的US申請第09/766,156號，2001年1月19日提交，并且于2002年7月25日作為US申請第2002/99051號所公布的，其通過參考引入本文。
發明概述一方面，本發明提供對免疫抑制、抗炎和抗癌治療有效的化合物。所述化合物為由式I表示的雷公藤內酯醇(triptolide)的衍生物 其中R1是H或R，其中R選自低級烷基，烯基，炔基，或丙二烯基(allenyl)，或者R1加R2為＝O(氧代)；R2＝OH或者和R1一起為＝O(氧代)；CR3R5和CR4R6選自CH2，CHOH和CROH；
R1、R5和R6中至少一個是R；并且CR3R5和CR4R6中至少一個是CH2。
在選擇的實施方案中，R選自甲基，烯丙基，或2-丙炔基；在一項實施方案中，R是甲基。在一項實施方案中，其包括C2-或C16-修改(modified)的雷公藤內酯酮(Triptonide)，R1和R2一起為＝氧代，CR3R5和CR4R6之一是CROH，另一個是CH2。另一實施方案中，其包括C2-或C16-修改的雷公藤內酯醇，R1是H，R2是OH，CR3R5和CR4R6之一是CROH，另一個是CH2。
在進一步的實施方案中，其包括C14-修改的雷公藤內酯醇，R1是R且R2是OH。還可以在C2或者C16位上修改這樣的化合物；在一項實施方案中，沒有修改這些位點中的任何一個；即，CR3R5和CR4R6每個均是CH2。當R是甲基時，這種實施方案包括本文指定為PG670的化合物。
另一方面，本發明提供一種對免疫抑制有效的方法，包括對需要這種治療的受體使用在藥學上可接受的載體中的有效量的具有如上所述的結構I的化合物，包括上述具體實施方案中的任何一種。本發明還通過使有效量的具有如上所述結構I的化合物，包括上述具體實施方案中的任何一種，與細胞接觸，來提供一種誘導細胞凋亡的方法。特別地，這種化合物可以是本文指定為PG670的化合物。
當閱讀以下本發明詳細描述連同附圖時，本發明的這些和其它目的會變成更為完全明顯。
附圖簡要說明

圖1表示與雷公藤內酯醇(實施例2B)比較，在Jurkat細胞中由本發明化合物(PG670)導致凋亡的劑量依賴性誘導；和圖2表示與雷公藤內酯醇(實施例3)比較，在Jurkat細胞中由本發明化合物(PG670)導致的IL-2生成的抑制性。
發明詳細描述I.定義如果不另外指示，下面的術語具有以下含義，
“烷基”指含有碳和氫的完全飽和的脂肪族單價基團，并且其可以是環狀，支鏈或直鏈的。烷基基團的例子是甲基，乙基，正丁基，叔丁基，正庚基，和異丙基。優選地，烷基基團具有一至八個碳原子。“低級烷基”指一至六個碳原子的烷基基團，例如甲基，乙基，正丁基，異丁基，叔丁基，異戊基(isoamyl)，正戊基，和異戊基(isopentyl)，通常為一至四個碳原子。
“烯基”指單價或二價不飽和，優選單-不飽和，含有碳和氫的基團，并且其可以是環狀，支鏈或直鏈的。優選地，烯基基團具有一至八個碳原子。“低級烯基”指具有一至六個，通常為一至四個碳原子的烯基基團。
“炔基”指單價或二價不飽和，優選單-不飽和，含有碳和氫的基團，且具有至少一個碳-碳三鍵。優選地，炔基具有一至八個碳原子。“低級炔基”指具有一至六個，通常為一至四個碳原子的炔基基團。
“丙二烯基(Allenyl)”指包含-CH＝C＝CH2部分的取代基。
術語“藥學上可接受的鹽”包含具有有機和無機陽離子的羧酸鹽，例如堿和堿土金屬陽離子(例如，鋰，鈉，鉀，鎂，鋇和鈣)；銨；或者有機陽離子，例如，二芐基銨，芐基銨，2-羥乙基銨，雙(2-羥乙基)銨，苯乙基芐基銨，二芐基乙烯二銨等等。其它的包含在以上術語中的陽離子包括質子化形式的普魯卡因、奎寧和N-甲基葡糖胺，和質子化形式的堿性氨基酸，例如甘氨酸、鳥氨酸、組氨酸、苯基甘氨酸、賴氨酸和精氨酸。
