純化抗體的工藝的制作方法

專利名稱：純化抗體的工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及純化抗體，例如單克隆抗體的工藝。更具體地，本發明涉及俘獲抗體的方法；使用至少兩個層析步驟純化抗體的工藝；使用本發明的方法純化抗體的試劑盒；和層析柱。
背景免疫系統由許多相互依賴的細胞類型組成，它們集體地保護軀體對抗細菌、寄生蟲、真菌、病毒感染和對抗腫瘤細胞的生長。免疫系統的衛士是它們宿主的血流中不斷地漫游的巨噬細胞。當受到感染或免疫的攻擊時，巨噬細胞通過吞入標記了稱為抗原的外來分子的侵入物來進行響應。這個由輔助T細胞介導的事件建立了引起B細胞刺激的復雜的反應鏈。這些B細胞隨后產生稱為抗體的蛋白，其與外來侵入物結合。在抗體和抗原之間的結合事件標記了外來侵入物以通過吞噬作用或補體系統的活化來進行破壞。存在著許多不同種類的抗體或免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。它們的不同不僅在于生理學作用，還在于它們的結構。從結構的角度來看，IgG抗體是已經廣泛研究了的特別種類的免疫球蛋白，可能是由于它們在成熟免疫反應中起到的顯著作用。
當今在人類和獸醫學的診斷、保健和治療領域的大量不同應用中利用了免疫球蛋白擁有的生物學活性。實際上，在近幾年中，單克隆抗體和重組抗體構建體已經成為當前在臨床試驗中進行研究的和接受FDA批準作為治療劑和診斷劑的最大一類蛋白。作為對表達系統和產生策略的補充，設計了純化方案來以簡單和低成本的方式獲得高純度抗體。
分離免疫球蛋白的傳統方法基于包含免疫球蛋白的蛋白級分的選擇性可逆沉淀，而將其他的蛋白質組群留在溶液中。典型的沉淀試劑是乙醇、聚乙二醇、易溶鹽例如硫酸銨和磷酸鉀和辛酸。一般地，這些沉淀方法得出非常不純的產物而同時是費時和費力的。此外，向原料中添加沉淀試劑使得難以將上清液用于其他目的并且產生了處理難題，當論及免疫球蛋白的大規模純化時這是特別相關的。
分離免疫球蛋白的可選擇的方法是層析，其包括緊密相關的分離方法的家族。將層析與大多數其他物理和化學的分離方法區分開來的特征是使兩種互不混合的相接觸，其中一個相是固定的，另一個是移動的。引入移動相的樣品混合物在被移動相攜帶通過系統時，在固定相和移動相之前經歷了一系列的相互作用。相互作用利用了樣品中的成分的物理或化學性質的差異。在移動相運動通過含有固定相的柱的影響下，這些差異決定了單個組分的移動速度。分離的成分按照與固定相的相互作用升高的順序出現。阻滯最小的成分首先洗脫，最強烈滯留的材料最后洗脫。當樣品成分從柱上洗脫時，當一種成分被阻滯到足以防止與鄰近的溶解物的區域重疊時，得到了分離。對于每種特定的分離目的不斷地進行著努力來設計最佳的固定相。這種固定相通常包含支持基質或基礎基質，在其上連接了包含功能基團即結合基團的配體。根據所利用的相互作用的原理，對每一種層析都給出了參考。工業上的層析工藝常常包括超過一個的步驟，從俘獲步驟開始、其是從粗的或澄清的進料初步純化目標分子；隨后是中間純化步驟和最終的精煉步驟。離子交換層析常被用于免疫球蛋白的分離。在陰離子交換層析中，免疫球蛋白的帶負電的氨基酸側鏈將與層析基質的帶正電的配體相互作用。另一方面在陽離子交換層析中，免疫球蛋白的帶正電的氨基酸側鏈將與層析基質的帶負電的配體相互作用。
疏水性相互作用層析(HIC)也是用于免疫球蛋白分離的廣泛描述的方法。然而，疏水性基質需要向原料中添加易溶鹽來使免疫球蛋白有效地結合。通過以連續的或階梯式的梯度來降低易溶鹽濃度，從基質上釋放結合的抗體。如果目的是高純度產品，建議的是將疏水性層析與進一步的步驟結合。這種步驟的缺點是必需向原料中添加易溶鹽，因為這產生了一些難題并且因而提高了大規模使用的成本。對于除了細胞培養上清液以外的其他原料，例如，乳清、血漿和蛋黃，向原料添加易溶鹽在許多情況下阻礙了大規模應用，因為鹽會妨礙耗盡了免疫球蛋白的原料的任何經濟上可行的用途。在大規模應用中的另外的難題是數千升廢料的處理。
蛋白A和蛋白G親和層析是用于分離和純化免疫球蛋白、特別是分離單克隆抗體的流行和普遍的方法，主要是由于易于使用和所獲得的高純度。與離子交換、疏水性相互作用、羥磷灰石和/或凝膠過濾步驟，特別是基于蛋白A的方法組合使用，已經成為許多生物藥公司選擇的抗體俘獲方法，參見，例如WO8400773和US 5,151,350。
已經建議了將蛋白A層析與疏水性相互作用層析(HIC)組合。US 5,429,746(SmithKline Beecham Corp.)涉及應用疏水性相互作用層析作為抗體純化中的一個步驟。其中公開了可以在采用例如蛋白A的親和層析之后如何使用HIC，任選的具有中間的陽離子交換層析步驟。通過弱陽離子交換劑(CM SepharoseTMFF)說明了陽離子交換層析，其被調節到pH 5.5用于吸附，用40mM檸檬酸鹽、100mM氯化鈉pH 6的洗脫緩沖液來洗脫。將混合物施加到HIC柱，隨后是親合性和/或陽離子交換層析，則可能含有混雜物，例如免疫球蛋白聚集物、錯誤折疊的碎片、宿主細胞蛋白和來自親和層析步驟的殘余材料。在這種工藝中，抗體首先吸附到蛋白A層析支持物上并被洗脫，然后吸附到陽離子交換層析支持物并從上選擇性地洗脫；最后吸附到HIC支持物并被洗脫。
