使用硅鋁酸鹽富集海藻糖的制作方法

專利名稱：使用硅鋁酸鹽富集海藻糖的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種從溶液中富集海藻糖的方法，其中海藻糖使用一種吸附劑富集。
海藻糖二糖(α-D-吡喃葡糖-α-D-吡喃葡苷)由彼此通過一個α，α-1，1-共價鍵連接的兩個葡糖分子組成。海藻糖，由于它在性能方面的重要性質，在工業上越來越重要。一個重要的應用領域是穩定蛋白質和多肽，例如酶和疫苗。海藻糖優選用于食品工業。由于它低甜度和保持味道的性質，海藻糖也被用作蔗糖替代物。此外，在冷凍和干燥過程中海藻糖具有穩定作用。進一步的應用領域是化妝品領域。
海藻糖優選通過酶法或使用合適的微生物發酵生產(Schiraldi，C.，etal.(2002).Trehalose ProductionExploiting Novel Approaches，Trend inBiotechnology，vol.20(10)，pages 420-425)。通常，海藻糖也作為用于發酵生產其它物質的副產品而形成(Hull，S.R.，Gray，J.S.S.，et al.(1995).Trehalose as a Common Industrial Fermentation Byproduct.Carbohydrate Research，vol.266，pages 147-152)。在非化學合成的方法中，尤其在發酵情況下，形成含有高污染的溶液，如含有細胞、蛋白質、脂質或其它糖。
因而海藻糖必須從這樣的高污染溶液中富集，并且根據使用目的，進一步純化。
在現有技術中，已知有多種富集和純化海藻糖的方法。
US 5,759,610描述了一種由微生物培養基中純化海藻糖的方法，包括步驟過濾和離心處理、使用活性炭處理、去離子作用、離子交換劑純化、濃縮形成糖漿產品，進一步通過色譜柱技術純化，如離子交換色譜，活性碳色譜和硅膠色譜，也可以通過有機溶劑沉淀，如乙醇、丙酮，并采用合適的膜過濾，酵母發酵處理或堿處理，目的是除去或分解任何殘留的糖類。為進一步純化目的，如進行冷凍結晶或噴霧干燥。未使用吸附劑吸附海藻糖。
JP 07000190(Tradashi，W.，et al.)描述了從釀酒廠發酵的固體殘留物中分離海藻糖。殘留物通過醇萃取和/或超聲波處理以從該殘留物中提取海藻糖。此外，通過熱處理抑制該殘留物中海藻糖酶的活性。其中通過離子交換柱和活性碳柱進行純化。在這種方法中，海藻糖不被柱吸附。
US 5,441,644中描述了一種從發酵肉湯中純化海藻糖的方法。在這種方法中進行超濾及使用活性碳脫色。其中，海藻糖不被活性碳吸附。
所述方法的缺點是各自使用吸附劑僅吸附不想要的雜質，而非吸附海藻糖本身。由于萃取和純化步驟必須適應不同的雜質，因而是非常復雜的，難以應用于工業規模。尤其，用于從發酵肉湯中純化，其中海藻糖的干重含量通常低于15％(Schiraldi et al.，(2002)，Trehalose ProductionExploiting Novel Approaches.Trends In Biotechnology，vol.20(10)，page421)。
根據另一種方法，海藻糖作為發酵副產品通過連續的活性碳和Bio-Gel P-2色譜純化得到(Hull，S.R.，Gray，J.S.S.，et al.(1995).Trehaloseas a Common Industrial Fermentation Byproduct.CarbohydrateResearch，vol.266，pages 147-152)。然而，這種方法僅為一種檢測方法，不適合作為應用于工業規模的方法。
除了上面描述的方法，US 5,441,644中還提到，現有技術中還有將海藻糖溶于乙腈溶液通過硅膠色譜柱的方法。然而，文件提到這種色譜方法不適于在工業規模上富集海藻糖或海藻糖純化。
