專利名稱：堆肥微生物總dna的提取與純化方法
技術領域：
本發明涉及DNA的提取與純化，具體涉及堆肥中微生物總DNA的提取與純化。
背景技術：
堆肥是利用微生物對可生物降解固體廢物進行分解從而對其實現最終處理的一種系統，因此，充分認識其中的微生物學原理能為改進處理工藝、提高處理效率提供依據。對堆肥進行微生物群落研究的傳統方法主要是微生物培養和純種分離技術。因為環境中的絕大多數微生物是無法通過培養方式進行研究的，而且堆肥中的微生物種類繁多、常處于動態變化狀態，培養研究無法反映系統中微生物的種群動態變化過程，因此，這樣的研究方法已經無法滿足堆肥微生物學研究的要求。分子生態學技術正是這樣一種能在不對微生物進行培養而對其進行研究的新技術。
1992年Burke等在《Molecular Ecology》發刊詞中提出分子生態學是應用分子生物學方法為生態學和種群生物學各領域提供革新見解的新興學科，從而確立了分子生物學技術在分子生態學研究中的主體地位。目前，分子生態學研究已經涉及到環境科學研究的眾多領域，包括在堆肥微生物分子生態學方面的研究。
在分子生態學研究中，DNA的提取與純化是基礎工作，高質量核酸樣品的獲得直接影響到后續分析的可信度。由于堆肥中微生物種類繁多，而且混雜有大量腐殖酸，因此，如何充分使微生物細胞裂解并釋放DNA，有效減少腐殖酸等雜質的污染從而獲得高產率和高純度的DNA是對堆肥微生物群落進行分子生態學研究的關鍵。目前，新的適合堆肥微生物總DNA提取與純化的方法體系尚未建成，大多數研究中還是借用植物或普通微生物DNA的提取與純化方法，存在著速度慢，產量低，設備要求高，腐殖酸類污染物含量高等缺點。因此，尋找一種有效的DNA提取與純化方法是利用分子生態學技術研究堆肥微生物所急需解決的問題。
發明內容
本發明旨在運用生物化學、分子生物學和微生物學的原理，研究一種DNA的提取與純化方法，以解決堆肥中微生物總DNA的提取與純化中存在的速度慢、腐殖酸等雜質含量高、DNA產率低與純度不高等問題，從而提高堆肥中DNA的產率和純度，以便更好地應用于堆肥微生物的分子生態學研究。
本發明是通過以下技術方案實現上述發明目的的。
堆肥中微生物總DNA的提取與純化方法，包括DNA的提取與純化，本發明的方法為(1)樣品的洗滌待提取DNA的樣品用0.12M磷酸鹽緩沖液，以4～6ml/g堆肥的用量在25～35℃溫度條件下，以150rpm速率勻速震蕩15～30min，然后以6000×g離心10min，沉淀再次洗滌；(2)DNA的提取樣品洗滌后，用1.2～1.5ml/g堆肥的溶菌酶溶液在37℃恒溫條件下，以200～250rpm振蕩溫浴1～2h，然后均以0.5～0.8ml/g堆肥的用量加入裂解緩沖液、磷酸鹽緩沖液和氯仿—異戊醇溶液，并以2500～3000rpm速率旋渦振蕩10～15min，經0.6倍體積的異丙醇沉淀1～2h后，以16000×g速度離心10～20min，沉淀用0.8～1.5的ml冰70％乙醇洗滌兩次后溶解于500～1000μl的TE緩沖液中，得到粗提的DNA溶液；(3)DNA的純化粗提的DNA溶液用0.5～0.6倍體積的聚乙二醇和0.1倍體積的NaCl溶液在4℃溫度條件下沉淀2～24h，然后取0.7ml粗提DNA溶液加入至DNA特異離心吸附柱內，在4℃，12000×g離心1min，DNA吸附于柱上，棄去收集管廢液，重復上述操作直至粗提的DNA溶液全部離心完畢，吸附柱上的DNA經0.7ml冰70％乙醇洗滌兩次，再用含RNaseA的TE緩沖液100～500μl洗脫DNA，得到純化的DNA溶液。
