使用Sec－系統分泌的改進的表達系統的制作方法

專利名稱：使用Sec－系統分泌的改進的表達系統的制作方法
技術領域：
本發明屬于蛋白質制造領域并且是一種改進的通過使用Sec導向肽和熒光假單胞菌Sec分泌系統制造適當加工的外源蛋白的方法。
背景技術：
美國食品藥品管理局(U.S.Food and Drug Administration)(FDA)已經批準了超過150種重組產生的蛋白質和肽作為生物技術合成藥和疫苗以及另外370種用于臨床試驗。與通過化學合成產生的小分子治療劑不同，蛋白質和肽在活細胞內最有效地產生。然而，在細菌中制造重組蛋白的現有方法通常產生不當折疊、聚集或失活的蛋白質，并且許多類型的蛋白質要求二次修飾，這使用已知方法難以實現。
已知方法的一個主要問題在于在細胞質中形成由聚集蛋白構成的包含體，這在過量蛋白質在細胞中積聚時產生。重組蛋白制造中的另一問題是形成表達蛋白的恰當的二級和三級結構。一個障礙是細菌細胞質積極抑制了二硫鍵形成(其通常構成恰當蛋白質折疊的基礎)(Derman等(1993)Science 2621744-7)。因此，在細菌中進行制造時，許多重組蛋白，特別是真核來源的重組蛋白不當折疊和失活。
為提高重組系統中恰當折疊的蛋白質的產量，已經進行了許多嘗試。例如，研究者改變了發酵條件(Schein(1989)Bio/Technology，71141-1149)，改變啟動子強度或使用過度表達的伴侶蛋白(Hockney(1994)Trends Biotechnol.12456-463)，這些有助于防止包含體的形成。
分泌提高恰當折疊的蛋白質產量的另一方法是從細胞內環境中分泌蛋白質。在革蘭氏陰性細菌中，細胞質分泌的蛋白質可以在周質空間中豎立(end up)、連接到外膜上，或在細胞外液體中。如果從細胞的細胞質中分泌出蛋白質，則通常不會形成由聚集蛋白構成的包含體。分泌到周質空間中還具有公知的促進恰當的二硫鍵形成的作用(Bardwell等(1994)Phosphate Microorg.270-5；Manoil(2000)Methods in Enz.32635-47)。重組蛋白的分泌是有利的，因為這會產生更有效的蛋白質分離；可以促進轉基因蛋白質的恰當折疊和二硫鍵形成，從而導致活性形式的蛋白質百分率的增加；可以減少包含體的形成并降低對宿主細胞的毒性；并且可以提高可溶形式的重組蛋白的百分率。相關蛋白質分泌進入培養基的能力也可能促進蛋白質制造的連續而非分批培養。
革蘭氏陰性細菌已經演化出許多用于使蛋白質穿過其雙重膜的有效輸出的系統(參看

圖1)。這些分泌途徑包括，例如用于一步穿過內在質及外膜易位的ABC(I型)路徑、Path/Fla(III型)路徑和Path/Vir(IV型)路徑；用于穿過質膜易位的Sec(II型)、Tat、MscL和Holins路徑；和用于兩步穿過內在質和外膜易位的Sec-加-fimbrial usher孔蛋白(FUP)、Sec-加-自動轉運子(AT)、Sec-加-兩partner分泌(TPS)、Sec-加-主末端分支(MTB)和Tat-加-MTB路徑。并非所有細菌都具有所有這些分泌路徑。
三種蛋白質系統(I、III和IV型)在單個能量結合步驟中同時穿過兩膜分泌蛋白質。四種系統(Sec、Tat、MscL和Holins)僅穿過內膜分泌，另外四個系統(MTB、FUP、AT和TPS)僅穿過外膜分泌。
帶有信號序列的肽的最常見分泌形式包括Sec系統。Sec系統負責使帶有N-末端信號肽的蛋白質穿過細胞質膜輸出(參看Agarraberesand Dice(2001)Biochim Biophys Acta.15131-24；Muller等(2001)Prog Nucleic Acid Res Mol Biol.66107-157)。在原核生物和真核生物中普遍發現Sec族蛋白復合物。細菌Sec系統包括轉運蛋白、伴侶蛋白(SecB)或信號識別粒子(SRP)和信號肽酶(SPase I和SPase II)。大腸桿菌(E.coli)中的Sec轉運復合物包括三種整合內膜蛋白，SecY、SecE和SecG，和細胞質ATPase、SecA。SecA吸收SecY/E/G復合物以形成活性易位通道。伴侶蛋白SecB結合到新生多肽鏈上以防止其折疊并將其導向SecA中。直線多肽鏈隨后通過SecYEG通道轉移，并在信號肽裂解之后，蛋白質在周質中折疊。三種輔助蛋白(SecD、SecF和YajC)形成了不是分泌所必須的但卻在許多條件(特別是在低溫)下最高10倍地刺激分泌的復合物。
轉移到周質中(也就是通過II型分泌系統)的蛋白質還可以在進一步的步驟中被輸出到細胞外介質中。其機制通常是通過自動轉運子、兩partner分泌系統、主末端分支系統或fimbrial usher孔蛋白。
在革蘭氏陰性細菌中的十二種已知分泌系統中，八種采用了據發現作為表達蛋白的一部分的導向信號肽。這些信號肽與分泌系統的蛋白質互相作用，從而使細胞正確地將蛋白質引向其合適的目的地。這八種信號肽基分泌系統中的五種涉及Sec-系統。這五種被認為參與了Sec-依賴(Sec-dependent)的細胞質膜易位，而且在其中起作用的它們的信號肽可以被稱作Sec依賴的分泌信號。產生恰當分泌信號的要點之一是確保信號被恰當地表達并從表達蛋白中裂解。
Sec-依賴的蛋白質輸出的一個標志是在輸出的蛋白質中存在短(大約30個氨基酸)的主要疏水的氨基末端信號序列。該信號序列輔助蛋白質輸出并且在輸出的蛋白質到達周質時被周質信號肽酶切除。典型的N-末端Sec-信號肽含有帶有至少一個精氨酸或賴氨酸殘基的N-區，然后是含有一段疏水殘基的區，以及含有信號肽酶裂解位點的C-區。
已經研發出如下細菌蛋白制造系統——在該系統中，轉基因蛋白結構通過基因工程設計成既包含相關蛋白質又包含試圖將該蛋白質導出細胞質的分泌信號的融合蛋白。
已經研發出將蛋白質從細胞分泌到上清液中的方法。例如，Georgious的美國專利5,348,867集中于細胞表面上的肽表達。授予Korea Advanced Institute of Science and Technology的美國專利6,329,172描述了在熒光假單胞菌中的ABC轉運子和通過使用這種與相關蛋白共表達的轉運子將蛋白分泌到細胞外的方法。授予NovoNordisk的PCT公開WO 96/17943集中于通過從周質中滲漏來從細胞中進行蛋白質的細胞外表達，其使用了與相關蛋白質相連的A.lyticus蛋白酶I和某些桿菌蛋白酶的序列的一部分以將它們導向周質。授予Boehringer Ingelheim，Int.的PCT公開WO 02/40696和美國申請公開2003/0013150描述了使用細菌信號肽OmpA的蛋白質的細胞外表達。這些公開論述了OmpA單獨與SecE相互作用或與包含氨基酸序列SEGN的蛋白質或肽結合相互作用。
提高表達的其它方法涉及將蛋白質導向周質。一些研究集中于非-Sec型分泌(參看，例如，授予Trustees of the University of Pennsylvania的PCT公開WO 03/079007；美國公開2003/0180937，授予Weiner andTurner的美國公開2003/0064435；和授予Research Foundaion of theState University of New York的PCT公開WO 00/59537)。然而，多數研究都集中于使用Sec-型分泌系統的外源蛋白分泌。
已經描述了許多用于表達重組肽或蛋白質的分泌信號。例如，授予Celtrix Pharmaceuticals，Inc.的美國專利5,914,254描述了使用來自白細胞介素-1-類蛋白質的融合partners和前導序列提高蛋白質的溶度和活性。
授予Genentech的美國專利4,963,495描述了使用原核信號序列(如大腸桿菌腸毒素的序列)的真核蛋白(特別是人類生長激素)表達。授予Genentech的歐洲專利0 177 343描述了周質HGH的表達，這可以通過使用P.aeruginosa腸毒素A信號序列來實現。
授予Biogen的美國專利5,082,783描述了來自最多具有中間強度的啟動子(例如肌動蛋白)或有效地與DNA信號序列相連的異-1-細胞色素c啟動子(例如來自酵母的Mfα1信號序列)的蛋白質(例如生長調節素C、組織纖溶酶原激活物或腫瘤壞死因子)的表達。
Pastan等的PCT公開WO 89/10971描述了使用OmpA信號序列在大腸桿菌中的假單胞菌外毒素表達，并且顯示了周質和培養基中部分蛋白質的差異表達。
授予Novo Nordisk的美國專利6,156,552描述了使用信號序列在大腸桿菌或脂酶不足的門多薩假單胞菌中的修飾假單胞菌脂酶的表達。信號序列可以是大腸桿菌phoA信號序列。授予Novozyme的美國專利6,495,357、6,509,181、6,524,827、6,528,298、6,558,939、6,608,018和6,617,143也描述了用信號序列表達的脂酶、纖維素酶、淀粉酶和其它酶(包括假單胞菌屬來源的酶)的制造，該信號序列優選原產于表達酶但也可以來自例如根毛素屬、是來自啤酒酵母屬的α-因子的基因或來自桿菌屬的淀粉酶或蛋白酶基因。
授予Xoma的美國專利5,595,898、5,698,435和6,204,023描述了使用果膠酸裂解酶信號肽的嵌合抗體片段的制造。這些專利揭示了果膠酸裂解酶是包括熒光假單胞菌的各種有機體中已知的，盡管沒有提供這些序列的例證。
授予Genentech的美國專利6,258,560描述了使用細菌信號序列在大腸桿菌中的DNA消化蛋白表達，該細菌信號序列被描述成優選原產于蛋白質但也可以選自堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或熱穩定的腸霉素、前導序列。該專利還指出，該蛋白質也可以在假單胞菌(Pseuomonads)中表達，盡管沒有給出任何例證。
授予Habermann和Ertl和Aventis的PCT公開WO 01/21662、WO02/068660和美國申請公開2003/0044906描述了從大腸桿菌中分泌水蛭素(hirudin)衍生物。所述信號序列之一是來自熒光假單胞菌的OprF蛋白質的序列。在‘662公開中確定的應用是在De(1995)FEMS Micr.Let.127263-272中描述的序列NTLGLAIGSLIAATSFGVLA。在該公開中沒有描述在假單胞菌屬中使用表達質粒，并且與大腸桿菌中的對照表達相比，使用該方法的水蛭素表達的增加僅是少量(marginal)的。
授予Unilever Patent Holdings B.V.的美國專利5,641,671涉及用穩定化蛋白質并優選用脂酶基因內生的信號序列從P.glumae中進行假單胞菌脂酶的表達。
授予Atkinson等的歐洲專利EP 0 121 352描述了在載體中使用來自假單胞菌屬RS-16羧肽酶的無前導序列的半胱氨酸以增強蛋白質的周質表達。該專利揭示了在信號序列中的半胱氨酸殘基可以促進與細胞膜的相互作用并阻礙分泌。所公開的信號序列是MRPSIHRTAIAAVLATAFVAGT。
依賴信號序列將蛋白質導出細胞質的的方法通常產生不當加工的蛋白質。對于氨基末端分泌信號(例如通過Sec系統引起分泌的那些分泌信號)尤為如此。通過該系統加工過的蛋白質通常或者保留一部分分泌信號，需要一種通常不當裂解的連接元素，或者在末端被截短。
從上述技術中可以明顯看出，已經開發出許多將蛋白質導向宿主細胞周質的方法。然而，已知方法不能產生恰當加工的活性重組蛋白的始終如一的高收率，其可以提純用于治療。現有方法中的一個主要限制是在不適當的細胞系統中用不好的分泌信號序列進行的蛋白質表達。
因此，在該領域中仍然需要能夠分泌和恰當加工重組多肽的改進的大規模表達系統以制造恰當加工形式的轉基因蛋白質。理想系統產生大量的可溶蛋白質并可以將該蛋白質導向周質并可能導向細胞外介質中。
本發明的一個目的是提供一種在宿主細胞中提高恰當加工的重組蛋白表達的系統和方法。
本發明的另一目的是提供一種在宿主細胞中提高活性重組蛋白表達的系統和方法。
本發明的另一目的是提供一種具有高水平的恰當加工的重組蛋白表達的工業規模系統。
概述本發明提供了用于在細胞表達系統中產生大量恰當加工的重組蛋白的改進的組合物和方法。令人驚訝地發現，熒光假單胞菌是一種改進的用于制造分泌蛋白質的平臺，基于此發現形成本發明。特別地，與通常在其它細菌表達系統中觀察到的相比，熒光假單胞菌令人驚訝地產生更大量的導向其Sec分泌系統的外源蛋白質，并且更大量地將這些蛋白質轉移到細胞周質中，從而提高完全加工成的重組蛋白的回收率。本發明包括來自熒光假單胞菌有機體的新識別出的分泌信號，并且包括包含這些序列的肽、載體和表達系統，它們可以促進相關的表達蛋白質或肽導向到革蘭氏陰性細菌周質或導入細胞外環境中。本發明還包括熒光假單胞菌宿主細胞，當與信號肽前導序列協同表達外源蛋白時，該宿主細胞可以提高恰當加工形式的外源蛋白的產量。
在一個具體實施方案中，提供了具有下述序列的分離肽——該序列是選自磷酸鹽結合蛋白(pbp)分泌信號、外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號、Lys-Arg-Orn結合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號的熒光假單胞菌Sec-系統分泌肽或基本與其同源。
在另一具體實施方案中，提供了具有為一種肽編碼的序列的分離核酸，該肽包括下述序列——其是選自pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結合蛋白和脂蛋白B分泌信號的熒光假單胞菌Sec-系統分泌肽或基本與其同源。在另一具體實施方案中，提供了一種核酸，該核酸可以與具有為一種肽編碼的序列的核酸雜交，該肽包括下述序列——其是選自pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結合蛋白和脂蛋白B分泌信號的熒光假單胞菌Sec-系統分泌肽或基本與其同源。在一個具體實施方案中，核酸在嚴格條件下雜交。
在一個具體實施方案中，肽序列是氨基酸序列Met Lys Leu LysArg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly Val Ala Thr Ala Asn AlaVal Ala(SEQ ID NO1)的至少氨基酸2-24的磷酸鹽結合蛋白(pbp)分泌信號肽的序列，或基本與其同源。在另一具體實施方案中，為肽編碼的核酸序列與核酸序列atg aaa ctg aaa cgt ttg atg gcg gca atg act tttgtc gct gct ggc gtt gcg acc gcc aac gcg gtg gcc(SEQ ID NO2)至少80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具體實施方案中，根據宿主機體的密碼子使用來調節SEQ ID NO2的核酸序列。
在另一具體實施方案中，肽序列是含有氨基酸序列Met Lys LysSer Thr Leu Ala Val Ala Val Thr Leu Gly Ala Ile Ala Gln Gln Ala Gly Ala(SEQ ID NO3)的至少氨基酸2-21的序列的外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號肽的序列或基本與其同源。在另一具體實施方案中，為肽編碼的核酸序列與核酸序列atg aag aag tcc acc ttg gct gtg gct gta acg ttgggc gca atc gcc cag caa gca ggc gct(SEQ ID NO4)至少80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具體實施方案中，根據宿主機體的密碼子使用來調節SEQ ID NO4的核酸序列。
在另一具體實施方案中，肽序列是含有氨基酸序列Met Phe AlaLys Leu Val Ala Val Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Gly Gln Leu Leu Ala(SEQ ID NO5)的至少氨基酸2-20的序列的天青蛋白分泌信號肽的序列或基本與其同源。在另一具體實施方案中，為肽編碼的核酸序列與核酸序列atg ttt gcc aaa ctc gtt gct gtt tcc ctg ctg act ctg gcg agc ggccag ttg ctt gct(SEQ ID NO6)至少60％，70％，80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具體實施方案中，根據宿主機體的密碼子使用來調節SEQ ID NO6的核酸序列。
在另一具體實施方案中，肽序列是含有氨基酸序列Met Gln AsnTyr Lys Lys Phe Leu Leu Ala Ala Ala Val Ser Met Ala Phe Ser Ala Thr AlaMet Ala(SEQ ID NO7)的至少氨基酸2-23的序列的Lys-Arg-Orn結合蛋白(LAObp或KRObp)分泌信號肽的序列或基本與其同源。在另一具體實施方案中，為肽編碼的核酸序列與核酸序列atg cag aac tat aaaaaa ttc ctt ctg gcc gcg gcc gtc tcg atg gcg ttc agc gcc acg gcc atg gca(SEQID NO8)至少60％，70％，80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具體實施方案中，根據宿主機體的密碼子使用來調節SEQ ID NO8的核酸序列。
在一具體實施方案中，肽序列是含有氨基酸序列Met Met Ile ArgAsp Asn Arg Leu Lys Thr Ser Leu Leu Arg Gly Leu Thr Leu Thr Leu LeuSer Leu Thr Leu Leu Ser Pro Ala Ala His Ser(SEQ ID NO9)的至少氨基酸2-32的序列的鐵(III)結合蛋白[Fe(III)bp]分泌信號肽的序列或基本與其同源。在另一具體實施方案中，為肽編碼的核酸序列與核酸序列atg atg atc cgt gac aac cga ctc aag aca tcc ctt ctg cgc ggc ctg acc ctc acc ctactc agc ctg acc ctg ctc tcg ccc gcg gcc cat tct(SEQ ID NO10)至少60％，70％，80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具體實施方案中，根據宿主機體的密碼子使用來調節SEQ ID NO10的核酸序列。
在另一具體實施方案中，肽序列是含有氨基酸序列Met Ile Lys ArgAsn Leu Leu Val Met Gly Leu Ala Val Leu Leu Ser Ala(SEQ ID NO11)的至少氨基酸2-17的序列的脂蛋白B(LprB)分泌信號肽的序列或基本與其同源。在另一具體實施方案中，為肽編碼的核酸序列與核酸序列atg atc aaa cgc aat ctg ctg gtt atg ggc ctt gcc gtg ctg ttg agc gct(SEQ IDNO12)至少60％，70％，80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具體實施方案中，根據宿主機體的密碼子使用來調節SEQ ID NO12的核酸序列。
另一具體實施方案是一種表達載體，其包括帶有下述序列或與其同源的熒光假單胞菌Sec-系統分泌肽的核酸——該序列是可連接到啟動子上的pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結合蛋白或脂蛋白B分泌信號。在另一具體實施方案中，載體進一步包含用于相關重組蛋白或肽的表達的編碼序列。在一個具體實施方案中，表達載體進一步包含與分泌信號的編碼序列相鄰或與重組蛋白或肽的編碼序列相鄰的標記序列。
本發明還提供了包括表達載體的細胞。在一個具體實施方案中，該細胞表達了與如本文所述的熒光假單胞菌Sec-系統分泌信號相連的重組蛋白。該細胞可以在周質隔室中表達蛋白質。在某些具體實施方案中，細胞還可以產生穿過外胞壁的細胞外重組蛋白。在一個具體實施方案中，細胞是細菌細胞，并且在某些具體實施方案中，細胞是熒光假單胞菌細胞或大腸桿菌細胞。在其它具體實施方案中，細胞是真核細胞，并且可以是酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞或植物細胞。
在一個具體實施方案中，宿主細胞是細菌細胞。在另一具體實施方案中，細胞是假單胞菌，在特定具體實施方案中，細胞是熒光假單胞菌細胞。
在另一具體實施方案中，提供了改進的用于在宿主細胞中制備重組蛋白的方法和系統。改進包括熒光假單胞菌Sec-系統分泌肽的表達，該熒光假單胞菌Sec-系統分泌肽是可與宿主細胞中的相關重組蛋白或肽相連的選自pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結合蛋白或脂蛋白B分泌信號的肽或與其同源。在一個具體實施方案中，表達在高密度細胞培養基中產生。Sec-分泌信號可以在細胞中從成熟蛋白質裂解。在另一具體實施方案中，分泌信號未裂解并且細胞表達出與分泌信號相連的重組蛋白。在一個具體實施方案中，標記序列可與相關蛋白質相連。
在另一具體實施方案中，提供了一種通過在熒光假單胞菌中表達出與Sec-系統分泌信號相連的蛋白質來制備重組外源分泌蛋白的方法。該具體實施方案是基于下述確認——即熒光假單胞菌被確認為是用于分泌的蛋白質表達的改進的表達平臺。在一個具體實施方案中，Sec-分泌信號來自熒光假單胞菌基因組，但是在另一具體實施方案中，Sec-分泌信號來自大腸桿菌基因組。在其它具體實施方案中，分泌信號原產于待表達的蛋白質。
在一個具體實施方案中，宿主細胞含有周質，且Sec-系統肽的表達將重組蛋白導向細胞周質。在附屬具體實施方案中，表達產生細胞外蛋白質。該方法還可以包括從周質或從細胞外介質中提純重組蛋白的步驟。可以表達與蛋白質相連的Sec-信號并且可以從細胞中提純與信號相連的蛋白質。因此，在一個具體實施方案中，該分離的肽是分泌信號與相關蛋白質或肽的融合蛋白。然而，還可以在將蛋白質導向周質時從蛋白質中裂解出分泌信號。在一個具體實施方案中，改進Sec-系統分泌信號與蛋白質或肽之間的連接以提高分泌信號的裂解。
在一個具體實施方案中，該方法可以在細胞中產生恰當加工的重組蛋白。在另一具體實施方案中，Sec-系統肽的表達可以在細胞中產生活性重組蛋白。與不用Sec-分泌信號表達的蛋白質相比，本發明的方法還可以提高重組蛋白的收率。
在另一具體實施方案中，該方法產生至少0.1克/升正確加工的蛋白質。在另一具體實施方案中，該方法在細胞中產生0.1至1克/升正確加工的蛋白質。在附屬具體實施方案中，所得總蛋白質可以是至少大約2.0至大約50.0克/升。在一些具體實施方案中，所得正確加工的蛋白質的量為所得重組蛋白總量的至少大約5％、大約10％、大約15％、大約20％、大約25％或更高。
相關蛋白質或肽可以是治療上有效的蛋白質或肽。在一個具體實施方案中，該蛋白質或肽來自真核物類。在另一具體實施方案中，蛋白質序列來自哺乳動物序列。在另一具體實施方案中，活性形式的蛋白質包括至少一個二硫鍵。在又一具體實施方案中，蛋白質或肽來自激素、生長因子、細胞外受體或配體、蛋白酶、激酶、血蛋白、趨化因子或細胞因子或抗體。
附圖簡述圖1革蘭氏陰性細菌中的蛋白質分泌系統概觀。四個系統(Sec、Tat、MscL和holins)僅穿過內膜轉移。該Sec系統分泌的蛋白質位于周質中，結合到外膜內或通過箭頭所示的四個外膜分泌系統之一傳輸穿過外膜。通過Tat系統易位的蛋白質主要位于周質中，但是已經發現銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)中的一些蛋白質通過MTB系統進一步輸出。Holins和MscL僅將蛋白質傳輸到周質內。I、III和IV型系統在不使用任何周質中間體的情況下穿過內膜和外膜輸出蛋白質，縮寫FUP，fimbrial usher孔蛋白；AT，自動轉運子；TPS，兩partner分泌系統；MTB，主末端分支；IM，內膜；OM外膜。
圖2熒光假單胞菌gal2分泌結構。顯示了pDOW1122和DOW1123的質粒圖，(A)pDOW1122包含oprF:gal2融合(B中顯示了氨基酸序列)，且pDOW1123包含pbp:gal2融合(C中顯示的氨基酸序列)。*表示預定信號肽酶裂解位點。