該術語還包括以堿性基團，例如氨基基團，通過標準酸-堿反應形成的鹽，其具有得自有機或無機酸的平衡離子。這樣的平衡離子包括氯化物，硫酸根，磷酸根，乙酸根，琥珀酸根，枸椽酸根，乳酸根，馬來酸根，延胡索酸根，棕櫚酸根，膽酸根，谷氨酸根，戊二酸根，酒石酸根，硬脂酸根，水楊酸根，甲磺酸根，苯磺酸根，山梨酸根，苦味酸根，苯甲酸根，肉桂酸根等等。
為了當前公開的目的，以下編號圖用于雷公藤內酯醇和雷公藤內酯醇衍生物
II.雷公藤內酯醇衍生物本發明的化合物是雷公藤內酯醇衍生物，如本文進一步所述，其是通過將碳親核試劑加入至羰基基團中，在C2、C14和/或C16上進行烷基化而產生的。可由雷公藤內酯醇、雷公藤羥內酯(tripdiolide)或16-羥基雷公藤內酯醇制備本發明的化合物。雷公藤內酯醇可得自中藥材雷公藤(Tripterygium wilfordii(TW))的根木質部或者其它已知來源。TW植物發現于福建省和中國其它南方省份；通常可從中國或者美國的商業途徑得到TW植物原料。制備雷公藤內酯醇、雷公藤羥內酯和16-羥基雷公藤內酯醇的方法是本領域已知的，并且描述于，例如，Kupchan等人.(1972，1977)；Lipsky等人.(1994)；Pu等人.(1990)；和馬等人.(1992)中。
本發明的化合物由以下通式I表示 其中R1是H或R，其中R選自低級烷基，烯基，炔基，或丙二烯基，或者R1加R2為＝O(氧代)；
R2＝OH或者R1和R2一起為＝O(氧代)；CR3R5和CR4R6選自CH2，CHOH或CROH；R1、R5和R6中至少一個是R；并且CR3R5和CR4R6中至少一個是CH2。
在所選的實施方案中，R選自甲基，烯丙基，或2-丙炔基；在一項實施方案中，R為甲基。在一項實施方案中，其包括C2-或C16-修改的雷公藤內酯酮，R1和R2一起為＝氧代，CR3R5和CR4R6之一是CROH，另一個是CH2。另一實施方案中，其包括C2-或C16-修改的雷公藤內酯醇，R1是H，R2是OH，CR3R5和CR4R6之一是CROH，另一個是CH2。
在進一步的實施方案中，其包括C14-修改的雷公藤內酯醇，R1是R且R2是OH。還可以在C2或者在C16位修改這樣的一種化合物；在一項實施方案中，沒有修改這些這些位點中的任何一個；即，CR3R5和CR4R6中的每個是CH2。當R是甲基時，這種實施方案包括本文指定為PG670的化合物。
優選地，當CR3R5或者CR4R6是CHOH或CROH時，分別地，C2或C14位上的立體化學使羥基被描繪在頁面平面之上。
通過將一個或多種羥基氧化成酮或醛基，接著與如有機鋰或有機鎂鹵化物(格式)試劑的碳親核試劑反應，由已知化合物雷公藤內酯醇、雷公藤羥內酯和16-羥基雷公藤內酯醇制備式I化合物。在例如M.Hudlicky，Oxidations in Organic Chemistry(ACS Monograph Series 186，1990)，R.C.Larock，Comprehensive Organic Transformations(第2版，Wiley，1999)，或者J.March，Advanced Organic Chemistry(第4版，Wiley，1992)的參考文獻中，提供了對氧化劑和適用于醇選擇性氧化的方法的描述。應當避免強酸性或堿性條件。如果需要，使用如HPLC，從任何副產物中分離出所需產物。以下為給出的幾個例子。
在方案1中，使用如三氧化鉻-吡啶絡合物，CrO2Cl2/氧化鋁，或者可比的氧化劑，將雷公藤內酯醇在C14位上的仲醇氧化成酮(通稱是雷公藤內酯酮)。且與甲基鋰(CH3Li)反應生成14-C-甲基雷公藤內酯醇。在實施例1中進一步描述這種化合物的制備和特征。
方案1在以上的方案1中，在C14位上顯示出兩個立體化學，并且在以下方案中，并未描述出該反應位點的立體化學。但是，在產生了手性中心(即在C14和C2上的加成物)的反應中，在分子“以下”得自加成的所述產物；也就是如方案1左側的產物通常占絕大多數。這種產物也在以下實施例1中所示。