作為對基于蛋白的親和柱的替代，已經提出了將純化學的樹脂，例如多式樹脂用于抗體純化，其中不同的但共同作用的位點與目標相互作用。一個商業上可獲得的實例是MBI Hypercel(BioSepra)，是一種包含巰基-苯并咪唑-磺酸配體的吸附劑，聲稱提供了疏水性以及與抗體的離子相互作用。疏水性相互作用假定是歸因于芳香環系統，而離子相互作用應當歸因于SO3-取代基，已知其是強陽離子交換劑。此外，MBI配體的芳香族系統的氮原子是在一定條件下可帶電的，因而可以提供與帶負電基團的離子相互作用。
US 6,498,236(Upfront Chromatography)公開了一種從溶液，例如雜交瘤細胞培養上清液、動物血漿或血清分離或純化免疫球蛋白的方法。提出了將該方法作為對使用蛋白A、蛋白G、合成肽和其他相對高分子量配體的替代，由于配體和免疫球蛋白的各自分子量之間的微小差異，以及由于它們相互結合的天然趨勢，已經陳述了這些配體包含了一些缺點。根據US 6,498,236，在它們的配體上存在的取代基的性質對于有效地結合免疫球蛋白是決定性的。更具體地，在所公開的方法中使用的固相基質由化學式M-SP1-X-A-SP2-ACID來描述，其中M代表基質主干，SP1代表間隔區，X代表O、S或NH，A代表單環或二環的任選的取代芳香族或芳香雜環部分，SP2代表任選的間隔區和ACID代表酸性基團。配體優選的來源于選自由苯并咪唑、苯并噻唑和苯并唑構成的組的化合物。
WO97/10887(Novo Nordisk A/S)涉及親和性配體-基質的結合物，在蛋白質材料例如免疫球蛋白、胰島素、因子VII或人生長激素或類似物、衍生物和其片段的純化中是有用的。發明WO97/10887是基于這種觀點，疏水性配體的選擇性可以通過提高疏水性成分的復雜度和空間幾何結構來提高。這個觀點引起了一組親和性配體的發現，這個組限于具有雜芳香族實體的結構，其中至少一個成環原子是氮。
進一步的，在WO 03/024588(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)中公開了合成多式陽離子交換媒介的方法。更具體地，將包含兩個功能性，優選的同型半胱氨酸硫內酯(thiolactone)的支架衍生化并與固體基礎基底矩陣反應。更具體地，兩種功能性之一，優選的硫(sulphur)，用于與基質連接，第二種功能性是可以轉化成離子基團的一種。因而，如此產生的多式媒介能夠進行離子相互作用以及進一步的種類的相互作用，例如疏水性相互作用，取決于衍生化作用的性質。在實驗部分，使用三種模型蛋白測試了生產的陽離子交換劑，即，細胞色素C(Cyt C)、牛血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白G(IgG)。
本發明的簡要說明在一個方面，本發明提供了純化抗體的耐用的工藝。這可以通過使包含所述抗體的液體接觸包含支持物的第一層析樹脂，所述支持物上已經固定了多式(multi-modal)配體，通過將抗體從樹脂上釋放來洗脫所述抗體，用第二層析樹脂接觸洗出液，如在附隨的權利要求中詳細地定義的。
在進一步的方面，本發明提供了從比現有技術的方法更小體積的進料純化抗體。更具體地，本發明提供了從工藝進料中俘獲抗體的方法，而不需要稀釋工藝進料中的鹽濃度。這可以通過如上所述的工藝實現，其中所述多式配體是耐鹽性的配體，稱為“高鹽配體”。這樣的第一步驟任選的繼之以使用包含支持物的層析樹脂的第二層析步驟，所述支持物上已經固定了包含陰離子交換基團的多式配體。
在特定的方面，本發明提供了一種工藝，其中第二層析步驟在非結合條件下進行。
根據以下的詳細公開，本發明的其他方面和益處將更為明顯。
附圖的簡要說明附

圖1顯示了在多式陽離子交換層析媒介上純化含有IgG的進料的層析譜。
附圖2顯示了進料的分析性凝膠過濾層析譜，如以下的實施例3所解釋的。在13ml處的峰是目標MAb，其余的峰是聚集物和/或宿主細胞蛋白。
附圖3顯示了從U1128042洗脫的集中級分9-16的分析性凝膠過濾層析譜，如實施例3所解釋的。
附圖4顯示了根據本發明的工藝的步驟2的層析譜，更具體的是使用多式陰離子交換層析的精煉步驟，如以下的實施例4所解釋的。
附圖5顯示了在柱238092上施加的流通物(級分3-10)的分析性凝膠過濾層析譜，如以下的實施例4所解釋的。
定義在本說明書中術語“抗體”和“免疫球蛋白”可互換地使用。
術語“洗脫液”按其在本領域中的常規含義使用，即，有適合的pH值和/或離子強度以從分離基質釋放一種或多種化合物的緩沖液。
術語“親和層析”是指基于以鎖-匙識別的原則在目標生物分子和生物特性配體之間的特異性相互作用的層析。因而，目標和配體將構成親和配對，例如抗原/抗體、酶/受體，等等。
術語“芳香族”基團是指根據Huckel′s由規則化學式(4n+2)定義的基團，其中n是正整數或零。
在此使用術語“層析樹脂”來表示已經聯結了稱為配體的官能團的支持物。術語“基質”有時用來表示支持物。