圖3Gal2的分泌表達。來自表達oprF:gal2(Pdow1122)或pbp:gal2(Pdow1123)的熒光假單胞菌的整個培養液樣品的SDS-PAGE分析圖(A)。將整個培養液的1/80稀釋液加載在10％NuPAGE凝膠上并在1XMOPS緩沖劑中電泳。圖B顯示了可溶(S)、不溶(I)和無培養上清細胞(SN)餾分的Western分析。在凝膠下方顯示出加載的培養物的量，標準化至A575＝30。
圖4大腸桿菌中pelB:gal2的表達。顯示了在pelB:gal2(Pdow1138)中表達的Gal2的western印跡分析圖。箭頭指向不溶(I)和可溶(S)餾分中加工處理和未加工處理的蛋白質。在誘導后0(I0)和3小時(I3)處取樣的樣品標準化至A575＝1；將5ul加載在4-12％NuPAGE凝膠上并在1X MES緩沖劑中電泳。
圖5來自大腸桿菌和熒光假單胞菌的提純scFv的活性。使用ELISA檢驗(A)測量從小規模(B)或大規模(C)發酵中分離出的scFv的活性。活性以吸光度的形式表示；下面每條框列出了抗體和量；顯示的是三個孔(well)的平均值。
圖6抗地高辛(anti-digoxin)scFv的分泌表達。A顯示了振蕩培養瓶規模的在熒光假單胞菌中的分泌。B顯示了振蕩培養瓶規模的在大腸桿菌中的分泌。所有樣品均標準化至20OD(對于熒光假單胞菌為OD575，且對于大腸桿菌為OD600)。在MES緩沖劑中在4-12％BT凝膠上電泳樣品。S＝可溶、I＝不溶。數字是以小時計的誘導后時間。
圖7振蕩培養瓶規模的分泌的抗地高辛scFv的Western印跡。圖A顯示了熒光假單胞菌表達的蛋白質，圖B顯示了大腸桿菌表達的蛋白質。將樣品標準化至20OD。蛋白質在兩種構造中都是100％不溶。S＝可溶，I＝不溶，0、3、24、48代表誘導后時間。
圖8通過抗地高辛scFv的定量分析進行構造之間的收率比較。將10微升每種樣品(包括BSA標準物)加載到4-12％BT凝膠上并在1X MES緩沖劑中電泳。對于每種構造，加載誘導后來自0、3、24、48小時的樣品。檢查熒光假單胞菌分泌的構造pDOW1142和大腸桿菌細胞質(pDOW1152)和分泌的(pDOW1153)構造。箭頭表示加工處理和未加工處理的分泌scFv的遷移。如下電泳BAS標準曲線1，0.1ug；3，0.60ug；5，1.529ug；8.1.85ug。
圖9提純抗地高辛scFv的活性檢驗。X-軸上是受試樣品來自含pDOW1142、pDOW1152或pDOW1153的菌株的提純scFv；多克隆的抗地高辛抗體(陽性)；或無蛋白質(陰性)。Y軸上是吸光度值。誤差棒代表三份樣品的標準偏差。
圖10在用5mM安息香酸鹽生長24小時后，誘導的Skp蛋白質。使用未誘導的燒瓶作為對照。在誘導12小時后收取細胞并且將蛋白質分離成可溶和不溶餾分。使用MES緩沖劑在4-12NuPAGE凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)上分離蛋白質。縮寫如下I，不溶；S，可溶；MW，分子量；MWM，分子量標記。
圖11加工處理和未加工處理的Skp蛋白質的氨基酸序列。加下劃線的序列相當于信號序列(上方)和MALDI-PSD識別出的序列(下方)。
圖12與用pDOW1123轉化的JM109、在37℃生長并用0.01mMIPTG誘導成陽性對照物DC265相比較，可溶和不溶樣品的SDS-PAGE分離圖。列1-可溶DC265，列2-不溶DC265，列3-SeeBlue Plus2 ladder，列4-可溶JM109/pDOW1123，列5-不溶JM109/pDOW1123。在每個孔內加載5微升20OD標準化樣品。在150伏電壓下在1×MES緩沖劑中電泳4-12％Bis Tris凝膠大約50分鐘，然后用Simply Blue Safe Stain著色。
圖13從用pDOW1123轉化并用0.01mM的IPTG誘導、在37℃生長的大腸桿菌菌株JM109中SDS-PAGE分離不溶樣品的圖。列1-3，10微升不溶樣品。列4，陽性對照物熒光假單胞菌DC265的10微升1∶20稀釋物。將12％Bis-Tris凝膠在200伏在1×MES緩沖劑中處理大約50分鐘，并用NovexColloidal Blue Stain Kit著色。
圖14來自用pDOW1123轉化、在0.01mM IPTG中誘導并在37℃生長的大腸桿菌菌株JM109的周質樣品的SDS-PAGE分析圖。將12％Bis-Tris凝膠在200伏電壓下在1×MES緩沖劑中電泳大約50分鐘，并用NovexColloidal Blue Stain Kit著色。列1-DC265陽性對照物的10微升1∶20稀釋物。列2-4 10微升周質樣品。
圖15在37℃生長的用0.01mM IPTG-誘導的JM109/pDOW1123培養物的可溶、不溶和周質餾分的western分析圖。將樣品在12％BisTris凝膠上在MES緩沖劑中電泳并在30伏電壓下轉移到硝化纖維素中1小時，然后用抗-His HRP用探針探查。列1-陽性對照物的不溶部分的10微升1∶30稀釋物。列2-20微升可溶部分。列3-10微升不溶部分。列4-20微升周質制品。
詳述本發明是以熒光假單胞菌中分泌信號序列的發現為基礎的。在一個具體實施方案中，本發明提供了信號肽序列、編碼信號肽的核酸、包括編碼信號肽序列的核酸的載體和細胞，它們來自熒光假單胞菌有機體，該有機體在與該蛋白質或肽協同表達時可以提高相關蛋白質或肽的分泌。還提供了改進的使用來自熒光假單胞菌的Sec-分泌信號在細胞表達系統中產生大量正確加工的重組蛋白的方法。
本發明還確認了熒光假單胞菌是用于多種蛋白質制造的改進平臺。特別地，與通常在其它細菌表達系統中觀察到的相比，熒光假單胞菌以正確加工形式產生了更大量的導向Sec分泌系統的外源蛋白，并更大量地將這些蛋白質轉移到細胞周質中，從而提高完全加工過的重組蛋白的回收率。因此，在一個具體實施方案中，本發明提供了一種通過表達與Sec分泌信號相連的目標蛋白質來在熒光假單胞菌中制造外源蛋白質的方法。
之前已經證實，某些假單胞菌與其它細菌表達系統相比，對肽和酶的商業表達提供了益處。特別地，已經確認熒光假單胞菌是有利的表達系統。熒光假單胞菌包括一組存在于土壤、水和植物表面環境中的常見的非病原腐生物。已經使用來自熒光假單胞菌的商業酶作為去垢添加劑以降低環境污染并用于立體選擇性水解。還在農業上使用熒光假單胞菌控制病原體。在上世紀90年代末被Dow AgroSciences完全收購的Mycogen，在80年代中期開始在熒光假單胞菌中表達重組細菌蛋白并在1985年1月22日提交其關于熒光假單胞菌中的蘇云金芽孢桿菌毒素表達的第一個專利申請(“Cellular encapsulation of biologicalpesticides”)。在1985和2004年之間，Mycogen，隨后Dow Agro Sciences以及其它公司在關于農藥(pesticidal)、殺蟲劑和殺線蟲毒素制造以及特定毒物序列和基因操作以提高它們的表達的專利申請中投資于熒光假單胞菌的農業應用。
DowPharma目前在使用熒光假單胞菌制造重組蛋白的應用領域中擁有一些待審專利申請。屬于Dow Global Technologies的PCT申請WO 03/068926和WO 03/068948描述了使用假單胞菌，特別是熒光假單胞菌作為宿主細胞的extremoyzme過度表達系統。這些文獻大致公開了與信號肽協同進行的extremozymes表達，但是沒有公開具體序列并且沒有確認這些細胞對分泌是優異的。
2003年4月22日提交的屬于Dow Global Technologies的名為“Low-Cost Production of Peptides”的PCT公開WO 03/089455描述了制造作為假單胞菌(特別是熒光假單胞菌)中的contatemeric前體的小肽(例如抗菌肽)的低成本方法。該文獻公開了與信號肽協同進行的concatameric肽的表達，但是沒有公開具體序列。
屬于Dow Global Technologies的名為“Benzoate and AntranilateInducible Promoters”的PCT申請WO 04/005221提供了用于商業原核發酵系統的來自熒光假單胞菌的安息香酸鹽或鄰氨基安息香酸鹽可誘導的啟動子。該文獻公開了包含帶有啟動子的信號肽，但是沒有公開具體信號序列。
肽在一個具體實施方案中，提供了帶有下述氨基酸序列的分離肽——該序列是選自磷酸鹽結合蛋白(pbp)分泌信號、外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號、Lys-Arg-Orn結合蛋白分泌信號、天青蛋白(azurin)，分泌信號、鐵(III)結合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號的熒光假單胞菌Sec-系統分泌肽或基本與其同源。
在另一具體實施方案中，提供了帶有下述氨基酸序列的分離肽——該序列是pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結合蛋白或脂蛋白B分泌信號或基本與它們同源。在一個具體實施方案中，分離肽是分泌信號與相關蛋白質或肽的融合蛋白。
在一個具體實施方案中，肽序列是至少氨基酸Met Lys Leu LysArg Len Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly Val Ala Thr Ala Asn AlaVal Ala(SEQ ID NO1)的磷酸鹽結合蛋白(pbp)分泌信號肽的序列，或基本與其同源。在另一具體實施方案中，肽序列包含SEQ ID NO1的至少氨基酸2-24。在另一具體實施方案中，肽序列包括截短的SEQ IDNO1，其從氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸，但是保留分泌信號活性。
在另一具體實施方案中，肽序列是含有至少氨基酸序列Met LysLys Ser Thr Leu Ala Val Ala Val Thr Leu Gly Ala Ile Ala Gln Gln Ala GlyAla(SEQ ID NO3)的外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號肽的序列或基本與其同源。在一個具體實施方案中，該肽是SEQ ID NO3的至少氨基酸2-21或與其同源。在另一具體實施方案中，肽序列包括截短的SEQID NO3，其從氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸，但是保留分泌信號活性。在一個具體實施方案中，將SEQ ID NO3的肽修飾以使位置2的Lys被Tyr取代。在一個具體實施方案中，將SEQ ID NO3的肽修飾以使位置5的Thr被Ser取代。在一個具體實施方案中，將SEQ ID NO3的肽修飾以使位置8的Val被Leu取代。在一個具體實施方案中，將SEQ ID NO3的肽修飾以使位置10的Val被Val和Arg取代。在一個具體實施方案中，將SEQ ID NO3的肽修飾以使位置14的Ala被Val取代。在一個具體實施方案中，將SEQ ID NO3的肽修飾以使位置15的Ile被Leu取代。
在另一具體實施方案中，肽序列是含有至少氨基酸序列Met PheAla Lys Leu Val Ala Val Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Gly Gln Leu Leu Ala(SEQ ID NO5)的天青蛋白分泌信號肽的序列或基本與其同源。在一個具體實施方案中，該肽是SEQ ID NO5的至少氨基酸2-20或與其同源。在另一具體實施方案中，肽序列包括截短的SEQ ID NO5，其從氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸，但是保留分泌信號活性。在一個具體實施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置2和3的Phe-Ala被Leu-Arg或Ile-Arg取代。在一個具體實施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置5的Leu被Ala取代。在一個具體實施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置6的Val被Ala取代。在一個具體實施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置6-8的Val-Ala-Val被Ile-Ser-Ala取代。在一個具體實施方案中，將SEQIDNO5的肽修飾以使位置11的Leu被Ile取代。在一個具體實施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置12的Thr被Ser取代。在一個具體實施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置14的Ala被Leu或Phe取代。在一個具體實施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置16的Gly被Ala取代。在一個具體實施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置17的Gln被Ser或Pro取代。在一個具體實施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置18的Leu被Val取代。在一個具體實施方案中，將SEQ ID NO5的肽修飾以使位置18-19的Leu-Leu被Val-Phe取代。
在另一具體實施方案中，肽序列是含有至少氨基酸序列Met GlnAsn Tyr Lys Lys Phe Leu Leu Ala Ala Ala Val Ser Met Ala Phe Ser Ala ThrAla Met Ala(SEQ ID NO7)的Lys-Arg-Orn結合蛋白(LAObp或KRObp)分泌信號肽的序列或基本與其同源。在一個具體實施方案中，該肽是SEQ ID NO7的氨基酸2-23或基本與其同源。在另一具體實施方案中，肽序列包括截短的SEQ ID NO7，其從氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸，但是保留分泌信號活性。
在再一具體實施方案中，肽序列是含有至少氨基酸序列Met MetIle Arg Asp Asn Arg Leu Lys Thr Ser Leu Leu Arg Gly Leu Thr Leu ThrLeu Leu Ser Leu Thr Leu Leu Ser Pro Ala Ala His Ser(SEQ ID NO9)的鐵(III)結合蛋白[Fe(III)bp]分泌信號肽的序列或基本與其同源。在一個具體實施方案中，該肽是SEQ ID NO9的氨基酸2-32或基本與其同源。在另一具體實施方案中，肽序列包括截短的SEQ ID NO9，其從氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸，但是保留分泌信號活性。
在另一具體實施方案中，肽序列是含有至少氨基酸序列Met IleLys Arg Asn Leu Leu Val Met Gly Leu Ala Val Leu Leu Ser Ala(SEQ IDNO11)的脂蛋白B(LprB)分泌信號肽的序列或基本與其同源。在一個具體實施方案中，該肽是SEQ ID NO11的氨基酸2-17或基本與其同源。在另一具體實施方案中，肽序列包括截短的SEQ ID NO11，其從氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸，但是保留分泌信號活性。
在另一具體實施方法中，分泌信號是來自大腸桿菌蛋白質的分泌信號。在一個具體實施方案中，分泌信號是用于來自大腸桿菌的蛋白質的內在信號序列。在一個具體實施方案中，蛋白質是伴侶蛋白質。蛋白質可以是二硫鍵形成的蛋白質。在一個具體實施方案中，該序列是大腸桿菌伴侶蛋白質(例如skp蛋白質)的內在序列。
sec路徑的信號肽通常包括下列三個區域(i)帶正電的n-區，(ii)疏水h-區和(iii)不帶電但是極性c-區。信號肽酶的裂解位點位于c-區。然而，在不同蛋白質之間，信號序列保持程度和長度以及裂解位點位置可以不同。分泌信號序列可以是，例如，使用為識別分泌信號而設計的電腦程序(例如SignalP程序)或如Hiller等(2004)Nucleic AcidsResearch 32(Web Server issue)W375-W379所述識別出的任何序列；可在互聯網上在URLhttp://www.predisi.de查到。
序列同源性此處所用的術語“同源”是指i)具有與給定原始蛋白質或肽的序列大致相似(也就是，至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％)的氨基酸序列并保留原始蛋白質或肽的所需功能的蛋白質或肽，或ii)具有與給定核酸的序列大致相似(也就是，至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％)的序列并保留原始核酸序列的所需功能的核酸。在本發明和公開的所有具體實施方案中，可以將任何公開的蛋白質、肽或核酸替換成保留所需功能的同源或基本同源的蛋白質、肽或核酸。在本發明和公開的所有具體實施方案中，當公開了任何核酸時，應該認為本發明還包括與所公開的核酸雜交的所有核酸。
在一個具體實施方案中，同源多肽的氨基酸序列是給定原始多肽的變體，其中可以通過將最多或大約30％(包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30％)的原始多肽氨基酸殘基取代成其它氨基酸殘基來獲得該變體的序列，條件是取代后的變體保留了原始多肽的所需功能。基本同源的變體氨基酸與給定多肽至少大約70％同源，或70、75、80、85、90、95、98、99或100％同源。
在一個具體實施方案中，變體可以是原始多肽的類似取代的變體或類似變體。術語“類似取代的變體”是指相對于原始多肽，含有不同殘基(它們是“類似的”氨基酸殘基取代基，但是其中并非所有的不同之處都是“類似的”取代基)的變體。此處所用的術語“類似變體”是指其中每個不同的殘基都是“類似的”氨基酸殘基取代基時的變體。本文中使用的術語“類似的”氨基酸殘基是指下述殘基——它們是表1所示的15個保守或半保守基團的任何一個。

在一個具體實施方案中，至少50％的取代基表現為保守氨基酸取代基，剩余取代基是半保守取代基。在其它具體實施方案中，至少60％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％的類似取代基表現為保守氨基酸取代基。
在一個具體實施方案中，至少50％的類似取代基表現為保守氨基酸取代基，剩余的類似取代基表現為半保守氨基酸取代基。在另一個具體實施例中，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％的類似取代基表現為保守氨基酸取代基。在一個實施方案中，取代變體是給定原始多肽的類似變體。
核酸序列本發明還包括帶有為一種肽編碼的序列的分離核酸，該肽包括與pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結合蛋白和脂蛋白B分泌信號基本同源的序列。在本發明的另一方面，提供了雜合成下述分離核酸的核酸，該分離核酸帶有為一種肽編碼的序列，該肽包括與pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結合蛋白和脂蛋白B分泌信號基本同源的序列。在某些具體實施方案中，雜合核酸在極其嚴格的條件下結合。極其嚴格的條件通常是指在68℃或更高的溫度下雜合。
在一個具體實施方案中，提供了為與SEQ ID NO1的至少氨基酸2-24的磷酸鹽結合蛋白(pbp)分泌信號肽的序列基本同源的肽序列編碼的核酸。在另一具體實施方案中，為肽編碼的核酸序列是atg aaa ctgaaa cgt ttg atg gcg gca atg act ttt gtc gct gct ggc gtt gcg acc gcc aac gcg gtggcc(DEQ ID NO2)。在另一具體實施方案中，該核酸序列與SEQ IDNO2的序列至少80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具體實施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO2的序列至少90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％或50％相同。在另一具體實施方案中，根據宿主機體的密碼子使用來調節SEQ ID NO2的核酸序列。
在一個具體實施方案中，提供了為與含有SEQ ID NO3的至少氨基酸2-21的序列的外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號肽的序列基本同源的肽序列編碼的核酸。在一個具體實施方案中，肽序列是如下的SEQ IDNO3的肽或與其基本同源——其中位置2的Lys被Tyr取代；其中位置5的Thr被Ser取代；其中位置8的Val被Leu取代；其中位置10的Val被Val和Arg取代；其中位置14的Ala被Val取代；其中位置15的Ile被Leu取代。在另一具體實施方案中，為肽編碼的核酸序列是atg aag aag tcc acc ttg gct gtg gct gta acg ttg ggc gca atc gcc cag caagca ggc gct(SEQ ID NO4)。在另一具體實施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO4的序列至少90％相同。在另一具體實施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO4的序列至少98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％相同。在另一具體實施方案中，根據宿主機體的密碼子使用來調節SEQ ID NO4的核酸序列。
在另一具體實施方案中，提供了為與含有SEQ ID NO5的至少氨基酸2-20的序列的天青蛋白分泌信號肽的序列基本同源的肽序列編碼的核酸。在一個具體實施方案中，肽序列是如下的SEQ ID NO5的肽或與其基本同源——其中位置2和3的Phe-Ala被Leu-Arg或Ile-Arg取代；其中位置5的Leu被Ala取代；其中位置6的Val被Ala取代；其中位置6-8的Val-Ala-Val被Ile-Ser-Ala取代；其中位置11的Leu被Ile取代；其中位置12的Thr被Ser取代；其中位置14的Ala被Leu或Phe取代；其中位置16的Gly被Ala取代；其中位置17的Gln被Ser或Pro取代；其中位置18的Leu被Val取代；或其中位置18-19的Leu-Leu被Val-Phe取代。在另一具體實施方案中，為肽編碼的核酸序列是atg ttt gcc aaa ctc gtt gct gtt tcc ctg ctg act ctg gcg agc ggc cag ttg cttgct(SEQ ID NO6)。在一個具體實施方案中，該核酸序列與SEQ IDNO6的序列至少90％相同。在另一具體實施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO6的序列至少98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％相同。在另一具體實施方案中，根據宿主機體的密碼子使用來調節SEQ ID NO6的核酸序列。