下面結合附圖進一步詳述本發明
圖1純化后的堆肥微生物總DNA的瓊脂糖凝膠電泳照片；其中Marker為從生物公司購買的DNA分子量標記，1，2，3分別代表三個平行樣品，數字表示DNA的大小，單位是bp。
圖2PCR擴增純化DNA得到的16SrDNA產物的瓊脂糖凝膠電泳照片；其中MarkerV為從生物公司購買的DNA分子量標記MarkerV，1，2，3分別代表三個平行樣品，數字表示DNA的大小，單位是bp；目前，分子生態學在環境科學中的研究主要依賴于對生物的DNA進行分析研究。堆肥中的微生物種類是非常豐富的，因此，要對其中的微生物開展分子生態學研究，就必須獲取高質、高量的DNA，然后利用PCR擴增、限制性內切酶酶切和梯度凝膠電泳以及建立克隆文庫和DNA測序對微生物的DNA序列進行分析，從而獲取微生物的遺傳信息。
本發明首先對堆肥中的一部分腐殖酸類物質和微生物細胞外的DNA洗脫，既減少了腐殖酸類物質的污染，也消除了胞外DNA對實驗結果的影響；因此本發明首先將磷酸鹽緩沖液(0.12M，pH8.0，)與堆肥樣品混合，使用時磷酸鹽緩沖液用量為4～6ml/g堆肥，堆肥樣品量增加時適量增加溶液用量，然后在振蕩器上在25～35℃溫度條件下勻速震蕩(150rpm以上)15～3min，樣品量較多時可提高振蕩速度或延長振蕩時間然后以6000×g離心10min，沉淀再次洗滌；樣品洗滌后使用溶菌酶溶液37℃振蕩(200～250rpm)溫浴1h，堆肥樣品量較多時可延長溫浴時間，一般保持在2h以內；然后再加入裂解緩沖液(0.5～0.8ml/g堆肥)和磷酸鹽緩沖液(0.5～0.8ml/g堆肥)以及氯仿—異戊醇溶液(0.5～0.8ml/g堆肥)旋渦振蕩(2500～3000rpm以上)10～15min，樣品量較多時可提高振蕩速度或延長振蕩時間將微生物細胞裂解，經0.6×體積異丙醇沉淀1～2h后，離心(16,000×g)10min，樣品量較大時離心時間可延長至20min；沉淀用1.0ml冰70％乙醇洗滌兩次后溶解于TE緩沖液(500～1,000μl)中，得到粗提的DNA溶液，提取過程使用的溶液和儀器為恒溫振蕩器旋渦混合儀冷凍離心機磷酸鹽緩沖液0.12M，pH8.0(NaH2PO4配制成0.12M，用1.0M NaOH溶液將pH調至8.0)溶菌酶溶液 0.15M NaCl，0.1M Na2EDTA，10mg/ml溶菌酶，pH8.0裂解緩沖液 10％SDS(w/v)，0.1M NaCl，0.5M Tris-HCl，pH8.0磷酸鹽緩沖液0.1M，pH8.0(NaH2PO4配制成0.1M，用1.0M NaOH溶液將pH調至8.0)氯仿—異戊醇溶液24∶1(v/v)TE緩沖液10mM Tris·Cl，pH8.0，1mMEDTA冰70％乙醇(v/v)；本發明采用溶菌酶、SDS以及高速旋渦振蕩的方法，利用生物、化學以及物理相結合的原理，盡可能地將堆肥中的微生物細胞裂解，從而使細胞內的核酸物質釋放出來，實現了DNA產量的最大化，而且為了使溶菌酶的作用更好地發揮，又將溶菌酶溶液與堆肥樣品在37℃下振蕩溫浴1～2h，這樣既保證了其處于酶催化的最適溫度，又可以與樣品充分接觸；加入的氯仿—異戊醇溶液能夠抽提掉大部分細胞裂解產生的蛋白質和糖類物質；粗提的DNA用0.5～0.6×體積聚乙二醇(PEG8000)和0.1×體積NaCl溶液在4℃沉淀2h以上，如果時間充裕，可以將其保存過夜；然后將0.7ml粗提DNA溶液加入DNA特異離心吸附柱離心(4℃，12,000×g，1min)，使DNA特異吸附于柱上，棄去收集管廢液；重復上述操作至粗提DNA溶液全部離心完畢；離心吸附柱上的DNA經0.7ml冰70％乙醇洗滌兩次后，使用含核糖核酸酶A(RNaseA)的TE緩沖液(100～500μl，根據堆肥樣品量具體確定)將DNA洗脫下來，得到純化的DNA溶液，純化過程使用的溶液和儀器材料為恒溫箱冷凍離心機PEG8000 