術語“多式層析配體”是指能夠提供與要結合的物質相互作用的至少兩個不同的但共同起作用的位點的配體。這些位點之一提供了在配體和感興趣的物質之間的吸引人的電荷-電荷相互作用類型。另一個位點一般提供了電子的受體-供體相互作用和/或疏水性和/或親水性相互作用。電子供體-受體相互作用包括例如氫鍵、π-π、陽離子-π、電荷轉移、偶極-偶極、感生偶極等的相互作用。多式層析配體也稱為“混合式”層析配體。在當前的應用中，其中配體是多式配體，在多式配體中的電荷-電荷相互作用基團是帶負電的層析樹脂表示為“多式陽離子交換樹脂”，而其中配體是多式配體，在多式配體中電荷-電荷相互作用基團是帶正電的層析樹脂表示為“多式陰離子交換樹脂”。
用語“電子供體-受體相互作用”是指，帶有游離電子對的負電原子作為供體起作用，并結合缺少電子的原子，缺少電子的原子作為供體的電子對的接受體起作用。(參見例如，Karger et al.，AnIntroduction into Separation Science，John Wiley & Sons(1973)第42頁。)術語“陽離子交換基團”在此是指帶負電的或可帶電的基團。
在液相色譜的上下文中術語“俘獲步驟”是指分離工藝的起始步驟。最通常地，俘獲步驟包括澄清、濃縮、穩定化和針對可溶混雜物進行重要的純化。在俘獲步驟之后，可以接著進行中間純化，其進一步降低混雜物的剩余量，例如宿主細胞蛋白、DNA、病毒、內毒素、營養物、細胞培養基的成分，例如防沫劑和抗生素，和與生產相關的混雜物，例如聚集物、錯誤折疊的種類和聚集物。
在液相色譜的上下文中術語“精煉步驟”是指最后的純化步驟，在其中除去痕量雜質留下活性的、安全的產物。在精煉步驟中除去的混雜物常常是目標分子或懷疑的漏出產物的構象體(conformer)。
術語“Fc結合蛋白”是指能夠與抗體的可結晶部分(Fc)結合的蛋白，包括，例如蛋白A和蛋白G，或其維持了所述結合性質的任何片段或融合蛋白。
發明的詳細說明本發明涉及從液體中俘獲一種或多種抗體的方法，該方法包括使所述液體接觸包含支持物的層析樹脂，所述支持物上已經固定了多式配體，來將抗體吸附到所述樹脂上，其中每個多式配體包含至少一個陽離子交換基團和至少一個芳香族或雜芳香族環系統，在所述系統中成環原子選自由碳(C)、硫(S)和氧(O)原子構成的組。
在本發明的有益的實施方式中，所述成環原子選自由碳(C)和硫(S)原子構成的組。在特定的實施方式中，所述成環原子是碳(C)原子。本方法可以對發酵液使用，所述發酵液優選的已經通過例如過濾進行了澄清以除去細胞碎片等等。最通常地，在俘獲方式中，不存在之前的層析。為了獲得更高純度的產品，本方法優選的繼之以進一步的純化，例如，通過層析、膜濾或任何其他的常規純化方法。因而，在一個實施方式中，所述多式層析俘獲步驟繼之以一個或進一步的純化步驟。
在一個方面，本發明涉及從液體純化一種或多種抗體的工藝，該工藝包括使所述液體與包含支持物的第一層析樹脂接觸，所述支持物上已經固定了多式配體，來將所述抗體吸附到所述樹脂上，其中每個多式配體包含至少一個陽離子交換基團和至少一個芳香族或雜芳香族環系統；添加洗脫液以從所述樹脂釋放抗體；用第二層析樹脂接觸如此獲得的洗出液。
因而，在第一步驟中，這是俘獲步驟，在結合條件下使包含抗體的液體接觸多式層析樹脂，容許吸附抗體和任選的一種或多種混雜物。在低于期望的抗體的等電點的pH值下，有利地緩沖接觸了第一樹脂的液體。在吸附步驟之后，稱為洗脫液的另一種液體將與樹脂接觸來解吸附，即，釋放所述抗體。洗脫液通常是緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液。在一個實施方式中，洗脫是通過增加pH值的逐步洗脫。然而，理解的是，本領域的技術人員可以容易地修改條件以獲得吸附和洗脫，例如通過另外調整pH值和/或鹽濃度，即，溶液的傳導性。在有益的實施方式中，本工藝的第一步驟是通過重力或泵送使液體和/或洗脫液通過裝填的層析柱。如果需要，在本工藝的層析步驟之間可以應用一個或多個洗滌步驟。應用于第一步驟的液體有利地是進料流，即，細胞培養液或發酵肉湯，其已經任選的經受了預處理，例如過濾、通過調節pH值和/或傳導性來整理，等等。因而，第一層析俘獲步驟將除去宿主細胞殘余物，例如細胞碎片和蛋白、DNA、內毒素，等等。直接對工藝進料使用本工藝的益處是，與常規樹脂相比，在此使用的特異性多式配體能夠在更高的鹽濃度下吸附抗體，因而這大大降低了或甚至消除了稀釋工藝進料的需要，如公知的，工藝進料是有相對高傳導性的。處理體積的減少將改善處理效率，并避免了對非常大和昂貴的設備的投資。在特定的實施方式中，本工藝作為膨脹床工藝來運行。