在方案2中，使用如上所述的氧化劑，將雷公藤羥內酯的仲醇均氧化成酮。且與烯丙基鋰(CH2＝CHCH2Li)反應產生由兩種酮反應得到的二醇(a)，和僅在較少位阻酮反應而得到的酮醇(b)。
方案2
在方案3中，在溫和條件下，使用例如以上所述的化學計量試劑，將雷公藤羥內酯的C2位上的較少位阻醇氧化成酮。且與烯丙基鋰反應在C2上產生叔醇。
方案3在方案4中，使用將不會進一步氧化產物醛的試劑，例如DMSO，氯鉻酸吡啶(Corey′試劑)，或者硝酸高鈰銨，來對16-羥基雷公藤內酯醇的仲和伯醇進行氧化，以產生酮醛中間體。使這種化合物與2-丙炔基鋰(CH≡CCH2Li)反應，產生二醇(c)和僅作為較少位阻醛反應結果的酮醇(d)。
方案4
在方案5中，僅氧化16-羥基雷公藤內酯醇的伯醇，使用選擇性的氧化劑例如，如，RuCl2(PPh3)3；(Me3SiO)2/催化的RuCl2(PPh3)3；DMSO/ClCOCOCl/Et3N；或者DMSO/吡啶·SO3/i-Pr2NEt(以上引用參見Larock)。且與2-丙炔基鋰反應產生所示的二醇。
方案5如方案6所示，以下與有機金屬2-丙炔基試劑的反應(這種情形下為雷公藤內酯酮)還可產生重排的丙二烯基產物。
方案6通過使用含14C-的碳親核試劑，本文所述的方法還可以用于同位素標記的化合物的制備。
III.治療組合物含有本發明雷公藤內酯醇衍生物的制劑可以為固體，半固體，凍干粉形式，或者液體劑型，例如片劑，膠囊劑，粉劑，緩釋制劑，溶液，懸浮液，乳劑，軟膏，洗劑，或氣溶膠，優選適于精確劑量的簡單使用的單位劑型。典型地，這種組合物包括常規的藥物載體或賦形劑，并且還額外包括其它藥劑、載體或助劑。
優選地，以重量計，這種組合物約為本發明化合物或本發明的多種化合物的0.5％至75％，剩余物由適當的藥物賦形劑組成。為了口服使用，這類賦形劑包括制藥級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、明膠、蔗糖、碳酸鎂等等。如果需要，該組合物還可包含較小量的無毒輔助物質，例如潤濕劑、乳化劑，或緩沖劑。
可以例如通過靜脈內、皮下、腹膜內或肌肉注射，將這種組合物經口服、透皮或非腸道地用于受體。為了用于口服液體制劑，可將該組合物制成以液體形式或者以適于在水或生理鹽水中水合的干燥形式供給的溶液、懸浮液、乳劑或糖漿。對于非腸道使用，典型地，適于非腸道使用的可注射組合物會在適合如無菌生理鹽溶液的靜脈溶液中包含雷公藤內酯醇衍生物。
可通過在藥學上可接受的載體，例如，如鹽水，葡萄糖溶液，甘油，或乙醇中溶解或分散雷公藤內酯醇衍生物(約0.5％至約20％)和任選的藥物助劑來形成溶液或分散液以制備液體組合物。本發明的高水溶解度化合物令其特別適于以水溶液形式使用，例如通過腹膜內注射。盡管水溶液是優選的，但還可以在脂類(例如，甘油三酯，磷脂，或者聚乙氧基化蓖麻油，例如″CREMOPHORELTM″)中，在脂質體懸浮液中，或者在含水乳劑中，將根據本發明的化合物配制成懸浮液。
還可通過吸入，以氣溶膠顆粒形式，或者固體或者液體，優選能被吸入的尺寸使用這種化合物。這樣的顆粒足夠小而使吸入通過口腔和喉，并且進入支氣管和肺的肺泡。一般來說，約1至10微米大小，優選小于約5微米的顆粒為能被吸入的。適于吸入的液體組合物包括分散在含水載體中的活性劑，如無菌無熱原鹽水或者無菌無熱原水。如需要，該組合物可與拋射劑混合以促使對該組合物進行噴射并形成氣溶膠。
制備這種劑型的方法是已知的或者對本領域熟練技術人員是顯而易見的；例如，參見Remington′s Pharmaceutical Sciences(第19版，Williams & Wilkins，1995)。所使用的組合物會包含一些選定的適于在受體中對免疫抑制有效或者在靶細胞中對細胞凋亡有效的有效量化合物。