在另一具體實施方案中，提供了為與含有SEQ ID NO7的至少氨基酸2-23的序列的Lys-Arg-Orn結合蛋白(LAObp或KRObp)分泌信號肽的序列基本同源的肽序列編碼的核酸。在另一具體實施方案中，為肽編碼的核酸序列是atg cag aac tat aaa aaa ttc ctt ctg gcc gcg gcc gtctcg atg gcg ttc agc gcc acg gcc atg gca(SEQ ID NO8)。在另一具體實施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO8的序列至少90％相同。在另一具體實施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO8的序列至少98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％相同。在另一具體實施方案中，根據宿主機體的密碼子使用來調節SEQ ID NO8的核酸序列。
在再一具體實施方案中，提供了為與含有SEQ ID NO9的至少氨基酸2-32的序列的鐵(III)結合蛋白[Fe(III)bp]分泌信號肽的序列基本同源的肽序列編碼的核酸。在另一具體實施方案中，為肽編碼的核酸序列是atg atg atc cgt gac aac cga ctc aag aca tcc ctt ctg cgc ggc ctg acc ctcacc cta ctc agc ctg acc ctg ctc tcg ccc gcg gcc cat tct(SEQ ID NO10)。在另一具體實施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO10的序列至少90％相同。在另一具體實施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO10的序列至少98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％相同。在另一具體實施方案中，根據宿主機體的密碼子使用來調節SEQ ID NO10的核酸序列。
在另一具體實施方案中，提供了為與含有SEQ IDNO11的至少氨基酸2-17的序列的脂蛋白B(LprB)分泌信號肽的序列基本同源的肽序列編碼的核酸。在另一具體實施方案中，為肽編碼的核酸序列是atg atc aaa cgc aat ctg ctg gtt atg ggc ctt gcc gtg ctg ttg agc gct(SEQ IDNO12)。在另一具體實施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO12的序列至少90％相同。在另一具體實施方案中，該核酸序列與SEQ ID NO12的序列至少98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％相同。在另一具體實施方案中，根據宿主機體的密碼子使用來調節SEQ ID NO12的核酸序列。
密碼子使用或密碼子選擇是本領域中公知的。可以如下修改所選編碼序列改變其遺傳密碼以配合細菌宿主細胞使用的序列，并且可以增強其密碼子序列以更接近宿主使用的序列。可以按照本領域普通技術人員已知的各種方法(例如低聚核苷酸誘發突變)進行遺傳密碼選擇和密碼子頻率增強。對此過程有幫助的有用的互聯網在線資源包括，例如(1)the Kazusa DNA Research Institute(2-6-7Kazusa-kamatari，Kisarazu、Chiba 292-0818日本)的密碼子使用數據庫并可在http://www.kazusa.or.jp/獲得；以及(2)可以從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi？mode＝c 的NCBI Taxonomy數據庫獲得的遺傳密碼表。例如，假單胞菌屬據描述使用了NCBI Taxonomy站點的遺傳密碼譯碼表11，并在Kazusa站點表現出http://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/所示的表中的密碼子使用頻率。
核酸同源性本領域技術人員顯而易見的是，可以提供多種基本同源的核酸，它們為基本類似的肽的序列編碼。在編碼序列同源性的情況下，與蛋白質編碼核酸序列同源的編碼序列含有與此處公開的蛋白質編碼核酸序列相比不超過30％(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30％)的會導致讀碼框中的變化的突變并且不含會產生過早終止密碼子的突變。然而，可以在改變所需表達系統中的密碼子使用的基礎上設計核酸序列。
按照本領域公知的各種方法測量核酸序列同源性。可用的序列比對和同源性測定方法的例子包括下述這些。
可以使用U.S.National Center for Biotechnology InfOrnation(NCBI)程序，MegaBLAST(目前可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/查到)進行同源序列的比對和檢索。該程序的使用可以選擇對于氨基酸序列在70％的等同百分比設置，或對于核苷酸序列在90％的設置，這種使用可以識別出與查詢序列(querysequence)具有70％或90％或更高同源性的序列。本領域已知的其它軟件也可用于同源序列(例如與本發明的含有啟動子堿基序列或激活子-蛋白質-編碼堿基序列的信息串至少70％或90％同源的序列)的比對和/或檢索。例如，用于比較以識別出與查詢序列至少70％或90％同源的序列的序列比對可以使用例如獲自GCG序列分析軟件包(SecquenceAnalysis Software Package，可獲自Genetics Computer Group，Universityof Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，Wis.53705)的GAP、BESTFTT、BLAST、FASTA和TFASTA程序進行，在此過程中使用這些程序中指定的缺省參數加上70％或90％的同源性程度設置用的參數。也可以使用例如CLUSTAL程序(可以在來自Interlligenetics，Mountain View，Cal.的PC/Gene軟件包中獲得)。
這些和其它序列比對方法是本領域中公知的并且可以通過人工比對，通過目測，或通過序列比對算法(例如上述程序所包含的那些)。的人工或自動運用來進行。各種可用的算法包括，例如，在W.R.Pearson&D.J.Lipman，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 852444-48(1988年4月)中描述的相似性檢索法；T.F.Smith&M.S.Waterman，在Adv.Appl.Math.2482-89(1981)及在J. Molec.Biol.147195-97(1981)中描述的局部同源性檢索法；在S.B.Needleman&C.D.Wunsch，J. Molec.Bial.48(3)443-53(1970年3月)中描述的同源性比對法；以及例如W.R.Pearson在Genomics 11(3)635-50(1991年11月)中；W.R.Pearson在Methods Mole.Biol.24307-31和25365-89(1994)中；以及D.G.Higgins&P.M.SharpComp.Appl’ns in Biosci.5151-53(1989)和在Gene73(1)237-44(1988年12月15日)中描述的各種方法。
在極其嚴格的雜合條件下進行的核酸雜合也是一種可用于獲得本文所用的足夠同源的序列的技術。極其嚴格的雜合條件通常是指在至少68℃的含水條件中進行的雜合。
載體另一具體實施方案是一種表達載體，其包括帶有下述序列的熒光假單胞菌Sec-系統分泌肽的核酸——該序列與可連接到啟動子上的pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結合蛋白或脂蛋白B分泌信號基本同源。可表達的編碼序列有效地連接到能夠在所選宿主細胞中起作用的轉錄啟動子以及所有其它必須的轉錄和轉譯調節因子上。
術語“可連接”是指下述任何構造，即在該構造中，轉錄和任何轉譯調節因子相對于編碼序列以這樣的布置共價連接到編碼序列上，使得在宿主細胞中并通過宿主細胞的作用，調節因子可以指引編碼序列的表達。
載體通常包含一個或多個表型可選擇標記和一個復制源以確保載體的維持并且如果需要，可以在宿主內提供擴增。適合按照本公開的內容進行轉化的宿主包括假單胞菌屬內的各種物類，特別優選的是熒光假單胞菌的宿主細胞株。
在一個具體實施方案中，載體進一步包含可連接到Sec分泌信號上的用于相關重組蛋白或肽的表達的編碼序列。這些重組蛋白和肽可以從多核苷酸中表達，其中目標多肽編碼序列可連接到前導序列和轉錄和轉譯調節因子上以形成功能基因，宿主細胞可從該功能基因中表達蛋白質或肽。編碼序列可以是目標多肽的內在編碼序列(如果可以得到的話)，但是更優選是經過選擇、改進或最優化以用于宿主細胞的選定表達的編碼序列例如通過合成基因以反應宿主物類的密碼子使用偏性。在本發明的一個具體實施方案中，宿主物類是熒光假單胞菌，并且在既設計信號序列又設計蛋白質或肽序列時，考慮熒光假單胞菌的密碼子偏性。在一個或多個載體內構造基因，或將基因插入一個或多個載體內，然后將載體轉化成表達宿主細胞。
在載體(也稱作“表達構造”)中可以包含其它調節因子。這些因子包括，但不限于，例如，轉錄增強序列、轉譯增強序列、其它啟動子、激活子、轉譯啟動和終止信號、轉錄終止子、順反子調節子、多順反子調節子、標記序列，例如核苷酸序列“標記”和“標記”肽編碼序列，這有助于表達出的多肽的識別、分離、提純或隔離。
在另一具體實施方案中，表達載體進一步包含與分泌信號的編碼序列相鄰或與重組蛋白或肽的編碼序列相鄰的標記序列。在一個具體實施方案中，該標記序列使蛋白質可以提純。標記序列可以是親和標記物，例如六-組氨酸親和標記物。在另一具體實施方案中，親和標記物可以是谷胱甘肽-S-轉譯酶分子。標記物還可以是熒光分子，例如YFP或GFP，或這些熒光蛋白質的類似物。該標記物還可以是一部分抗體分子，或可用于提純的已知的結合partner的已知抗原或配體。
本發明的蛋白質編碼基因除了蛋白質編碼序列外，還可以包括可與其相連的下列調節因子啟動子、核糖體結合位點(RBS)、轉錄終止子、轉譯啟動和終止信號。可用的RBSs可獲自可在本發明的表達系統中用作宿主細胞的任何物類，尤其獲自選定的宿主細胞。許多特定的RBSs和多種一致認可的RBSs是已知的，例如，D.Frishman等人，Starts of bacterial genomesestimating the reliability of computerpredictions，Gene 234(2)257-65(1999年7月8日)中；以及B.E.Suzek等人，A probabilistic method for identifying start codons in bacterialgonomes，BioinfOrnatics 17(12)1123-30(2001年12月)中描述和引用的那些。此外，可以使用天然的或合成的RBSs，例如，下列文獻中描述的那些EP 0207459(合成的RBSs)；O.Ikehata等人，Primary structureof nitrile hydratase deduced from the nucleotide sequence of aRhodococcus species and its expression in Escherichia coli，Eur.J.Biochem.181(3)563-70(1989)(AAGGAG的天然RBS序列)。在下列文獻中描述了本發明中可用的方法、載體和轉譯及轉錄因子的其它例子，例如授予Gilroy的美國專利No.5,055,294和授予Gilroy等人的美國專利No.5,128,130；授予Rammler等人的美國專利No.5,281,532；授予Barnes等人的美國專利No.4,695,455和4,861,595；授予Gray等人的美國專利No.4,755,465；以及授予Wilcox的美國專利No.5,169,760。
通過在載體或質粒中插入增強序列來提高假單胞菌對本發明的蛋白質的編碼DNA的轉錄。典型的增強子是DNA的順式作用元件，通常大小為大約10至300bp，其作用于啟動子以提高其轉錄。例子包括各種假單胞菌增強子。
通常，重組表達載體包括復制源和允許假單胞菌宿主細胞轉化的可選擇的標記和來自高度表達基因的啟動子以指示下游構造序列的轉錄。這些啟動子可來自為3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、酸性磷酸酶或熱休克蛋白質之類的酶編碼的操縱子。用轉譯起始和終止序列并優選用能夠指示轉譯酶分泌的前導序列在合適的階段組裝異質構造序列。任選地，異質序列可以編碼包括損害所需特性(例如表達出的重組產品的穩定或簡化的提純)的N-末端識別肽的融合酶。
載體在本領域中已知可用于在宿主細胞中表達重組蛋白，并且可以使用這些載體中的任何一種以按照本發明表達基因。這些載體包括，例如，質粒、粘粒、噬菌體表達載體。可用的質粒載體的例子包括，但不限于，表達質粒pBBR1MCS、pDSK519、pKT240、pML122、pPS10、RK2、RK6、pRO1600和RSF1010。此類可用載體的其它例子包括下列文獻中描述的那些N，Hayase，在Appl.Envir.Microbiol.60(9)3336-42(1994年9月)中；A.A.Lushnikov等人，在Basic Life Sci.30657-62(1985)中；S.Graupner&W.Wackernagel，在Biomolec.Eng.17(1)11-16(2000年10月)中；H.P.Schweizer，在Curr.Opin.Biotech.12(5)439-45(2001年10月)中；M.Bagdasarian&K.N.Timmis，在Curr.Topics.Microbiol.Immunol 9647-67(1982)中；T.Ishii等人，在FEMS Microbiol Lett.116(3)307-13(1994年3月1日)中；I.N.Olekhnovich&Y.K.FOrnichev，在Gene 140(1)63-65(1994年3月11日)中；M.Tsuda&T.Nakazawa，在Gene 136(1-2)257-62(1993年12月22日)中；C.Nieto等人，在Gene 87(1)145-49(1990年3月1日)中；J.D.Jones&N.Gutterson，在Gene 61(3)299-306(1987)中；M.Bagdasarian等人，在Gene 16(1-3)237-47(1981年12月)中；H.P.Schweizer等人，在Genet.Eng.(NY)2369-81(2001)中；P. Mukhopadhyay等人，在J.Bact.172(1)477-80(1990年1月)中；D.O.Wood等人，在J.Bact.145(3)1448-51(1981年3月)中；以及R.Holtwick等人，在Microbiology 147(Pt 2)337-44(2001年2月)中。
可以在假單胞菌屬宿主細胞中使用的表達載體的其它例子包括表2所列的來自所示復制子的那些載體。

例如，F.Heffron等人在Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 72(9)3623-27(1975年9月)中，和K.Nagahari&K.Sakaguchi在I.Bact.133(3)1527-29(1978年3月)中描述了表達質粒RSF1010。質粒RSF1010及其衍生物是本發明中特別有效的載體。本領域中已知的、示例性的可用的RSF1010衍生物包括，例如pKT212、pKT214、pKT231和相關質粒，以及pMYC1050和相關質粒(參看，例如，授予Thompson等的美國專利5,527,883和5,840,554)，例如，pMYC1803。質粒pMYC1803來自RSF1010-基質粒pTJS260(參看授予Wilcox的美國專利5,169,760)，其從RSF1010質粒中攜帶調節的抗四環素標記物和復制和流通(mobilization)位點。其它示例性的可用載體包括授予Puhler等人的美國專利4,680,264中描述的那些。
在一個具體實施方案中，使用表達質粒作為表達載體。在另一具體實施方案中，使用RSF1010或其衍生物作為表達載體。在再一具體實施方案中，使用pMYC1050或其衍生物或pMYC1803或其衍生物作為表達載體。
可以使用選擇標記基因(也存在于質粒中)將質粒保持在宿主細胞中。這可以是抗生素抗性基因，在這種情況下可以在發酵培養基中加入相應的抗生素，或者是已知在本領域內可用的任何其它類型的選擇標記基因，例如原養恢復基因(prototrophy-restoring gene)，在這種情況下，在宿主細胞中使用對相應的特性(例如生物催化特性，例如氨基酸生物合成或核苷酸生物合成特性，或碳源利用特性)有營養缺陷的質粒。
按照本發明使用的啟動子可以是組成型啟動子或調節型啟動子(regulated promoters)。可用的調節型啟動子的常用例子包括來自lac啟動子(也就是lacZ啟動子)的那類啟動子，尤其是授予DeBoer的美國專利4,551,433中描述的tac和trc啟動子，以及Ptac16、Ptac17、PtacII、PlacUV5和T7lac啟動子。在某些具體實施方案中，啟動子來自大腸桿菌有機體。
本發明的表達系統中可用的非lac型啟動子的常用例子包括，例如，表3中列的那些。

參看，例如J.Sanchez-Romero&V.De Lorenzo(1999)GeneticEngineering of Nonpathogenic Pseudomonas Strains as Biocatalysts forIndustrial and Environmental Processes，在Manual of IndustrialMicrobiology(A.Demain&J.Davies，eds)中pp.460-74(ASM Press，Washington，D.C.)；H.Schweizer(2001)Vectors to express foreign genesand techniques to monitor gene expression for Pseudomonads，CurrentOpinion in Biotechnology，12439-445；以及R.Slater&R.Williams(2000)The Expression of Foreign DNA in Bacteria，在Molecular Biology andBiotechnology(J，Walker&R.Rapley.eds.)中pp.125-54(The Royal Societyof Chemistry，Cambridge，UK)。還可以使用含有原產于所選細菌宿主細胞的啟動子的核苷酸序列的啟動子以控制為目標多肽編碼的轉基因的表達，例如假單胞菌鄰氨基安息香酸鹽或安息香酸鹽操縱子啟動子(Pant，Pben)。還可以使用串聯(tandem)啟動子，其中一個以上的啟動子互相共價連接，無論它們在序列上是否相同，例如Pant-Pben串聯啟動子(啟動子間雜合)或Plac-Plac串聯啟動子。
調節型啟動子采用了啟動子調節蛋白以控制包含啟動子作為其組成部分的基因的轉錄。當在此使用調節型啟動子時，相應的啟動子調節蛋白也可以是本發明的表達系統的一部分。啟動子調節蛋白的例子包括激活蛋白，例如大腸桿菌代謝產物激活蛋白，MalT蛋白；AraC族轉錄激活子；阻遏蛋白，例如大腸桿菌LacI蛋白；和雙功能調節蛋白，例如大腸桿菌NagC蛋白。許多調節型啟動子/啟動子-調節蛋白對是本領域已知的。
啟動子調節蛋白與效應化合物(也就是可逆或不可逆地與調節蛋白相連以使蛋白質能夠釋放或結合到該基因的處于啟動子控制下的至少一個DNA轉錄調節區的化合物)相互作用，從而允許或阻礙轉錄酶在啟動基因轉錄中的作用。將效應化合物分成誘導物或輔阻遏物，并且這些化合物包括天生的效應化合物和義務誘導化合物。許多調節型啟動子/啟動子-調節蛋白/效應化合物三件套是本領域已知的。盡管可以在整個細胞培養和發酵過程中隨處使用效應化合物，但在使用調節型啟動子的優選具體實施方案中，在生成了所需量或密度的宿主細胞生物量后，在培養物中加入合適的效應化合物以直接或間接引起所需目標基因的表達。
作為例子，在使用lac族啟動子時，該系統中可以存在lacI基因。LacI基因(其(通常)是組成型表達的基因)對結合到這些啟動子的lac操縱子上的Lac阻遏蛋白n(LacI蛋白)進行編碼。因此，當使用lac族啟動子時，在表達系統中也可以包含并表達lacI基因。在lac族啟動子成員(例如tac啟動子)的情況下，效應化合物是誘導物，優選IPTG(異丙基-D-1-硫代半乳糖苷，也稱作“異丙基硫代半乳糖苷)之類的義務誘導物。
ChampionTMpET表達系統提供了高效的蛋白質生產。由強T7lac啟動子誘導表達。該系統利用了噬菌體T7RNA聚合酶的高活性和特異性以大量轉錄相關基因。位于啟動子區域的lac操縱基因提供了比傳統T7-基載體更緊密的調節，從而改進質粒穩定性和細胞存活力(Studier，F.W.和B.A.Moffatt(1986)J Molegular Biology 189(1)113-30；Rosenberg等人，(1987)Gene 56(1)125-35)。T7表達系統使用了T7啟動子和T7RNA聚合酶(T7RNAP)以大量轉錄相關基因。在T7表達系統中實現了高效表達，因為T7RNAP比天然大腸桿菌RNAP更具有加工性并且專門用于相關基因的轉錄。通過在宿主細胞中提供T7RNAP源來誘導確定基因的表達。這可以使用含有T7RNAP基因的染色體副本的BL21大腸桿菌宿主實現。T7RNAP基因處于可通過IPTG誘導的LacUV5啟動子控制下。在誘導時表達T7RNAP并轉錄相關基因。
βBAD表達系統可以通過特定碳源(例如葡萄糖、甘油和阿拉伯糖)的存在進行重組蛋白質的緊密受控的可滴定表達(Guzman等人(1995)JBacteriology 177(14)4121-30)。βBAD載體獨特地設計成對表達水平進行精確控制。在araBAD啟動子上開始來自pBAD載體的異質基因表達。通過araC基因的產品正向和負向調節啟動子。AraC是與L-阿拉伯糖形成復合物的轉錄調節子。在不存在L-阿拉伯糖的情況下，AraC二聚物阻礙了轉錄。為了獲得最大的轉錄活化作用，要求兩種情況(i)L-阿拉伯糖結合到AraC上以使轉錄開始，(ii)cAMP激活蛋白(CAP)-cAMP復合物結合到DNA上并促進AraC結合到啟動子區域的正確位置上。
Trc表達系統可以在大腸桿菌中實現來自trc啟動子的高效的受調節的表達。已經對大腸桿菌中的真核基因表達優化了trc表達載體。trc啟動子是來自色氨酸(trp)和乳糖(lac)啟動子的強雜合啟動子。通過lacO操縱基因和lacIQ基因的產品進行調節(Brosius，J.(1984)Gene27(2)161-72)。
表達系統在一個具體實施方案中，提供了一種用于制造重組蛋白的改進的表達系統。在一個具體實施方案中，該系統包括宿主細胞和載體，該載體包含可與選自pbp分泌信號、OprE分泌信號、Lys-Arg-Orn結合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號的熒光假單胞菌Sec-系統分泌信號或與該信號序列基本同源的序列相連的重組蛋白或肽。
在另一具體實施方案中，提供了一種包含熒光假單胞菌宿主細胞和至少一個載體的表達系統，該載體包括來自可與相關蛋白質或肽相連的任何基因組的Sec分泌信號。載體可以具有上述任何特性。在一個具體實施方案中，Sec分泌信號來自熒光假單胞菌基因組。然而，在另一具體實施方案中，Sec-分泌信號來自任何細菌基因組。在一個具體實施方案中，分泌信號來自非熒光假單胞菌基因組的細菌基因組，并且在特定具體實施方案中，分泌信號來自大腸桿菌基因組。在某些具體實施方案中，分泌信號可以原產于該蛋白質。在另一具體實施方案中，分泌信號不是原產于蛋白質。
例如，提供的分泌系統可以包括Sec分泌信號，例如用于skp蛋白質的分泌信號。在將重組表達的蛋白質導向周質隔室或導向細胞外時，載體中可以包含可與相關蛋白質相連的該蛋白質的內在前導序列。
在其它具體實施方案中，載體中可以包括來自不同蛋白質的分泌信號序列。令人驚奇地，熒光假單胞菌可以恰當地通過其Sec分泌路徑將帶有各種信號序列的蛋白質導向周質中。在一些具體實施方案中，在信號序列和相關蛋白質或肽之間不提供進一步修飾。然而，在某些具體實施方案中，加入附加的裂解信號以促進肽的氨基末端的恰當加工。