用于本工藝的多式層析樹脂可以由本領域的技術人員容易地制備。簡言之，所述樹脂包含多式配體，所述多式配體直接地或通過間隔區與有機或無機支持物聯結，支持物有時指基礎基質。支持物可以是粒子，例如基本上球形的粒子、整料、過濾器、膜、表面、毛細管，等等的形式。在一個實施方式中，所述支持物是從天然的多聚體，例如交聯的碳水化物材料，例如瓊脂糖、瓊脂、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、konjac、角叉菜膠、gellan、藻酸鹽等等制備的。為了獲得高的吸附能力，所述支持物優選的是多孔的，然后配體與外表面以及孔洞表面結合。這種天然的多聚體支持物可以根據標準方法容易地制備，例如反相懸浮凝膠化(S HjerténBiochim Biophys Acta 79(2)，393-398(1964)。做為選擇，所述支持物是從合成聚合物，例如交聯的合成聚合物，例如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基酰胺等等制備的。這種合成聚合物可以根據標準方法容易地生產，參見例如″Styrene basedpolymer supports developed by suspension polymerization″(R ArshadyChimica e L′Industria 70(9)，70-75(1988))。多孔的天然或合成聚合物支持物也可以從商業的來源獲得，例如Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden。對于用多式配體純化抗體有用的樹脂的特定實例是用于膨脹床吸附的樹脂，即，含有高密度填料，優選的不銹鋼填料的多聚體支持物。
如上所述，在本工藝中利用的層析樹脂的多式配體包含至少一個陽離子交換基團和至少一個芳香族或雜芳香族環系統。在可選擇的實施方式中，用于第一步驟的樹脂是多式的，包含兩種不同種類的配體，即陽離子交換基團和芳香族或雜芳香族環系統，優選的為基本上相當的數量。能夠與目標分子進行疏水性相互作用的芳香環系統可以包含一個或兩個環狀結構，由一個或多個原子或例如由萘基基團來分隔。進一步的，所述環狀系統任選的被例如烷氧基團，例如甲氧基取代。在一個實施方式中，所述芳香族或雜芳香族環系統不含有任何氮原子，但限于碳原子、硫原子和/或氧原子作為所述環狀結構的構成原子。因而，在這個實施方式中，第一步驟接觸使用包含芳香族或雜芳香族環系統的多式陽離子交換劑，所述環狀系統在成環位置中沒有氮。因而，在一個實施方式中，所述芳香族或雜芳香族實體的成環原子選自由碳(C)、硫(S)和氧(O)原子構成的組。在有益的實施方式中，所述芳香族或雜芳香族實體的成環原子選自由碳(C)和硫(S)構成的組。在特定的實施方式中，所述芳香族或雜芳香族實體的成環原子是碳(C)原子。
在一個實施方式中，用于本工藝的第一步驟的樹脂描述如下Sup-間隔區-X-陽離子交換基團-間隔區-芳香族或雜芳香族的環，其中Sup是支持物，間隔區是任選的；X是連結原子例如O、S或N。適合的間隔區和產生這種間隔區的聯結化學作用是本領域中公知的。因此，這個實施方式不同于以上討論的US 6,498,236，在US6,498,236中作為陽離子交換基團的酸性基團是對芳香族實體的取代。因而，在本實施方式中使用的樹脂可以預計容許不同的和在空間上更為擴展的種類的與目標化合物的鍵，因為當前的結構容許在芳香族和陽離子官能團之間的進一步的距離。
陽離子交換基團優選的是弱的陽離子交換劑，即，可以在某些pH值下質子化的基團。與弱陽離子交換劑相反，強陽離子交換基團包含在所有pH值下都保持帶電的基團。因而，在一個實施方式中，多式配體包含羧基，例如一個或兩個羧基。
然而，本領域技術人員將理解的是，如上所述的多式配體可以還有提供進一步的相互作用，例如氫鍵作用。除了以上討論的基團之外，在本工藝中使用的多式層析配體也可以包含一個或多個磺酰基基團、胺或羰基基團，其分別可以或可以不促進與混雜物和抗體的相互作用。
例如，與以上討論的載體連結來制備本工藝中使用的多式層析樹脂的配體可以按以上討論的WO03/024588(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)中所描述的來合成，其中包含弱陽離子官能團的多式配體從高半胱氨酸硫內酯開始合成。對于多式配體合成的進一步的參考文獻，參見例如WO 02/059059(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)。配體可以通過稱為間隔區的適合的距離元件與載體連結。對于對此有用的連結方法的綜述，參見例如Immobilized AffinityLigand Techniques，Hermanson et al，Greg T.Hermanson，A.KrishnaMallia and Paul K.Smith，Academic Press，INC，1992。如本領域中公知的，諸如配體密度或取代水平、支持物的孔隙大小等的參數可以變化，以提供具有期望的性質的層析樹脂。
本工藝的第二步驟包括用第二層析樹脂接觸從第一步驟獲得的洗出液。在一個實施方式中，第二層析步驟選自由離子交換層析；疏水性相互作用層析(HIC)；固定的金屬親和層析(IMAC)；和親和層析構成的組。所有所述方法和它們的使用是本領域技術人員公知的，可以方便地使用商業上可獲得的層析樹脂。關于支持物和配體的固定的以上討論的原則也適用于這個步驟。在一個實施方式中，第二步驟是精煉步驟，以除去細微的混雜物，產生高純度產品。在可選擇的實施方式中，第二步驟是中間步驟，在這種情況下，根據本發明的工藝還包括隨后的精煉步驟。在有益的實施方式中，第二步驟是離子交換層析步驟，優選的是陰離子交換層析步驟。陰離子交換樹脂可以呈現任何帶正電的配體，例如Q基團。