Buttersack et al.(Specific Adsorption from Aqueous Phase on ApolarZeolites，Progress in Zeolite and Microporous Materials，vol.105，pp.1723-1730，1977)中描述了一定的單-和二糖與選擇的FAU，PEA和MFI沸石的結合。對于個別二糖，發現了差別很大的不同的吸附性。其中沒有對海藻糖進行研究。
在一項進一步的研究中，Buttersack et al.描述了二糖與不同的Y沸石和脫鋁Y沸石的結合(Buttersack et al.(1994).Adsorption of Glucose andFructose containing Disaccharides on different Faujasities.Studies InSurface Science and Catalysis，vol.84，pp.1363-1371)。他們強調在二糖研究中果糖自由基對于沸石吸附性的重要性。他們沒有對海藻糖進行研究，海藻糖也沒有果糖自由基。
前面提到的吸附劑的缺點是，它們具有通用的吸附性，不能根據每一種方法單獨地作出調整。
因此，要求一種使用更好的吸附劑從溶液中富集海藻糖的方法，尤其要求吸附劑可以根據每一種方法進行適應調整。因而，本發明的目的是提供一種這樣的方法，尤其適用于色譜方法。本發明進一步的目的是提供一種方法，使從發酵肉湯中富集海藻糖成為可能，尤其是從生產賴氨酸的發酵肉湯中富集海藻糖。
我們發現由公知使用吸附劑從溶液中富集海藻糖的方法開始可以實現上述目的。本發明方法的特征在于吸附劑為硅鋁酸鹽。
與已有技術使用的吸附劑(如活性碳或離子交換劑)比較，硅鋁酸鹽，尤其是沸石，有利的是可以制備大量不同的變體，結果是吸附劑可以更好地適應分離問題。
海藻糖可以通過多種已知的方法生產。傳統地，海藻糖通過發酵方法生產，同時，酶解生產方法也已出現(Schiraldi，C.，et al.(2002)TrehaloseProductionExploiting Novel Approaches.Trends in Biotechnology，vol.20(10)，page 420-425)。微生物中，已發現3種主要的酶解路線用于海藻糖合成(1)在真菌類和酵母中的磷酸化酶體系，(2)在嗜溫細菌和嗜極(extremophilic)細菌中的糖基轉移酶-水解酶體系，(3)海藻糖合成酶催化的麥芽糖到海藻糖轉糖基反應(例如見JP 09098779，KR 99029104)。
術語富集是本領域技術人員公知的。根據本發明，術語富集尤其涉及與不想要的雜質相比，增加海藻糖的比例。通常，海藻糖的比例相對于產品的干重計。
在優選的實施方案中，術語富集也涉及海藻糖的純化。術語純化是本領域技術人員公知的。本發明內容中，純化的目的尤其是得到一種海藻糖的純度，其中使海藻糖基本上不含其它物質。尤其是，這意味著海藻糖以結晶形式存在。
富集或純化方法只有有滿意的產率才具有最好的經濟效益。因此，本方法的進一步目的是不僅獲得高富集而且獲得高產率。
關于溶液，對溶劑沒有特別的限制，如水或乙腈均可使用。優選溶液是水溶液。
本發明意義上的吸附劑是固體或其它類似凝膠的物質，在其表面上另一種物質的吸收可以發生。此處術語“表面”也指三維基材的內部表面，如一種三維結構沸石的內表面。
本發明中吸附劑的例子為硅膠，活性碳和硅鋁酸鹽。
硅鋁酸鹽是本領域技術人員公知的。術語硅鋁酸鹽含有，例如，酸活化的膨潤土(精制用的白土)和沸石。酸活化的膨潤土(精制用的白土)是其中蒙脫石(可膨脹的或粘土礦)通過酸處理被部分溶解，并因此具有高表面積和大微孔體積的膨潤土。膨潤土是通過風化火山巖灰(石灰華)形成的粘土，并且由礦物蒙脫石和貝得石(綠土礦物組)組成。