50％(w/v)NaCl溶液 5MDNA特異離心吸附柱 型號CB2(北京天為時代科技有限公司)TE緩沖液 10mM Tris·Cl，pH8.0，1mM EDTA，0.5mg/ml RNaseA冰70％乙醇(v/v)。
本發明在DNA純化中加入的PEG8000是一種對腐殖酸類物質具有良好的去除效果的物質，而隨后使用的特異離心吸附柱，則能特異性地將DNA吸附在離心柱上，當用70％乙醇洗滌時不能將DNA洗脫，因此不能很好地去除與DNA混雜在一起的其他有機物質，本發明即在溶解吸附柱上的DNA的TE緩沖液中還加入了RNaseA，能夠去除DNA中的核糖核酸(RNA)。
本發明針對堆肥的特點，使用了對不同對象有特定作用的處理方法，從而獲得了片段長度比較單一的23kb的DNA；經過純化以后，DNA的產量達到了53±1.5μgDNA/g堆肥，而腐殖酸類物質的產量僅為1.5±0.2μg/g堆肥，使用細菌16S rDNA通用擴增引物從純化后的DNA中成功地擴增出了特異性很高的長度約為1.5kb的PCR擴增產物。
具體實施例方式1、堆肥取樣堆肥取自一個20L的實驗室規模的堆肥裝置，堆肥材料主要為10kg菜市場剩余，并添加了5kg菜園土壤，采樣點為堆肥表面以下3cm，一共取三個樣品(設為1，2，3)，每個樣品1g，取樣時間為堆肥處理16d后，溫度為22℃(已達到了最高溫度46℃)，pH為6.8，含水率為43.4±0.5％，有機質含量為1.62±0.3％。其中，pH用玻璃電極法測定，含水率在105℃下重復烘烤至恒重測定，有機質含量根據重鉻酸鉀法測定。
2、樣品的洗滌每1g樣品加入到4ml 0.12M的磷酸鹽緩沖液(pH8.0)中并與溶液混勻，然后室溫下在振蕩器上150rpm勻速震蕩15min，然后以6,000×g離心10min；沉淀再次洗滌后用于后續處理。
3、DNA的提取洗滌過的堆肥樣品1g與1.5ml的溶菌酶溶液混勻，然后在37℃恒溫振蕩器上以225rpm振蕩1h；然后加入0.5ml裂解緩沖液，0.5ml磷酸鹽緩沖液，0.5ml氯仿-異戊醇；將裝有樣品的離心管置于漩渦混合器上以2,800rpm振蕩10min；裂解液以6,000×g離心3min，上清轉入新離心管；原管加入0.5ml去離子水重新離心5～10s；兩次離心的上清混合，12,000×g離心5min，收集水相留用；加0.6×異丙醇沉淀1h，然后16,000×g離心10min；沉淀以冰預冷的70％乙醇洗滌兩次后風干，加入600μl TE緩沖液將DNA溶解。
其中，溶菌酶溶液0.15M NaCl，0.1M Na2EDTA，10mg/ml溶菌酶，pH8.0；裂解緩沖液10％SDS、0.1M NaCl、0.5M Tris-HCl，pH8.0；磷酸鹽緩沖液0.1M，pH8.0；氯仿-異戊醇體積比為24∶1；TE緩沖液10mM Tris·Cl，pH8.0，1mM EDTA。