在特定的實施方式中，本工藝的第二步驟包括用多式陰離子交換樹脂接觸從第一步驟獲得的洗出液。更具體地，多式陰離子交換樹脂包含陰離子交換基團以及一種或多種能提供與目標抗體的合作性相互作用的進一步的基團。所述多式陰離子交換樹脂包含第一基團，其能夠與目標化合物的帶負電的位點相互作用，和第二基團，其能夠產生至少一種相互作用，所述相互作用不同于與所述目標化合物的電荷-電荷相互作用。關于這一點，理解的是，分離基質的基團的相互作用的不同方式針對相同的目標化合物，即，每個目標化合物理想地被兩種或多種相互作用的方式吸附。本領域技術人員理解的是，這種功能基團可以在相同的配體上出現，在這種情況下，每個配體是多式的，或在不同的配體上出現，在這種情況下分離基質的總體是多式的。在一個實施方式中，所述多式陰離子交換樹脂的陰離子交換基團是強的離子交換劑。在可選擇的實施方式中，所述多式陰離子交換樹脂的陰離子交換基團是弱的離子交換劑。在特定的實施方式中，所述多式陰離子交換樹脂包含芳香族基團。在另一個實施方式中，所述配體選自由N-苯甲基-N-甲基乙醇胺、N，N-二甲基苯甲基胺、2-氨基苯并咪唑和thiomicamine構成的組。根據以上關于支持物和固定的討論，用于本方法的多式陰離子交換樹脂可以由本領域的技術人員容易地制備。已經公開了多式陰離子交換基團，參見例如US 6,702,943(AmershamBiosciences)，通過引用將其包括在此。在最佳的實施方式中，本工藝的第二步驟是在非結合條件下在多式陰離子交換樹脂上進行的陰離子交換步驟。因而，在這個實施方式中，將第一步驟產生的洗出液在非結合條件下施加到第二層析樹脂上，容許吸附混雜物而抗體從流通物中回收。
本工藝對于回收任何單克隆或多克隆抗體是有用的，例如來源于哺乳動物宿主，例如小鼠、嚙齒動物、靈長類和人類的抗體，或來源于培養的細胞例如雜交瘤的抗體。在一個實施方式中，所述回收的抗體是人類或人源化抗體。所述抗體可以是任何類型的抗體，即，選自由IgA、IgD、IgE、IgG和IgM構成的組。在一個實施方式中，要純化的抗體是能夠與蛋白A結合的抗體，或含Fc的抗體片段或融合蛋白。在特定的實施方式中，回收的抗體是免疫球蛋白G(IgG)。在本文中，要理解的是，術語“抗體”還包括抗體片段和任何包含抗體或抗體片段的融合蛋白。因而，本發明還包括純化上述抗體以及包含這種抗體的融合蛋白的任何一種的片段。根據本發明分離的抗體作為藥物是有用的，例如包含為特定個體設計的活性成分的個人化藥物。根據本發明分離的抗體在研究中和在診斷領域中也是有用的。
如以上討論的，在此討論的多式陽離子交換樹脂的多式配體通常包含陽離子交換基團，即帶負電的或可帶電的基團，和至少一個芳香族或雜芳香族環系統。然而，本領域的技術人員容易理解的是，通過將至少兩種不同種類的配體附著到支持物可以制備等效的樹脂，其中一種配體包含陽離子交換基團，而另一種包含芳香族或雜芳香族環系統。因而，在此討論的功能性可以通過單個連結基團、或通過不同的連結基團來與支持物連結。因而，在一個實施方式中，本發明涉及從液體中俘獲一種或多種抗體的工藝，該工藝包括使所述液體接觸層析樹脂來將抗體吸附在配體上，所述樹脂是多式的，并包含已經固定了配體的支持物，其中所述樹脂包含在相同或不同配體上呈現的陽離子交換基團和芳香族或雜芳香族環系統，在所述系統中成環原子選自由碳(C)、硫(S)和氧(O)原子構成的組。在另一個實施方式中，本發明涉及從液體純化一種或多種抗體的工藝，該工藝包括使所述液體與第一層析樹脂接觸以將所述抗體吸附到配體上，所述樹脂是多式的，并包含已經固定了配體的支持物，其中所述樹脂包含在相同或不同配體上呈現的陽離子交換基團和芳香族或雜芳香族環系統，添加洗脫液以從所述樹脂釋放抗體；用第二層析樹脂接觸如此獲得的洗出液。以上所討論的也同樣很好地適用于多式陰離子交換樹脂，在該實施方式中第二層析步驟在多式陰離子交換樹脂上進行。
在第二個方面，本發明是試劑盒，在獨立的區室中包含多式層析樹脂；第二層析樹脂；至少兩種不同的緩沖液；和描述如何純化抗體的書面說明，其中多式配體包含至少一個陽離子交換基團和至少一個芳香族或雜芳香族環系統。在一個實施方式中，所述芳香族或雜芳香族實體的成環原子選自由碳(C)、硫(S)和氧(O)構成的組。在可選擇的實施方式中，在不同的配體上呈現不同的基團，而是層析樹脂仍包含約相等比例的每種基團，并且基本上所有的基團對于與目標相互作用是有效的。本試劑盒可以用于任一上述描述的工藝用來純化抗體。在有益的實施方式中，所述樹脂存在于由任何常規材料制成的柱中，所述常規材料例如，生物相容的塑料，例如聚丙烯，或玻璃。所述柱可以是適合于抗體的實驗室規模或大規模純化的大小。在特定的實施方式中，所述柱裝備有luer銜接器、tubing連接器和domednuts。在有益的實施方式中，所述多式層析樹脂存在于層析柱中，其是一次性的(disposable)種類。通過在使用后丟棄樹脂，消除了在不同工藝之間交叉污染的風險。
最后，本發明包括一次性的層析柱用于純化抗體，該柱包含多式層析樹脂，所述多式層析樹脂包含在相同或不同配體上的陽離子交換基團和芳香族和/或雜芳香族環系統。在一個實施方式中，所述一次性的層析柱包含多式層析樹脂，其中每個配體包含至少一個陽離子交換基團和至少一個芳香族或雜芳香族環系統。在一次性的柱的特定實施方式中，所述多式配體的芳香族或雜芳香族實體的成環原子選自由碳(C)、硫(S)和氧(O)原子構成的組。本發明的一次性的層析柱可以填有用于常規液相色譜的樹脂，或具有適合于膨脹床吸附的形式的樹脂，膨脹床吸附是一種在運作期間樹脂被液化的方法。在最后提及的情況中，帶有配體的支持物具有某些常規的高密度填料，例如鋼或玻璃。