在本

發明內容
中尤其優選的硅鋁酸鹽是沸石。在本文中，那些不含鋁的沸石也在本發明的范圍內。
沸石是廣泛分布的一組結晶性硅酸鹽，更精確的說，是一種含水的堿金屬或堿土金屬硅鋁酸鹽，通式為M2/zO□Al2O3□xSiO2□yH2O，其中M＝單價或多價金屬(通常為一種堿金屬或堿土金屬陽離子)H或NH4等，z＝陽離子的化合價，x＝0.8～約12，y＝0～約8。SiO2相對于Al2O3的化學計量比例(模量)是沸石的一個重要參數。
沸石的晶格由SiO4和AlO4四方體構建，通過氧橋鍵連接。這在空間產生相等孔穴結構(吸附)的排列，有可進入的通道或開孔，其中彼此之間尺寸相等。這種類型的晶格可作為分子篩，其容許相對于開孔具有較小截面的分子到達該晶格的孔穴，同時較大分子不能穿過。因而沸石也被稱為分子篩。靜電相互作用，氫鍵和其它分子內力也在吸附上發揮作用。沸石的許多化學和物理性質依賴于鋁的含量。
本發明中的術語沸石不僅涉及天然的，也包括合成沸石。
天然沸石通過火山玻璃或含有石灰華的沉積物水熱轉化形成。根據它們的晶格，天然沸石可以被分成纖維性沸石(如發光沸石，MOR)，葉狀沸石和立方體沸石(如八面沸石，FAU和鉀沸石，OFF)。通常將不同的沸石給予三個字母代碼(例如MOR，FAU，OFF)。
為了制備合成沸石，初始使用的原料為含有SiO2(如水玻璃，硅土填料，硅溶膠)和含有Al2O3(如氫氧化鋁，鋁酸鹽，高嶺土)的物質，其與堿金屬氫氧化物(通常為NaOH)一起在超過50℃溫度下的水相中轉變為結晶沸石。
對用于工業吸收劑的合成沸石需可進一步修飾。優選的沸石孔尺寸至少為7。孔尺寸和沸石極性影響例如不同糖的重量分布，例如其帶來不同的色譜分離性質。低鋁沸石普通為極性，并因此優先吸附食糖。
如前所述，沸石可以適應不同的分離問題。最初的制備可影響孔的尺寸，并且極性可以通過減少鋁含量的后處理改變。
本發明優選的沸石為FAU，BEA和OFF。在本發明中，不同的沸石各自有不同的優點，性能見實施例1。尤其優選OFF。
使用硅鋁酸鹽富集原則上可以采用兩種不同的方法進行。硅鋁酸鹽或者吸收不要的雜質以使溶液中主要為海藻糖，或者吸收海藻糖以使不想要的雜質留在溶液中。在兩種情況下均優選發生的吸附選擇性盡可能高。
作為吸附器，可以使用固定床，移動床和流化床吸附器。吸附可以間歇進行或連續進行。
在海藻糖被硅鋁酸鹽吸附的具體實施方案中，有許多優點。用于分離海藻糖所需的工藝步驟數通過選擇性富集海藻糖而減少(相比較以前分離海藻糖的方法，其中經常有多種不想要的雜質不得不通過一步一步地除去)。相比較分步除去雜質，副產品/廢棄蒸汽的量降低。海藻糖由于選擇性吸附，甚至在用硅鋁酸鹽初步富集后，就以高純度形式存在。由于減少了工藝步驟及降低了副產品/廢棄蒸汽的量，產品生產成本降低。此外，相當低濃度的海藻糖通過選擇性吸附可以進行成本合算地有效地富集。
因而，在本發明實施方案中優選硅鋁酸鹽，尤其為沸石，相比較溶液中存在的不需要雜質，對海藻糖進行選擇性吸附、優選進行高選擇性結合。
在海藻糖吸附到硅鋁酸鹽后，下一步，海藻糖可以由硅鋁酸鹽上洗脫。例如，使用甲醇、乙醇、水、熱水(50-100℃)、熱甲醇(50-65℃)、熱乙醇(50-80℃)或其它合適的洗脫劑，如二氯甲烷、乙腈、NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)、DMSO(二甲亞砜)、短鏈酮或短鏈醚進行洗脫。在本文中短鏈意思是鏈長至多為C10，優選至多為C6，更優選至多為C4。
本發明的另一個實施方案涉及一種富集海藻糖的方法，其中使用的吸附劑用于色譜分離中。在色譜方法中，海藻糖可以通過與存在溶液中的其它物質間不同的流出時間行為得到分離。產生含有海藻糖的產品餾分。
