專利名稱：一種卵磷脂和類黃酮小分子的組合物、制備方法和它們的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有醫學用途的組合物，更具體地說是由卵磷脂和類黃酮的分子組成的組合物在預防和治療動脈粥樣硬化等心血管疾病中應用。
背景技術：
急性冠狀動脈綜合癥是死亡率極高的一類疾病。目前醫學界對動脈粥樣硬化心血管病的處理手段僅限于冠脈搭橋術、冠脈內裝支架和導管術三種外科手術方法。
外科手術的危險性和局限性已是眾所周知。所以通過將組織細胞內異常積聚的膽固醇尤其血管壁內動脈粥樣硬化斑塊中膽固醇轉運出體外，減少血管中斑塊堵塞體積從而治療心肌梗死、心絞痛等急性冠狀動脈綜合癥的方法是世界各大制藥公司在開發新一代治療動脈粥樣硬化心血管病藥上競爭的核心。而LUV是開發治療急性冠狀動脈綜合癥藥最為重要的方向之一。黃茚甙元(CM105)是我公司應用世界先進的第三代抗心血管病藥物篩選平臺從中草藥中篩選出來的天然小分子化合物，該小分子化合物可直接作用于細胞核受體PPAR系列及受PPAR調控的相關蛋白(如APOAI、APOCIII等的表達)來提高血漿中轉運膽固醇的關鍵脂蛋白，高密度脂蛋白(HDL)含量，同時降低低密度脂蛋白(LDL)和總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)等含量。本發明介紹了一種用LUV和類黃酮小分子復方將人體細胞和組織中膽固醇，尤其血管壁內動脈粥樣硬化斑塊中膽固醇轉運出體外，減少血管中斑塊堵塞體積從而治療心肌梗死、心絞痛等急性冠狀動脈綜合癥中的應用。下面將詳述LUV和CM105的復方的配比及它的作用機理。
發明內容
本發明的目的是提供一種由磷脂和類黃酮小分子-黃芹甙元組成的組合物。
本發明的另一目的是提供該類組合物的新醫學用途。
本發明提供一種具有如下結構的黃岑甙元(CM105) 與卵磷酯組成組合物，該組合物的配比比例如下
黃芩甙元∶卵磷酯＝1份∶5～30份，根據制劑需要加入輔料組成組合物。
本發明提供LUV和CM105的不同比例組成的組合物對預防和治療心血管疾病中的應用，其作用原理分述如下磷脂LUV的作用原理LUV是一種大的單層脂質體。LUV療法是一種在不破壞肝臟膽固醇動態平衡的條件下，迫使膽固醇從身體外周部分逆向轉運到肝臟的方法。膽固醇(未酯化的，酯化的和氧化的)和其他在動脈血管壁及組織細胞內外堆積的脂質在急性冠狀動脈綜合癥形成中起到重要的作用。因此，從外周細胞、組織、器官和胞外區域移走膽固醇和其他有交換能力的物質，對治療急性冠狀動脈綜合癥致關重要。同時應該注意到，膽固醇主要是在肝中代謝，LUV攜帶膽固醇等進入肝臟一定不要破壞肝臟膽固醇代謝的動態平衡，也一定不要使血漿中引起動脈粥樣硬化的載脂蛋白濃度升高。特定粒徑如200nm粒徑的LUV將可以完成此項功能。我們采用200nm孔徑的膜擠壓卵磷脂，可以得到直徑大概為220nm-230nm±60nm的LUV。
LUV可以大量逆向轉運多余的脂質，包括外周組織中的膽固醇和其他可交換物質和類似成分。可以從其他脂質雙層膜那里接收未酯化的膽固醇，還可以攜帶蛋白質和隨附的磷脂。其范圍含蓋血管壁、任何的膜、細胞、組織、器官和胞外區域和結構上可以交換的脂質，不儀包括膽固醇，還包括鞘磷脂、氧化脂質、溶血卵磷脂、蛋白質以及其它來源的磷脂。從而消除斑塊，減輕嚴重的血管狹窄和血管成形后的再狹窄，有利于動脈粥樣硬化的改善。