分泌系統還可以包括如下所述的發酵培養基。在一個具體實施方案中，該系統包括無機鹽培養基。在另一具體實施方案中，該系統在培養基中包括化學誘導物。
該系統還可以包括啟動子(其可以是可選擇啟動子)和誘導物。有時，該啟動子是非原產于熒光假單胞菌的啟動子，例如大腸桿菌啟動子。在某些具體實施方案中，該啟動子是，例如，可誘導啟動子，例如lac啟動子。該啟動子還可以是幾種不同啟動子的混合物，其中至少一種不是原產于熒光假單胞菌有機體。例如，啟動子可以是trc啟動子。啟動子還可以是例如tac啟動子。
方法在一個具體實施方案中，提供了一種用于制造重組蛋白的改進的方法，其包括表達與Sec分泌信號相連的相關融合蛋白的熒光假單胞菌宿主細胞。該方法可以包括提供一種包含載體的熒光假單胞菌細胞，該載體對可與重組Sec系統分泌信號序列相連的重組蛋白或肽編碼；并在產生蛋白質或肽表達的條件下培養該細胞。載體可以具有上述任何特性。在一個具體實施方案中，Sec分泌信號來自熒光假單胞菌基因組。在另一具體實施方案中，Sec-分泌信號來自任何細菌基因組。在一個具體實施方案中，分泌信號來自細菌基因組，并且在特定具體實施方案中，分泌信號來自大腸桿菌基因組。在某些具體實施方案中，分泌信號可以原產于該蛋白質。在另一具體實施方案中，分泌信號不是原產于蛋白質。
在另一具體實施方案中，提供了一種在任何宿主細胞中制備重組蛋白的改進的方法，包括可與宿主細胞中的相關重組蛋白或肽相連的選自pbp、OprE、Lys-Arg-Orn結合蛋白、天青蛋白、鐵(III)結合蛋白或脂蛋白B分泌信號的熒光假單胞菌Sec-系統分泌肽的表達。
在一個具體實施方案中，宿主細胞含有周質，且Sec-系統肽的表達將重組蛋白導向細胞周質。在附屬具體實施方案中，表達產生細胞外蛋白質。該方法還可以包括從周質或從細胞外介質中提純重組蛋白的步驟。可以表達與蛋白質相連的Sec-信號并且可以從細胞中提純與信號相連的蛋白質。因此，在一個具體實施方案中，該分離的肽是分泌信號與相關蛋白質或肽的融合肽。然而，還可以在將蛋白質導向周質時從蛋白質中裂解出分泌信號。在一個具體實施方案中，改進Sec-系統分泌信號與蛋白質或肽之間的連接以提高分泌信號的裂解。
在一個具體實施方案中，該方法可以產生定位于宿主細胞周質中的蛋白質。在一個具體實施方案中，該方法在細胞中產生恰當加工的重組蛋白。在另一具體實施方案中，Sec-系統肽的表達可以在細胞中產生活性重組蛋白。與不用Sec-分泌信號表達的蛋白質相比，本發明的方法還可以提高重組蛋白的收率。
在一個具體實施方案中，該方法在周質隔室中產生至少0.1克/升蛋白質。在另一具體實施方案中，該方法在細胞中產生0.1至10克/升周質蛋白質。在附屬具體實施方案中，該方法在細胞中產生至少大約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0克/升周質蛋白質。在一個具體實施方案中，所得重組蛋白總量為至少1.0克/升。在一些具體實施方案中，所得周質蛋白質的量為所得重組蛋白總量的至少大約5％、大約10％、大約15％、大約20％、大約25％、大約30％、大約40％、大約50％、大約60％、大約70％、大約80％、大約90％、大約95％或更多。
在一個具體實施方案中，該方法產生至少0.1克/升正確加工過的蛋白質。正確加工過的蛋白質具有天然蛋白質的氨基末端。在另一具體實施方案中，該方法在細胞中產生0.1至10克/升正確加工過的蛋白質。在附屬具體實施方案中，該方法產生至少大約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0克/升正確加工過的蛋白質。在一個具體實施方案中，所得正確加工過的重組蛋白總量為至少1.0克/升。在附屬具體實施方案中，所得正確加工過的蛋白質總量為至少大約2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、15.0、20.0或50.0克/升。在一些具體實施方案中，所得正確加工過的蛋白質的量是正確加工形式的重組蛋白總量的至少大約5％、大約10％、大約15％、大約20％、大約25％、大約30％、大約40％、大約50％、大約60％、大約70％、大約80％、大約90％、大約95％或更多。
在一些具體實施方案中，可以產生活性形式的蛋白質。術語“活性”是指存在生物功能或生物效應，其中生物功能或效應比得上或基本相當于相應的天然蛋白質或肽的生物功能或效應。在蛋白質領域中，這通常意味著多核苷酸或多肽包括與使用標準參數的相應天然蛋白質或肽相比具有至少大約20％，大約50％，優選至少大約60-80％，最優選至少大約90-95％活性的生物功能或效應。蛋白質或肽活性的測定可以使用特定蛋白質或肽的相應的標準定向(targeted)比較生物檢定法進行。重組蛋白或多肽生物功能或效應的一個指征是重組多肽在免疫學上可與天然多肽交叉反應。
在另一具體實施方案中，制成的表達出的轉基因肽、多肽、蛋白質或它們的片段中超過50％可以在宿主細胞中以可復性(renaturable)形式制造。在另一具體實施方案中，表達出的蛋白質中大約60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％以活性形式獲得或可以恢復成活性形式。
本發明的方法可以提高重組蛋白的收率。在一個具體實施方案中，該方法以總細胞蛋白量(tcp)的5、10、15、20、25、30、40或50、55、60、65、70或75％制造重組蛋白。“總細胞蛋白量百分比”是以合計細胞蛋白質百分比計的在宿主細胞中的蛋白質或肽的量。總細胞蛋白量百分比的測定方法是本領域技術人員已知的。
在特定具體實施方案中，當在無機鹽培養基中生長時(也就是在大約4℃至大約55℃的溫度范圍內，包括4℃和55℃在內)，宿主細胞可以具有至少1％tcp的重組肽、多肽、蛋白質或它們的片段的表達水平和至少40克/升的細胞密度。在特別優選的具體實施方案中，當以至少10升的發酵規模在無機鹽培養基中生長時(也就是在大約4℃至大約55℃的溫度范圍內，包括4℃和55℃在內)，表達系統具有至少5％tcp的重組蛋白質或肽表達水平或至少40克/升的細胞密度。
宿主細胞在一個具體實施方案中，本發明提供了用于表達包含Sec-型分泌信號的重組蛋白的熒光假單胞菌表達系統。本發明的這一方面建立在下述意外發現的基礎上——即發現熒光假單胞菌Sec分泌系統能夠恰當地加工并從熒光假單胞菌和非熒光假單胞菌Sec信號系統中導出分泌信號。
在該具體實施方案中，宿主細胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群18(Gram-negative Proteobacteria Subgroup 18)”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群18”是指熒光假單胞菌屬的所有亞種、變種、菌株及其它亞種單元(sub-special units)的集合，包括例如下列這些細胞(具有括號內所示的示范性菌株的ATCC或其它deposit數)熒光假單胞菌生物型A，也稱為生物變型1或生物變型I(ATCC 13525)；熒光假單胞菌生物型B，也稱為生物變型2或生物變型II(ATCC 17816)；熒光假單胞菌生物型C，也稱為生物變型3或生物變型III(ATCC 17400)；熒光假單胞菌生物型F，也稱為生物變型4或生物變型IV(ATCC 12983)；熒光假單胞菌生物型G，也稱為生物變型5或生物變型V(ATCC 17518)；熒光假單胞菌生物變型VI；熒光假單胞菌Pf0-1；熒光假單胞菌Pf-5(ATCC BAA-477)；熒光假單胞菌SBW25；以及熒光假單胞菌亞種細胞外層(NCIMB 10462)。
宿主細胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群19”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群19”是指熒光假單胞菌生物型A的所有菌株的集合。該生物型的特別優選的菌株是熒光假單胞菌菌株MB101(參看授予Wilcox的美國專利5,169,760)，及其衍生物。其優選衍生物的一個例子是熒光假單胞菌菌株MB214，其是通過在MB101染色體asd(天冬氨酸鹽脫氫酶基因)位點插入天然大腸桿菌PlacI-lacI-lacZYA結構(也就是其中刪除了PlacZ)而構成的。
本發明中可以使用的其它熒光假單胞菌菌株包括熒光假單胞菌Migula和熒光假單胞菌Loitokitok，具有下列ATCC名稱[NCIB 8286]；NRRL B-1244；NCIB 8865菌株CO1；NCIB 8866菌株CO2；1291[ATCC17458]；IFO 15837；NCIB 8917；LA；NRRL B-1864；吡咯烷；PW2[ICMP3966；NCPPB 967；NRRL B-899]；13475；NCTC 10038；NRRL B-1603[6；IFO 15840]；52-1C；CCEB 488-A[BU 140]；CCEB 553[1EM 15/47]；IAM1008[AHH-27]；IAM 1055[AHH-23]；1[IFO 15842]；12[ATCC 25323；NIH 11；den D0oren de Jong 216]；18[IFO 15833；WRRL P-7]；93[TR-10]；108[52-22；IFO 15832]；143[IFO 15836；PL]；149[2-40-40；IFO 15838]；182[IFO 3081；PJ 73]；184[IFO 15830]；185[W2L-1]；186[IFO 15829；PJ 79]；187[NCPPB 263]；188[NCPPB 316]；189[PJ227；1208]；191[IFO 15834；PJ 236；22/1]；194[Klinge R-60；PJ 253]；196[PJ288]；197[PJ 290]；198[PJ 302]；201[PJ 368]；202[PJ 372]；203[PJ 376]；204[IFO 15835；PJ 682]；205[PJ 686]；206[PJ 692]；207[PJ 693]；208[PJ722]；212[PJ 832]；215[PJ 849]；216[PJ 885]；267[B-9]；271[B-1612]；401[C71A；IFO 15831；PJ 187]；NRRL B-3178[4；IFO 15841]；KY 8521；3081；30-21；[IFO 3081]；N；PYR；PW；D946-B83[BU 2183；FERM-P3328]；P-2563[FERM-P 2894；IFO 13658]；IAM-1126[43F]；M-1；A506[A5-06]；A505[A5-05-1]；A526[A5-26]；B69；72；NRRL B-4290；PMW6[NCIB 11615]；SC 12936；A1[IFO 15839]；F 1847[CDC-EB]；F1848[CDC 93]；NCIB 10586；P17；F-12；AmMS 257；PRA25；6133D02；6519E01；N1；SC15208；BNL-WVC；NCTC 2583[NCIB 8194]；H13；1013[ATCC 11251；CCEB 295]；IFO 3903；1062；或Pf-5。
在另一具體實施方案種，該方法提供了帶有熒光假單胞菌Sec-系統分泌肽的融合蛋白的表達，該熒光假單胞菌Sec-系統分泌肽選自磷酸鹽結合蛋白(pbp)分泌信號、外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號、Lys-Arg-Orn結合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號。該方法建立在下述理念上——即熒光假單胞菌Sec分泌信號加工分泌蛋白的能力表明這些細胞極其適合制造分泌蛋白。因此，源自這些細胞的信號發送系統在多重表達系統中對于這種分泌是理想的信號發送系統。因此，使用識別出的熒光假單胞菌Sec系統分泌信號表達蛋白質或肽的方法可用于任何給定的宿主系統，包括真核和原核來源的宿主系統。
在該具體實施方案中，宿主細胞可以是能夠產生重組蛋白質或肽的任何細胞，包括上述熒光假單胞菌細胞。最常用于制造重組蛋白或肽的系統包括某些細菌細胞，特別是大腸桿菌，因為它們具有相對廉價的生長要求和潛在的在大批量培養物中制造蛋白質的能力。還使用酵母表達生物相關的蛋白質和肽，特別是用于研究用途。系統包括啤酒酵母(saccaromyces cerevisiae)或pichia pastoris。這些系統已經充分表征，提供了大致可接受的總蛋白表達水平并且相當快速和廉價。還出現了昆蟲細胞表達系統作為以生物活性形式表達重組蛋白的一種備選方案。有時，可以制造后轉譯修飾的正確折疊的蛋白質。已經使用了哺乳動物細胞表達系統，例如中國倉鼠卵巢細胞，以表達重組蛋白。這些表達系統在小規模下通常有效。某些生物制劑可以由蛋白質制成，特別是在動物或人類保健用途中。在另一具體實施方案中，宿主細胞是植物細胞，包括，但不限于煙草細胞、玉米、來自擬南芥屬(arabidopsis)的細胞、馬鈴薯或稻米細胞。在另一具體實施方案中，在該方法中分析和改變多細胞有機體，包括，但不限于轉基因有機體。分析和/或改變多細胞有機體的技術大致基于下述用于改變細胞的技術。
在一個具體實施方案中，宿主細胞可以是原核生物，例如細菌細胞，包括但不限于埃希氏桿菌屬或假單胞菌屬。在例如由EstrellaMoumtain Community College，Arizona，USA的Dr MJ Parabee在URLhttp://www.emc，micropa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BiobookDiversity_2.html上提供的“Biological DiversityBacteria and Archaeans”，ON-LineBiology Book的一章中描述了典型的細菌細胞。在某些具體實施方案中，宿主細胞可以是假單胞菌細胞，并且通常是熒光假單胞菌細胞。在其它具體實施方案中，宿主細胞也可以是大腸桿菌細胞。在另一具體實施方案中，宿主細胞可以是真核細胞，例如昆蟲細胞，包括但不限于來自斜紋夜蛾、Trichoplusia Drosophila或estigmene屬的細胞，或者哺乳動物細胞，包括但不限于鼠科動物細胞、倉鼠細胞、猴子細胞、靈長類細胞或人類細胞。
在一個具體實施方案中，宿主細胞可以是任何細菌分類群的一員。細胞可以是例如任何種類的真細菌的一員。宿主可以是下列分類群的任何一種中的一員酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、產水菌門(Aquificae)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠菌門(Chlorobi)、衣原體(Chlamydiae)、綠彎菌門(Chloroflexi)、產金菌門(Chrysiogenetes)、藍細菌、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、恐球菌(Deinococcus)、網團菌門(Dictyoglomi)、螺旋體門(Fibrobacteres)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、Lentisphaerae、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、浮霉菌門(Planctomycetes)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體(Spirochaetes)、熱脫硫桿菌門(Thermodesulfobacteria)、熱微菌門(Thermomicrobia)、熱袍菌門(Thermotogae)、棲熱菌(Thermus)(Thermales)、或疣微菌門(Verrucomicrobia)。在真細菌宿主細胞的具體實施方案中，該細胞可以是任何種類的真細菌的一員，不包括藍細菌。
細菌宿主還可以是任何種類的變形菌的一員。變形菌宿主細胞可以是α-變形菌門、β-變形菌門、γ-變形菌門、δ-變形菌門、ε-變形菌門。此外，宿主可以是分類群α-變形菌門、β-變形菌門、γ-變形菌門的任何一種中的一員，和任何種類的γ-變形菌門的一員。
在γ-變形菌門宿主的具體實施方案中，宿主可以是分類群氣單胞菌目、交替單胞菌目、腸桿菌目、假單胞菌目或黃單胞菌目；或任何種類的腸桿菌目或假單胞菌目的一員。在一個具體實施方案中，宿主細胞可以是腸桿菌目，宿主細胞是腸桿菌目中的一員，或Erwinia屬、埃希氏桿菌屬或沙雷氏菌屬任何一種中的一員；或埃希氏桿菌屬的一員。在假單胞菌目(pseudomonadales)的宿主細胞的一個具體實施方案中，宿主細胞可以是Pseudomonadaceae屬的一員，甚至是Pseudomonas屬的一員。γ-變形菌門宿主包括大腸桿菌屬的成員和熒光假單胞菌屬的成員。
其它假單胞菌屬有機體也可用。假單胞菌屬和關系很近的物類包括革蘭氏陰性變形菌亞群1，其包括屬于被R.E.Buchanan和N.E.Gibbons(eds.)描述成“Gram-Negative Aerobic Rods and Cocci”，Bergey’sManual of Determinative Bacteriology，pp.217-289(8th ed.，1974)(TheWilliams&Wilkins Co.，Baltimore，MD，USA)(下文中稱“Bergey(1974)”)的科和/或屬的變形菌的集合。表4呈現了有機體的這些科和屬。

“革蘭氏-陰性變形菌亞群1”也包括按照分類學中采用的標準在標題中分類的變形菌。該標題也包括曾經——但已經不再歸入該項中的類別，例如食酸菌屬、短波單胞菌屬、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、氫噬胞菌屬、Oceanimonas、青枯菌屬(Ralstonia)、以及寡養食單胞菌屬，通過重組屬于黃單胞菌屬(以前被稱為種)的有機體而獲得的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)，通過重組屬于Bergy(1974)中所定義的醋酸桿菌屬的有機體而獲得酸單胞菌屬(Acidomonas)。此外，宿主可以包括來自假單胞菌屬、Pseudomonas enalia(ATCC 14393)、黑色腐敗假單胞菌(Pseudomonas nigrifaciens)(ATCC 19375)和Pseudomonasputrefaciens(ATCC 14393)的細胞，它們已經分別重新分類成Alteromonas haloplanktis、Alteromonas nigrifaciens和Alteromonasputrefaciens。類似地，已經分別將食酸假單胞菌屬(ATCC 15668)和睪丸酮假單胞菌屬(ATCC 11996)重新分類成食酸叢毛單胞菌和睪丸酮叢毛單胞菌；并且已經分別將pseudomonas nigrifaciens(ATCC 19375)和pseudomonas piscicida(ATCC 15057)重新分類成Pseudoalteromonasnigrifaciens和Pseudoalteromonas piscicida。“革蘭氏-陰性亞群1”還包括被歸類為屬于下列任何一科的變形菌門假單胞菌科，固氮菌科(現在常稱其異名，假單胞菌科的“固氮菌群”)，根瘤菌科，和甲基單胞菌(現在常稱其異名，“Methylococcaceae”)。因此，除了在本文中其它地方描述的屬，在“革蘭氏-陰性亞群1”內的其它變形菌屬包括1)Azorhizophilus屬的固氮菌類細菌；2)纖維弧菌素、寡源桿菌(Oligella)、和Teredinibacter屬的假單胞菌科細菌；3)Chelatobacter、劍菌屬、Liberibacter(也稱為“Candidatus Liberibacter”)和中華根瘤菌屬的根瘤菌科細菌；以及4)甲基桿菌屬、甲基暖菌屬、甲基微菌屬、甲基八疊球菌屬、和甲基球形菌屬的甲基球菌科細菌。
在另一具體實施方案中，宿主細胞選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群2”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群2”是指下列屬的變形菌(除非另行說明，目錄中所列的、可公開獲得的、括號中所示的其標號菌株全部都標在ATCC上)酸單胞菌屬(2)；醋酸桿菌屬(93)；葡萄糖桿菌屬(37)；Brevundimonas(23)；拜葉林克氏菌屬(Beijerinckia)(13)；德克斯氏菌屬(2)；布魯氏菌(4)；土壤桿菌屬(79)；Chelatobacter(2)；劍菌屬(3)；根瘤菌屬(144)；中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)(24)；Blastomonas(1)；鞘氨醇單胞菌(27)；產堿桿菌(88)；包特氏菌屬(Bordetella)(43)；伯克霍爾德菌(73)；青枯菌屬(Ralstonia)(33)；食酸菌(Acidovorax)(20)；氫噬胞菌屬(9)；動膠菌屬(Zoogloea)(9)；甲基桿菌(2)；甲基暖菌屬(1 at NCIMB)；甲基球菌屬(2)；甲基微菌屬(2)；甲基單胞菌屬(9)；甲基八疊球菌屬(1)；甲基球形菌屬；氮單胞菌屬(9)；Azorhizophilus(5)；固氮菌屬(64)；纖維弧菌屬(3)；寡源桿菌(Oligella)(5)；假單胞菌(1139)；弗朗西斯氏菌屬(4)；黃單胞菌屬(229)；寡養食單胞菌(50)；和Oceanimonas(4)。
“革蘭氏-陰性變形菌亞群2”的示例性宿主細胞類型包括，但不限于，下列細菌(帶有ATCC或括號中所示的示例性菌株的其它標號)甲醇酸單胞菌(ATCC 43581)；紋膜醋酸桿菌(Acetobacter aceti(ATCC15973)；氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)(ATCC 19357)；缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)(ATCC 11568)；印度貝氏固氮菌(ATCC 9039和ATCC 19361)；膠德克斯氏菌(Derxia gummosa)(ATCC 15994)；波狀熱菌(ATCC 23456)，流產布魯氏菌(ATCC23448)；根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(ATCC 23308)；放射土壤桿菌(ATCC 19358)；毛根土壤桿菌(ATCC 11325)；Chelatobacter heintzii(ATCC 29600)；Ensifer adhaerens(ATCC 33212)；豆科植物根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)(ATCC 10004)；費氏中華根瘤菌(ATCC 35423)；Blastomonas natatoria(ATCC 35951)；少動鞘氨醇單胞菌(ATCC 29837)；糞產堿桿菌(Alcaligenes faecalis)(ATCC 8750)；百日咳桿菌(Bordetella pertussis)(ATCC 9797)；洋蔥伯克霍爾德菌(ATCC 25416)；Ralstonia pickettii(ATCC 27511)；敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)(ATCC 11228)；黃色氫噬胞菌屬(ATCC 33667)；分支菌膠團(生枝動膠菌Zoogloea ramigera)(ATCC19544)；Methylobacter luteus(ATCC 49878)；Methylocaldum gracile(NCIMB 11912)；莢膜甲基球菌屬(Methylococcus capsulatus)(ATCC19069)；Methylomicrobium agile(ATCC 35068)；甲烷甲基單胞菌屬(ATCC 35067)；Methylosarcina fibrata(ATCC 700909)；Methylosphaerahansonii(ACAM 549)；敏捷氮單胞菌屬(ATCC 7494)；Azorhizophiluspaspali(ATCC 23833)；褐球固氮菌(ATCC 9043)；Cellvibrio mixtus(UQM 2601)；尿道寡源桿菌(ATCC 17960)；綠膿假單胞菌(ATCC10145)；熒光假單胞菌(ATCC 35858)；土拉熱弗朗西斯氏菌(Francisellatularensis)(ATCC 6223)；嗜麥寡養食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)(ATCC 13637)；野油菜黃單胞菌屬(Xanthomonascampestris)(ATCC 33913)；和Oceanimonas doudoroffii(ATCC 27123)。