本發明含義上的術語“色譜法”包括所有已知和合適的色譜分離方法，如固定床色譜、移動床色譜和模擬移動床色譜。色譜分離可以間歇進行或連續進行。連續色譜可以例如使用Continous Rotating AnnularChromatograph(CRAC)，True Moving-Bed Chromatograph(TMBC)和Simulated Moving-Bed Chromatograph(SMB)來進行。
從含有海藻糖的流出液中，可以通過本領域技術人員公知的和合適的后續方法進行進一步的富集或純化。
例如，通過沉淀進一步富集或純化海藻糖。在這一步，將希望得到的有價值材料或者雜質沉淀出來。沉淀可以通過加入一種進一步的溶劑、加鹽或變化溫度來起動。最終的固體沉淀可通過本領域技術人員公知的方法分離。
例如，可通過過濾分離固體，如加壓或真空過濾。也可使用濾餅過濾、深度過濾和交叉流過濾。優選交叉流過濾。此處更優選使用微過濾分離＞0.1μm的固體。
還可以采用沉積和/或離心分離固體。可以使用各種型號的儀器進行離心，例如，管式和籃式離心機，尤其是推動器，反向過濾離心機和盤式分離器。
可使用活性碳或離子交換劑(陰離子交換劑和/或陽離子交換劑)進行處理，作為進一步富集或純化步驟。這種類型的方法可以由現有技術中得知(參見，如US 5,441,644，US 5,858,735和EP 0555540A1)。
進一步的富集，尤其是純化，可使用微過濾和超濾(例如濾餅、深度和交叉流過濾)和反向滲透。這種情況下，微孔、均相、不對稱和電子荷電膜均可使用，其可通過公知的方法生產。通常膜的材料為纖維素酯、尼龍、聚氯乙烯、丙烯腈、聚丙烯、聚碳酸酯和陶瓷。
模的使用方式可以為，例如平面模、螺旋模、管簇和中空纖維模。此外，也可使用液體膜。海藻糖不僅可以被富集在進料側并通過保留物移出，也可以在進料側貧化并通過濾出物/滲透物移出。
為進一步富集海藻糖，尤其是純化和最后加工，可使用多種本領域技術人員公知的方法。此處優選的方法是結晶。結晶可以通過，例如冷凍、蒸發、真空結晶(絕熱冷卻)、反應結晶和鹽析。例如可以在攪拌的和非攪拌的槽中、用直接接觸的方法、在蒸發結晶器、真空結晶器中間歇或連續地結晶，結晶器可以是例如，壓力循環結晶器(Swenson壓力循環結晶器)或流化床結晶器(Oslo型)。也可以分部結晶。
海藻糖的結晶通常是本領域人員人員熟悉的，并已有廣泛描述，包括從水溶液中結晶(參見US 5,441,644第4-5欄)。例如，結晶也可以通過預先的超濾實現。
一個特別典型的結晶海藻糖的方法是從合適的溶劑中冷卻結晶，溶劑為例如乙醇、甲醇、水、二氯乙烷、乙腈、NMP、DMSO、短鏈酮或短鏈醚。在本文中，短鏈指鏈長至多為C10，優選至多為C6，更優選至多為C4。
另一個結晶的方法是沉淀結晶。在這種方法中，海藻糖存在于如水中，然后通過加入一種低溶解度的溶劑，如短鏈醇或短鏈酮，沉淀出來。在本文中，短鏈指鏈長至多為C10，優選至多為C6，更優選至多為C4。
通過加入少量的海藻糖晶體可以加速結晶，海藻糖晶體作為晶種。
還存在其它的方法進一步富集海藻糖；尤其對于純化和最后加工，其為干燥。有對流干燥的方法，例如用干燥箱、隧道式干燥器、帶形干燥器、盤式干燥器、噴射干燥器、流化床干燥器、充氣旋轉鼓干燥器的干燥方式和噴霧干燥方式。本發明優選的方法是噴霧干燥。還可以利用接觸干燥，例如，葉片干燥器。同樣，熱輻射(紅外)和電介能(微波)也可以用于干燥。其它的方式還有真空干燥或凍干。也可以使用濃縮方式，也就是說，干燥導致富集，但干燥至干不是必需的。
進一步富集海藻糖的另一個方法，尤其是對于純化和最后加工，是納米過濾。在這種方法中，海藻糖全部或部分被保留在滯留側而富集。