4、DNA的純化在粗提DNA溶液中加入0.5×體積的PEG8000溶液和0.1×體積NaCl溶液，輕微顛倒將液體混合，在4℃恒溫箱中保存2h；使用北京天為時代科技有限公司的CB2離心吸附柱將混合液離心，每次在吸附柱中加入0.7ml混合液，冷凍離心機中4℃下12,000×g離心1min，棄去收集管中液體，重復多次直至粗提DNA溶液全部離心完畢；然后吸附柱以冰預冷的70％乙醇0.7ml洗滌，在4℃下12,000×g離心1min；棄去收集管中廢液，70％乙醇重復洗滌；吸附柱自然風干后，更換新收集管，用200μl加入了核糖核酸酶A(RNaseA)的TE緩沖液將吸附柱上的DNA洗脫至收集管，37℃恒溫消化2h后于4℃保存備用。
其中，PEG8000溶液50％(質量體積百分數)；NaCl溶液5M；含RNaseA的TE緩沖液10mM Tris·CL，pH8.0，1mM EDTA，0.5mg/ml RNaseA。
5、純化的DNA片段大小的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段大小的檢測按照常規的瓊脂糖凝膠電泳進行，所用瓊脂糖凝膠濃度為1％(質量體積百分數)，所用的DNA分子量標記(Marker)為北京天為時代科技有限公司的λDNA/HindIII，所用電泳緩沖液為1×TAE電泳緩沖液，以10V/cm的電壓降在水平電泳槽上電泳，電泳結束后凝膠使用溴化乙錠(EB)染色液染色10min，然后在美國BIoRad公司的Gel Doc2000凝膠成像系統上拍照檢測，結果見圖1，從圖1可以看出，純化后的DNA條帶單一，沒有拖尾現象，DNA片段長度約為23kb。
其中，1×TAE電泳緩沖液40mM Tris堿，20mM乙酸，2mM EDTA；1％瓊脂糖凝膠1g瓊脂糖，加入100ml 1×TAE電泳緩沖液加熱溶解，然后冷卻；EB染色液10μg/ml 1×TAE電泳緩沖液。
6、DNA和腐殖酸類物質濃度的測定DNA濃度使用美國Beckman公司生產的DU640核酸和蛋白質分析儀進行測定，實驗步驟根據儀器操作手冊進行，儀器根據測量結果自動給出所檢測DNA溶液的濃度，根據稀釋倍數計算得到原始DNA濃度，從而根據DNA溶液濃度和體積計算得到純化后的DNA產量為53±1.5μgDNA/g堆肥。
腐殖酸的吸收波長為340nm，使用一系列濃度(0.1-100ng/μl)的腐殖酸混合物(Aldrich Chemical，USA)作為標準曲線，通過加入10ng/μl DNA(Molecular Probes，USA)和2μg/μl牛血清白蛋白(Amresco，USA)以檢查DNA和蛋白質對腐殖酸濃度測定的影響，使用紫外下分光光度計在340nm波長處測定各個樣品的吸光度。根據測量結果計算得出腐殖酸類物質的產量為1.5±0.2μg/g堆肥。
7、16S rDNA的PCR擴增及產物檢測選擇細菌16S rDNA擴增通用引物對27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1495R(5′-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3′)作為PCR擴增的引物，該引物對分別對應于大腸桿菌(E.coli)16S rDNA的8-27位堿基和1495-1514位堿基，從而可以擴增出近乎全長的16S rDNA序列，約為1507bp。
50μl的PCR擴增體系為1μl已純化DNA，5μl dNTP混合溶液(終濃度為1pmol/μl)，引物各1μl，10×Buffer 5μl，Taq DNA聚合酶(Promege，USA)0.5μl，加無菌去離子水補足50μl。擴增條件為94℃預變性5min，接下來是94℃30s，50℃30s，72℃1min，30個循環；72℃延伸10min，停止于4℃。