正如所述，例如，在Panchagnula等人(2000)中，藥劑的分配系數或logP能影響其對各種使用途徑的適應性，包括口服生物利用度。本文描述的化合物具有比母體化合物，雷公藤內酯醇更高的計算logP(參見表)，使其就口服生物利用度而言為更好地侯選物。(表中所代表的化合物是式I的化合物，其中R2是OH，CR3R5和CR4R5都是CH2，R1如所示。如上所述，這些化合物在C14位上的立體化學使羥基被描繪在頁面平面之上。)
a)按照A.K.Ghose和G.M.Crippen，J.Chem.Inf.Comput.Sci.2721-35(1987)計算；SD＝0.47b)按照V.N.Viswanadhan，J.Chem.Inf.Comput.Sci.29163(1989)計算；SD＝0.49IV.免疫調節和抗炎治療已經顯示出在廣泛的自身免疫和慢性炎癥疾病中存在免疫調節的異常，包括系統性紅斑狼瘡，慢性風濕性關節炎，I型和II型糖尿病，炎癥性腸病，膽汁性肝硬化，葡萄膜炎，多發性硬化和其它病癥，例如克羅恩氏病，潰瘍性結膜炎，大皰性類天皰瘡，肉樣瘤病，牛皮癬，魚鱗癬，格雷夫斯氏眼病和哮喘。盡管下面這些病癥中每一個的發病機理可能是極不相同，但其共同具有多種自身抗體和自身反應性淋巴細胞的外觀。這種自身反應性可以部分地歸因于正常免疫系統在穩態控制下運行中穩態控制的喪失。
類似地，在骨髓或器官移植之后，宿主淋巴細胞識別外部組織抗原并開始產生引起移植排斥的抗體。
自身免疫或排斥過程的一項最終結果是由炎性細胞及其釋放的媒介引起的組織破壞。例如非甾體抗炎藥(NSAID′s)的抗炎劑主要通過阻滯這些媒介的效果或分泌起作用，但不緩和疾病的免疫學基礎。另一方面，例如環磷酰胺的細胞毒性劑以使正常和自身免疫反應均被切斷的這一非特異性的方式來起作用。實際上，以這些非特異性免疫抑制劑治療的病人與其患有的自身免疫性疾病一樣，可能屈服于感染。
在在雷公藤內酯醇和其前藥以及其它的衍生物已經證實為有用的應用，例如在免疫抑制治療中，如在治療自身免疫性疾病、預防移植排斥，或者治療或預防移植物抗宿主病(GVHD)中，本發明的組合物是有效的。參見，例如，共有的U.S.專利No.6,150,539號，其通過參考并入本文。雷公藤內酯醇和現有的衍生物還對于其它炎性病癥的治療，例如外傷性炎癥，以及在減小雄性生育力上是有效的。
對于抑制來自不相容人類供體的實體器官移植，組織移植，或者細胞移植排斥，所述方法是有效的，從而可延長移植物的成活率和功能，以及受體的成活率。這類用途包括，但不限于，實體器官移植(例如心臟、腎和肝)，組織移植(例如皮膚、腸、胰腺、性腺、骨，和軟骨)，和細胞移植(例如來自胰腺、腦和神經組織的細胞，肌肉，皮膚，骨，軟骨和肝)。
這種方法還對于抑制異種移植(種間)排斥有效；即在預防源于非人類動物的實體器官移植，組織移植，或細胞移植的排斥中有效，該非人類動物無論是在體質上是天然的情況中還是在生物工程化(bioengineered)(遺傳基因控制)以表達人類基因，RNA，蛋白質，肽或其它非天然的、異種基因分子，或者生物工程化以缺少動物天然基因，RNA，蛋白質，肽或其它通常表達分子的表達的情況中。本發明還包括如上所述的組合物在延長這種源于非人類動物的實體器官移植，組織移植，或細胞移植的成活率方面的用途。
另一方面，本發明包括移植物抗宿主病的治療或預防方法，其通過移植入受體匹配或不匹配的骨髓、脾細胞、胎兒組織、臍帶血，或者流動的或以別的方式采集的干細胞而得到。劑量優選為0.25-2mg/kg體重/天的范圍，優選0.5-1mg/kg/天，經口服或非腸道使用。