LUV必須限制合理的粒徑。肝臟內皮細胞是圓形的開放形式，大約100-115nm，粒徑小的脂質體(SUVs)，如50nm的SUV將大量膽固醇帶進入肝細胞，使肝實質細胞過載甾醇，從而打亂了肝臟膽固醇動態平衡，導致CE濃度和有害的載脂蛋白(低密度脂蛋白(LDL)、VLDL-膽固醇)的濃度升高，同時啟動了異常的基因調節，比如LDL受體基因(表達下降)，HMG輔酶A還原酶基因(表達下降)，膽固醇7-α羥化酶等。而這些可以加速而不是延遲血管綜合癥的發展。導致CE濃度升高可能涉及兩個環節。其一，CE富積粒子在血漿和肝臟中的過度產生。在血漿中，LCAT可作用于SUVs，利用SUVs提供額外的磷脂和膽固醇去產生膽固醇酯和溶血卵磷脂。CE又被CETP轉運給了LDL。其二，CE富積脂蛋白清除的削弱。在血漿中，SUVs將apoE從VLDL的奪走能減緩VLDL本身的清除，因此有助于其轉換成LDL。在肝臟中，在膽固醇被動員過程中，膽固醇運到肝臟數量增加刺激了apoB，CE富積的脂蛋白的產生。
而特定大小的LUV(200～1000nm)可控制血漿中LDL濃度、VLDL-膽固醇的濃度。但不會引發肝臟代謝的紊亂。首先，LUVs由于直徑大，不易通過肝臟實質細胞，大部分被Kupffer細胞吸收。Kupffer細胞在改變了脂質的甾醇結構后再逐步地將它運給肝實質細胞。因此說膽固醇通過肝實質細胞和Kupffer細胞進行清除的途徑有截然不同的代謝產物。第二，動力學上LUVs和SUVs運輸到肝臟的性質也是不同的，LUVs從血漿中轉運一般比SUVs慢。第三，這兩種載體吸收蛋白質的數量不同，由于它們截然不同的表面曲度，SUVs而不是LUVs，會很貪心地從VLDL上將aopE剝下來，使其在血漿中清除變慢，而有助于其向LDL轉變。因此LUVs也不會影響肝臟中CETP，HMG輔酶a還原酶，LDL受體和膽固醇7-a羥化酶，LDL ChE的mRNA含量。因此，總的說來利用LUVs作為治療急性冠狀動脈綜合癥的藥物，它可以直接朝向目標，由于它不造成肝臟脂質代謝的紊亂，因此即使使用高劑量也未發現它的毒副作用。
CM105是通過第三代抗動脈粥樣硬化藥物篩選平臺從中草藥中篩選出來的天然小分子化合物，該小分子化合物可直接作用于細胞核受體PPAR系列及受PPAR調控的相關蛋白(如APOAI、APOCIII等的表達)。該化合物可提高血漿中的高密度脂蛋白(HDL)含量，同時降低低密度脂蛋白(LDL)和總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)等含量。更為重要的是，CM105可以調控從周圍細胞到血液，到肝臟的與膽固醇轉運出體外相關的系列基因、受體、蛋白和酶。通過控制和調節這些基因、受體、蛋白和酶可以將血管壁細胞和動脈粥樣硬化斑塊細胞內的膽固醇運至細胞膜，通過升高的HDL將膽固醇轉運到肝臟，在肝臟相關受體、酶的作用下，將HDL轉運來的膽固醇排出體外。
主要用途及應用范圍提示LUV復方的主要適應癥是治療動脈病理改變包括心絞痛(穩定型和不穩定型)、心肌梗死、心力衰竭和猝死、腦組織缺血(腦梗死)及腦部血管破裂造成的腦出血等。另外還包括動脈硬化癥、靜脈硬化癥和相關靜脈斑塊沉積的各種疾病、脈管炎、充血性心力衰竭、高血壓、冠心病引發的心率失常、外周血管病、一過性心肌缺血，外科手術等引起的缺血再灌注損傷、冠脈再狹窄、深靜脈血栓形成、周邊四肢缺血、斑塊脫落和任何由于血管狹窄導致的缺血性病理改變；此藥可以治療I和II糖尿病及其引發的后遺癥、糖尿病神經病變，視網膜病變等。該項目的最終研究成果將開發出一種臨床上抗急性冠狀動脈綜合癥及其相關疾病的重要藥物。
制備LUV的工藝LUV提取以富含卵磷脂的大豆或雞蛋粉為初始粗原料，用有機溶劑溶出其中的磷脂成分，然后經過硅膠柱層析去除色素和部分雜質，并濃縮、收集大豆或雞蛋卵磷脂(phosphatidylcholine，PC)成分，再經過離子交換柱層析進一步除去雜質成分，成為可以用于LUVs制備的純品卵磷脂(purified PC)；卵磷脂加入于圓底燒瓶中，先用N2盡量吹干，然后真空干燥，使EPC均勻的附著在瓶壁上；然后加入緩沖液或者水，振蕩形成多層脂質體(multilemella visicle，MLV)，然后依次使用0.4um、0.2um聚碳酸酯濾膜，在高壓下(100-450psi)，利用Extrusion技術制備LUVs。