附圖的詳細說明附圖1顯示了在多式陽離子交換層析媒介(U1128042)上純化含有IgG的進料的層析譜，如以下的實施例3所解釋的。收集級分9到16并集中，用于通過凝膠過濾進行分析。測定回收率為＞95％。280nm處的UV吸收表示為實線，傳導性表示為短劃線，pH值表示為點線。
附圖2顯示了對進料的分析性凝膠過濾層析譜(柱U1128042上的起始材料)，如以下的實施例3所解釋的。在0ml注射樣品，IgG峰在13ml出現。在13ml處的峰是目標MAb，其余的峰是聚集物和/或宿主細胞蛋白。
附圖3顯示了從U1128042洗脫的集中級分9-16的分析性凝膠過濾層析譜，如實施例3所解釋的。在13ml處的峰是目標MAb，其余的峰是洗脫的樣品中的聚集物和/或宿主細胞蛋白。
附圖4顯示了根據本發明的工藝的步驟2的層析譜，更具體的是使用多式陰離子交換層析的精煉步驟，如以下的實施例4所解釋的。在調整pH值到6后將來自第一純化步驟(實例3)的洗出物的集中的級分(9-16)施加到柱上。通過分析性凝膠過濾估計的來自流通物、在集中的級分3-10中的IgG純度是非常高的(參見附圖5)。使用pH值6，預計IgG在流通物中停止。然而，層析譜的形狀表明，某些蛋白與柱結合。這也通過在這個層析操作之后計算回收率而確認了，回收率是80％。在用運動緩沖液洗滌開始時所見的額外的峰，可能是離開所述柱的松散結合的蛋白。
附圖5顯示了在柱238092上施加的流通物(級分3-10)的分析性凝膠過濾層析譜，如以下的實施例4所解釋的。在13處的峰是IgG，在10處的峰是聚集物。通過這種分析方法實際上不能檢測出污染宿主細胞蛋白。標度與附圖2和3不相同，而是更為放大的。
實驗部分當前的實施例僅為了說明性的目的提供，無論如何不能解釋為限制由附隨的權利要求定義的本發明的范圍。以下和本說明書中其他地方提供的所有參考文獻通過引用合并在此。
實施例1多式陽離子交換樹脂(第一步驟)的制備以下給出的基質的體積是指澄清床(settled bed)體積。按克給出的基質重量是指抽吸(水泵)干重。要理解的是，這些基質仍是水溶的材料。以下所指的攪動是通過懸浮的、電機驅動的的攪拌器進行，因為提示了使用磁棒攪拌器會損壞珠子。功能性的分析，和珠子上烯丙基化、環氧化作用的程度或離子交換基團的取代程度的確定，參考本領域技術人員公知的常規方法。通過對凝膠的另外的元素分析，特別是分析硫原子，最終補足以下的方法。
表1多式配體原型的化學結構 實施例1(a)多式配體原型U1012054在這個實施例中，描述了3-氨基-4(丙基磺酰基)噻吩-2-羧酸是怎樣與NHS活化的瓊脂糖載體連結的。
硫丙酸SepharoseTM的制備向100ml烯丙基活化的(0.3mmol烯丙基/ml)SepharoseTM6Fast Flow凝膠(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)、4g AcONa和100ml蒸餾水的攪拌的懸浮液中添加溴，直到獲得持久的黃色。然后添加甲酸鈉直到懸浮液完全地脫色。過濾反應混合物，用500ml蒸餾水濕潤凝膠。然后將活化的凝膠直接轉移到反應容器，用17.5ml硫丙酸(每個烯丙基6同等物)和12g NaCl的水溶液(50ml蒸餾水)處理，在添加前其pH值用50％aq.NaOH調節到11.5。在攪動下在50℃進行反應18小時。過濾反應混合物和用500ml蒸餾水洗滌，產生具有0.29mmol CO2H基團/ml凝膠的取代程度的硫丙酸SepharoseTM凝膠。
用N-羥基琥珀酰亞胺活化凝膠然后用300ml1M NaCl、500ml 0.1MHCl、500ml 50％aq.丙酮、500ml丙酮連續地洗滌100ml所產生的硫丙酸SepharoseTM。洗滌之后將凝膠置于丙酮中沉積，虹吸抽出上清液，借助20ml的丙酮將沉積的珠子轉移到反應容器。然后添加80ml丙酮中15.2g N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的溶液，和80ml丙酮中二環己基碳二亞胺的另一種溶液。將反應漿液在30℃下攪動18小時。過濾之后，在整個工作日用150ml異丙醇慢慢地洗滌(重力流)凝膠10次。反應后用NH4OH估計NHS活化的程度約80％，相當于約0.23mmol NHS官能團/ml凝膠的活化。
多式配體與NHS活化的硫丙酸SepharoseTM的連結如WO 02/05959中描述的制備3-氨基-4(丙基磺酰基)噻吩-2-羧酸(配體12)。制備565mg的3-氨基-4(丙基磺酰基)噻吩-2-羧酸(2.27mmol)在2ml蒸餾水、2ml 1M NaHCO3和2ml乙醇中的溶液的可溶混合物，小心添加50％含水NaOH調節到pH值8.5。
用20ml冰冷的1mM HCl溶液快速洗滌NHS-活化的硫丙酸SepharoseTM(10ml)。然后將凝膠轉移到Erlenmeyer中，向其中添加thineyl絲氨酸溶液。將反應混合物置于搖床上(150rpm)在室溫下18小時。