本發明還包括自身免疫性疾病或者具有自身免疫表現的疾病的治療方法，例如阿狄森氏病，自身免疫性溶血性貧血，自身免疫性甲狀腺炎，克羅恩氏病，糖尿病(I型)，格雷夫斯氏眼病，格林-巴利綜合征，全身性紅斑狼瘡(SLE)，狼瘡腎炎，多發性硬化，重癥肌無力，牛皮癬，原發性膽汁性肝硬化，風濕性關節炎和葡萄膜炎，哮喘，動脈硬化癥，I型糖尿病，牛皮癬，和各種過敏癥。在治療自身免疫性病癥中，在周期性的基礎上，例如每周1-2次，以足以減少癥狀的和提高病人舒適的劑量水平使病人使用這種組合物。特別地，對于治療風濕性關節炎，可以通過靜脈注射或通過直接注射入受感染的關節來使用這種組合物。在病人的疾病癥狀開始之后的幾周周期內，可以以至少24小時的重復間隔治療病人。
通過利用本領域已知的動物模型評價體內化合物的免疫抑制活性。可以使用這類實驗來評價免疫抑制化合物的相對有效性，并估計適于免疫抑制治療的劑量。這些實驗包括，例如，由Ono和Lindsey(1969)所述的，用于同種移植物的良好特征大鼠模型系統，其中移植心臟與同種異體的受體動物的腹部大脈管相連，通過受體動物中心臟跳動的能力估計移植心臟的活力。Wang(1991)和Murase(1993)描述了異種移植模型，其中受體動物為不同種類。一種評價抗GVHD療效所用的模型包括用親代脾細胞對正常F1小鼠的注射；小鼠顯示出特征在于脾大且免疫抑制的GVHD綜合征(Korngold，1978；Gleichmann，1984)。由單獨脾臟制備單一的細胞懸浮液，并且在存有和不存有伴刀豆球蛋白A的條件下建立微孔培養物以估計致有絲分裂反應的程度。
對于在移植排斥中的治療，特別地，所述方法試圖用于心臟、腎、肝、細胞和骨髓移植排斥的治療，還可以用于GVHD的治療。典型地，在外科手術移植操作稍前或稍后，在手術期間開始所述治療，并且持續每天的給藥方案，持續至少幾周的周期，以便對急性移植排斥進行治療。在治療期間，例如，通過包括同種異體淋巴細胞的混合淋巴細胞反應，或者通過采取移植組織的活組織，定期測試病人免疫抑制水平。
此外，可以長期使用所述化合物以預防移植排斥，或者用于治療晚期移植排斥的急性發作。如上所述，使用劑量優選為每天每kg病人體重1-25mg，對于非腸道使用，優選為更低數量的劑量，對于口服使用，優選更高數量的劑量。根據病人的反應，和在治療期內，病人抗感染的能力，劑量可適當增加或降低。
在本發明范圍內還包括式I化合物和一種或多種常規免疫抑制劑的結合治療。本發明范圍內的這些免疫抑制劑包括，但不限于，IMUREKTM(硫唑嘌呤鈉)，布喹那鈉，SPANIDINTM(胍立莫司三鹽酸化物，還稱為脫氧司加林)，咪唑立賓(還稱為布雷青霉素)，CELLCEPTTM(霉酚酸嗎啉乙酯)，NEORALTM(環孢霉素A；還在商標SANDIMMUNETM下以不同的制劑所銷售的)，PROGRAFTM(他克莫司，還稱為FK-506)，RAPIMMUNETM(西羅莫司，還稱為雷帕霉素)，來氟米特(還稱為HWA-486)，ZENAPAXTM，糖皮質素，例如潑尼松龍和其衍生物，例如正克隆(OKT3)的抗體，和例如兔抗胸腺細胞球蛋白(thymoglobulins)的抗胸腺細胞球蛋白。當與另一種免疫抑制藥物同時使用以進行如上討論的免疫治療時，所述化合物可作為增效劑來使用。因此，可以以比單獨使用所述化合物時基本上更少的用量(例如標準劑量的20％至50％)，使用例如以上所述的常規免疫抑制藥。或者，以使得到的免疫抑制遠大于單獨使用所述藥物和雷公藤內酯醇衍生物而所希望的或獲得的效果總和的劑量，使用雷公藤內酯醇衍生物和免疫抑制藥。典型地，在至少2周的時期內，以固定間隔時間使用免疫抑制藥和增效劑。
本發明所述的組合物和方法還對于炎性病癥的治療是有效的，例如哮喘，無論內在還是外在的表現。對于哮喘的治療，優選地，所述組合物經吸入法使用，但是任何常規的使用途徑均是有效的。所述組合物和方法還用于其它炎癥病癥的治療，包括外傷性炎，萊姆病炎癥，牛皮癬，慢性支氣管炎(慢性傳染性肺病)，慢性竇炎，急性呼吸窘迫綜合征相關的敗血病，貝堤特氏病，肺肉瘤病，天皰瘡，類天皰瘡炎癥性腸病，和潰瘍性結腸炎。