儀器Agilent高效液相色譜儀樣品(Sample EPC)自制對照品(Standard EPC)L-α-Phosphatidylcholine From Flesh Egg Yolk(SIGMA公司)蛋黃各種脂質中，卵磷脂是主要成分。我們通過高效液相色譜的方法對我們制備的蛋黃卵磷脂和國際上各實驗室使用的SIGMA公司銷售的蛋黃卵磷脂進行了鑒別。將卵磷脂樣品與標準品的乙醇溶液分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，樣品主峰的保留時間與對照品主峰的保留時間一致。同時，樣品與標準品主峰的紫外掃描圖譜也一致，最大吸收波長均為204nm。這些結果表明，我們的制備品是高純度的蛋黃卵磷脂。
CM105和LUV復方的研發LUV可以將外周細胞間質或細胞間隙的膽固醇逆向轉運到肝臟，直接靶向治療急性冠狀動脈綜合癥；CM105全面調節基因表達整體調節機體的血脂組成，兩者合用起到直接靶向作用和整體調節相互協調的效果。直徑較大的大運載體LUV由于其特定的運作效果和模式，使它很難滲透到細胞間隙，因此也很難到達這種環境下的細胞表面。這樣就使得外周組織中具有交換能力的物質(如膽固醇)很難被轉運。因此，大直徑的LUV和小直徑的運載體——CM105調節內生的HDL——合用可以解決此類問題。小運載體HDL可以滲透到細胞間隙，到達細胞表面，所以可以有效轉運這種物質。同時，合用后也可以解決小運載體容量有限的不足。所以，小運載體滲透到組織，從組織中得到物質，變得飽和。它們離開組織，到達血漿中的大運載體，在那里將物質轉給大運載體。此后，小運載體容量得到恢復，回到組織，可以運載更多的物質。這種循環可以持續多次。另外，大運載體還可以完成對小運載體的部分改造。因此，LUVs和HDL之間存在相互作用，相互取長補短。LUVs可重塑HDL，通過給予更多磷脂使之變成更好的受體，而小運載體HDL可作為穿梭體，有效攜帶膽固醇到脂質體上。
此外，CM105不但可提高血漿HDL水平，還可以降低血漿LDL、TC、TG水平，起綜合調節脂質代謝紊亂的作用。這種合用會產生多種有利于消除動脈粥樣硬化斑塊的作用，比如LUV和CM105的合用可共同搬運細胞氧化的脂質，共同減少其對內皮細胞的損壞，恢復內皮細胞分泌EDRF、CNP(C-type natrizuretic peptide)的能力。LUV和CM105的合用也可易化HDL運走可氧化脂質的相關酶的作用。LUV和CM105的合用可增加身體消除體內凝塊的能力等等。因此LUV與CM105的合用各取其利而避其弊，得到了最佳的治療效果。
CM105和LUV復方的體內藥效學研究我們選用抗動脈粥樣硬化最為常用和公認的試驗動物，新西蘭兔，制造動脈粥樣硬化動物模型。分別研究空白對照組、模型對照組、單獨LUVs治療組、單獨CM105治療組、CM105聯合三個不同劑量LUVs治療組。采用隔天給藥(靜脈)的方式觀察藥物對動脈粥樣硬化新西蘭兔的影響。我們分別對家兔的血清、血管、肝臟、糞便中最為反應療效的觀測指標進行檢測。觀測指標分別為(1)血清①TC、TG、HDL-C、LDL-C、FC(2)血管①血管壁脂質生化TC、TG檢測；②血管壁游離膽固醇；③膠原含量、巨嗜細胞、血管壁厚度；④斑塊面積；(3)肝臟①總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)②游離膽固醇檢測；③HMG-CoA還原酶；；(4)糞便膽酸值。
研究結果提示，LUV復方可以定向轉運動脈粥樣硬化斑塊中的膽固醇，復方的作用效果遠大于藥物的單獨使用。由于復方的匹配合理，藥物具備了定向作用和全身調節的協同作用。機體在逆向轉運膽固醇時，沒有引發肝臟和機體代謝的紊亂，代謝后的膽固醇也快速通過腸道排除，沒有影響機體的正常功能。
同時，本發明提供了一種可藥用的組合物，該組合物由黃芹甙元化合物與卵磷脂(或其藥用鹽，或它們的藥用溶劑化物)與適當的藥用輔料組成。藥用輔料的選擇因施用途徑和作用特點而異，通常是填充劑、稀釋劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、乳化劑、助懸劑等。
