專利名稱：真鯛抗菌肽基因和重組酵母表達載體及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域中的魚類基因工程范疇，是一種能在魚類病害防治中應用的魚類抗菌肽基因與酵母重組表達載體及其制備方法。
背景技術：
魚類是特異性免疫和非特異性免疫并存的脊椎動物。但與哺乳類相比，魚類的特異免疫系統尚不夠發達，特異性免疫機制還不完善。因此，在魚類對外界刺激及病原生物侵襲的防御反應中，非特異性免疫起著重要作用。現已知參與魚類非特異性免疫反應的因子主要包括巨噬細胞、粒細胞和細胞毒性細胞等一些具有吞噬作用的細胞，以及介導一系列免疫或應激反應的蛋白分子，如補體、細胞因子、趨化因子及溶菌酶和抗菌肽等。
抗菌肽是一類可以抵抗多種病原菌感染的非特異性免疫因子。過去幾年，抗菌肽在植物和小鼠上研究較多，并得到成功應用。研究表明，抗菌肽基因轉移明顯提高了植物(Liu et al.，1994)和小鼠的抗病能力(Reedet al.，1997)；相類似，抗菌肽在魚、蝦抵抗病原感染過程中也起著重要作用。美國和法國科學家在虹鱒、泥鰍和對蝦抗菌肽分離純化上做了一些工作(Park et al.，1997；Destoumieux et al.，1997)。
魚類的肝臟、皮膚、腮、頭腎、腸和皮膚分泌物里含有大量的抗菌肽物質存在。已經得到多種具有抗菌活性蛋白。目前已分離到的魚類類組蛋白抗菌肽類似物主要rainbow trout的oncorhyncinI、II(MezquitaJ，1984；Fernandes JMO，2004)，brown trout的H1(Macleod AR，1977)，coho salmon的HDSF(Patrzykat A，2001)，Atlantic salmon的H1(Richards RC，2001)，Atlantic halibut的Hipposin(BirkemoGA，2003)，Parasilurus asotus的ParasinI(Park IY，1998)等。除此以外，國內外已經分離到的其他魚天然抗菌肽蛋白有Misgurnin(Park，CB.，1997)、Plerocidin(Patrzykat A.，2003)、Moronecidin(Lauth，X.，2002)、Hepcidin(Shike，H.，2002；Douglas，SE.，2003)以及HFS-1(Hwang，EY.，1999)等。已克隆的魚類抗菌肽基因比較少，多數通過電子克隆的方法通過數據庫檢索得到的。
魚類抗菌肽基因工程開展的比較晚。Kelly等(1990，1992)發現化學合成的抗菌肽cecropinB的類似物LSB-37和Shiva-1對多種魚類的革蘭氏陰性菌都有作用。并且在channel catfish上的實驗發現LSB-37以提高其抗Edwardsiella ictaluri侵染的的能力。轉抗菌肽cecropinB的channel catfish親代和子代抗E.ictaluri和Flavobacteriumcolumnare的能力明顯提高，而且子代和親代不存在明顯差異(DunhamRA.，2002)。抗菌肽B和P1被轉入鮭魚胚胎CHSE-214細胞系后，用RT-PCR和southern雜交都可以檢測到轉基因的存在，同時表達分離的產物具有很強的抗菌活性(Sarmasik A.and Chen T.T.，2003)。1996年，Oren等從豹鰨體上分離到一種33個氨基酸殘基的抗菌肽并命名為Paradaxin，研究發現它具有比蜂毒素更強的抗菌活性和更低的人紅血球溶血活性。Park等從泥鰍體上分離到一個21氨基酸的抗菌肽misgurin，具有較強的體外廣譜抗菌活性且沒有明顯的溶血作用。但有關魚類抗菌肽基因重組表達載體構建及其在酵母中的表達研究，迄今國際上均未見報道。
發明內容
本發明的目的是為了構建基因重組魚類抗菌肽(Hepcidin)表達載體，建立將基因重組抗菌肽作為魚類飼料添加劑的技術，為魚類抗病機理研究和病害防治提供基因材料和技術方法。
本發明其技術內容如下一、真鯛抗菌肽(hepcidin)基因的克隆；二、重組真鯛抗菌肽基因酵母表達載體的構建；三、重組抗菌肽的發酵生產。
一、真鯛抗菌肽(hepcidin)基因的克隆主要包括cDNA文庫構建、EST序列測定和DNA序列分析與比對。