在另一具體實施方案中，宿主細胞選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群3”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群3”是指下列屬的變形菌Brevundimonas；土壤桿菌(Agrobacterium)；根瘤菌(Rhizobium)；中華根瘤菌(Sinorhizobium)；Blastomonas；鞘氨醇單胞菌；產堿桿菌屬(Alcaligenes)；伯克霍爾德菌；青枯菌屬(Ralstonia)；食酸菌(Acidovorax)；氫噬胞菌屬；甲基桿菌屬；甲基暖菌屬；甲基球菌屬；甲基微菌屬；甲基單胞菌屬；甲基八疊球菌屬；甲基球形菌屬；氮單胞菌屬；Azorhizophilus；固氮菌(Azotobacter)；纖維弧菌屬；寡源桿菌(Oligella)；假單胞菌；Teredinibacter；弗朗西斯氏菌屬(Francisella)；寡養食單胞菌；黃單胞菌素；和Oceanimonas。
在另一具體實施方案中，宿主細胞選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群4”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群4”是指下列屬的變形菌Brevundimonas；Blastomonas；鞘氨醇單胞菌；伯克霍爾德菌；青枯菌屬(Ralstonia)；食酸菌(Acidovorax)；氫噬胞菌屬；Mehtylobacter；甲基暖菌屬；甲基球菌屬；甲基微菌屬；甲基單胞菌屬；甲基八疊球菌屬；甲基球形菌屬；氮單胞菌屬；Azorhizophilus；固氮菌；纖維弧菌屬；寡源桿菌(Oligella)；假單胞菌；Teredinibacter；弗朗西斯氏菌屬(Francisella)；寡養食單胞菌；黃單胞菌素；和Oceanimonas。
在一個具體實施方案中，宿主細胞選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群5”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群5”是指下列屬的變形菌甲基桿菌屬；甲基暖菌屬；甲基球菌屬；甲基微菌屬；甲基單胞菌屬；甲基八疊球菌屬；甲基球形菌屬；氮單胞菌屬；Azorhizophilus；固氮菌；纖維弧菌屬；寡源桿菌(Oligella)；假單胞菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗朗西斯氏菌屬(Francisella)；寡養食單胞菌；黃單胞菌素；和Oceanimonas。
宿主細胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群6”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群6”是指下列屬的變形菌Brevundimonas；Blastomonas；鞘氨醇單胞菌；伯克霍爾德菌；青枯菌屬(Ralstonia)；食酸菌(Acidovorax)；氫噬胞菌屬；氮單胞菌屬；Azorhizophilus；固氮菌；纖維弧菌屬；寡源桿菌(Oligella)；假單胞菌；Teredinibacter；寡養食單胞菌；黃單胞菌屬；和Oceanimonas。
宿主細胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群7”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群7”是指下列屬的變形菌氮單胞菌屬；Azorhizophilus；固氮菌；纖維弧菌屬；寡源桿菌(Oligella)；假單胞菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；寡養食單胞菌；黃單胞菌屬；和Oceanimonas。
宿主細胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群8”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群8”是指下列屬的變形菌Brevundimonas；Blastomonas；鞘氨醇單胞菌；伯克霍爾德菌；青枯菌屬(Ralstonia)；食酸菌(Acidovorax)；氫噬胞菌屬；假單胞菌；寡養食單胞菌；黃單胞菌屬；和Oceanimonas。
宿主細胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群9”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群9”是指下列屬的變形菌Brevundimonas；伯克霍爾德菌；青枯菌屬(Ralstonia)；食酸菌(Acidovorax)；氫噬胞菌屬；假單胞菌；寡養食單胞菌；和Oceanimonas。
宿主細胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群10”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群10”是指下列屬的變形菌伯克霍爾德菌；青枯菌屬(Ralstonia)；假單胞菌；寡養食單胞菌；和黃單胞菌屬。
宿主細胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群11”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群11”是指下列屬的變形菌假單胞菌屬；寡養單胞菌屬；和黃單胞菌屬。宿主細胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群12”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群12”是指下列屬的變形菌伯克霍爾德菌；青枯菌；假單胞菌。宿主細胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群13”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群13”是指下列屬的變形菌伯克霍爾德菌；青枯菌；假單胞菌屬；和黃單胞菌屬。宿主細胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群14”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群14”是指下列屬的變形菌假單胞菌屬和黃單胞菌屬。宿主細胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群15”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群15”是指假單胞菌屬的變形菌。
宿主細胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群16”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群16”是指下列屬的變形菌(帶有ATCC或括號中所示的示例性菌株的其它標號)Pseudomonas abietaniphila(ATCC 700689)；銅綠假單胞菌(ATCC 10145)；產堿假單胞菌(ATCC 14909)；Pseudomonasanguilliseptica(ATCC 33660)；Pseudomonas citronellolis(ATCC 13674)；Pseudomonas flavescens(ATCC 51555)；門多薩假單胞菌(ATCC25411)；硝基還原假單胞菌(ATCC 33634)；Pseudomonas oleovorans(ATCC 8062)；加產堿假單胞菌(ATCC 17440)；Pseudomonasresinovorans(ATCC 14235)；Pseudomonas straminea(ATCC 33636)；蘑菇假單胞菌(ATCC 25941)；Pseudomonas alcaliphila；Pseudomonasalginovora；Pseudomonas andersonii；Pseudomonas asplenii (ATCC23835)；Pseudomonas azelaica(ATCC 27162)；Pseudomonas beijerinckii(ATCC 19372)；Pseudomonas borealis；Pseudomonas boreopolis(ATCC33662)；Pseudomonas brassicacearum；Pseudomonas butanovora(ATCC43655)；Pseudomonas cellulosa(ATCC 55703)；Pseudomonas aurantiaca(ATCC 33663)；Pseudomonas chlororaphis (ATCC 9446，ATCC13985，ATCC 17418，ATCC 17461)；Pseudomonas fragi(ATCC 4973)；Pseudomonas lundensis(ATCC 49968)；Pseudomonas taetrolens(ATCC4683)；Pseudomonas cissicola(ATCC 33616)；Pseudomonascoronafaciens；Pseudomonas diterpeniphila；Pseudomonas elongata(ATCC10144)；Pseudomonas flectens(ATCC 12775)；PseudomonasazotofOrnans；Pseudomonas brenneri；Pseudomonas cedrella；Pseudomonas corrugata(ATCC 29736)；Pseudomonas extremorientalis；熒光假單胞菌(ATCC 35858)；Pseudomonas gessardii；Pseudomonaslibanensis；Pseudomonas mandelii(ATCC 700871)；Pseudomonasmarginalis(ATCC 10844)；Pseudomonas migulae；Pseudomonasmucidolens(ATCC 4685)；Pseudomonas orientalis；Pseudomonasrhodesiae；Pseudomonas synxantha(ATCC 9890)；Pseudomonas tolaasii(ATCC 33618)；Pseudomonas veronii(ATCC 700474)；Pseudomonasfrederiksbergensis；Pseudomonas geniculata(ATCC 19374)；Pseudomonasgingeri；Pseudomonas graminis；Pseudomonas grimontii；Pseudomonashalodenitrificans；Pseudomonas halophila；Pseudomonas hibiscicola(ATCC19867)；Pseudomonas huttiensis (ATCC 14670)；Pseudomonashydrogenovora；Pseudomonas jessenii(ATCC 700870)；Pseudomonaskilonensis；Pseudomonas lanceolata(ATCC 14669)；Pseudomonas lini；Pseudomonas marginata(ATCC 25417)；Pseudomonas mephitica(ATCC33665)；Pseudomonas denitrificans(ATCC 19244)；Pseudomonaspertucinogena(ATCC 190)；Pseudomonas pictorum(ATCC 23328)；Pseudomonas psychrophila；Pseudomonas fulva(ATCC 31418)；Pseudomonas monteilii(ATCC 700476)；Pseudomonas mosselii；Pseudomonas oryzihabitans(ATCC 43272)；Pseudomonas plecoglossicida(ATCC 700383)；Pseudomonas putida(ATCC 12633)；Pseudomonasreactans；Pseudomonas spinosa(ATCC 14606)；Pseudomonas balearica；Pseudomonas luteola(ATCC 43273)；Pseudomonas stutzeri(ATCC17588)；Pseudomonas amygdali(ATCC 33614)；Pseudomonas avellanae(ATCC 700331)；Pseudomonas caricapapayae(ATCC 33615)；Pseudomonas cichorii(ATCC 10857)；Pseudomonas ficuserectae(ATCC35104)；Pseudomonas fuscovaginae；Pseudomonas meliae(ATCC 33050)；假單胞菌(Pseudomonas syringae)(ATCC 19310)；Pseudomonasviridiflava(ATCC 13223)；Pseudomonas thermocarboxydovorans(ATCC35961)；Pseudomonas thermotolerans；Pseudomonas thivervalensis；Pseudomonas vancouverensis(ATCC 700688)；Pseudomonaswisconsinensis；和Pseudomonas xiamenensis。
宿主細胞可以選自“革蘭氏-陰性變形菌亞群17”。“革蘭氏-陰性變形菌亞群17”是指在本領域中被稱作“熒光假單胞菌屬”的變形菌，包括屬于例如下列假單胞菌屬的變形菌Pseudomonas azotofOrnans；Pseudomonas brenneri；Pseudomonas cedrella；Pseudomonas corrugata；Pseudomonas extremorientalis；熒光假單胞菌；Pseudomonas gessardii；Pseudomonas libanensis；Pseudomonas mandelii；邊緣假單胞菌；Pseudomonas migulae；Pseudomonas mucidolens；Pseudomonas orientalis；Pseudomonas rhodesiae；產黃假單胞菌；Pseudomonas tolaasii；和Pseudomonas veronii。
其它合適的宿主包括在本文獻其它部分中分類的那些，例如革蘭氏(+)變形菌。在一個具體實施方案中，宿主細胞是大腸桿菌。對于大腸桿菌MG1655，已經確立了大腸桿菌的基因組序列(Blattner等，(1997)The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 Science277(5331)1453-74)，且對于大腸桿菌K12(MWG Inc，High Point，NC)，可通過商業途徑獲得DNAmicroarrays。可以在富營養培養基，例如Luria-Bertani(LB)(10克/升胰胨，5克/升NaCl，5克/升酵母提取物)，或確定的基本培養基，例如M9(6克/升Na2HPO4，3克/升KH2PO4，1克/升NH4Cl，0.5克/升NaCl，pH7.4)中用1％葡萄糖之類的合適碳源培養大腸桿菌。常規地，將大腸桿菌的過夜培養物稀釋并在振蕩培養瓶或發酵器中植入新的富營養或標準培養基中并在37℃生長。
宿主還可以來自哺乳動物，例如來自哺乳動物(包括任何人類或非人類哺乳動物)的細胞。哺乳動物可以包括，但不限于靈長動物、猴子、豬科、綿羊科、牛科、嚙齒動物、有蹄動物、豬、swine、羊、羔羊、山羊、家畜、鹿、騾、馬、猴子、猿、狗、貓、鼠和小鼠。
宿主細胞還可以來自植物。對于基因和調節序列的識別，可以選擇任何植物。對于基因和調節序列的分離，合適的植物目標的例子包括，但不限于，苜蓿、蘋果、杏、擬南芥(arabidopsis)、朝鮮薊、芝麻菜、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、豆、甜菜、黑莓、藍莓、花莖甘藍、球芽甘藍、卷心菜、菜籽油、羅馬甜瓜、胡蘿卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、櫻桃、菊苣、芫荽葉、柑橘屬果樹、克萊門氏小柑橘、三葉草、椰子、咖啡、玉米、棉花、蔓越橘、黃瓜、花旗松、茄子、菊苣(endive)、寬葉萵苣、桉樹、茴香、無花果、大蒜、葫蘆、葡萄、葡萄柚、甘露、豆薯、獼猴桃、萵苣、韭菜、檸檬、酸橙、火炬松、亞麻子、芒果、瓜、蘑菇、油桃、堅果、燕麥、油棕、油菜籽、秋葵、橄欖樹、洋蔥、橙、觀賞植物、棕櫚、番木瓜、歐芹、歐洲防風草、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿子、松樹、菠蘿、車前草、李子、石榴、白楊、馬鈴薯、南瓜、溫柏、輻射松、radiscchio、蘿卜、油菜籽、覆盆子、稻米、黑麥、高粱、美國長葉松、大豆、菠菜、南瓜(squash)、草莓、sugarbeet、甘蔗、向日葵、甘薯、蘇合香、柑橘(tangerine)、茶、煙草、番茄、黑小麥、草地、蕪菁甘藍、葡萄樹、西瓜、小麥、山藥和綠皮密生西葫蘆。在一些具體實施方案中，在該方法中可用的植物為擬南芥(Arabidopsis)、玉米、小麥、大豆和棉花。
對于重組蛋白或肽的表達，或對于識別的補充基因的調節，可以使用任何植物啟動子。植物啟動子中包含的元件可以是通常位于轉錄初始位點的大約25至35上游堿基對(5’)之間的TATA框或Goldberg-Hogness框，和位于70和100上游堿基之間的CCAAT框。在植物中，CCAAT框具有與哺乳動物啟動子的功能類似序列不同的一致序列(Messing等(1983)InGenetic Engineering of Plants，Kosuge等，eds.，pp.211-227)。此外，幾乎所有啟動子都在轉錄初始位點的上游包括延伸大約-100bp至-1000bp或更高的附加的上游激活序列或增強子(Benoist and Chambon(1981)Nature 290304-310；Gruss等(1981)Proc.Nat.Acad.Sci.78943-947；和Khoury and Gruss(1983)Cell27313-314)。
蛋白質制造/發酵本發明的方法最適宜提高宿主細胞中重組蛋白質或肽的產量。提高的產量可以是恰當加工過的蛋白質或肽在所得每克蛋白質中或在每克宿主蛋白質中的含量提高。提高的產量還可以是制成的可回收的蛋白質或肽在每克重組蛋白中或在每克宿主細胞蛋白質中的含量提高。提高的產量還可以是提高的總量與提高的恰當加工的、活性或可溶蛋白質含量的任意結合。
重組蛋白的改進表達可以是蛋白質的溶度提高。可以從宿主細胞的細胞質、周質或細胞外培養基中制造并回收重組蛋白或肽。蛋白質或肽可以是不溶或可溶的。蛋白質或肽可以包括一個或多個定向序列以協助提純。
細胞生長可以使用本領域已知的任何轉化方法用載體進行假單胞菌宿主細胞的轉化，并且細菌宿主細胞可以作為完整細胞或作為內在質體(也就是包括胞質體)轉化。示例性的轉化方法包括穿孔法(例如電穿孔)、內在質體融合、細菌接合、和二價陽離子處理，例如氯化鈣處理或CaCl/Mg2+處理，或本領域其它公知的方法。參看，例如，Morrison，J.Bact.，132349-351(1977)；Clark-Curtiss&Curtiss，Methods inEnzymology，101347-362(Wu等，eds，1983)，Sambrok等，MolecularCloning，A Laboratory Manual(第二版，1989)；Kriegler，Gene Transferand ExpressionA Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等，eds，1994)。
此處所用的術語“發酵”既包括使用字面意義的發酵的具體實施情況，又包括使用其它非發酵型培養方式的具體實施情況。發酵可以在任何規模下進行。在一個具體實施方案中，發酵培養基可以選自富營養(rich)培養基、基本培養基和無機鹽培養基；可以使用富營養培養基，但優選避免使用。在另一具體實施方案中，選擇基本培養基或無機鹽培養基。在再一具體實施方案中，選擇基本培養基。在又一具體實施方案中，選擇無機鹽培養基。無機鹽培養基特別優選。
無機鹽培養基包括無機鹽和碳源，例如葡萄糖、蔗糖或甘油。無機鹽培養基的例子包括，例如，M9培養基、假單胞菌培養基(ATCC179)、Davis and Mingioli培養基(參看，BD Davis&ES Mingioli(1950)，在J.Bact.6017-28中)。用于制造無機鹽培養基的無機鹽包括選自例如磷酸鉀、硫酸銨或氯化銨、硫酸鎂或氯化鎂、和微量礦物質(例如氯化鈣、鐵、銅、錳和鋅的硼酸鹽和硫酸鹽)的那些無機鹽。在無機鹽培養基中不包含任何有機氮源，例如胨、胰蛋白胨、氨基酸或酵母提取物。相反，使用無機氮源并且其可以選自例如銨鹽、氨水和氣態氨。優選無機鹽培養基包含葡萄糖作為碳源。與無機鹽培養基相比，基本培養基還可以包含無機鹽和碳源，但是可以補充少量氨基酸、維生素、胨或其它成分，盡管這些只能以非常小的量加入。
在一個具體實施方案中，可以使用下表5所列的組分制備培養基。可以按照下列順序添加組分首先可以將(NH4)HPO4、KH2PO4和檸檬酸溶于大約30升蒸餾水；然后可以加入微量元素的溶液，然后加入防沫劑，例如Ucolub N115。然后，在熱殺菌(例如大約121℃)后，可以加入葡萄糖MgSO4和硫胺素-HCL的無菌溶液。使用氨水實現大約6.8的pH控制。然后加入無菌蒸餾水將初始體積調節至371減甘油原料(123毫升)。這些化學品可購自各個供應商，例如Merck。該培養基可以進行高細胞密度培養(HCDC)以生長假單胞菌屬和相關細菌。HCDC可以作為分批法開始，然后進行兩相進料分批培養。在分批部件中無限生長之后，可以在降低的比生長速率下經過3加倍時間控制生長，其中生物量濃度可以提高數倍。Riesenberg，D.；Schulz，V.；Knorre，W.A.；Pohl，H.D.；Korz，D.；Sanders，E.A.；Ross，A.；Derckwer，W.D.(1991)“Hign cell density cultivation of Escherichia coli at controlledspecific growth rate”J Bviotechnol20(1)17-27描述了這些培養程序的進一步細節。

可以以任何發酵形式培養本發明的表達系統。例如，此處可以使用分批、進料-分批、半連續和連續發酵模式。