本發明的組合物可以口服、注射(靜脈、肌肉、皮下和冠狀動脈內)、舌下、經頰、經直腸、經尿道、經陰道、經鼻、吸入或局部途徑施用。優選的途徑是口服。
本發明還提供了黃芹甙元化合物與卵磷脂可藥用的組合物的制備方法。通常將黃芹甙元化合物與卵磷脂藥用輔料相混合，經常規的制備方法制成適于一定途徑施用的形式(劑型)。劑型包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、軟膏、膜劑、霜劑、氣霧劑、注射劑、栓劑等。優選片劑和膠囊劑。
片劑和膠囊劑的組方可含有黃芹甙元化合物與卵磷脂，以及一種或多種常用輔料，例如淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、微晶纖維素、甘露糖等填充劑；羧甲基纖維素、明膠、海藻酸鹽和聚乙烯吡咯烷酮等粘合劑；甘油等潤濕劑；瓊脂、乙基纖維素、羧甲基淀粉鈉、碳酸鈣等崩解劑；硬脂酸鎂、滑石粉、聚乙二醇等潤滑劑配制而成。
此外，本發明還提供了黃芹甙元化合物與卵磷脂或其藥用鹽，或它們的藥用溶劑化物，或含有其中的任一個的可藥用的組合物，作為人用(或動物用)藥物的用途。
本發明還提供了黃芹甙元化合物與卵磷脂或其藥用鹽，或它們的藥用溶劑化物，在制備治療或預防任何由血管狹窄導致的缺血性病理改變的疾病的人用(或動物用)藥物中的用途。
本發明特點1)在世界上首次將快速轉運動脈粥樣硬化斑塊和組織間質中膽固醇的LUV和控制人體內整體轉運血管壁細胞和動脈粥樣硬化斑塊細胞內膽固醇出體外的CM105類黃酮小分子化合物聯用，產生了一個治療急性冠狀動脈綜合癥作用全面，功能強大的新方法。
2)在世界上首次采用特定粒徑的LUV來消除動脈粥樣硬化斑快。
3)在世界上首次以PPARα-ApoAI聯用篩選平臺篩選到純天然的小分子化合物用于治療急性冠狀動脈綜合癥。
4)發明了制作特定粒徑LUV的全新方法，方法高效、高產、低耗質量穩定。
5)發明了生產高純度類黃酮小分子化合物CM105的最佳生產工藝。
應用本公司發明的，國際先進的體內病理動物模型、體外基因、蛋白、細胞新藥高通量篩選平臺，用綜合評價方法篩選到全新治療急性和慢性動脈粥樣硬化心血管病藥物。
以下我們將結合具體實施例和附圖對本發明作進一步說明。
表1是動物分組與給藥劑量。
圖1是血漿TC(mg/dL)檢測結果。
圖2是血漿HDL-C(mg/dL)檢測結果。
圖3是血漿TG(mg/dL)檢測結果。
圖4是血漿L DL-C(mg/dL)檢測結果。
圖5是肝臟TC含量的檢測結果。
圖6是肝臟FC含量的檢測結果。
圖7是肝臟EC含量的檢測結果。
圖8是肝臟TG含量的檢測結果。
圖9是肝臟HMG-CoA活性的檢測結果。
圖10是血漿PAF-AH活性的檢測結果。
圖11是主動脈弓斑塊厚度的檢測結果。
圖12是卵磷脂樣品和標準品的主峰的保留時間比較。
圖13是卵磷脂樣品和標準品的主峰的紫外吸收比較。
具體實施例方式
實施例1試驗材料1試劑飼料購自上海海科動物中心。
HE染色相關試劑。
血漿總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)生化檢測試劑盒上海Roche。
HMG-CoA還原酶活性檢測試劑(試劑名稱、廠家參見附錄實驗Protocol)。
2器材動物飼養、麻醉、解剖相關器材；卵磷脂純化；LUVS制備相關試劑和儀器；生化分析儀；-80℃冰箱；勻漿器，離心機；高效液相色譜儀以及相關分析柱；其他離心管等常用耗材。詳見SOP。