1、cDNA文庫構建TRIzol試劑盒從真鯛脾臟中提取總RNA，用OligotexTM離心柱試劑盒分離Poly-(A)RNA，用pBluescript II XR cDNA文庫試劑盒構建cDNA文庫。
2、EST序列測定用快速微量制備方法制備質粒DNA，質粒制備在96孔板上完成；用T3定序試劑盒測定cDNA片段的序列，用T3和T7引物從cDNA片段的兩端分別進行測序，從而獲得全長序列。
該基因的cDNA全長為596個堿基，包括255個堿基的開放閱讀框，該閱讀框編碼85個氨基酸的前體，該前體又由3個區組成，24個氨基酸組成的信號肽，39個氨基酸組成的前區和22個氨基酸組成的成熟肽，該成熟肽包括8個半光胺酸殘基。
3、DNA序列分析與比對在測定EST序列后，用Cross-Match軟件掩蓋載體序列，然后將從cDNA文庫中獲得的序列與美國GENBANK序列數據庫中已存的DNA序列進行比對，用PHRAP聚類程序鑒定共同序列和單一序列；用BLASTN和BLASTX程序計算我們獲得的cDNA克隆片段與GENBANK序列數據庫中已存的DNA序列的同源性。
二、重組真鯛抗菌肽酵母表達載體的構建根據測定出的真鯛抗菌肽成熟肽基因的序列，設計含有適當酶切位點的特異引物，從脾臟提取的cDNA中擴增抗菌肽成熟肽序列，經酶切后連接到用同樣的酶消化的酵母表達載體pPICZαA，構建成真鯛抗菌肽基因酵母表達質粒。
三、重組抗菌肽的發酵生產1、表達載體向酵母細胞的轉化將大量制備的真鯛抗菌肽基因酵母表達載體用SacI酶切，使其線性化，制備新鮮的感受態酵母細胞，通過電穿孔方法將線性化的抗菌肽基因酵母表達質粒轉化到巴氏畢赤酵母X-33細胞內，800μl轉化后的酵母細胞涂布在YPDS平板上。
2、含外源抗菌肽基因的重組酵母的篩選通過在不同培養基MD和刪平板上的選擇性培養篩選甲醇利用正表型的菌株和甲醇利用慢表型的酵母菌株；設計特異的引物，通過PCR方法鑒定整合了外源抗菌肽基因的酵母菌落。
3、重組抗菌肽表達的誘導首先對篩選出的陽性菌落進行增殖培養，挑取陽性單菌落，接種于BMGY培養基中進行擴大培養。采用甲醇誘導法誘導酵母表達抗菌肽，即將稀釋后的酵母培養液放于250ml的培養瓶中，用滅好菌的四層棉花塞塞住瓶口，28-30℃誘導培養5天。每天補加甲醇，補加甲醇的量根據所誘導的培養基的體積具體計算，但必須使甲醇終濃度維持在0.5-1％之間。
4、重組抗菌肽抑菌活性的測定通過誘導培養后，將含真鯛抗菌肽基因的重組酵母培養液添加到不同細菌培養物中，測定重組抗菌肽的抑菌活性，表明重組抗菌肽對大腸桿菌(E.coli DH5a和E.coliATCC25922)，綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophia)均具有劑量依存的抑制活性。
本發明與已有技術對比其特點是本發明以真鯛為材料首次構建了魚類抗菌肽(hepcidin)基因酵母表達載體并研制了重組抗菌肽表達產物，該表達載體在酵母體內表達穩定，重組抗菌肽分子量小，抑菌活性明顯，適宜用作魚類等水產動物的飼料添加劑，用于魚類等水產動物的疾病防治.本發明的技術方法可在其它魚類上進行應用。
圖1真鯛Hepeidin基因cDNA和推導的氨基酸序列；圖2真鯛抗菌肽Hepeidin基因表達載體；圖3真鯛重組抗菌肽抑菌活性A用大腸桿菌DH5a作為受試菌；B用大腸桿菌ATCC25922作為受試菌；c用綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa作為受試菌；D用嗜水氣單胞菌Aeromonas hydromonas作為受試菌。
實施方式下面以真鯛抗菌肽hepcidin基因的克隆和表達載體構建為例，結合附圖，對本發明的實施方式進行詳細說明。
1、cDNA文庫構建cDNA文庫于2002年4月-7月在黃海水產研究所構建。用TRIzol試劑盒從真鯛脾臟中提取總RNA，用OligotexTM離心柱試劑盒分離Poly-(A)RNA，用pBluescript II XR cDNA文庫試劑盒構建cDNA文庫，該文庫含有1.5×106克隆。