本發明的表達系統可用于任何發酵規模(也就是體積)的轉基因表達。因此，可以使用例如微升規模、厘升規模和分升規模發酵體積；可以使用1升規模和更大的發酵體積。在一個具體實施方案中，發酵體積為1升或更高。在另一具體實施方案中，發酵溶劑為5升、10升、15升、20升、25升、50升、75升、100升、200升、500升、1000升、2000升、5000升、10000升或50000升或更高。
在本發明中，在允許宿主細胞存活的溫度范圍內，優選在大約4℃至大約55℃(包括4℃和55℃在內)的溫度，進行轉化的宿主細胞的生長、培養和/或發酵。因此，例如，此處對于本發明的宿主細胞使用的術語“生長”，“培養”和“發酵”本質上是指在大約4℃至大約55℃(包括4℃和55℃在內)的溫度范圍內的“生長”、“培養”和“發酵”。此外，“生長”用于指活性細胞分裂和/或增大的生物狀態，以及代謝維持非分裂和/或非增大細胞的生物狀態，術語“生長”的后一種用法與術語“維持”同義。
細胞密度在表達重組分泌蛋白質中使用熒光假單胞菌的另一優點包括熒光假單胞菌與大腸桿菌或其它細菌表達系統相比以高細胞密度生長的能力。為此，本發明的熒光假單胞菌表達系統可以提供大約20克/升或更高的細胞密度。本發明的熒光假單胞菌表達系統還可以提供至少大約70克/升的細胞密度，其表示成生物量/單位體積，生物量是作為干燥細胞重量測得的。
在一個具體實施方案中，細胞密度為至少20克/升。在另一具體實施方案中，細胞密度為至少25克/升，30克/升，35克/升，40克/升，45克/升，50克/升，60克/升，70克/升，80克/升，90克/升，100克/升，110克/升，120克/升，130克/升，140克/升，或至少150克/升。
在另一具體實施方案中，誘導時的細胞密度為20克/升至150克/升；20克/升至120克/升；20克/升至80克/升；25克/升至80克/升；30克/升至80克/升；35克/升至80克/升；40克/升至80克/升；45克/升至80克/升；50克/升至80克/升；50克/升至75克/升；50克/升至70克/升；40克/升至80克/升。
相關蛋白質或肽的分離通常，該方法與傳統的表達系統相比，提高了表達出的正確或恰當加工的重組蛋白的量。特別地，本發明提高了恰當加工的重組蛋白的量。
在某些具體實施方案中，本發明提供了一種改進宿主細胞中重組蛋白或肽的溶度的方法。此處所用的術語“可溶”是指在生理條件下在緩沖劑中旋轉10-30分鐘時，蛋白質在大約5000至20000×重力的離心作用下不沉淀。可溶蛋白質不構成包含體或其它沉淀物的組成部分。類似地，“不溶”是指在生理條件下在緩沖劑中旋轉10-30分鐘時，蛋白質或肽在大約5000至20000×重力的離心作用下沉淀。不溶蛋白質或肽可以構成包含體或其它沉淀物的組成部分。術語“包含體”包括細胞內包含的任何細胞內物體，在其中隔出蛋白質或肽的聚集體。
本發明還提高了活性重組蛋白或肽的回收率。可以通過任何方便的活體外或活體內檢定法測量識別出的與母體多肽、多肽變體、片段(segment)取代的多肽和/或殘基取代的多肽之間的相互作用，從而測量活性蛋白質含量。因此，可以使用活體外檢定法測定識別出的相關蛋白質和肽之間(例如酶與底物之間、激素與激素受體之間、抗體與抗原之間等)的任何可檢出的相互作用。這種檢測可以包括測量比色變化、放射性變化、溶度變化、分子量變化(通過凝膠電泳和/或凝膠排阻法等測得)。活體內檢定法包括，但不限于，檢測生理效應(例如重量增加、電解質平衡變化、凝血時間變化、血凝塊溶解變化和抗原反應的誘導)的檢定法。通常，可以使用任何活體內檢定法，只要存在可變參數以檢測識別出的多肽與相關多肽之間相互作用的變化。參看，例如，美國專利5,834,250。
為了從周質中釋放重組蛋白，已經使用了包含化學品(例如氯仿)的處理(Ames等(1984)J.Bacteriol.，1601181-1183)、胍-HCl和TritonX-100(Naglak and Wang(1990)Enzyme Microb.Technol.，12603-611)。然而，這些化學品非惰性并且可能對許多重組蛋白產品或隨后的提純程序產生有害影響。還提出了大腸桿菌細胞的甘氨酸處理(其導致外膜的滲透)以釋放周質內含物(Ariga等(1989)J.Ferm.Bioeng.，68243-246)。最廣泛使用的重組蛋白的周質釋放方法是滲壓休克(Nosal and Heppel(1966)J.Biol.Chem.，2413055-3062；Neu andHeppel(1965)J.Biol.Chem.，2403685-3692)、雞蛋清(HEW)-溶菌酶/乙二胺四乙酸(EDTA)處理(Neu and Heppel(1964)J.Biol.Chem.，2393893-3900；Witholt等(1976)Biochim.Biophys.Acta，443534-544；Pierce等(1995)ICheme Research.Event，2995-997)、和結合的HEW-溶菌酶/滲壓休克處理(French等(1996)Enzyme and Microb.Tech.，19332-338)。French法包括細胞在分餾緩沖劑中再懸浮，然后回收周質餾分，其中滲壓休克之后立即進行溶菌酶處理。還論述了重組蛋白，熱紫鏈霉菌α-淀粉酶的過度表達和宿主有機體的生長相對回收率的影響。
通常，這些程序包括在滲透性穩定培養基中的初始分裂(disruption)，然后在非穩定培養基中選擇性釋放。在所述特定程序之間，這些培養基的組成(pH、保護劑)和所用分裂方法(氯仿、HEW-溶菌酶、EDTA、超聲處理)可以改變。Stabel等(1994)VeterinaryMicrobiol.，38307-314論述了使用兩極離子型去垢劑代替EDTA以改變HEW-溶菌酶/EDTA處理，對于使用細胞內分解酶系統分裂大腸桿菌的概述，參看Dabora和Cooney(1990)在Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，卷43，A.Fiechter，ed.(Springer-VerlagBerlin)，pp.11-30中。
從細胞質中以可溶蛋白或折射粒子的形式回收重組蛋白的傳統方法包括通過機械破壞使細菌細胞分解。機械破壞通常包括在液體懸浮液中產生局部空化，用硬珠進行迅速攪動，或細胞懸液的研磨(BacterialCell Surface Technique，Hancock and Poxton(John Wiley&Sons Ltd，1988)，第3章，55頁)。
HEW＝溶菌酶起到生物化學作用以水解細胞壁的肽葡聚糖骨架。該方法最初是Zinder和Arndt(1956)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，42586-590開發出的，其用卵清蛋白(其含有HEW-溶菌酶)處理大腸桿菌以制造之后被稱作內在質球的圓形細胞球。這些結構保留了一些細胞壁組分，但是具有大的暴露出細胞質膜的表面積。美國專利5,169,772公開了一種從細菌中提純肝素酶的方法，包括在滲透穩定的培養基(例如20％蔗糖溶液)中使用例如EDTA、溶菌酶或有機化合物破壞細菌包膜，通過用低離子強度的緩沖劑處理細菌來從破裂細菌的周質空間釋放出非肝素酶類的蛋白質，并且通過用緩沖鹽溶液處理低離子強度洗滌過的細菌來釋放肝素酶類的蛋白質。
可以在多種表達系統上以不同的成功程度使用這些方法的許多不同變體(Joseph-Liazun等，(1990)Gene，86291-295；Carter等(1992)Bio/Technology，10163-167)。提出了誘導重組細胞培養以產生溶菌酶的努力。EP 0 155 189公開了一種誘導重組細胞培養以產生溶菌酶的方法，其通常被認為通過破壞或溶解細胞壁結構來殺滅這些宿主細胞。
美國專利4,595,658公開了一種促進輸送到大腸桿菌周質空間中的蛋白質外化的方法。該方法不需要使用溶菌酶處理、機械研磨或細胞的滲壓休克處理就可以選擇性分離位于周質中的蛋白質。美國專利4,637,980公開了如下制造細菌產品用直接或間接對產品編碼的DNA分子轉化熱敏溶原性細菌，在許可條件下培養轉化體以在細胞內表達基因產品，并通過提高溫度誘發噬菌體編碼功能來使產品外化。Asami等(1997)J.Ferment.and Bioeng.，83511-516公開了通過T4噬菌體傳染進行大腸桿菌細胞的同步破裂，且Tanji等(1998)J.Ferment.andBioeng.，8574-78公開了在T4噬菌體中編碼的溶菌基因的受控表達以產生大腸桿菌細胞的溫和破裂。
在細胞溶菌作用下，染色體組DNA從細胞質滲出到培養基中，并導致流體粘度的明顯提高，這阻礙了離心力場中的固體沉降。在不存在剪切力(例如在機械破壞以分解DNA聚合物的過程中產生的剪切力)，通過粘性流體的較慢的固體沉降速率越慢會在離心過程中導致固體與液體的較差分離。除了機械剪切力，存在使DNA聚合物降解的核酸分解酶。在大腸桿菌中，外源基因endA對通常分泌到周質中并以內切核苷酸方式將DNA裂解成的寡脫氧核苷酸的核酸內切酶編碼(成熟蛋白質的分子量為大約24.5kD)。已經提出，大腸桿菌相對較弱地表達endA(Wackernagel等(1995)Gene 15455-59)、在一個具體實施方案中，不要求附加的二硫鍵助長條件和試劑來從宿主細胞中回收活性可溶形式的含二硫鍵的識別出的多肽。在一個具體實施方案中，轉基因肽、多肽、蛋白質或其片段具有激活態的折疊分子內構造。在一個具體實施方案中，轉基因肽、多肽、蛋白質或片段在激活態下含有至少一個分子內二硫鍵；并且可以含有最多2、4、6、8、10、12、14、16、18或20或更多二硫鍵。
本發明的蛋白質可以通過本領域公知的標準技術分離提純至相當純度，包括但不限于硫酸銨或乙醇沉淀、酸萃取、陰離子或陽離子交換色譜法、磷酸纖維素色譜法、疏水作用色譜法、親和色譜法、鎳色譜法、羥磷灰石色譜法、反相色譜法、植物血凝素色譜法、制備電泳法、去垢劑增溶、用這些物質進行選擇性沉淀作為柱色譜法、免疫純化法和其它方法。例如，具有確定分子粘合性能的蛋白質可以可逆融合配體。使用合適的配體，可以將蛋白質選擇性吸附到提純柱上，然后以相對純凈的形式從柱中釋放出來。然后通過酶活性去除融合蛋白。此外，可以使用免疫親和柱或Ni-NTA柱提純蛋白質。在例如R.Scopes，Protein PurificationPrinciples and Practice，Springer-VerlagN.Y.(1982)；Deutscher，Guide to Protein Purification，Academic Press(1990)；美國專利4,511,503；S.Roe，Protein Purification TechniquesAPractical Approach(Practical Approach Series)，Oxford Press(2001)；D.Bollag等，Protein Methods，Wiley-Lisa，Inc.(1996)；AK Patra等，ProteinExpr Purif，18(2)p/182-92(2000)；和R.Mukhija等，Gene 165(2)p.303-6(1995)中進一步描述了通用技術。還可以參看，例如，Ausubel等(1987和定期增補)；Deutscher(1990)“Guide to Protein Purification，”Methods in Enzymology卷182和該系列的其它卷；Coligan等(1996和定期增補)Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene，NY；和關于蛋白質提純產品引用的制造商文獻，例如Pharmacia，Piscataway，N.J.，或Bio-Rad，Richmond，Calif。結合重組技術可以融合到合適的片段上，例如融合到FLAG序列或可經由蛋白酶可去除序列融合的對等物上。參看，例如，Hochuli(1989)Chemische Industrie 1269-70；Hochuli(1990)“Purification of Recombinant Proteins with Metal ChelateAbsorbent”，在Setlow(ed.)Genetic Engineering，Principle and Methods1287-98，Plenum Press，NY中；和Crowe等(1992)QLAexpressTheHigh Level Expression&Protein Purification System QULAGEN，Inc.，Chatsworth，Calif。
表達蛋白質的檢測是通過本領域已知的方法實現的并且包括，例如，放射性免疫測定、Western印跡技術或免疫沉淀反應。
可以通過許多方法從重組細胞培養物中回收和提純重組制成和表達的酶，例如如果需要，對于最終提純步驟可以使用高效液相色譜法(HPLC)。
在本發明中表達的某些蛋白質可以形成不溶聚集體(“包含體”)。對于從包含體中提純蛋白質，適合使用幾種方案。例如，包含體提純通常包括通過宿主細胞的破裂(例如通過在50mM TRIS/HCL pH 7.5，50mM NaCl，5mM MgCl2，1mM DTT，0.1mM ATP，和1mM PMSF的緩沖劑中培養)來提取、分離和/或提純包含體。通過French Press 2-3次，從而使細胞懸液進行細胞溶解。也可以使用Polytron(BrinkmanInstruments)使細胞懸液均化或在冰上進行聲處理。其它溶解細菌的方法是本領域技術人員顯而易見的(參看，例如上述Sambrook等；上述Ausubel等)。
如果需要，可以使包含體溶解，并且通常將溶解的細胞懸液離心分離以去除不需要的不溶物。可以通過用相容緩沖劑稀釋或滲析來使形成包含體的蛋白質復性(renature)。合適的溶劑包括，但不限于脲(大約4M至大約8M)、甲酰胺(至少大約80％，體積/體積基)，和鹽酸胍(大約4M至大約8M)。盡管鹽酸胍和類似試劑是變性劑，但該變性不是不可逆的，并且在變性劑去除(例如通過滲析)或稀釋時產生復性，從而可以重新形成免疫和/或生物活性的蛋白質。其它合適的緩沖劑是本領域技術人員已知的。
或者，可以從宿主周質中提純重組蛋白質或肽。在宿主細胞溶解后，當將重組蛋白輸出到宿主細胞的周質中時，可以通過冷滲壓休克以及本領域技術人員已知的其它方法分離細菌的周質餾分。為了從周質中分離重組蛋白，例如，可以離心處理細菌細胞以形成丸粒。這些丸粒可以在含有20％蔗糖的緩沖劑中重新懸浮。為了溶解細胞，可以離心處理細菌并將丸粒重新懸浮在冰冷的5mM MgSO4中并在冰浴中保持大約10分鐘。可以離心處理細胞懸液并將上清液潷析并保存。可以通過本領域技術人員公知的標準分離技術從宿主蛋白質中分離上清液中存在的重組蛋白。
初始鹽分分離可以從相關重組蛋白中分離許多不需要的宿主細胞蛋白質(或來自細胞培養基的蛋白質)。一個這樣的例子可以是硫酸銨。硫酸銨通過有效減少蛋白質混合物中水的量來使蛋白質沉淀。蛋白質隨后根據其溶度沉淀。蛋白質越疏水，就越可能在較低的硫酸銨濃度下沉淀。典型的方案包括在蛋白質溶液中加入飽和硫酸銨，從而使所得硫酸銨濃度在20-30％之間。該濃度會使多數疏水蛋白質沉淀。然后棄置沉淀物(除非相關蛋白質是疏水的)并在上清液中加入硫酸銨至已知能使相關蛋白質沉淀的濃度。然后使沉淀物溶于緩沖劑并根據需要通過滲析或透濾法去除過量的鹽。依靠蛋白質溶度進行的其它方法(例如冷乙醇沉淀法)是本領域技術人員公知的，并可用于分餾絡合蛋白質混合物。
可以使用透過不同孔徑大小的膜(例如Amicon或Millipore膜)的超濾利用重組蛋白的分子量將其與具有更大或更小尺寸的蛋白質分離。作為第一步驟，可以透過下述膜超濾蛋白質混合物——該膜的孔徑大小可以截留比相關蛋白質的分子量小的分子量。然后再將超濾的滲余物用下述膜超濾——該膜具有大于相關蛋白質分子量的分子截留。重組蛋白可以透過膜進入濾液。然后如下對該濾液進行色譜分析。
還可以根據尺寸、表面凈電荷、疏水性和對配體的親合力將重組蛋白與其它蛋白質分離。此外，可以將蛋白質的抗體結合到柱基質(column matrices)上并將蛋白質免疫提純。所有這些方法都是本領域公知的。對本領域技術人員顯而易見的是，可以使用來自許多不同制造商(例如Pharmacia Biotech)以任何規模進行色譜技術。
實踐中，通常在培養液中發現導向周質的異質蛋白質(參看歐洲專利EP 0 288 451)，這可能是由于損害或提高了外細胞膜流動性。可以使用各種滲透外細胞膜的機制提高該“被動”分泌的速率大腸桿菌素(Miksch等(1997)Arch.Microbiol.167143-150)；生長速率(Shokri等，(2002)App Miocrobiol Biotechnol 58386-392)；TolIII過度表達(Wan和Baneyx(1998)Protein Expression Purif1413-22)；細菌素釋放蛋白(Hsiung等(1989)Bio/Technology 7267-71)、大腸桿菌素A溶解蛋白(Lloubes等(1993)Biochimie 75451-8)、使周質蛋白滲漏的突變體(Furlong和Sundstrom(1989)Developments in Indus.Microbio.30141-8)；融合partner(Jeong和Lee(2002)Appl.Environ.Microbio.684979-4985)；通過滲壓休克回收(Taguchi等(1990)BiochimicaBiophysica Acta 1049278-85)。將工程蛋白運送到周質空間中，隨后局部定位在培養液中，由此在大腸桿菌中制造恰當折疊的活性蛋白質(Wan和Baneyx(1998)Protein Expression Purif.1413-22；Simmons等(2002)J.Immun.Meth.263133-147；Lundell等(1990)J.Indust.Microbio.5215-27)。
革蘭氏-印跡細菌已經演化出許多用于穿過雙重膜輸出蛋白質的系統(參看圖1)。這些分泌途徑包括，例如用于一步穿過內在質及外膜易位的ABC(I型)路徑、Path/Fla(III型)路徑和Path/Vir(IV型)路徑；用于穿過質膜易位的Sec(II型)、Tat、MscL和Holins路徑；和用于兩步穿過內在質和外膜易位的Sec-加-fimbrial usher孔蛋白(FUP)、Sec-加-自動轉運子(AT)、Sec-加-兩partner分泌(TPS)、Sec-加-主末端分支(MTB)和Tat-加-MTB路徑。并非所有細菌都具有所有這些分泌路徑。
三種蛋白質系統(I、III和IV型)在單個能量結合步驟中同時穿過內膜和外膜分泌蛋白質。四種系統(Sec、Tat、MscL和Holins)僅穿過內膜分泌，另外四個系統(MTB、FUP、AT和TPS)僅穿過外膜分泌。
使用本發明的分泌信號或宿主細胞轉運到周質中的蛋白質還可以在進一步的步驟中主動輸出到細胞外介質中。用于主動轉運的已知機制通常是通過自動轉運子、兩partner分泌系統、主末端分支系統或fimbrial usher孔蛋白。
使用本發明的分泌信號或宿主細胞轉運到周質中的蛋白質還可以在進一步的步驟中主動輸出到細胞外介質中。用于主動轉運的已知機制通常是通過自動轉運子、兩partner分泌系統、主末端分支系統或fimbrial usher孔蛋白。
通過自動轉運子(AT)路徑轉運的蛋白質通常含有N-末端Sec-型信號肽、中央通道區(central passenger domain)和α-區的C-末端250-300氨基酸殘基。不同自動轉運子的α-區高度同源，而通道區在序列和尺寸上明顯不同。通過Sec系統和信號肽的裂解穿過內膜分泌后，α-區的低聚物形成外膜孔蛋白，通過該孔蛋白分泌通道區(Veiga等(2002)EMBO J.，212122-2131)。通道區或者被釋放到環境中，或者殘留在細胞表面上。多數自動轉運子與革蘭氏-陰性病原體的毒性有關。
兩-partner分泌(TPS)系統在功能上與AT系統類似，盡管蛋白質沒有共享序列同源性。TPS系統由兩個通過相鄰基因編碼的含信號肽的蛋白質構成。一個蛋白質含有通道區，另一個含有α-區。兩個蛋白質都通過Sec系統分泌到周質中，并且帶有通道區的蛋白質進一步通過由帶有α-區的蛋白質形成的外膜孔輸出(Jacob-Dubuisson等(2001)Mal Microbiol.40306-13)。TPS系統的多數底物蛋白是來自1651至5640氨基酸的大蛋白質。盡管它們與N-末端250殘基(其是轉運子的導向序列)極其相似，但它們的C-末端序列非常不同。
主末端分支(MTB)是使已經折疊的蛋白質從周質轉譯到細胞外介質中的大復合物。該復合物包含至少10個蛋白質組分，其中一些與4型菌毛生源系統共享序列同源性(Pugsley(1993)Microbiol.Rev.5750-108)。編碼功能MTB系統的基因通常在基因組中形成聚簇。尚未充分理解MTB作用下的蛋白質分泌的導向信號和分子機制。
FUP系統是革蘭氏-陰性變形菌和藍細菌中許多纖毛(菌毛)的生物形成原因。為每一傘毛的結構蛋白編碼的操縱子也為傘毛類周質伴侶蛋白和傘毛類外膜usher蛋白編碼。所有這些蛋白質都可以用Sec-型信號肽合成為前體蛋白。在通過Sec系統穿過內膜轉移后，將菌毛亞基結合到伴侶蛋白上，這防止菌毛在周質中的自組裝。伴侶蛋白與usher蛋白之間的相互作用釋放出蛋白質亞基，其隨后相互作用并通過usher蛋白穿過外膜分泌。
復性和再折疊可以將不溶蛋白復性或再折疊以產生二級和三級蛋白質構象。可以在完成重組產品的構造時根據需要使用蛋白質再折疊步驟。可以使用本領域已知的促進蛋白質離解/結合的試劑實現再折疊和復性。例如，可以用二硫蘇糖醇培養蛋白質，然后用氧化谷胱甘肽二鈉鹽培養，然后用含有脲之類的再折疊劑的緩沖劑培養。
還可以如下將重組蛋白復性例如用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或50mM乙酸鈉pH 6緩沖劑加上200mM NaCl將其滲析。或者，使用含有蛋白酶抑制劑的在500mM NaCl，20％甘油，20mM Tris/HCl pH7.4中的直線6M-1M脲梯度溶液將蛋白質固定在柱(例如Ni NTA柱)上，與此同時將蛋白質再折疊。復性可以進行1.5小時或更久。復性之后，加入250mM咪唑來洗脫蛋白質。通過用PBS或50mM乙酸鈉pH6緩沖劑加上200mM NaCl進行的最終滲析步驟去除咪唑。將提純的蛋白質儲存在4℃下或冰凍在-80℃下。
其它方法包括，例如，MH Lee等，Protein Expr.Purif.，25(1)p.166-73(2002)，W.K.Cho等，J.Biotechnology，77(2-3)p 169-78(2000)，Ausubel等(1987和定期增補)，Deutscher(1990)“Guide to ProteinPurification，”Methods in Enzymology卷182和該系列的其它卷；Coligan等(1996和定期增補)Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene，NY，S.Roe，Protein Purification TechniquesA Practical Approach(Practical Approach Series)，Oxford Press(2001)；D.Bollag等，ProteinMethods，Wiley-Lisa，Inc.(1996)中描述的那些。
活性蛋白或肽分析活性蛋白可以具有作為序列來源的天然蛋白質或肽的至少20％，30％或40％，且優選至少50％，60％或70％，且最優選至少80％，90％或95％的比活性。此外，底物特異性(Kcat/Km)任選大致類似于天然蛋白質或肽。通常，Kcat/Km是天然蛋白或肽的至少30％，40％或50％；并優選至少60％，70％，80％或90％。蛋白質和肽活性以及底物特異性(Kcat/Km)的檢定和定量測量方法是本領域技術人員公知的。
按照本發明制成的重組蛋白或肽的活性可以通過本領域已知的任何蛋白質特定傳統或標準活體外或活體內檢定法測量。可以將假單胞菌分泌成的重組蛋白或肽的活性與相應原始蛋白質的活性進行比較以測定重組蛋白是否表現出與通常在相同或類似的生理條件下在原始蛋白或肽中觀察到的活性大致類似或相當的活性。