試驗動物1 動物品系新西蘭兔2 來源由上海海科動物中心提供，許可證號SCXK(滬)2002-00153 體重試驗開始時，1.4-1.7g之間4.數量60只5.性別雄性6.飼養條件家兔在上海凱曼生物科技有限公司普通級飼養房飼養。自由飲水，溫度23℃±2，相對濕度40-70％。每天處理糞便、尿液2次，自由飲用過濾水和食用滅菌飼料。采用頂棚垂直送風，四周側墻回風方式，使新鮮空氣均勻分配到每個籠。全新風定時換氣，室內形成大于大氣壓1毫米水柱的正壓，以防止外界空氣污染。每日光照12小時，黑暗12小時。
試驗方法1.實驗動物飼養與造模方法飼料配方基礎飼料9380g中，添加膽固醇20g，椰子油300g，魯花牌花生油(無膽固醇)300g。
飼喂方法每只兔子每天飼喂共早晚兩次，早上60g，晚上80g，共計140g。飼喂過程檢測動物體重并記錄；定期檢測血漿TC、TG量，并以此作為分組標準。采血前統一禁食12小時。
造模方法以含膽固醇的飼料飼喂5周，并檢測血漿TC值。后停止飼喂膽固醇飼料，改喂基礎飼料。
2.LUVS制備2.1溶解卵磷脂原料與上樣液制備取出3kg蛋黃粉或者大豆原料，用5000mL丙酮，攪拌混勻，抽提3次；負壓抽濾，濾餅盡量濾干，濾餅用1000mL異丙醇超聲抽提3次，合并提取液(稍顯黃色)，減壓過濾回收異丙醇溶液，旋轉蒸干，用柱層析洗脫液(異丙醇∶石油醚∶H2O＝200∶200∶25)約500mL溶解，作為卵磷脂上樣液，準備進行柱層析。
2.2硅膠柱層析2.2.1浸泡取300g的300或者400目硅膠，用1000mL柱層析洗脫液浸泡過夜，準備裝柱；2.2.2裝柱與洗脫硅膠浸泡過夜后，濕法裝柱；等待硅膠自然沉降致密后，開始用5000mL洗脫液洗柱；2.2.3上樣洗柱結束后，保留大約10mL洗脫液，然后小心加入卵磷脂上樣液；然后小心加入洗脫液，到一定高度后，加入足量的洗脫液，打開閥門，進行洗脫；2.2.4洗脫與收集正壓洗脫。收集洗脫液，每300mL收集到一個容器中。用薄層層析(TLC)檢驗洗脫液中卵磷脂成分和含量，收集不見明顯雜質的洗脫液部分。
2.2.5旋轉蒸干將收集洗脫液旋轉蒸干，并用乙醇溶解，濃度約0.1g/mL。取適量用于離子交換層析。
2.3層析2.3.1裝柱取一只直徑4cm的層析柱，稱取200g層析用聚酰胺樹脂(尼龍6)[巴陵石化有限責任公司，緩慢均勻的倒入層析柱內；然后加入無水乙醇洗柱，洗到洗脫液澄清；2.3.2上樣取6-15g溶于乙醇的的卵磷脂，上樣量不能超過4g/100g離子交換樹脂，否則柱子會過載。上樣后，打開閥門，讓樣本進入交換材料，然后加入乙醇洗脫。
2.3.3洗脫用無水乙醇進行洗脫。洗脫液每15mL收集一管。用薄層分析洗脫液中是否出現卵磷脂。根據檢測結果，開始洗脫的第一個成分棄置不用，收集第二個成分的洗脫液，旋轉蒸干，再于真空下干燥，至形成干燥的白色卵磷脂停止真空干燥，充入高純氮氣，密封保存備用。因為柱吸附的原因，得率一般可以達到60-70％。
2.4 LUVs制備實驗2.4.1器材準備500(或者250)mL試劑瓶250℃除熱原；Extrusion濾器下部裝置2M NaOH除熱原處理(室溫浸泡2h)；生理鹽水(醫用)；布置N2鋼瓶、紫外滅菌燈、正壓潔凈工作臺的獨立房間；超濾器除熱原準備。聚碳酸酯濾膜2M NaOH浸泡0.5小時，除熱原、備用。
2.4.2卵磷脂固體純品卵磷脂稱重，向燒瓶中加入大約20倍重量體積的millipore純水；放在搖床上振蕩，至瓶壁上的卵磷脂全部脫落，并形成均一的白色乳濁液(多層脂質體，MLVs)。溫度4℃；時間約需4小時，如果需要可以延長過夜。
2.4.3 Extrusion制備LUVs在超凈臺上進行。0.4um、0.2um聚碳酸酯濾膜先經2M的NaOH溶液泡過后，然后置于millipore高壓濾器中，組裝完整并旋緊螺絲；MLV加入組裝完好的濾器中，擰緊密封螺絲；過濾裝置與氮氣壓力進氣口連接，并擰緊連接螺絲；打開氮氣閥門，慢慢開始加壓，先加壓到1Mpa(大約140psi)，此時開始Extrusion并促使MLVs轉變成LUVs，流速可能會變慢，此時可以適當增加壓力，但是不要超過3.0Mpa；依次更換使用0.4、0.2um膜過濾，直至所有MLV均形成均一直徑(最終直徑約200nm)的LUVs。LUVs為均一、半透明的乳濁液。