本發明所述組合物還可與常規的抗炎藥(或者藥品)結合使用，這里藥物或所使用的藥物量，其本身對誘導炎癥的適當抑制或制約是無效的。
優選地，使用劑量在每天每kg病人體重1-25mg的范圍內，對于非腸道使用，優選為更低的數量，對于口服使用，優選為更高的數量。按照本領域已知的方法，通過常規實驗可確定最優劑量。
V.抗癌治療在癌癥治療中，雷公藤內酯醇衍生物已經顯示出有效性。參見，例如，共有的U.S.專利第6,620,843號，本文通過參考引入，其描述了在以HT-29人類腫瘤結腸癌細胞系的異種移植研究中，雷公藤內酯醇衍生物與5-FU和CPT-11相比，在抑制腫瘤生長中的高效力。雷公藤內酯醇衍生物(雷公藤內酯醇14-琥珀酸鹽)與5-FU和CPT-11相比，在明顯地更大程度上強有力地抑制腫瘤生長，并誘導腫瘤的縮小。
因此，本發明包括如上所述組合物在治療癌癥方面的用途，包括癌癥，其含有源于生殖組織的細胞(例如塞爾托利細胞，生殖細胞，發育的或更成熟的精原細胞，精細胞或精母細胞和營養細胞，卵巢的生殖細胞和其它細胞)，淋巴或免疫系統癌癥(例如何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤)，造血系統和上皮(例如皮膚和胃腸道)、實體器官、神經系統及肌骨骨組織癌癥的細胞。雷公藤內酯醇衍生物還適用于各種癌細胞類型的治療，包括但不限于，乳房，結腸，小細胞肺，大細胞肺，前列腺，惡性黑色素瘤，肝，腎，胰腺，食管，胃，卵巢，子宮頸或淋馬瘤。乳房、結腸、肺和前列腺腫瘤的治療為特別注意的。還注意到對白血病的治療。如上所論，可以通過任何常規使用途徑對受癌癥和/或白血病折磨的病人使用所述組合物。
所述方法對于延緩腫瘤的生長，預防腫瘤生長，誘導腫瘤部分縮小，和誘導腫瘤完全縮小，至徹底消失均為有效。所述方法在預防源于實體瘤的轉移瘤的贅疣中也是有效的。
可以作為單獨治療來使用本發明的組合物或與其它并未設計來在受體中具有抗癌作用的支持或治療性治療一起使用本發明的組合物。所述方法還包括使用與一種或多種常規抗癌藥或生物蛋白制劑結合的本發明組合物，該組合物在受體中具有所需抗癌作用的有效量，其中藥或制劑的數量對于誘導癌癥生長的適當抑制本身是無效的。這類抗癌藥包括放線菌素D，喜樹堿，卡鉑，順鉑，環磷酰胺，阿糖胞苷，柔紅霉素，多柔比星，依托泊苷，氟達拉濱，5-氟尿嘧啶，羥基脲，吉西他濱，伊立替康，甲氨蝶呤，絲裂霉素C，米托蒽醌，紫杉醇，泰索帝，替尼泊苷，拓撲替康，長春堿，長春新堿，長春地辛和長春瑞賓。抗癌生物蛋白劑包括腫瘤壞死因子(TNF)，TNF--相關的凋亡誘導配體(TRAIL)，其它TNF-相關或TRAIL-相關的配體和因子，干擾素，白介素-2，其它白介素，其它細胞因子，趨化因子，和因子，對腫瘤相關分子或受體的抗體(例如抗-HER2抗體)，和與這些制劑反應或結合的制劑(例如TNF超家族受體的成員，其它受體，受體拮抗劑，和對這些制劑具有特異性的抗體)。
實施例以下實施例用于舉例說明但不以任何方式限制本發明。
實施例1.14-C-甲基雷公藤內酯醇(PG670)的制備 在-78℃的氮氣下，向雷公藤內酯酮、PG492(60mg，0.17mmol)的THF(5ml)溶液中加入0.45ml甲基鋰(1.4M乙醚溶液，0.63mmol，3.7當量)。溶液在-78℃攪拌2小時45分鐘，然后在室溫下攪拌2小時，這時TLC上的起始物料已經消失了。緩慢加入乙酸(1ml)。然后在真空下濃縮溶液。將粗品溶于二氯甲烷(3ml)并使其通過硅膠墊，然后將其用5％甲醇乙酸乙酯溶液(80ml)洗滌。除去溶劑后，得到78mg粗品。將其溶于乙腈(0.6ml)并過濾。使用均來自Alltech的10×250mmEconosil C18(5μ)柱和Alltima C18(5μ)卡套保護柱(7.5×4.6mm)，和流動相CH3CN/H2O40/60，流速為2.0ml/分鐘，在HPLC上分離產品混合物。收集具有32.13分鐘保留時間的第六峰，并將其真空濃縮。產品具有m/z 374(7.9mg，收率12.6％)。