對本領域技術人員來說，顯而易見的是，所述的進一步富集步驟不僅可以在本發明的用硅鋁酸鹽處理之前進行，也可以在其之后進行。
在另一實施方案中，本發明涉及一種從源自酶合成海藻糖的溶液中富集海藻糖的方法。酶法合成海藻糖是本領域人員公知的(例如參見Schiraldi，C.，et al.(2002)Trehalose ProductionExploiting NovelApproaches.Trends in Biotechnology，vol.20(10)，page 420-425和US5,919,668和EP 0990704A2)。
在一個實施方案中溶液是發酵肉湯。
本發明含義中，發酵肉湯是在真核和原核細胞的培養中產生的，尤其是微生物(例如細菌、酵母或其它真菌類)。
在合成海藻糖中優選的微生物為酵母菌(Saccharomyces spec.)，尤其是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；芽孢桿菌(Bacillus Spec.)；念珠菌(Candida spec.)，尤其是發酵念珠菌(Candida fermentii)；大腸桿菌(Escherichia coli)；棒桿菌(Corynebacterium spec.)，尤其是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidofirum)(例如ATCC 13870)，百合棒桿菌(Corynebacterium lilium)(例如ATCC 15990)和棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium melaseccola)(例如ATCC 17965)；假單胞桿菌(Pseudomonas spec.)；諾卡氏菌(Nocardia spec.)；短桿菌(Brevibacterium spec.)，尤其是Brevibacterium lactofermentum(例如ATCC 13869)，Brevibacterium fiavum(例如ATCC 14067)和叉開短桿菌(Brevibacterium divaricatium)(例如ATCC 21642)；節桿菌(Arthrobacter spec.)，尤其是Arthrobacter sulfureis(例如ATCC 15170)，Arthrobacter citoreus(例如ATCC 11624)；曲霉菌(Aspergillus spec.)；鏈霉菌(Streptomyces spec.)；微桿菌(Microbacterium spec.)，尤其是Microbacterium ammoniaphylum(例如ATCC 15354)；畢赤酵母(Pichiaspec.)和絲擔子菌(Filobasidium spec.)，尤其是Filobasidium fioriforme。
其它本領域技術人員公知的微生物，例如參見Miyazaki，J.-I.，et al.(1996).，Trehalose acumulation by a basidiomycotinous yeast，Filobasidium fioriforme.Journal of Fermentation and Bioengineering，vol.81(4)，pages 315-319。
通過突變或遺傳修飾衍生的這些菌株的變異體，或其具有增加海藻糖合成能力的變異體，也可以用于本發明中。
微生物也可以通過添加合適的抗生素進行培養，例如添加一種β-內酰胺環抗生素誘導合成海藻糖。
在這種情形中，發酵肉湯首先不僅含有細胞，而且還有培養基。根據發酵類型，主要部分的海藻糖可以在細胞內部堆積。這種情況下，有利的是是消化使用的細胞，并且使用合適的方法萃取海藻糖。合適的方法例如超聲處理、清潔劑處理、堿溶解和/或醇萃取或三氯乙酸萃取(JP 07 000190，US 5,441,644)都是本領域技術人員公知的。