3.動物分組與給藥方法動物分組動物預養兩周，然后開始飼喂添加膽固醇的飼料，并于每周結束時檢測血漿TC、TG指標。繼續飼喂三周。檢測此時血漿中TC、TG值。預先挑選、解剖兩只動物，檢測模型發展情況。如果模型建立情況良好，斑塊均有形成，則停止飼喂含膽固醇的飼料，并進行分組。把三周內血漿TC值由高到低排列，連續6只一組，共分成五組。然后各組的高值與另一組的低值搭配，形成動物實驗分組(如此保證每組的TC平均值基本相似)。組別和用藥計劃如下(包括一個模型組，一個空白對照組。空白對照組不需要進行飼喂膽固醇飼料)。
給藥方式耳緣靜脈給藥。相對于0.9g/kg、0.6g/kg、0.3g/kg LUVS的劑量，LUVS注射液體積為7.5mL/kg、5mL/kg、2.5mL/kg體重。注射量隨動物體重而做調整。模型組和空白對照組統一注射5mL/kg體重的生理鹽水。
動物分組和給藥方法見表1。
4.動物處死和標本處理依計劃家兔連續注射LUVS七次后，耳緣取血，部分收集肝素抗凝的血漿，部分待凝固后收集血清。頸總動脈放血，處死動物。取肝臟置-80℃凍存備用。取心臟、主動脈弓(到腎的位置)，縱剖開，然后連同心臟一起用10％的中性甲醛固定一周。
檢測指標1.血清TC、TG、HDL-C檢測。將收集的血清，在Landmark-AGII全自動生化分析儀，用Roche試劑盒檢測。
2. HE染色確定斑塊厚度取動脈弓，10％甲醛水溶液固定24小時以上。然后依次用70％、80％和95％乙醇(兩次)、無水ALC(三次)，進行脫水，時間分別是四個2h、三個1h、兩個30min、3個1h，共11h。然后用兩罐二甲苯、三罐蠟進行浸蠟。然后在溫箱中，56-58℃進行石蠟包埋。石蠟凝固后，進行連續切片，然后轉移到載玻片上，60℃烤片3小時，至石蠟融解，然后用兩罐二甲苯、兩罐95％乙醇、80％乙醇、70乙醇脫去石蠟，時間分別是3、3、5、2min。水洗之后，常規HE染色，現在蘇木素中染色5min，如果發現染色過深，用酸進行分化；繼續流水沖洗，然后快速進行伊紅染色。經過兩罐95％ALC、三罐無水ALC、一罐二甲苯處理，擦干凈玻片，貼上標簽，并用中性樹脂封片。鏡檢測量斑塊厚度，并拍照記錄結果。
3.肝臟中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)檢測分別稱取每只兔子0.5g重量的肝組織，以磷酸buffer勻漿，然后在Landmark-AGII全自動生化分析儀，用Roche試劑盒檢測。
4.肝臟游離膽固醇檢測以上勻漿液取0.5mL，加入3.0mL乙酸乙酯，漩渦振蕩30sec，然后每間隔3min混勻，以充分提取勻漿中得游離膽固醇。然后用HPLC進行檢測，分析柱為C18ODS柱。用標準曲線計算游離膽固醇含量。具體步驟參見附錄SOP。
5.肝臟中HMG-CoA還原酶檢測方法見附錄SOP。
6.血漿PAF檢測家兔耳緣靜脈采血，肝素抗凝，離心取血漿，-20℃保存備用。檢測參照數據處理各檢查指標數據錄入SPSS進行統計學分析。
實驗結果1. LUVs制備質量鑒定結果為了判定注射是否安全，使用前進行質量鑒定。我們已經建立的卵磷水的混合比例為1∶6(W/V)。經過多方面實驗鑒定，動物實驗所使用的卵磷脂和LUVS已經達到以下標準。
純度＞98％(HPLC鑒定)。
Extrusion實驗合格。
酸值0.1。日本標準為＜25。無國內標準。
皂化值196。國內醫療注射部頒標準為195~212。
過氧化值(mEq/Kg)0.25。德國產品標準為＜5。無國內標準。
無菌鑒定合格。
無熱源根據藥典規定的動物實驗、和鱟試劑法鑒定均已合格。
澄明度鑒定合格。
pHLUVs液體pH為6.5。
毒副作用無。
LUVs粒徑檢測經過激光粒度測定儀進行多次測定后(以intensity統計為主)，發現粒徑分布大約在200nm(±60nm)。均一性良好。