由NMR鑒定結構。H1NMR(300MHz，CDCl3)δ＝4.68(2H，s，19-CH2)，3.95(1H，d，11-CH)，3.50(1H，d，12-CH)，3.49(1H，s，14-OH)，3.39(1H，d，7-CH)，2.69(1H，m，5-CH)，2.46(1H，m，15-CH)，2.33(1H，m，2-CHb)，2.12(1H，m，6-CHb)，1.97(1H，m，6-CHa)，1.57(1H，dd，1-CHb)，1.38(1H，m，2-CHa)，1.22(1H，m，1-CHa)，1.14(3H，s，14-CH3或20-CH3)，1.09(3H，d，17-CH3)，1.08(3H，s，20-CH3或14-CH3)，0.81(3H，d，16-CH3)ppm。
實施例2細胞凋亡檢測A.對帶有人血清的化合物的培育在-80℃下，等分貯藏匯集的人血清。在1.5ml微量離心機的試管中將20mM化合物加入解凍的人血清中并以37℃水浴培育48小時。將試樣置于冰上直至稀釋以便生物測定。由在完全組織培養基(RPMI1640培養基加5％熱鈍化胎牛血清、1％HEPES、1％青霉素/鏈霉素(pen/strep)、1％谷氨酰胺)而非人血清中培育出的化合物組成對照物。
B.Annexin V細胞凋亡檢測將試樣(如A部分所述在人血清中培育的)在完全組織培養基中稀釋至1mM。將其等分置于微量培養板中并進行連續稀釋，以使最后濃度包括在具有半對數(half-log)增量的2至6000nM范圍內。從Jurkat人類T淋巴細胞系(#TIB-152得自美國典型微生物菌種保藏中心，Manassas，VA)的指數增加培養物中收集細胞，通過離心對其進行一次洗滌并在完全組織培養基中稀釋，稀釋至1×106細胞/ml濃度。將100ml體積的Jurkat細胞(1×105細胞)加入到含有100ml已稀釋化合物的孔中，然后在5％CO2培養箱中于37℃培育片板。
24小時之后，對片板進行離心以使細胞成團，并且用2％熱鈍化胎牛血清PBS液洗滌細胞兩次。按照Annexin V檢測步驟(BioVision，Inc.，Mountain view，CA)，向每個孔中加入500ml結合緩沖液。然后，向每個孔中加入5ml異硫氰酸熒光素(FITC)的Annexin V(BioVision，Inc.)共軛物，隨后在黑暗中培養5分鐘。在一些檢測中，在此階段加入碘化丙啶(BioVision，Inc.)以檢查壞死細胞。將孔中的內容分別轉移至試管，采用FACSCalibur流式細胞儀(BD Immunocytometry Systems，San Jose，CA)分析細胞凋亡。認為與Annexin V結合為陽性的細胞是凋亡的，以凋亡細胞百分比計算數據。
以在血清中培育的化合物的濃度對凋亡細胞百分比將數據繪圖。圖1顯示出與PG490(雷公藤內酯醇)和溶劑對照物相比，PG670(14-甲基雷公藤內酯醇)的結果。
C.末端脫氧核甘酸轉移酶細胞凋亡檢測在這個檢測中，如以上部分A所述制備試樣并如部分B所述進行稀釋。還如部分B所述，加入Jurkat人類T淋巴細胞，在5％CO2培養箱中于37℃培育片板。24小時之后，對片板進行離心以使細胞成團，用PBS洗滌細胞。用多聚甲醛固定、洗滌細胞，并用乙醇處理、洗滌，隨后以酶末端脫氧核甘酸轉移酶(TdT)和熒光素標記的脫氧尿苷(dUTP)培育細胞。所述方法使DNA分子的3’末端標記在細胞凋亡的DNA裂解階段期間缺口(末端核苷酸轉移酶介導的脫氧三磷酸尿苷原位缺口末端標記法，TUNEL標記法)。洗滌細胞，用核糖核酸酶對其進行處理，洗滌并在含有碘化丙啶的培養基中再懸浮，以辨別完整的凋亡細胞。將檢測孔中的內容分別轉移至試管，采用FACSCalibur流式細胞儀(BDImmunocytometry Systems，San Jose，CA)分析細胞凋亡水平。認為對F1-dUTP為陽性的細胞是凋亡的。