2、EST序列分析與真鯛抗菌肽基因序列用快速微量制備方法制備質粒DNA，質粒制備在96孔板上完成；用T3定序試劑盒測定cDNA片段的序列，用T3和T7引物從cDNA片段的兩端分別進行測序，從而獲得全長序列。從真鯛脾臟cDNA文庫中隨機挑取2000個EST進行序列分析，經過與美國GENBANK序列數據庫中已存的DNA序列進行比對，發現那2000個EST中有17EST克隆與其他魚類和哺乳類抗菌肽Hepcidin具有高度同源性，屬于抗菌肽Hepcidin基因。該基因全長為1216個堿基，由3個外顯子和2個內含子組成。該基因的cDNA全長為596個堿基，包括255個堿基的開放閱讀框，該閱讀框編碼85個氨基酸的前體，該前體又由3個區組成，24個氨基酸組成的信號肽，39個氨基酸組成的前區和22個氨基酸組成的成熟肽，該成熟肽包括8個半光胺酸殘基(附圖1、序列表)3、表達載體的構建根據測定出的真鯛抗菌肽成熟肽基因的序列，設計含有適當酶切位點的特異引物，從真鯛脾臟提取的cDNA中擴增抗菌肽成熟肽序列，經酶切后連接到用同樣的酶消化的酵母表達載體pPICZαA，構建成魚類抗菌肽基因酵母表達質粒。根據真鯛抗菌肽hepcidin成熟肽基因序列，設計特異引物Hepc N(5’-ATCCTC GAGAAA AGACGC TGTCGC TTT TGC TGT-3’，Xho I+Kex蛋白酶切位點+18堿基)和Hepc C(5’-ATCTCT AGATCA ACG CCT CTG GCA GCA-3’，Xba I+18堿基)，用常規PCR方法進行擴增，對擴增的PCR產物進行回收，經過適當的酶切后，與用同樣的酶消化的pPICZαA載體進行連接，產生真鯛抗菌肽基因表達載體pPICZ-rsbHEPC1(附圖2)。
4、表達載體向酵母細胞的轉化將大量制備的真鯛抗菌肽Hepcidin基因酵母表達載體pPICZ-rsbHEPC1用Sac I酶切，使其線性化，通過電穿孔方法將線性化的抗菌肽基因酵母表達質粒轉化到巴氏畢赤酵母X-33胞內，簡言之，80μl新鮮制備的感受態酵母細胞，與5-10μg線性化的質粒混勻，放入電轉杯。冰浴5min后，在1500V，200Ω，25μF條件下，電擊4-5ms；加入1ml冰冷的1M Sortitol，輕輕混勻后，放入15ml的離心管中。30℃培養1-2h；然后800μl涂布在含100μg/mlZeocin抗生素的YPDS平板上，30℃培養1-2天。
5、含真鯛抗菌肽基因的重組酵母的篩選和確認通過在不同培養基MD和刪平板上的選擇性培養篩選甲醇利用正表型的菌株和甲醇利用慢表型的酵母菌株；通過使用特異的引物進行PCR，進一步證實所篩選出來的、整合了外源抗菌肽基因的酵母菌落。所用PCR引物為5’AOX(5-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3)和3’AOX(5-GCAAATGGCATTCTGACA TCC-3)。
6、重組抗菌肽表達的誘導首先對篩選出的陽性菌落進行增殖培養，挑取陽性單菌落，接種于BMGY培養基中進行擴大培養。采用甲醇誘導法誘導酵母表達抗菌肽，即將稀釋后的酵母培養液放于250ml的培養瓶中，用滅好菌的四層棉花塞塞住瓶口，28-30℃誘導培養5天。每天補加甲醇，補加甲醇的量根據所誘導的培養基的體積具體計算，但必須使甲醇終濃度維持在0.5-1％之間。每24小時取樣。整個操作過程保持無菌操作。誘導培養結束后，將培養液以最大速度離心5-10min。將上清以及離心后的菌液放于-80℃備用。取適量的菌體，加入含蝸牛酶(30mg/ml)的SCE消化溶液(ph7.0)(0.9M山梨醇，0.1M檸檬酸鈉，0.06M EDTA，PH8.0)，37℃消化3小時。離心取上清進行蛋白質電泳分析。首先經過小規模的誘導培養，從所獲得的6個pPICZαA-rsbHEPC陽性轉化子中得到了1個可以表達hepcidin的菌株。
7、重組抗菌肽抑菌活性的測定通過誘導培養后，將含真鯛抗菌肽基因的重組酵母菌株和陰性對照菌株分別進行大規模的培養，然后將各組的培養上清分別超濾濃縮10倍，然后將不同量的濃縮液(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 or 2.0ml)添加到10ml不同細菌培養物中，受試細菌分別為大腸桿菌E.coli DH5a和E.coli ATCC25922，綠膿桿菌Pseudomonasaeruginos和嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophia。在37℃培養10小時后，測定細菌培養物的OD值，計數細菌的數量，結果表明重組真鯛抗菌肽對上述四種細菌的生長均具有劑量依存的抑制活性(附圖3)。