過濾反應混合物之后，用40ml蒸餾水、20ml乙醇、20ml 0.25M aq.乙醇胺、20ml蒸餾水、20ml 1M aq.NaCl、和20ml蒸餾水連續地洗滌凝膠。
實施例1(b)-(d)在以下的實施例1(b)-(d)中，使用D，L-高半胱氨酸硫內酯作為支架，如WO 03/024588中描述的制備多式配體原型U790P65、U790P71和U790P73。簡言之，在通過高半胱氨酸硫內酯與酰基氯或酐反應形成酰胺鍵之后，用堿水解來實現硫內酯環的開放，將產生的化合物進一步與活化的SepharoseTM6FF(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)連結。
實施例1(b)多式配體原型U790P73將30ml DCM中的苯甲酰氯(8.7ml，75mmol)溶液在0℃滴加到二氯甲烷(DCM，120ml)中的D，L-高半胱氨酸硫內酯(11.5g，75mmol)和二異丙胺(DIPEA)(26ml，150mmol)的溶液中。在室溫下攪拌混合物過夜。在真空下蒸發溶劑，用乙酸乙酯(300ml)提取反應殘余物。用aq.檸檬酸10％(w/w，200ml)、aq.K2CO310％(200ml)、水(200ml)洗滌有機相，用硫酸鈉干燥。過濾之后，除去溶劑產生白色固體(13.8g，83％)。在0℃，向276mg(1.25mmol)這種白色固體中添加5N氫氧化鈉溶液(5ml)，混合物在室溫下進一步攪拌2小時。將從烯丙基化的SepharoseTM6Fast Flow(250μmol/ml)開始根據公知工藝獲得的溴化的SepharoseTM6 Fast Flow(10ml)(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)與配體(如上所述)的堿性溶液混合，加熱到50℃過夜。反應之后，過濾凝膠，用水(2×150ml)、乙醇(2×150ml)、乙酸0.2M(2×150ml)和水(2×150ml)洗滌。然后通過滴定酸根來測量凝膠的離子容量，得出約130μmol/ml凝膠。
實施例1(c)多式配體原型U790P65將4ml DCM中的3，4，5-三甲氧基-苯甲酰氯(2.37g，10.3mmol)溶液在0℃滴加到二氯甲烷(DCM，6ml)中的D，L-高半胱氨酸硫內酯(1.58g，10.3mmol)和二異丙胺(DIPEA)(3.58ml，20.6mmol)的溶液中。在室溫下攪拌混合物過夜。在真空下蒸發溶劑，用乙酸乙酯(50ml)提取反應殘余物。用aq.檸檬酸10％(w/w，30ml)、aq.K2CO310％(30ml)、水(30ml)洗滌有機相，用硫酸鈉干燥。過濾之后，除去溶劑產生白色固體(2.21g，69％)。在0℃，向389mg(1.25mmol)這種白色固體中添加5N氫氧化鈉溶液(5ml)，混合物在室溫下進一步攪拌2小時。將從烯丙基化的SepharoseTM6 Fast Flow(250μmol/ml)開始根據公知工藝獲得的溴化的SepharoseTM6 Fast Flow(10ml)(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)與配體(如上所述)的堿性溶液混合，加熱到50℃過夜。反應之后，過濾凝膠，用水(2×150ml)、乙醇(2×150ml)、乙酸0.2M(2×150ml)和水(2×150ml)洗滌。測量凝膠的離子容量為59μmol/ml凝膠。
實施例1(d)多式配體原型U790P71將4ml DCM中的苯基戊二酐(1.96g，10.3mmol)溶液在0℃滴加到二氯甲烷(DCM，6ml)中的D，L-高半胱氨酸硫內酯(1.58g，10.3mmol)和二異丙胺(DIPEA)(3.58ml，20.6mmol)的溶液中。在室溫下攪拌混合物過夜。在真空下蒸發溶劑，用5N氫氧化鈉溶液(10ml)直接處理反應殘余物，在室溫下進一步攪拌2小時。將從烯丙基化的SepharoseTM6 Fast Flow(250μmol/ml)開始根據公知工藝獲得的溴化的SepharoseTM6 Fast Flow(10ml)(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)與如上所述的配體的1.4ml堿性溶液混合，加熱到50℃過夜。反應之后，過濾凝膠，用水(2×150ml)、乙醇(2×150ml)、乙酸0.2M(2×150ml)和水(2×150ml)洗滌。然后測量凝膠的離子容量為110μmol/ml凝膠，相當于55μmol/ml凝膠的配體取代水平。
實施例2多式陰離子交換樹脂(第二步驟)的制備一航的基質的體積是指澄清床體積。
按克給出的基質重量是指抽吸干重。要理解的是，這些基質仍是水溶的材料。
大規模反應攪動是指懸浮的、電機驅動的攪拌器，因為提示了使用磁棒攪拌器會損壞珠子。小規模反應(最多20ml或g凝膠)在封閉的小瓶中進行，攪動是指使用搖床。
功能性的分析，和珠子上烯丙基化、環氧化作用的程度或離子交換基團的取代程度的確定，參看常規方法。
1.在基質上引入烯丙基團在典型的工藝中，用烯丙基縮水甘油醚進行烯丙基化，但是注意到，在固相支持物上引入烯丙基團也可以使用烯丙基溴容易地實現。