實施例3IL-2生成檢測將如實施例2A所述在人血清中培育的試樣，在完全組織培養基中稀釋至1mM。將其等分置于已經涂敷抗-CD3抗體(用于通過Jurkat細胞刺激IL-2生成的)的微量培養板，并且進行連續稀釋，以使最后濃度包括在具有半對數(half-log)增量的2至6000nM的范圍內。從Jurkat人類T淋巴細胞系(#TIB-152得自美國典型微生物菌種保藏中心，Manassas，VA)的指數增加培養物中收集細胞，通過離心對其進行一次洗滌并在完全組織培養基中稀釋，稀釋至2×106細胞/ml濃度。將50ml體積的Jurkat細胞(1×105細胞)加入到含有100ml已稀釋化合物的孔中，向每個孔中加入50ml PMA(10ng/ml)，并且在5％CO2培養箱中于37℃培育片板。24小時之后，對片板進行離心以使細胞成團，從每個孔中除去150ml上清液，在-20℃貯藏樣品。使用Luminex 100(LuminexCorporation，Austin，TX)，與抗-IL-2捕獲抗體偶合的Luminex微球，和熒光物質-偶合的抗-IL-2檢測抗體對貯藏上清液的人IL-2濃度進行分析。以IL-2ng/ml表示數據。
將數據以在血清中培育的化合物的濃度對IL-2濃度進行繪圖。圖2顯示出與PG490(雷公藤內酯醇)和溶劑對照物相比，PG670(14-甲基雷公藤內酯醇)的結果。
權利要求
1.一種具有結構I的化合物 其中R1是H或R，其中R選自低級烷基，烯基，炔基，或丙二烯基，或者，R1加R2＝O(氧代)；R2＝OH或者R1和R2一起為＝O(氧代)；CR3R5和CR4R6選自CH2，CHOH，或CROH；R1、R5和R6中至少一個是R；并且CR3R5和CR4R6中至少一個是CH2。
2.根據權利要求1所述的化合物，其中R選自甲基，烯丙基，或2-丙炔基。
3.根據權利要求2所述的化合物，其中R是甲基。
4.根據權利要求1所述的化合物，其中R1加R2為＝氧代，CR3R5和CR4R6之一是CROH，另一個是CH2。
5.根據權利要求1所述的化合物，其中R1是H，R2是OH，CR3R5和CR4R6之一是CROH，另一個是CH2。
6.根據權利要求1所述的化合物，其中R1是R且R2是OH。
7.根據權利要求6所述的化合物，其中CR3R5和CR4R6的每一個均是CH2。
8.根據權利要求7所述的化合物，其中R是甲基。
9.一種對免疫抑制有效的方法，包括對需要這種治療的受體使用在藥學上可接受的載體中的有效量的具有結構I的化合物 其中R1是H或R，其中R選自低級烷基，烯基，炔基，或丙二烯基，或者R1加R2為＝O(氧代)；R2＝OH或者R1和R2一起為＝O(氧代)；CR3R5和CR4R6選自CH2，CHOH，或CROH；R1、R5和R6中至少一個是R；并且CR3R5和CR4R6中至少一個是CH2。
10.一種在細胞中誘導凋亡的方法，包括使有效量的具有結構I的化合物與所述細胞接觸 其中R1是H或R，其中R選自低級烷基，烯基，炔基，或丙二烯基，或者R1加R2為＝O(氧代)；R2＝OH或者R1和R2一起＝O(氧代)；CR3R5和CR4R6選自CH2，CHOH，或CROH；R1、R5和R6中至少一個是R；并且CR3R5和CR4R6中至少一個是CH2。
全文摘要
本發明涉及對誘導細胞死亡(凋亡)和免疫抑制有效的具有結構I的化合物。在結構I中，R
文檔編號C07D307/77GK1726025SQ200380106129
公開日2006年1月25日 申請日期2003年12月16日 優先權日2002年12月17日
發明者D·戴, J·H·馬瑟 申請人:泛華醫藥公司