序列表<110>中國水產科學研究院黃海水產研究所<120>真鯛抗菌肽基因和重組酵母表達載體及其制備方法<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>596<212>DNA<213>真鯛(Chrysophrys major)<220>
<221>CDS<222>(72)..(329)<223>
<400>1gaaaggagct gacgagagtc accaaaagaa tcaaaggact gaacaagtta aagcagtcaa60agcctcctaa g atg aag aca ttc agt gtt gca gtt gca gtg gcc gtc gtg110Met Lys Thr Phe Ser Val Ala Val Ala Val Ala Val Val1 5 10ctc acc ttt att tgc ctt cag gag agc tct gct gcc tca ttc act gag 158Leu Thr Phe Ile Cys Leu Gln Glu Ser Ser Ala Ala Ser Phe Thr Glu15 20 25gtg caa gag ctg gag gag cca atg agc aat ggc agc cca gtt gct gca 206Val Gln Glu Leu Glu Glu Pro Met Ser Asn Gly Ser Pro Val Ala Ala30 35 40 45gat gaa gag atg tca gag gag tcc tgg aag atg ccg tat gcc agc aga 254Asp Glu Glu Met Ser Glu Glu Ser Trp Lys Met Pro Tyr Ala Ser Arg50 55 60cgc tgg cgc tgt cgc ttt tgc tgt cgt tgc tgt cct cgc atg aga gga 302Arg Trp Arg Cys Arg Phe Cys Cys Arg Cys Cys Pro Arg Met Arg Gly65 70 75
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1.一種真鯛抗菌肽基因和重組酵母表達載體及制備方法，其特征在于它的真鯛抗菌肽基因的克隆主要包括cDNA文庫構建、EST序列測定和DNA序列分析與比對cDNA文庫構建用TRIzol試劑盒從真鯛脾臟中提取總RNA，用OligotexTM離心柱試劑盒分離Poly-(A)RNA，用pBluescript II XR cDNA文庫試劑盒構建cDNA文庫；EST序列測定用快速微量制備方法制備質粒DNA，質粒制備在96孔板上完成；用T3定序試劑盒測定cDNA片段的序列，用T3和T7引物從cDNA片段的兩端分別進行測序，從而獲得全長序列；DNA序列分析與比對在測定EST序列后，用Cross-Match軟件掩蓋載體序列，然后將從cDNA文庫中獲得的序列與美國GENBANK序列數據庫中已存的DNA序列進行比對，用PHRAP聚類程序鑒定共同序列和單一序列；用BLASTN和BLASTX程序計算我們獲得的cDNA克隆片段與GENBANK序列數據庫中已存的DNA序列的同源性。
2.根據權利要求1所述的真鯛抗菌肽基因和重組酵母表達載體及制備方法，其特征在于所述的cDNA序列該基因的cDNA全長為596個堿基，包括255個堿基的開放閱讀框，該閱讀框編碼85個氨基酸的前體，該前體又由3個區組成，24個氨基酸組成的信號肽，39個氨基酸組成的前區和22個氨基酸組成的成熟肽，該成熟肽包括8個半光胺酸殘基；真鯛Hepeidin基因cDNA和推導的氨基酸序列為GAAAGGAGCTGACGAGAGTCACCAAAAGAATCAAAGGACTGAACAAGTTAAAGCAGTCAAAGCCTCCTAAGATGAAGACATTCAGTGTTG90M K T F S V A7CAGTTGCAGTGGCCGTCGTGCTCACCTTTATTTGCCTTCAGGAGAGCTCTGCTGCCTCATTCACTGAGGTGCAAGAGCTGGAGGAGCCAA180V A V A V V L T F I C L Q E