可以將重組蛋白的活性與之前確立的天然蛋白質或肽的標準活性進行比較。或者，可以在與天然蛋白質或肽的同時或大致同時的對比檢定法中測定重組蛋白質或肽的活性。例如，可以使用活體外檢定法測定重組蛋白質或肽與目標之間(例如表達酶與底物之間、表達激素與激素受體之間、表達抗體與抗原之間等)的任何可檢出的相互作用。這種檢測可以包括測量比色變化、增殖變化、細胞死亡、細胞排斥、放射性變化、溶度變化、分子量變化(通過凝膠電泳和/或凝膠排阻法等測得)、磷酸化能力，抗體特異性檢定法(例如ELISA檢定法)等等。此外，活體內檢定法包括，但不限于，與天然蛋白質或肽的生理效應比較起來檢測假單胞菌制成的蛋白質或肽的生理效應(例如重量增加、電解質平衡變化、凝血時間變化、血凝塊溶解變化和抗原反應的誘導)的檢定法。通常，可以使用任何可與天然蛋白質或肽進行對比分析的活體外或活體內檢定法來測定假單胞菌制成的重組蛋白或肽的活性，只要這種活性是可檢定的。或者，可以檢定本發明中制成的蛋白質或肽的刺激或抑制蛋白質或肽與下述分子之間的相互作用的能力——該分子通常會與蛋白質或肽相互作用，例如，通常與原始蛋白質相互作用的信號路徑的底物或組分。這些檢定法通常包括在允許蛋白質或肽與目標分子相互作用的條件下將蛋白質與底物分子結合的步驟，并且檢測出與蛋白質和目標分子相互作用的生物化學后果。
在下列文獻中描述了可用于測定蛋白質或肽活性的檢定法Ralph，P.J.，等(1984)J.Immunol.1321858或Saiki等(1981)J.Immunol.1271044，Steward，W.B.II(1980)The Interferon Systerms.Springer-Verlag，Vienna and New York，Broxmeyer，H.E.，等(1982)Blood 60595，“Molecular CloningA Laboratory Manual”，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis eds，1989，以及“Methods in EnzymologyGuide to Molecular Cloning Techniques”，Academic Press，Berger，S.L.和A.R.Kimmel eds.，1987，AK Patra等，Protein Expr Purif，18(2)p/182-92(2000)，Kodama等，J.Biochem.991465-1472(1986)；Stewart等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA905209-5213(1993)；(Lombillo等，J.Cell Biol.128107-115(1995)；(Vale等，Cell 4239-50(1985))相關蛋白質宿主細胞可以設計成表達重組蛋白質或肽。這些可以具有任何類型和任何尺寸。然而，在某些具體實施方案中，重組蛋白或肽是治療上有效的蛋白質或肽。在一些具體實施方案中，蛋白質可以是哺乳動物蛋白質，例如人類蛋白質，并且可以是例如，生長因子、細胞因子、趨化因子或血蛋白。重組蛋白或肽可以按照類似方法加工成天然蛋白或肽。在某些具體實施方案中，蛋白質或肽在編碼序列中不包括分泌信號。在某些具體實施方案中，重組蛋白或肽在尺寸上低于100kD，低于50kD，或低于30kD。在某些具體實施方案中，重組蛋白或肽是至少5，10，15，20，30，40，50或100個氨基酸的肽。
可以廣泛地公開獲得分子遺傳學和遺傳工程技術所需的詳盡的序號信息。哺乳動物以及人類的完整核苷酸序列、基因、cDNA序列、氨基酸序列和基因組的獲得方法可獲自GenBank，URL地址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez。附加信息還可獲自GeneCards，來自WeizmannInstitute of Science Genome and BioinfOrnatics(http://bioinfOrnatics.weizmann.ac.il/cards/)的關于基因及其產品以及生物醫學應用的電子百科全書集成信息，核苷酸序列信息還可獲自EMBL核苷酸序列數據庫(http://www.ebi.ac.uk/embl/)或DNA數據庫或Japan(DDBJ，http://www.ddbj.nig.ac.jp/)；氨基酸序列的信息的其它站點包括Georgetown的蛋白質信息資源網站(http://www-nbrf.georgetown.edu/pir/)和Swiss-Prot(http://au.expasy.org/sprot/sprot-top.html)。
可以在本發明中表達的蛋白質的例子包括如下分子，例如腎素、生長激素，包括人類生長激素；牛科生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激索；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；血栓形成素；促卵胞成熟激素；降血鈣素；促黃體生成激素；胰高血糖素；凝血因子，例如第VIIIC因子、克雷斯馬斯因子(factor IX)、組織因子、和von Willebrands因子；抗凝血因子，例如蛋白質C；atrial naturietic因子；肺表面活性物質；纖溶酶原激活物，例如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA)的；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β；腦啡肽酶；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；米勒管抑制物質(mullerian-inhibitingsubstance)；松弛素A-鏈；松弛素B-鏈；prorelaxin；鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白質，例如β-內酰胺酶；脫氧核糖核酸酶；抑制素；苯丙酸諾龍；血管內皮細胞生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；整聯蛋白；蛋白A或D；類風濕因子；神經營養因子，例如腦源性神經營養因子(BDNF)、神經營養素-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、或諸如NCF-β的神經生長因子；心臟營養素(心臟肥大因子)，例如心臟營養素-1(CT-1)；血小板源生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子，例如aFGF和bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉化生長因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1；TGF-β2；TGF-β3；TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦ICF-1)、胰島素樣生長因子；I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-1)，胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白質，例如CD-3、CD-4、CD-8、CD-19；促紅細胞生成素；osteoinductive factors；免疫毒素；骨形態生成蛋白(BMP)；干擾素，例如干擾素-α、-β、和-γ；菌落刺激因子(CSFs)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白細胞介素(ILs)，例如IL-1至IL-10；抗-HER-2抗體；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白質；促衰變因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的一部分；轉運蛋白；homing受體；粘附分子(addressins)；調節蛋白；抗體；和上列多肽的任一種的片段。
在某些具體實施方案中，蛋白質或肽可以選自IL-1、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-12elasti、IL-13、IL-15、、IL-16、IL-18、IL-18BPa、IL-23、IL-24、VIP、促紅細胞生成素、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、血小板源生長因子(PDGF)、MSF、FLT-3配體、BGF、成纖維細胞生長因子(FGF；例如，αFGF(FGF-1)、βFGF(FGF-2)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6或FGF-7)、胰島素樣生長因子(例如，IGF-1、IGF-2)；腫瘤壞死因子(例如，TNF、淋巴細胞毒素)、神經生長因子(例如，NGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)；干擾素(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-γ)；白血病抑制因子(LIF)；睫狀神經營養因子(CNTF)；制瘤素M；干細胞因子(SCF)；轉化生長因子(例如，TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)；TNF總科(例如，LIGHT/TNFSF14、STALL-1/TNFSF13B(BLy5、BAFF、THANK)、TNFα/TNFSF2和TWEAK/INFSF12)；或趨化激素(chemokines)(BCA-1/BLC-1、BRAK/Kec、CXCL16、CXCR3、ENA-78/LIXEotaxin-2/MPIF-2、Exodus-2/SLC、Fractalkine/Neurotactin、GROα/MGSA、HCC-1、I-TAC、Lymphotactin/ATAC/SCM、MCP-1/MCAF、MCP-3、MCP-4、MDC/STCP-1/ABCD-1、MIP-1□、MIP-1□、MIP-2□/GRO□、MIP-3□/Exodus/LARC、MIP-3/Exodus-3/ELC、MIP-4/PARC/DC-CK1、PF-4、RANTES、SDF1、TARC、或TECK)。
在本發明的一個具體實施方案中，提供了通過假單胞菌屬宿主細胞制造重組多亞基蛋白質。可表達的多亞基蛋白質包括同數和異數(homomeric和heteromeric)蛋白質。多亞基蛋白質可以包括兩個或多個可以相同或不同的亞基。例如，蛋白質可以是含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多亞基的同數蛋白質。蛋白質還可以是含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多亞基的異數蛋白質。示例性的多亞基蛋白質包括包括離子通道受體的受體；包括軟骨素的細胞外基質蛋白質；膠原；包括MHC蛋白質、全鏈抗體和抗體片段的免疫調節劑；包括RNA聚合酶、DNA聚合酶的酶；和膜蛋白質。
在本發明的一個具體實施方案中，提供了通過宿主細胞制造血蛋白。該具體實施方案中表達的血蛋白包括，但不限于主要在哺乳動物的血液中發現的載體蛋白，例如白蛋白(包括人血清蛋白和牛白蛋白)、轉鐵蛋白、重組轉運半分子(transferrin half-molecules)、結合珠蛋白、纖維蛋白原和其它抗血友病因子、補體成分、免疫球蛋白、酶抑制劑、諸如血管緊張素和血管舒緩激肽的物質的前體、胰島素、內皮縮血管肽、和球蛋白(包括α、β、γ-球蛋白)，以及其它類型的prote ins、肽及其片段。已經提出了許多血蛋白的氨基酸序列(參看，S.S.Baldwin(1993)Comp.Biochem Physiol.106b203-218)，包括人類血清白蛋白的氨基酸序列(Lawn，L.M.，等(1981)Nucleic Acids Research，96103-6114)和人類血清血蛋白轉鐵蛋白的氨基序列(Yang，F.等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 812752-2756)。
在本發明的一個具體實施方案中，提供了通過熒光假單胞菌屬的宿主細胞制造重組酶或輔因子。在該具體實施方案中表達的酶和輔因子包括但不限于醛縮酶、胺氧化酶、氨基酸氧化酶、天門冬氨酸酶、B12依賴酶、羧肽酶、carboxyesterase、carboxylyases、chemotrypsin、CoA所需酶、氰醇合成酶、cystathione synthases、脫羧酶、脫氫酶、醇脫氫酶、脫水酶、心肌黃酶、加雙氧酶、enoate reductases、epoxidehydrases、fumerases、半乳糖氧化酶、葡萄糖異構酶、葡糖氧化酶、glycosyltrasferases、甲基轉移酶、腈水化酶、核苷磷酸化酶、氧化還原酶、oxynitilases、肽酶、glycosyltrasferase、過氧化物酶、稠合到具有治療活性的多肽上的酶、組織纖溶酶原激活物、蛇毒凝血酶、鏈激酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶；脫氧核糖核酸酶、氨基酸水解酶(例如，天門冬酰胺酶、氨基水解酶)；羧肽酶；蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、膠原酶；神經氨酸酶；乳糖酶、麥芽糖酶、蔗糖酶、和阿拉伯呋喃糖酶。
在本發明的一個具體實施方案中，提供了通過熒光假單胞菌屬的宿主細胞制造重組單鏈、Fab片段和/或全鏈抗體或它們的片段或部分。單鏈抗體可以包括在穩定折疊的多肽單鏈上的抗體的抗原結合區域。Fab片段可以是一段特定的抗體。Fab片段可以含有抗原結合位點。Fab片段可以含有2條鏈輕鏈和重鏈片段。這些片段可以通過連接鍵或二硫鍵連接。
重組蛋白或肽的編碼序列可以是目標多肽的內在編碼序列(如果可以得到的話)，但是更優選是經過選擇、改進或最優化以用于宿主細胞的選定表達的編碼序列例如通過合成基因以反應假單胞菌類型(例如熒光假單胞菌)的密碼子使用偏性。在一個或多個載體內構造所得基因，或將所得基因插入一個或多個載體內，然后將載體轉化成表達宿主細胞。被稱作以“可表達形式”提供的核酸或多核苷酸是指含有至少一個可通過所選細菌表達宿主細胞表達的基因的核酸或多核苷酸。
在某些具體實施方案中，相關蛋白質是天然蛋白質(例如天然哺乳動物或人類蛋白質)，或與其基本同源。在這些具體實施方案中，蛋白質未發現具有串聯體(concatameric)形式，而是僅連接到分泌信號上并任選連接到用于提純和/或識別的標記序列上。
在其它具體實施方案中，相關蛋白質是在大約20至大約42℃具有活性的蛋白質。在一個具體實施方案中，蛋白質在生理溫度具有活性并且在加熱至高溫或極端溫度(例如超過65℃)時失活。
在其它具體實施方案中，相關蛋白質是在大約20至大約42℃具有活性和/或在加熱至高溫或極端溫度(例如超過65℃)時失活的蛋白質；其是天然蛋白質(例如天然哺乳動物或人類蛋白質)，或與其基本同源，并且不以串聯體形式從核酸中表達；而且啟動子不是熒光假單胞菌中的內在啟動子，而是來自另一有機體，例如大腸桿菌。
在其它具體實施方案中，制成的蛋白質還包括附加的導向序列，例如將蛋白質導向細胞外介質的序列。在一個具體實施方案中，附加的導向序列可連接到蛋白質的羧基末端上。在另一具體實施方案中，蛋白質包括自動轉運子的分泌信號、兩partner分泌系統、主末端分支系統或fimbrial usher孔蛋白。
實施例實施例1.Sec-分泌信號肽的表征通過大腸桿菌堿性磷酸酶(phoA)編碼序列-染色體組DNA融合體的形成和表達來表征熒光假單胞菌Sec-系統分泌信號肽。進一步表征六個表達的融合體的特性。
用SPScan程序(Menne等(2000)BioinfOrnatics 16741-742)與來自其它假單胞菌的同源蛋白進行比較，從而推導出被確認為PhoA融合體的分泌基因的信號序列的裂解位點。通過與信號肽酶II基序進行比較推導出putative脂蛋白的裂解位點；信號肽II特定裂解脂蛋白的信號序列。使用SignalP(用于分析putative信號肽的軟件程序；獲自Centerfor Biological Sequence Analysis of the Technical University of Denmark，在http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。還參看H Nielson等(1997)Protein Engineering 101-6。在有些情況下，使用增補來源進一步表征信號肽的特性。在pbp的情況下，通過加工過的融合蛋白的MALDI-TOF分析(參看下面的實施例5)獲得裂解信息。該信息列在表6中。

PhoA融合蛋白的Western分析為了分析是否制成了融合蛋白，在培養物(其通過離心分離到全細胞餾分(細胞質和周質)和無細胞培養液餾分中)上用抗體對堿性磷酸酶進行Western分析。在五個菌株(對其測定插入位點)中，四個信號序列(Putative天青蛋白、Putative磷酸鹽結合蛋白、Putative周質脂蛋白B、Putative Fe(III)結合蛋白)產生了具有預定尺寸的融合蛋白，一個(Putative oprE蛋白)產生了比預定尺寸小大約40kD的蛋白質，一個(Putative Lys-Arg-Orn結合蛋白)產生了比預定尺寸小大約20kD的蛋白質。Western分析和PhoA活性分析表明信號序列將異質PhoA蛋白質輸送到熒光假單胞菌的周質中。
實施例2.pbp-scFv融合體的構造、表達和表征將磷酸鹽結合蛋白(也就是包括Met1)的Putative 24氨基酸信號序列融合到gal2 scFv基因(gal2)上以產生SEQ ID Nos15和16(見表)并測試分泌到周質中和/或培養上清液中的情況。如下所述構造融合體。
磷酸鹽結合蛋白分泌前導-gal2-His標記融合體


磷酸鹽結合蛋白分泌前導-gal2-His標記融合體核酸序列(SEQ ID NO15)氨基酸序列(SEQ ID NO16)pbp-scFv載體的構造通過重疊延伸法(SOE)PCR使用拼接將熒光假單胞菌oprF和磷酸鹽結合蛋白(pbp)putative信號序列在+2位置融合到部分Gal2編碼序列上。使用熒光假單胞菌pbp分泌信號肽作模板，使用引物sig_pbp_for(gctctagagg aggtaactta tgaaactgaa acg；SEQID NO17)和pbp_gal2SO_rev(ctgcacctgg gcggccaccg cgtt；SEQ IDNO18)(包括pbp_gal2SOE_for(aacgcggtgg ccgcccaggt gcag；SEQ IDNO19))進行PCR。這產生含有pbp信號肽編碼序列和gal2單鏈抗體(scAb或scFv)的5’末端的編碼序列的寡核苷酸片段。
還擴增gal2ORF。使用引物pbp_gal2SOE_for(SEQ ID NO19)和scFv2rev(acgcgtcgac ttattaatgg tgatgatggt gatgtgcggc cgcacgtttg atc；SEQID NO20)并使用gal2-編碼多核苷酸作模板進行PCR。這產生含有pbp信號肽的3’末端編碼序列和gal2的開放讀碼框(ORF)的多核苷酸片段。
將信號序列的指定-1氨基酸(提出的裂解位點前面的最后一個氨基酸)融合到gal2scFv(Ala)的+2氨基酸上。該融合體與磷酸鹽結合蛋白信號肽的匹配之處在于緊隨重組信號肽酶裂解位點的氨基酸(+1)是Ala，正如活性pbp蛋白中相應的氨基酸殘基那樣。
在Ptac啟動子的控制下將所得融合體克隆到熒光假單胞菌載體Pmyc1803中以產生質粒Pdow1123(pbp:gal2)。將質粒轉化成攜帶質粒pCN51-lacI(包括lac阻遏物)的熒光假單胞菌菌株MB101，產生菌株DC217。還將質粒轉化成大腸桿菌菌株JM109。
用于在大腸桿菌中分泌的ScFv無性系的構造將gal2 ORF結合到pET2b(+)上，從而使pelB信號序列在Gal2的+2位置融合到丙氨酸殘基上。將正確的無性系轉化成BL21(DE3)Gold(stratagene)以用于表達分析。
比較熒光假單胞菌與大腸桿菌中的Gal2 scFv分泌如上所述，將用于大腸桿菌表達/分泌的pelB分泌信號與兩個putative熒光假單胞菌分泌信號一起在+2位置融合到gal2開放讀碼框上，也就是去除融合體中的Gal2的N-末端蛋氨酸并替換成指定的信號序列(圖2)。測試外膜孔蛋白F(oprF)和磷酸鹽結合蛋白(pbp)信號序列將異質蛋白分泌到周質中和/或培養基中的能力。據發現，在20升規模的熒光假單胞菌中表達和加工了OprF和pbp前導序列構造。這兩種構造都產生大約9-10克/升蛋白質，它們大部分被發現在不溶餾分中(圖3B)。大約50％的oprF信號序列被加工，而大約100％的pbp信號被加工(圖3A和3B)。
此外，來自pbp:gal2融合體的少量(＜1％)加工過的Gal2表現出已經分泌到培養基中(圖3B)。與oprF信號序列類似，pelB信號序列表現出確實被加工過(圖4)。在大腸桿菌中表達的pelB-gal2融合體產生大約1.6克/升的蛋白質，其大約54％被加工過的。其中，11％被發現在可溶餾分中。盡管與熒光假單胞菌pbp:gal2構造相比，對于大腸桿菌構造，蛋白質總量中有更大的比率被發現在可溶餾分中，但是在熒光假單胞菌中加工過的蛋白質的總收率明顯更高。

ScFv活性的分析進行酶聯免疫測定法(ELISA)以測量純化Gal13和Gal2抗-β-半乳糖苷酶scFv的活性。在涂有β-半乳糖苷酶的微板孔中加入不同量的純化scFv。使用與堿性磷酸酶共軛的抗-His標記抗體和抗-mouse抗體檢測結合抗體(圖5A)。使用抗β-半乳糖苷酶的兔子多克隆抗體作為正對照物。如圖6B所示，從小規模表達實驗中提純的Gal2抗體表現出明顯的活性。這些結果表明來自包含體(Gal2)的分離的可復性活性抗體。
實施例3比較大腸桿菌與熒光假單胞菌中的抗-地高辛scFv的分泌將抗-地高辛scFv克隆到pET27d載體中以在大腸桿菌中進行分泌表達。將抗-地高辛scFv轉譯融合到pelB前導物(leader)上，產生pDOW1153。在熒光假單胞菌中，將抗-地高辛scFv轉譯融合到磷酸鹽結合蛋白分泌信號序列上，產生pDOW1142。SDS-PAGE(圖6)和Western分析(圖7)表明在熒光假單胞菌和大腸桿菌中表達的抗-地高辛scFv都不可溶。大腸桿菌無性系在3小時誘導后產生60微克/毫升的蛋白質，且pelB分泌前導物沒有表現出被加工。熒光假單胞菌無性系pDOW1142產生比pDOW1153多大約20倍的蛋白質，其中表達的蛋白質為1.23毫克/毫升(通過與BSA標準比較時SDS-PAGE的光密度分析法測得)(圖8)。通過光密度分析法以20升規模測定時，攜帶pDOW1142的熒光假單胞菌進行的抗-地黃辛scFv表達為大約15-20克/升(數據未顯示)。如在振蕩培養瓶規模下觀察的那樣，所有蛋白質似乎都被恰當地加工。
純化抗-地高辛scFv活性的分析。從熒光假單胞菌和大腸桿菌結構中提純抗-地高辛scFv。使用酶聯免疫吸附檢定法(ELISA)評估活性。如圖9所示，從攜帶分泌結構pDOW1142的熒光假單胞菌中分離出的抗-地高辛scFv被發現如多克隆抗體對照物一樣是活性的。然而，大腸桿菌細胞質結構pDOW1152被發現含有活性抗-地高辛scFv，而從攜帶分泌的抗-地高辛scFv結構pDOW1153的大腸桿菌中提純的蛋白質被發現無活性并且大量未被加工(圖10)。
這些結果表明，熒光假單胞菌產生比大腸桿菌分泌的結構多19倍的蛋白質。此外，在大腸桿菌結構中使用的pelB分泌信號不如在熒光假單胞菌中的磷酸鹽結合蛋白分泌信號那樣被有效地加工。蛋白質在熒光假單胞菌和大腸桿菌中都幾乎完全不溶。然而，純化的熒光假單胞菌分泌的蛋白質與純化的大腸桿菌胞漿蛋白質一起被發現是活性的。
實施例4.用于pbp:gal2的表征的MALDI-TOF分析使用基質輔助激光解吸/電離飛行時間(MALDI-TOF)質譜分析來表征分泌的成熟蛋白質pbp:gal2的氨基酸組成以證實已經在pbp信號肽的putative信號肽酶裂解位點產生putative信號肽酶裂解。對于該分析，對于pbp:gal2獲得肽質量指紋譜，并且將這些數據與推導氨基酸序列的理論肽質量指紋譜進行比較。為了產生這些肽質量指紋譜，用endoproteinase Lys-C消化蛋白質，并且測定所得肽的質量。通過源后衰減(MALDI-PSD)測定N-末端肽序列。沒有觀察到與未加工的蛋白質對應的肽質量。結果與預期的相同(數據未顯示)。