在發酵肉湯中通常有相當量的固體應優選地首先被分離除去。
本發明中使用的術語“固體”也包括細胞和細胞組成物，如核酸和蛋白質。為分離這些固體，尤其是細胞組成物，有利的是首先聚積它們。可用各種合適的方法來進行，然而在此種情況下應盡可能避免海藻糖分解(例如水解)。合適的方法包括，如堿處理，例如Ca(OH)2處理，或熱處理。這種情況下，有利的是使可能存在的海藻糖活性的酶也同時失活。
固體可以用本領域技術人員公知的方法除去。相關方法前面已經提到。
本方法也適合從溶液中富集海藻糖，尤其是發酵肉湯，其中海藻糖以低濃度存在，尤其是低于15重量％，根據發酵肉湯的干重測定。
通常，海藻糖的濃度根據發酵肉湯的干重測量為3-8重量％。在分離其它有價值的產品(如賴氨酸)后，海藻糖的質量分數可以增加到10-20重量％，根據剩余發酵肉湯的干重測定。如果在初始階段也對作為不溶組分的生物量進行分離，則海藻糖的濃度達到20-40重量％，根據發酵肉湯的干重測定。
因而，本發明的另一種實施方案也是一種從發酵肉湯中富集海藻糖的方法，其中海藻糖的濃度至少低于15重量％，根據發酵肉湯的干重測定。
在許多發酵中，有多種有價值產品產生。經常地，海藻糖也作為另一種有價值的產品同時產生。問題是，用于發酵產生的物質的富集或純化方法，要特定適合每一個有價值產品本身(例如在氨基酸或有機酸的情況下是通過離子交換色譜純化)。在富集第一價值產品后，其它價值產品，如海藻糖，實際上存在于阻礙富集其它有價值產品的環境中(例如從離子交換材料上洗脫氨基酸后的高離子濃度)。這在海藻糖中尤其是一個問題，由于海藻糖不具備適合簡單富集的特別化學性質(例如在水溶液中低溶解性或電荷)。因此，海藻糖常常與發酵的廢物流一起被丟棄。
因此本發明的另一個目的是從發酵肉湯中提取海藻糖作為進一步有價值的產品，其中第一有價值產品已經被或提前或隨后提取。
本發明的另一個具體實施方案涉及一種從發酵肉湯中富集進一步有價值產品海藻糖的方法，從中已經或得到了至少一種第一有價值產品，該方法包括分離固體和使用吸附劑富集海藻糖的步驟，其中吸附劑是硅鋁酸鹽。
本方法的不同之處在于，其特別能容忍存在海藻糖的溶液的性能。因而，當海藻糖存在于通常阻礙其富集的環境中時，本發明的方法也可以使用。
不同的是，本發明對存在海藻糖的溶液的處理特別溫和，使得其它有價值的產品即使在富集海藻糖之后也可以獲得。
因而，海藻糖可以在得到第一有價值產品之前、之后或同時間得到。
在本發明的含義之內，有價值的產品包括例如有機酸、蛋白原的和非蛋白原的氨基酸，核苷和核苷酸、脂質和脂肪酸、二醇、碳水化合物、芳香化合物、維生素和輔助因子，儲藏物質，例如PHA(聚羥基烷酸酯)或PHB(聚羥基丁酸酯)，和蛋白質與多肽(例如酶)。
本發明中優選的第一有價值產品為氨基酸賴氨酸。
此外，在本說明書或實施例中描述的方法中本發明涉及使用硅鋁酸鹽，尤其是沸石。
在示例性的實施方案中，描述了適合從發酵肉湯中純化海藻糖的方法，其中另一種有價值的產品已預先得到。
附圖和實施例用于更進一步詳細解釋本發明。


如下圖1顯示沸石對于蔗糖(sac)和麥芽糖(malt)相對于海藻糖(tre)的選擇性。
圖2顯示選擇的沸石孔尺寸對于蔗糖(sac)和麥芽糖(malt)相對于海藻糖(tre)的選擇性。
孔尺寸的測量用空間填充的原子中心球體來表示原子的范德華體積，如MSI Program Materials Studio定義的，球的半徑與范德華半徑一致。在沸石孔中施用0.9的膨脹系數到該原子的范德華半徑之上，并且一個氦原子隨后放入孔的中心。氦的范德華半徑膨脹系數用手最優化，直到氦原子的膨脹空間填充體積接觸到沸石孔的空間填充體積。氦的膨脹系數用作孔(孔尺寸)的膨脹系數。