S S AA S F T E V Q E L E E P M37Signal peptideTGAGCAATGGCAGCCCAGTTGCTGCAGATGAAGAGATGTCAGAGGAGTCCTGGAAGATGCCGTATGCCAGcAGACGcTGGC GCTGTCGCT 270S N G S P V A A D E E M S E E S W K M P Y A S R R WR C R F67prodomainTTTGCTGTCGTTGCTGTCCTCGCATGAGAGGATGTGGTCTCTGCTGCCAGAGGCGTTGAGGATTCCTGCTGCAGCCTGGGATTTACACAA360C C R C C P R M R G C G L C C Q R R*85Mature peptideCGACCACTAAATATTTTATTTTAAGATTTTTACTTTAAAAGCAAATCTTTCCAAATTTCAATAGTGGTTGTAAATATCTGAGGATGTTTC450TGGATTTGGTCATGCTGCAGAGAATGTGTGCTAACTGATGTATCATCCTGATATTTTGTTAAAAATCTCATGTGTGATCAATAAAGTTGC540TTGTTTCTATAATATATACAAAAAAAAAAAA 596
3.一種真鯛抗菌肽基因和重組酵母表達載體及制備方法，其特征在于所述的酵母表達載體的構建是根據測定出的魚類抗菌肽成熟肽基因的序列，設計含有適當酶切位點的特異引物，從脾臟提取的cDNA中擴增抗菌肽成熟肽序列，經酶切后連接到用同樣的酶消化的酵母表達載體pPICZαA，構建成魚類抗菌肽基因酵母表達載體。
4.一種真鯛抗菌肽基因和重組酵母表達載體及制備方法，其特征在于所述的重組抗菌肽的發酵生產技術，其制備方法是1)、表達載體向酵母細胞的轉化將大量制備的抗菌肽基因酵母表達質粒用Sac I酶切，使其線性化，制備新鮮的感受態酵母細胞，通過電穿孔方法將線性化的抗菌肽基因酵母表達質粒轉化到巴氏畢赤酵母X-33細胞內，取800μl轉化后的酵母細胞涂布在YPDS平板上；2)、含外源抗菌肽基因的重組酵母的篩選通過在不同培養基MD和MM平板上的選擇性培養篩選甲醇利用正表型的菌株和甲醇利用慢表型的酵母菌株；設計特異的引物，通過PCR方法鑒定整合了外源抗菌肽基因的酵母菌落；3)、重組抗菌肽表達的誘導首先對篩選出的陽性菌落進行增殖培養，挑取陽性單菌落，接種于BMGY培養基中進行擴大培養；采用甲醇誘導法誘導酵母表達抗菌肽，即將稀釋后的酵母培養液放于250ml的培養瓶中，用滅好菌的四層棉花塞塞住瓶口，28-30℃誘導培養5天；每天補加甲醇，補加甲醇的量根據所誘導的培養基的體積具體計算，但必須使甲醇終濃度維持在0.5-1％之間；4)、重組抗菌肽抑菌活性的測定通過誘導培養后，將含抗菌肽基因的重組酵母培養液添加到不同細菌培養物中，測定重組抗菌肽的抑菌活性，表明重組抗菌肽對大腸桿菌(E.coli DH5a和E.coli ATCC)，綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophia)均具有劑量依存的抑制活性。
全文摘要
一種真鯛抗菌肽基因和重組酵母表達載體及其制備方法，通過文庫篩選和EST序列分析，克隆出真鯛抗菌肽(hepcidin)基因，將該基因重組到酵母表達載體pPICZαA，構建成抗菌肽基因表達質粒pPICZ－rsbHEPC1，轉化畢赤酵母后，獲得了穩定表達真鯛抗菌肽的酵母菌株。細菌生長抑制實驗表明重組抗菌肽對大腸桿菌，綠膿桿菌和嗜水氣單胞菌等4種細菌均具有劑量依存的抑制活性。本發明首次構建了魚類抗菌肽(hepcidin)基因酵母表達質粒并研制了重組抗菌肽表達產物，該表達質粒在酵母體內表達穩定，重組抗菌肽分子量小，抑菌活性明顯，適宜用作魚類等水產動物的飼料添加劑。本發明適用于各種魚類抗菌肽基因克隆和表達載體的構建，生產的基因工程魚類抗菌肽可作為飼料添加劑，用于魚類等水產動物的疾病防治。
文檔編號C07K14/435GK1641025SQ20041009755
公開日2005年7月20日 申請日期2004年11月29日 優先權日2004年11月29日
發明者陳松林, 徐美瑜, 隋少飛 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所