實施例5pbp-hGH融合體的構造、表達和表征將熒光假單胞菌磷酸鹽結合蛋白分泌前導物融合到人類生長激素(hGH)基因的成熟區域的N-末端并測試其分泌到周質中的情況。使用sig_pbp_for(SEQ ID NO17)和pbp_hgh(gggaatggttgggaaggcca ccgcgttggc；SEQ ID NO21)引物，從作為模板的熒光假單胞菌pbp信號序列的無性系中PCR擴增pbp信號序列編碼區，然后進行凝膠提純。這產生含有pbp信號肽編碼序列和hGH的成熟區域的5’末端的編碼序列的寡核苷酸片段。
使用引物ELVIfor(agagaactag taaaaaggag aaatccatgg ctacaggctcccggacgtcc；SEQ ID NO22)和ELVIrev(agagactcga gtcattagaa gccacagctgccctccac；SEQ ID NO23)，從人類垂體cDNA庫(Clontech，Palo AltoCA)中PCR-擴增人類生長激素的編碼cDNA，它們被設計成僅擴增hGH的成熟區域，并且克隆到pMYC1803/SpeI XhoI中，形成pDOW2400。使用引物pbp_hgh_revcomp(gccaacgcgg tggccttcccaaccattccc；SEQ ID NO24)和hgh_rev(agagactcga gtcattagaa gccacagctgccctccacag agcggcac；SEQ ID NO25)從pDOW2400中擴增成熟的hGH基因，然后用Strataprep柱(Stratagene)提純以去除引物和其它反應組分。為了制造pbp-hGH融合體的編碼多核苷酸，將兩個PCR反應結合并再用sig_pbp_for(SEQ ID NO17)和hgh_rev(SEQ ID NO25)擴增以連接這兩段。將該片段結合到pDOW1269上以形成pDOW1323-10，使pbp-hGH處于tac啟動子的控制下。將ligation mix轉化到熒光假單胞菌中。該融合體的DNA和氨基酸序列分別表現在(SEQ ID NO26)和(SEQ ID NO27)中。
磷酸鹽結合蛋白分泌前導物-人類生長激素融合核酸序列(SEQID NO26)

磷酸鹽結合蛋白分泌前導物-人類生長激素融合核酸序列(SEQID NO26)氨基酸序列(SEQ ID NO27)首先以振蕩培養瓶規模測試所得菌株。通過SDS-PAGE檢測加工過和未加工的蛋白質的預計尺寸(分別是22.2kDa和24.5kDa)誘導帶。大約一半的蛋白質被加工過(表明定向到周質中)，在加工過的蛋白中，大約一半在可溶餾分中，一半在不溶餾分中(數據未顯示)。表達研究的規模最高為20升生物反應器。Coomassie-染色的SDS-PAGE凝膠的光密度分析發表明所得hGH總量的18％被加工過并可溶。菌株產生3.2克/升所有形式的hGH；加工過和可溶的hGH為0.6克/升。
實施例6熒光假單胞菌中的Skp伴侶蛋白表達在熒光假單胞菌中表達具有內在前導序列的大腸桿菌Skp蛋白質(圖10)。在生長24小時后，加入5mM安息香酸鹽誘導Skp(在PCT公開WO 04/005221中描述了安息香酸鹽啟動子)。在誘導12小時后，通過在20,000克的離心處理將誘導和未誘導蛋白質的樣品分離入可溶和不溶餾分。使用MES緩沖劑在4-12％NuPAGE上分離蛋白質。僅在誘導的可溶樣品中在大約17kDa的分子量觀察到大腸桿菌Skp蛋白質(由圖10中的箭頭表示)。
通過MALDI源后衰減(PSD)將蛋白質識別為Skp。制備切離17kDa蛋白質帶的胰凝乳蛋白酶消化液。觀察兩個胰凝乳蛋白酶片段，它們與由Skp的理論消化液預測的尺寸匹配(表8)進一步通過MALDI-PSD分析具有1378.7m/z的離子質量的putative N-末端肽，其顯示出ADKIAIVNMGSLF的預計N-末端氨基酸序列，表明已經按照預期去除了前導序列，相當于Ala20與Ala21之間的加工位點(圖11)。

*通過MALDI-PSD進一步分析該片段。
實施例7在大腸桿菌中的熒光假單胞菌信號序列表達來自熒光假單胞菌的信號序列在大腸桿菌中起作用，可以使pbp:Gal2蛋白質被加工并分泌到周質中。
用pDOW1123(pbp:gal2融合)或pDOW1141(oprF:gal2融合)轉化大腸桿菌菌株JM109(Promega)。用編碼為pbp:gal2的pDOW1123轉化的JM109表明，在37℃生長時用0.4mM和0.01mM IPTG誘導時的Gal2蛋白質的表達(圖12)。用0.01mM IPTG誘導的培養物表現出與正對照物(在熒光假單胞菌中表達的DC265，pbp:gal2)相當的表達。
在圖12中在28kDa區域中看到的兩條帶代表信號序列的細菌加工(裂解)之前和之后的Gal2。通過SDS-PAGE在不溶餾分中觀察到這兩個帶，并且與通過DC245制成的加工過和未加工的Gal2共遷移(圖13)。通過MALDI-PSD確定每個帶的N-末端序列，從而證實下方帶是Gal2并如預期被加工(FPTIPLSRPF)。上方帶含有未加工的Gal2的序列。在SDS-PAGE凝膠上，周質樣品顯示出在尺寸上與加工過的Gal2一致的帶(圖14)。
在用0.01mM IPTG誘導并在37℃生長的JM109/pDOW1123樣品的可溶、不溶和周質餾分上進行Western印跡法。結果表明在所有三個餾分中都發現了加工過的Gal2(圖15)。
圖3未加工的gal2加工過的gal2php:gal2(pDOW1123)和oprF:gal2(pDOW1122)中的Western分析20升規模的表達(32小時誘導)圖5A堿性磷酸酶接合的抗-mouse抗體抗-His標記單克隆抗體用6×His標記的Gal2scFvβ-半乳糖苷酶B ELISA檢定法 分泌的oprF:gal2再折疊蛋白質和通過Ni-NTA提純的細胞質gal13天然蛋白質C從熒光假單胞菌或大腸桿菌中分離出的Gal13抗體活性的ELISA測量圖9抗地黃辛ELISA圖11未加工的Skp蛋白質的氨基酸序列。下劃線的序列相當于信號序列加工過的Skp蛋白質的氨基酸序列。下劃線的序列相當于被識別為MALDI-PSD的信號序列。
權利要求
1.一種分離的核酸序列，其包含熒光假單胞菌Sec-系統分泌肽的分泌信號編碼序列或與該編碼序列基本同源的序列——該分泌信號肽選自磷酸鹽結合蛋白(pbp)分泌信號、外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號、Lys-Arg-Orn結合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號。
2.如權利要求1的核酸，其中該序列為磷酸鹽結合蛋白(pbp)分泌信號或與該pbp信號序列基本同源的序列編碼。
3.如權利要求2的核酸，其中該序列與SEQ ID NO2至少80％或至少85％相同。
4.如權利要求2的核酸，其中該序列與SEQ ID NO2至少90％或至少95％相同。
5.如權利要求1的核酸，其中該序列與選自下列序列的核酸序列雜交pbp分泌信號編碼的序列、SEQ ID NO2的序列、與SEQ ID NO2至少80％相同的序列、與SEQ ID NO2至少85％相同的序列、與SEQID NO2至少90％相同的序列、與SEQ ID NO2至少95％相同的序列。
6.如權利要求1的核酸，其包含SEQ ID NO2的序列，其調節至反映選定表達核酸序列的宿主機體的密碼子偏性。
7.如權利要求1的核酸，其中該序列為外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號或與該OprE信號序列基本同源的序列編碼。
8.如權利要求7的核酸，其中該序列與SEQ ID NO4至少80％、或至少85％、至少90％或至少95％相同。
9.如權利要求1的核酸，其中該序列為Lys-Arg-Orn結合蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
10.如權利要求9的核酸，其中該序列與SEQ ID NO6至少80％、或至少85％、至少90％或至少95％相同。
11.如權利要求1的核酸，其中該序列為天青蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
12.如權利要求11的核酸，其中該序列與SEQ ID NO8至少80％、或至少85％、至少90％或至少95％相同。
13.如權利要求1的核酸，其中該序列為鐵(III)結合蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
14.如權利要求13的核酸，其中該序列與SEQ ID NO10至少80％、或至少85％、至少90％或至少95％相同。
15.如權利要求1的核酸，其中該序列為脂蛋白B分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
16.如權利要求15的核酸，其中該序列與SEQ ID NO12至少80％、或至少85％、至少90％或至少95％相同。
17.如權利要求1的核酸，其中該序列與選自下列序列的核酸序列雜交與SEQ ID NO4至少80％相同的序列、與SEQ ID NO6至少80％相同的序列、與SEQ ID NO8至少80％相同的序列、與SEQ ID NO10至少80％相同的序列和與SEQ ID NO12至少80％相同的序列。
18.如權利要求1的核酸，其包含選自SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10和SEQ ID NO12的核酸序列，其被調節至反映選定表達核酸序列的宿主機體的密碼子偏性。
19.如權利要求5或17的核酸，其中雜交是在嚴格條件下進行的。
20.如權利要求19的核酸，其中雜交在68℃進行。
21.一種重組載體，其包含編碼熒光假單胞菌Sec-系統分泌肽的核酸分泌信號序列——該分泌信號肽選自pbp分泌信號、OprE分泌信號、Lys-Arg-Orn結合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號；或與該分泌信號序列基本同源的序列；或與該分泌信號序列雜交的序列。
22.如權利要求21的載體，其中分泌信號序列是選自SEQ IDNO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10和SEQ ID NO12，或是與該分泌信號序列基本同源的序列。
23.如權利要求21的載體，其中分泌信號序列為磷酸鹽結合蛋白(pbp)分泌信號或與該pbp信號序列基本同源的序列編碼。
24.如權利要求23的載體，其中分泌信號序列與SEQ ID NO2至少80％或至少85％相同。
25.如權利要求23的載體，其中分泌信號序列與SEQ ID NO2至少90％或至少95％相同。
26.如權利要求23的載體，其包含SEQ ID NO2的分泌信號序列，其被調節至反映選定表達核酸序列的宿主機體的密碼子偏性。
27.如權利要求21的載體，其中分泌信號序列為外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
28.如權利要求21的載體，其中分泌信號序列為Lys-Arg-Orn結合蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
29.如權利要求21的載體，其中分泌信號序列為天青蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
30.如權利要求21的載體，其中分泌信號序列為鐵(III)結合蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
31.如權利要求21的載體，其中分泌信號序列為脂蛋白B分泌信號或與該信號序列基本同源的序列編碼。
32.如權利要求21的載體，其中分泌信號序列與選自下列序列的核酸序列雜交與SEQ ID NO4至少80％相同的序列、與SEQ ID NO6至少80％相同的序列、與SEQ ID NO8至少80％相同的序列、與SEQID NO10至少80％相同的序列和與SEQ ID NO12至少80％相同的序列。
33.如權利要求21的載體，其中分泌信號序列選自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10和SEQ ID NO12，其被調節至反映選定表達核酸序列的宿主機體的密碼子偏性。
34.如權利要求21的載體，其包含與分泌信號序列雜交的序列。
35.如權利要求34的載體，其中雜交是在嚴格條件下進行的。
36.如權利要求35的載體，其中雜交在68℃進行。
37.如權利要求21的載體，其中分泌信號序列被可操縱地連接到相關重組蛋白或肽的編碼序列上。
38.如權利要求37的載體，其中重組蛋白或肽原產于宿主。
39.如權利要求38的載體，其中重組蛋白或肽原產于熒光假單胞菌。
40.如權利要求37的載體，其中重組蛋白或肽來自不是原產于宿主有機體的蛋白質或肽。
41.如權利要求37的載體，其中重組蛋白或肽來自非假單胞菌的有機體。
42.如權利要求37的載體，其中重組蛋白或肽來自真核有機體。
43.如權利要求37的載體，其中重組蛋白或肽來自哺乳動物有機體。
44.如權利要求37的載體，其在信號肽序列與重組蛋白或肽序列之間進一步包含連接序列。
45.如權利要求44的載體，其中連接序列可被信號肽酶裂解。
46.如權利要求37的載體，其中重組蛋白或肽序列被可操縱地連接到第二信號序列上。
47.如權利要求46的載體，其中第二信號序列包含導向外膜分泌信號的序列。
48.如權利要求21的載體，其中載體進一步包含啟動子。
49.如權利要求48的載體，其中啟動子原產于細菌宿主細胞。
50.如權利要求48的載體，其中啟動子不是原產于細菌宿主細胞。
51.如權利要求48的載體，其中啟動子原產于大腸桿菌。
52.如權利要求48的載體，其中啟動子是可誘導啟動子。
53.如權利要求48的載體，其中啟動子是lac啟動子或lac啟動子的衍生物。
54.一種重組細胞，其包含編碼熒光假單胞菌Sec-系統分泌肽的核酸分泌信號序列——該分泌信號肽選自pbp分泌信號、OprE分泌信號、Lys-Arg-Orn結合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號；與該分泌信號序列基本同源的序列；或與該分泌信號序列雜交的序列，或與該編碼序列基本同源的序列。
55.如權利要求54的重組細胞，其中分泌信號序列在表達載體中。
56.如權利要求54的重組細胞，其中分泌信號序列是pbp序列。
57.如權利要求54的重組細胞，其中分泌信號序列是OprE序列。
58.如權利要求54的重組細胞，其中分泌信號序列被可操縱地連接到相關重組蛋白或肽上。
59.如權利要求54的重組細胞，其中細胞表達被可操縱地連接到由該核酸編碼的分泌信號肽上的相關蛋白質或肽。
60.如權利要求59的細胞，其中該蛋白質或肽表達在細胞的周質隔室中。
61.如權利要求54的細胞，其中細胞中的酶使信號肽從相關蛋白質或肽裂解。
62.如權利要求54的細胞，其中細胞來自細菌宿主。
63.如權利要求62的細胞，其中宿主是假單胞菌。
64.如權利要求63的細胞，其中宿主是熒光假單胞菌。
65.如權利要求62的細胞，宿主是大腸桿菌。
66.一種分離肽，其包含熒光假單胞菌Sec-系統分泌肽的編碼氨基酸序列——該分泌信號肽選自pbp分泌信號、OprE分泌信號、Lys-Arg-Orn結合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號，或與該信號序列基本同源的序列。
67.如權利要求66的肽，其中分泌肽包含磷酸鹽結合蛋白(pbp)分泌信號或與該pbp信號序列基本同源的序列。
68.如權利要求66的肽，其中氨基酸序列與SEQ ID NO1的氨基酸2-24至少90％相同。
69.如權利要求66的肽，其中氨基酸序列與SEQ ID NO1的氨基酸2-24至少95％相同。
70.如權利要求66的肽，其中氨基酸序列與SEQ ID NO1的氨基酸2-24至少98％相同。
71.如權利要求66的肽，其中分泌肽包含外膜孔蛋白E(OprE)分泌信號或與該OprE信號序列基本同源的序列。
72.如權利要求66的肽，其中氨基酸序列與SEQ ID NO3的氨基酸2-21至少90％相同。
73.如權利要求66的肽，其中分泌肽包含Lys-Arg-Orn結合蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列。
74.如權利要求66的肽，其中分泌肽包含天青蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列。
75.如權利要求66的肽，其中分泌肽包含鐵(III)結合蛋白分泌信號或與該信號序列基本同源的序列。
76.如權利要求66的肽，其中分泌肽包含脂蛋白B分泌信號或與該信號序列基本同源的序列。
77.如權利要求66的肽，其被可操縱地連接到相關重組蛋白或肽上。
78.如權利要求77的肽，其中重組蛋白或肽來自不是熒光假單胞菌有機體的有機體。
79.一種用于表達重組蛋白或肽的表達系統，包含a.一種宿主細胞；和b.一種載體，其包含被可操縱地與熒光假單胞菌Sec-系統分泌信號相連的重組蛋白或肽——該分泌信號選自pbp分泌信號、OprE分泌信號、Lys-Arg-Orn結合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號、或與該信號序列基本同源的序列。
80.如權利要求79的系統，其中分泌信號序列是pbp序列。
81.如權利要求79的系統，其中分泌信號序列是OprE序列。
82.如權利要求79的系統，其中分泌信號序列是Lys-Arg-Orn結合蛋白分泌信號。
83.如權利要求79的系統，其中分泌信號序列是天青蛋白分泌信號。
84.如權利要求79的系統，其中分泌信號序列是鐵(III)結合蛋白分泌信號。
85.如權利要求79的系統，其中分泌信號序列是脂蛋白B分泌信號。
86.如權利要求79的系統，其中分泌信號序列被可操縱地連接到相關重組蛋白或肽上。
87.如權利要求79的系統，其中細胞表達被可操縱地與由該核酸編碼的分泌信號肽相連的相關蛋白質或肽。
88.如權利要求87的系統，其中該蛋白質或肽表達在細胞的周質隔室中。
89.如權利要求87的系統，其中細胞中的酶使信號肽從相關蛋白質或肽裂解。
90.如權利要求79的系統，其中細胞來自細菌宿主。
91.如權利要求90的系統，其中宿主是假單胞菌。
92.如權利要求91的系統，其中宿主是熒光假單胞菌。
93.如權利要求90的系統，其中宿主是大腸桿菌。
94.如權利要求79的系統，進一步包含發酵培養基。
95.如權利要求94的系統，其中發酵培養基包含化學誘導物。
96.一種用于在宿主細胞中表達重組蛋白或肽的方法，包括提供一種包含載體的細胞，該載體編碼與熒光假單胞菌Sec系統分泌信號可操縱地連接的重組蛋白或肽——該分泌信號選自pbp分泌信號、OprE分泌信號、Lys-Arg-Orn結合蛋白分泌信號、天青蛋白分泌信號、鐵(III)結合蛋白分泌信號和脂蛋白B分泌信號、或與該信號序列基本同源的序列；并在產生重組蛋白或肽的表達的條件下生長該細胞。
97.如權利要求96的方法，其中分泌信號是pbp分泌信號。
98.如權利要求96的方法，其中分泌信號是OprE分泌信號。
99.如權利要求96的方法，其中分泌信號是Lys-Arg-Orn結合蛋白分泌信號。
100.如權利要求96的方法，其中分泌信號是天青蛋白分泌信號。
101.如權利要求96的方法，其中分泌信號是鐵(III)結合蛋白分泌信號。
102.如權利要求96的方法，其中分泌信號是脂蛋白B分泌信號。
103.如權利要求96的方法，其中細胞在無機鹽培養基中生長。
104.如權利要求96的方法，其中細胞以高細胞密度生長。
105.如權利要求104的方法，其中細胞以至少20克/升的細胞密度生長。
106.如權利要求96的方法，額外包括將重組蛋白提純。
107.如權利要求96的方法，其中通過親和色譜法提純重組蛋白。
108.如權利要求96的方法，其中重組蛋白與分泌信號的可操縱的連接可被原產于宿主細胞的酶裂解。
109.如權利要求109的方法，其中分泌信號在表達過程中與重組蛋白裂解。
110.如權利要求96的方法，其中重組蛋白或肽來自原產于宿主有機體的蛋白質或肽。
111.如權利要求96的方法，其中重組蛋白或肽來自原產于熒光假單胞菌的蛋白質或肽。
112.如權利要求96的方法，其中重組蛋白或肽來自不是原產于宿主有機體的蛋白質或肽。
113.如權利要求96的方法，其中重組蛋白或肽來自不是假單胞菌的有機體。
114.如權利要求96的方法，其中重組蛋白或肽來自真核有機體。
115.如權利要求96的方法，其中重組蛋白包含包括至少兩個半胱氨酸殘基的序列。
116.如權利要求96的方法，其中在細胞中在重組蛋白中形成至少一個二硫鍵。
117.如權利要求96的方法，在信號肽序列與重組蛋白或肽序列之間進一步包含連接序列。
118.如權利要求96的方法，其中至少50％重組蛋白包含天然氨基末端。
119.如權利要求96的方法，其中至少80％重組蛋白包含天然氨基末端。
120.如權利要求96的方法，其中至少90％重組蛋白包含天然氨基末端。
121.如權利要求96的方法，其中至少50％重組蛋白是活性的。
122.如權利要求96的方法，其中至少80％重組蛋白是活性的。
123.如權利要求96的方法，其中至少50％重組蛋白表達在周質隔室中。
124.如權利要求96的方法，其中至少75％重組蛋白表達在周質隔室中。
125.如權利要求96的方法，其中至少90％重組蛋白表達在周質隔室中。
126.如權利要求96的方法，其中細胞是假單胞菌細胞。
127.如權利要求126的方法，其中細胞是熒光假單胞菌細胞。
128.如權利要求96的方法，其中細胞是大腸桿菌細胞。
129.一種用于在熒光假單胞菌宿主細胞中表達重組蛋白的改進的方法，包括提供一種包含載體的熒光假單胞菌細胞，該載體編碼與重組Sec系統分泌信號序列可操縱地相連的重組蛋白或肽；并在產生該蛋白或肽的表達的條件下生長該細胞。
130.如權利要求129的方法，其中信號序列來自熒光假單胞菌基因組。
131.如權利要求129的方法，其中信號序列不是來自熒光假單胞菌基因組。
132.如權利要求129的方法，其中信號序列來自大腸桿菌基因組。
133.如權利要求129的方法，其中細胞在無機鹽培養基中生長。
134.如權利要求129的方法，其中細胞以高細胞密度生長。
135.如權利要求134的方法，其中細胞以至少20克/升的細胞密度生長。
136.如權利要求129的方法，額外包括將重組蛋白提純。
137.如權利要求136的方法，其中通過親和色譜法提純重組蛋白。
138.如權利要求129的方法，其中重組蛋白與分泌信號的可操縱的連接可被原產于宿主細胞的酶裂解。
139.如權利要求138的方法，其中分泌信號在表達過程中與重組蛋白裂解。
140.如權利要求129的方法，其中重組蛋白或肽來自假單胞菌有機體。
141.如權利要求129的方法，其中重組蛋白或肽來自不是假單胞菌的有機體。
142.如權利要求129的方法，其中重組蛋白或肽來自真核有機體。
143.如權利要求129的方法，其中重組蛋白包含包括至少兩個半胱氨酸殘基的序列。
144.如權利要求129的方法，其中在細胞中在重組蛋白中形成至少一個二硫鍵。
145.如權利要求129的方法，在信號肽序列與重組蛋白或肽序列之間進一步包含連接序列。
146.如權利要求129的方法，其中至少50％重組蛋白包含天然氨基末端。
147.如權利要求129的方法，其中至少80％重組蛋白是活性的。
148.如權利要求129的方法，其中至少90％重組蛋白是活性的。
149.如權利要求129的方法，其中至少50％重組蛋白表達在周質隔室中。
150.如權利要求129的方法，其中至少75％重組蛋白表達在周質隔室中。
151.如權利要求129的方法，其中至少90％重組蛋白表達在周質隔室中。
全文摘要
本發明使用熒光假單胞菌Sec分泌系統描述了使用Sec－系統分泌信號肽制造重組蛋白的改進的方法和原核表達系統。本發明描述了特定的新型Sec－系統分泌信號肽作為重組蛋白和肽的改進分泌的融合蛋白和編碼序列。
文檔編號C07H19/00GK1882605SQ200480034455
公開日2006年12月20日 申請日期2004年11月22日 優先權日2003年11月21日
發明者D·M·雷塔拉克, J·C·斯涅德, T·M·拉姆塞耶爾 申請人:陶氏環球技術公司