圖3顯示對碳氫化合物相對于選擇的沸石的孔尺寸的選擇性。
實施例1為了定量比較在各種沸石中糖的擴散性，進行了理論計算。這樣，沿擴散坐標上進行傳統的動態分子模擬。擴散坐標通過應用于沿最大孔或最寬通道的軸向上的小驅動力測定。這模擬了一種濃度梯度的效果。
研究首先做的是該模擬是否定性地得到正確結果。為了這樣的目的，計算麥芽糖和蔗糖在FAU和BEA中的擴散時間，與實驗結果相比較。根據計算，通過FAU時，麥芽糖的擴散明顯較海藻糖和蔗糖慢(見表1)。這與麥芽糖較蔗糖具有明顯較低吸附能力的試驗數據一致。
對于BEA，在使用的時間刻度內，計算的結果是，蔗糖沒有通過沸石遷移(見表2)。這種結果(不吸附)是實驗測量的其它1-2Fru二糖的一般特性。從BEA和FAU的結果來看，得到的結論是，對于FAU和BEA中麥芽糖和蔗糖的相對“溶解性”，該計算定性地得到正確預測。
首先排列了一系列用于分離海藻糖、麥芽糖和蔗糖的合適沸石的候選物質(見表1)。
表1

使用這些沸石對所有3種糖進行動態分子模擬。在這種方法中，關于通過相應通道擴散的糖的相對選擇性，可以被計算得出。
動態分子力場模擬在微正則系綜、298K下操作。分子通過靜電力驅使，通過沸石結構中的孔的相對時間被測定。靜電力通過帶電氦原子固定在分子孔的相對側面的方法來形成，分子被每一個原子上的相應相反電荷均一地帶電。例如，當氦原子具有電荷為+1.5q時，最接近氦原子的海藻糖的5個原子，每一個設定電荷為-0.3q。系統上其它保留的原子為非荷電。表1中的選擇性根據下列公式計算選擇性＝t海藻糖/t食糖，此處當t食糖＞8000ps，t食糖＝8000ps，計算的食糖擴散時間被列在表2中。
表2

圖1中的曲線代表選擇性。從圖1中可以清楚看出，每一種沸石有不同從糖混合物中分離出海藻糖的能力。最通用的是不含鋁的OFF(鉀沸石)，相對于其它兩種糖，明顯的優選海藻糖。FAU和BEA同樣地顯示對海藻糖相對高的選擇性，同時對蔗糖和麥芽糖一定的選擇性。
實施例2氫氧化鈣沉淀，離心，活性碳處理，干燥殘留物，富集海藻糖1L賴氨酸發酵肉湯，在賴氨酸已經被離子交換劑分離除去后，加入250g固體氫氧化鈣混合。懸浮液攪拌4小時后，3000g懸浮液被實驗室離心機離心10min。結果，從深褐色的發酵肉湯中得到800mL黃色的上清液，該上清液含有初始使用的8g海藻糖中的7.6g。加入400g的活性碳粉末，進一步純化此上清液。在室溫保溫12小時后，活性碳被過濾分離出去。得到650mL的淡黃色濾液，其中總共含有6.3g海藻糖。最后，凍干濾液。9.7g殘留物中含有海藻糖64.9重量％。
實施例3氫氧化鈣沉淀，過濾，活性碳處理，干燥殘留物，富集海藻糖相比較實施例2，在氫氧化鈣沉淀后，形成的固體通過過濾分離。產生730mL的黃色濾液。進一步的工藝操作與實施例2類似，結果得到8.7g干的殘留物，海藻糖含量為66.2重量％。
實施例4通過熱誘導沉淀，交叉過濾，活性碳處理，干燥殘留物，富集海藻糖實施例5氫氧化鈣沉淀，活性碳處理后離心，干燥殘留物，富集海藻糖1L賴氨酸發酵肉湯，在賴氨酸被離子交換劑分離后(海藻糖含量11g/L)，加入250g固體氫氧化鈣混合。懸浮液攪拌4小時后，3000g懸浮液被實驗室離心機離心10min。20g活性碳加入到所獲得的800mL深褐色上清液中，并且混合物在室溫保溫19小時。活性碳被過濾分離出去。濾液含8.9g海藻糖。真空濃縮，得到72.6g黑褐色粘稠殘留物，海藻糖含量為10.4重量％。
實施例6活性碳吸附、甲醇解吸富集海藻糖100mL含有海藻糖的發酵肉湯(含量9.76g/L)與10g活性碳(CPG12x40)一起在室溫下振搖16小時。在混合物通過短頸抽吸過濾器過濾后，活性碳與100mL甲醇在室溫下振搖60小時。再次過濾后，濾液在旋轉蒸發器上濃縮至干。1.1g褐色殘留物含有300mg海藻糖(27重量％)。