2.用藥前后，實驗動物血漿脂質濃度的變化2.1造模、用藥期間，對新西蘭兔血漿TC濃度檢測指標的結果(圖1)表明，用藥前各組的TC在基本一致的情況下，LUVs用藥組TC水平明顯比非用藥組要高，并且呈現明顯的LUVs劑量依賴關系，這充分驗證了LUVs從血管壁等外周組織奪取膽固醇的能力。但是CM105組對血漿TC含量的影響并不明顯。
2.2造模、用藥期間，對新西蘭兔血漿HDL-C濃度檢測的結果(圖2)表明，向家兔注射LUVs之后，血漿HDL-C明顯升高。這說明LUVs的使用促進了HDL-C對脂質的運輸，這是防治動脈粥樣硬化的積極因素。
2.3造模、用藥期間，對新西蘭兔血漿TG濃度檢測的結果(圖3)表明，向家兔注射LUVs之后，血漿TG含量沒有顯著變化。說明LUVs轉運外周組織膽固醇的能力高于轉運TG的能力。
2.4造模、用藥期間，對新西蘭兔血漿LDL-C濃度檢測的結果(圖4)表明，向家兔注射LUVs之后，血漿LDL-C的測量結果急遽升高，屬于嚴重反常的結果。后來，我們制作了含有膽固醇的脂質體，用同一種試劑盒進行檢測，發現該試劑盒可以檢測LUVs本身含有的膽固醇，該試劑盒不能區分LDL和LUVs的膽固醇。所以在使用LUVs的家兔中，對LDL-C含量檢測的結果是LDL和LUVs含有的膽固醇的含量之和。體內LDL、HDL水平是相對恒定，所以LDL使用LUVs后的檢測結果的急遽升高，是由于LUVs從血管壁外周組織剝奪、轉運脂質的結果，LDL-C測定結果呈現明顯的劑量依賴關系也從側面證明這一點。這也證明了LUVs轉運脂質的強大能力。
3.用藥以后實驗動物肝臟脂質含量的變化3.1用藥以后對新西蘭兔肝臟TC含量的檢測結果(圖5)表明，和使用LUVs可以促進血漿TC升高一樣，使用LUVs還可以升高肝臟中TC的含量。我們認為這是LUVs從外周組織積極的轉運脂質，促進了脂質反相運輸的結果。不僅如此，與對照組比較，CM105的使用明顯升高了肝臟的TC水平，并且在LUVs同時使用的情況下，表現出明顯的疊加效應。這也驗證了LUVs以前的動物實驗的結果。
3.2用藥以后對新西蘭兔肝臟FC含量的檢測結果(圖6)表明，使用LUVs還可以升高肝臟中TC的含量，與對照組比較，CM105的使用明顯升高了肝臟的TC水平，并且在LUVs同時使用的情況下，同樣表現出明顯的疊加效應。
3.3用藥以后對新西蘭兔肝臟EC含量的檢測結果(圖7)實際上和肝臟TC的檢測結果一致，因為肝臟TC的含量的主要成分還是CE，而FC只是很少一部分，約5％。
3.4用藥以后對新西蘭兔肝臟TG含量的檢測結果(圖8)表明，用藥后肝臟的TG水平基本上沒有明顯差別。
4.用藥以后實驗動物肝臟HMG-CoA還原酶活性的變化(圖9)表明，用藥后HMG-CoA還原酶活性沒有因為LUVs所引起的脂質反相運輸而受到抑制。這說明LUVs在脂質代謝角度上，并不會導致肝臟代謝過載，也具有顯著的優勢。同時還可以看出，與對照組比較，CM105可以明顯的升高肝臟HMG-CoA活性。
5.用藥以后實驗動物血漿PAF-AH活性的檢測結果(圖10)表明，LUVs和CM105的使用均能升高血漿中PAF-AH活性的水平。在原理上，這種效應可以消除血漿中過多的血小板激活因子(PAF)，從而降低炎性反應，如此可以延緩動脈板塊的形成速度。
6.用藥后，照組和用藥組主動脈弓斑塊厚度的切片實驗結果(圖11)作為示例說明。用藥后，主動脈弓的平均斑塊厚度變小，血管壁內孔徑增大。這種改變的意義是可以降低各種動脈粥樣硬化疾病的發生幾率。
通過這次實驗，我們認為現有LUVs和CM105制造工藝穩定可靠，安全性良好，療效等檢測目標基本都已經達到預期值，表現為血漿TC、HDL-C水平顯著升高，肝臟TC、FC等脂質水平也顯著升高，而且LDL-C的檢測結果，都從很多方面證實了LUVs反相運輸轉運外周組織膽固醇的能力。HMG-CoA的實驗結果證明LUVs沒有造成肝臟膽固醇代謝過載失衡；PAF-AH活性檢測結果證實了對炎癥反應的良好效應；動脈粥樣硬化斑塊厚度的縮小則直接顯示了LUVs對動脈粥樣硬化的治療效果。實驗結果也與其他研究結果具有一致性。LUVs和CM105合用是一種非常理想的防治動脈粥樣硬化相關疾病的藥物制劑。