PCR擴增產物的檢測同樣使用1％瓊脂糖凝膠電泳，除所用的DNA分子量標記為北京天為時代科技有限公司的Marker V外，其余與第5點方法相同，結果見圖2，從圖2可以看出，使用細菌通用引物對(27F和1495R)進行PCR擴增，得到了長度為1,500bp的PCR產物，條帶單一，表明擴增的特異性很好，本方法提取、純化的DNA可以用于分子生態學研究。
從上述測定結果可以清楚地看出，本方法不僅可以得到較高產量的長片段DNA，而且其中的腐殖酸類物質含量極低，純化的DNA用于16S rDNA的PCR擴增，得到了特異性良好的產物，此外，本方法不需要額外的儀器設備，因此本方法可以成為堆肥微生物分子生態學研究中的一種方便、高質、高量、低成本的堆肥微生物總DNA提取與純化技術。
權利要求
1.一種堆肥中微生物總DNA的提取與純化方法，包括DNA的提取與純化，本發明的特征在于(1)樣品的洗滌待提取DNA的樣品用0.12M磷酸鹽緩沖液，以4～6ml/g堆肥的用量在25～35℃溫度條件下，以150rpm速率勻速震蕩15～30min，然后以6000×g離心10min，沉淀再次洗滌；(2)DNA的提取樣品洗滌后，用1.2～1.5ml/g堆肥的溶菌酶溶液在37℃恒溫條件下，以200～250rpm振蕩溫浴1～2h，然后均以0.5～0.8ml/g堆肥的用量加入裂解緩沖液、磷酸鹽緩沖液和氯仿—異戊醇溶液，并以2500～3000rpm速率旋渦振蕩10～15min，經0.6倍體積的異丙醇沉淀1～2h后，以16000×g速度離心10～20min，沉淀用0.8～1.5ml的冰70％乙醇洗滌兩次后溶解于500～1000μl的TE緩沖液中，得到粗提的DNA溶液；(3)DNA的純化粗提的DNA溶液用0.5～0.6倍體積的聚乙二醇和0.1倍體積的NaCl溶液在4℃溫度條件下沉淀2～24小時，然后取0.7ml粗提DNA溶液加入至DNA特異離心吸附柱內，在4℃，12000×g離心1min，DNA吸附于柱上，棄去收集管廢液，重復上述操作直至粗提DNA溶液全部離心完畢，吸附柱上的DNA經0.7ml冰70％乙醇洗滌兩次，再用含RNaseA的TE緩沖液100～500μl洗脫DNA，得到純化的DNA溶液。
全文摘要
本發明涉及堆肥中微生物總DNA的提取和純化。本發明用磷酸鹽緩沖液洗滌樣品，用溶菌酶溶液和SDS溶液裂解堆肥微生物細胞，粗提的DNA經異丙醇離心沉淀和70％冰乙醇洗滌，用聚乙二醇和DNA特異離心吸附柱純化粗提的DNA。經瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，提取的DNA片段長度約為23kb；純化后的DNA經紫外分光光度計檢測，腐殖酸類的產量為1.5μg/g堆肥，去除了大部分的腐殖酸類物質；用核酸蛋白質分析儀對純化的DNA進行檢測，DNA的產量為53μg/g堆肥。本發明堆肥微生物總DNA的提取與純化，能去除DNA中的腐殖酸類物質的干擾，得到的高質量DNA可直接用于PCR擴增及其他分子生物學分析，從而建立一套可用于城市生活垃圾堆肥微生物分子生態學研究的快速、高質、高量的DNA提取與純化技術。
文檔編號C07H1/00GK1733791SQ20051003211
公開日2006年2月15日 申請日期2005年9月6日 優先權日2005年9月6日
發明者肖勇, 楊朝暉, 曾光明, 陳耀寧, 陶然 申請人:湖南大學