實施例7活性碳吸附、乙醇解吸、冷凍結晶富集海藻糖300mL海藻糖溶液(含量9.25g/L)與20g活性碳一起在室溫下振搖18小時。混合物通過短頸抽吸過濾器過濾后，活性碳與300mL乙醇混合并攪拌回流15小時。熱過濾活性碳，濾液冷凍至0-5℃，結晶出海藻糖。混合物抽濾后，得到1.3g淺灰色海藻糖結晶。濾液在旋轉蒸發器上濃縮至干，得到0.1g無色海藻糖晶體。
過濾之后，該活性炭與300mLMeOH在室溫下振搖16小時，過濾和濾出之后，該濾液在旋轉蒸發器上濃縮，結果進一步得到0.5g基本上白色的海藻糖晶體。
實施例8硅膠吸附、甲醇解吸富集海藻糖100mL含有海藻糖的發酵肉湯(含量14g/L)與10g硅膠(MR3482)一起在室溫下振搖19小時。混合物通過玻璃抽濾瓶抽濾后，硅膠與100mL甲醇在室溫下振搖16小時。再次過濾后，濾液在旋轉蒸發器上濃縮至干。1.5g褐色殘留物含有110mg海藻糖(7重量％)。
權利要求
1.一種從溶液中富集海藻糖的方法，其中富集通過使用一種吸附劑進行，其中包括使用硅鋁酸鹽作為吸附劑。
2.如權利要求1所述的方法，其中的硅鋁酸鹽是沸石。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中海藻糖被硅鋁酸鹽吸附。
4.如權利要求2或3所述的方法，其中沸石選自FAU、BEA、DON、EMT、CFI、MOR、MAZ和OFF。
5.如權利要求1-4任一項所述的方法，其中在色譜法中使用吸附劑。
6.如權利要求1-5任一項所述的方法，其中溶液源自酶法海藻糖合成。
7.一種由發酵肉湯中富集海藻糖的方法，包括分離固體和使用吸附劑富集海藻糖的步驟，其中使用硅鋁酸鹽作為吸附劑。
8.如權利要求7所述的方法，其中硅鋁酸鹽是一種沸石。
9.如權利要求7或8所述的方法，其中除海藻糖外，至少還有另一種有價值的產品從發酵肉湯中分離出。
10.如權利要求7-9任一項所述的方法，其中發酵肉湯源自至少一種選自下組的微生物發酵酵母菌(Saccharomyces spec.)，念珠菌(Candidaspec.)，大腸桿菌(Escherichia coli)；棒桿菌(Corynebacterium spec.)，谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，假單胞桿菌(Pseudomonasspec.)，諾卡氏菌(Nocardia spec.)，短桿菌(Brevibacterium spec.)，節桿菌(Arthrobacter spec.)，鏈霉菌(Streptomyces spec.)；微桿菌(Microbacterium spec.)，曲霉菌(Aspergillus spec.)，芽孢桿菌(BacillusSpec.)，畢赤酵母(Pichia spec.)和絲擔子菌(Filobasidium spec.)。
11.如權利要求7-10任一項所述的方法，其中海藻糖以低于15％重量的濃度存在于發酵肉湯中，以發酵肉湯的干重測定。
12.如權利要求1-11任一項所述的方法，其中該方法包括至少一個選自活性碳處理、超濾和離子交換劑處理的步驟。
全文摘要
本發明涉及一種從溶液中富集海藻糖的方法，其中富集使用一種吸附劑進行，吸附劑為硅鋁酸鹽。優選的硅鋁酸鹽為沸石。本發明進一步涉及由發酵肉湯中富集和純化海藻糖的方法，特別是作為發酵生產其它有價值產品的關聯產品。
文檔編號C07H3/00GK1696139SQ20051006562
公開日2005年11月16日 申請日期2005年3月18日 優先權日2004年3月18日
發明者M·博伊, M·蓬佩尤斯, D·克萊因, M·弗爾克特, J·R·布朗 申請人:巴斯福股份公司