表1動物分組與給藥劑量
權利要求
1.一種由卵磷脂與黃岑甙元配比組成的組合物，該組合物的配比為黃芩甙元∶卵磷脂1份∶5～30份，輔料組成。
2.如權利要求1所述的組合物中的卵磷脂的制備方法，由如下步驟組成a、由蛋黃粉或大豆為原料用有機溶劑提取磷脂成份，然后經硅膠柱層析流動相為異丙醇∶石油醚∶水＝200∶200∶25V/V；b、濃縮、硅膠層析和冼脫液收集大豆或雞蛋的卵磷脂；c、粗卵磷酯經交換樹脂層析進一步除去雜質，得純卵磷酯；d、卵磷酯放入園底燒瓶中，用N2吹干，真空干燥，使EPC均勻附著在瓶壁上，加入緩沖液或水，震蕩形成多層脂質體，然后依次用0.4um、0.2um聚碳酸酯濾膜，在高壓下用Extrusion技術制備配方用卵磷酯。
3.根據權利要求2所述的組合物中的卵磷脂的制備方法，其特征在于卵磷酯的制備原料為大豆或蛋黃粉。
4.根據權利要求2所述的組合物中卵磷脂制備方法，其特征在于大脂質體尺寸和形狀是200nm，大于上述的肝竇狀小管細胞內皮層膜孔的。
5.根據權利要求2所述的組合物中卵磷脂制備方法，其特征在于脂質體在上述的治療過程中進行階段性給藥。
6.根據權利要求2所述的組合物中卵磷脂制備方法，其特征在于大的脂質體包括單層脂質和多層脂質體。
7.根據權利要求2所述的組合物中卵磷脂制備方法，其特征在于脂質體直徑大于200nm。
8.如權利要求1所述的組合物的用途在制備治療任何由于血管狹窄導致的缺血性病理改變包括(d)的疾病藥物中應用。
9.根據權利要求8所述的組合物的用途，其特征在于非腸內給藥可以通過靜脈給藥，動脈給藥，肌肉內給藥，皮下給藥，真皮穿刺給藥，腹膜給藥，胸內給藥，通過淋巴腺，血管內給藥包括毛細管和動靜脈連接處給藥，直腸給藥，通過長期存在的導管給藥，通過臨時插入的導管給藥。
10.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于非脂質體粒子包括甘油三酯-磷脂乳濁液，這種乳濁液包括不會被肝臟實質細胞很快吸收的乳濁液，大部分不被肝實質細胞吸收的乳濁液，甘油三酯-磷脂-蛋白質乳濁液，以及被肝臟緩慢吸收的乳濁液。
11.根據權利要求8所述的組合物的用途，其特征在于運載外周膽固醇和鞘磷脂進入肝臟的藥物制劑主要包括大小形狀比內皮細胞膜孔大的脂質體，因此這些脂質體足夠大而不會滲透出來并且不會與肝臟實質細胞相互作用。
12.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于運載外周膽固醇和鞘磷脂的制藥工具主要包括首先一個容器，里面有進入機體肝臟而降低動脈損傷的藥物成分，該成分包括大小形狀比內皮細胞膜孔大的脂質體，因此這些脂質體足夠大而不會滲透出來并且不會與肝臟實質細胞相互作用；第二個容器有化合物，這些化合物包括膽固醇受體和可以促進內源HDL產生的藥物。
全文摘要
本發明公開了一種用卵磷脂和類黃酮小分子組成的組合物將人體細胞和組織中膽固醇，尤其血管壁內動脈粥樣硬化斑塊中膽固醇轉運出體外，減少血管中斑塊堵塞體積從而可在制備治療心肌梗死、心絞痛等任何由于血管狹窄導致的缺血性病理改變。包括心力衰竭和猝死、腦組織缺血及腦部血管破裂造成的腦出血等，另外還包括動脈硬化癥、靜脈硬化癥和相關靜脈斑塊沉積的各種疾病、脈管炎、充血性心力衰竭、高血壓、冠心病引發的心率失常等疾病中應用。
文檔編號C07F9/10GK1748706SQ20041006633
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月13日 優先權日2004年9月13日
發明者龔邦強, 張國晶, 李勇 申請人:上海凱曼生物科技有限公司