用烯丙基縮水甘油醚活化SepharoseTM將100g數量的SepharoseTM6 FF抽吸干燥至80g，與0,4g NaBH4、12g Na2SO4和45ml 50％NaOH水溶液混合。在50℃將混合物攪拌1小時。在添加100ml烯丙基縮水甘油醚之后，將懸浮物在50℃下強烈攪拌額外的20小時。過濾反應混合物之后，用500ml蒸餾水、500ml乙醇、200ml蒸餾水、200ml 0,2M乙酸和500ml蒸餾水連續地洗滌凝膠。滴定得出0.32mmol烯丙基/ml凝膠的取代程度。
2.配體連結到基質上優選的在堿性條件下通過烯丙基的溴化和親核取代來實現與基質的連結。
通過溴化來活化烯丙基SepharoseTM向100ml烯丙基活化的SepharoseTM6 FF(0.32mmol烯丙基/ml排水的凝膠)、4g AcONa和100ml蒸餾水的攪拌的懸浮液中添加溴，直到獲得持久的黃色。然后添加甲酸鈉直到懸浮液完全地脫色。
過濾反應混合物，用500ml蒸餾水濕潤凝膠。然后將活化的凝膠直接轉移到反應容器，與合適的多式陰離子交換配體進一步反應。
2-氨基苯并咪唑-SepharoseTM將如上所述獲得的10g數量的溴活化的凝膠(0.32mmol烯丙基/ml排水的凝膠)轉移到反應小瓶中，反應小瓶含有在水(6ml)和乙醇(3ml)中的、通過添加50％ NaOH水溶液調節到pH 12的2-氨基苯并咪唑(2g)的溶液。
在攪動下在55℃進行反應17小時。將反應混合物過濾之后，用3×10ml蒸餾水、3×10ml水性0.5HCl和最后的3×10ml蒸餾水連續地洗滌凝膠。獲得的2-氨基苯并咪唑具有0.17mmol胺基/ml凝膠的取代程度。
2-氨基苯并咪唑實施例3抗體俘獲到多式陽離子交換劑材料和方法在層析柱中，將包含如以上的實施例1所描述制備的、與SepharoseTM6 FF連結到40μmol/ml凝膠的取代水平的配體U790P73(N-(2-氧-四氫-噻吩-3-基)-苯甲酰胺)的原型樹脂TricornTM5/50裝填到1ml的柱體積。
起始材料是根據標準方法制備的中國的倉鼠卵巢(CHO)細胞澄清的進料。該進料含有人源化IgG1，其是堿性的，表現出9.1的pI值和1.7的消光系數(ε)，濃度0.8g mAb/L。
通過添加濃縮的乙酸將進料的pH值調節到6，之后將25ml進料加載到多式陽離子交換柱上。50mM磷酸鹽緩沖液pH 6用作加載緩沖液，加載期間的流速是100cm/h。在14倍柱體積的洗滌期之后，通過pH梯級，使用25mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.5來洗脫結合的蛋白。收集流通級分和來自洗滌的2ml級分和洗脫物。
分析性凝膠過濾進行分析性凝膠過濾來獲得對洗脫級分的純度的估計。分析了起始材料以及層析操作的流通物和集中的洗出物。使用10mM磷酸鹽緩沖液、0.14M NaCl，pH 7.4作為運動緩沖液和0.5ml/min的流速，將50μl的樣品施加到SuperdexTM200 10/300GL柱上。
分析集中的洗出液中的蛋白濃度用于測定回收率在洗脫緩沖液中將來自洗出物的總庫稀釋五倍。在分光光度計中測量280nm的吸光率，將三份吸光率的平均值用于根據公式1來測定蛋白濃度。計算洗脫的蛋白的總量，并除以施加到柱上的IgG的總量來計算回收率。
公式1C＝A*稀釋因數/(1×ε)其中C＝IgG的濃度(mg/ml)A＝280nm的吸光率1＝通路長度(ε)＝MAb的摩爾消光系數(mg ml-1)結果使用pH 6的結合緩沖液將IgG結合到柱上，可以使用pH 7.5來洗脫。與起始材料的IgG純度相比，來自洗出物的集中的級分(9-16)含有高純度的IgG。在流通物中存在非常少的目標蛋白(＜5％)，回收率估計是＞95％。在多式陽離子交換劑上進行純化的層析譜可見附圖1，來自對起始材料(進料)、和來自俘獲步驟的集中的洗出液的分析性凝膠過濾的層析譜在附圖2和3中示出。
更具體地，首先，在將進料的pH值調整到6之后，將CHO細胞澄清的進料加載到多式陽離子交換層析媒介(U1128042)上。50mM磷酸鹽、20mM Na-琥珀酸鹽，pH 6用作結合緩沖液，使用pH梯級洗脫結合的蛋白。25mM磷酸鹽緩沖液pH 7.5用于洗脫。收集級分9到16并集中，用于通過凝膠過濾進行分析。測定回收率收為＞95％。在附圖1中，280nm處的UV吸收表示為實線，傳導性表示為短劃線，pH值表示為點線。
對于進料的分析性凝膠過濾層析(柱U1128042上的起始材料)，樣品體積是50μl，洗脫液為PBS緩沖液，pH 7.4，流速0.5ml/min。在0ml注射樣品，IgG峰在13ml出現。在附圖2中，在10ml處的峰是IgG聚集物，其余的峰是宿主細胞蛋白。
從U1128042洗脫的集中級分9-16的分析性凝膠過濾層析譜在附圖3中示出。在第一層析步驟之后，污染蛋白被很大程度地減少了。在0ml注射樣品，在13ml處的峰是IgG，在10ml處的峰是IgG聚集物。在洗脫的樣品中的另一個峰是宿主細胞蛋白。
實施例4通過陰離子交換精煉材料和方法媒介(238092)包含以170μmol/ml凝膠的取代水平與SepharoseTM6FF連結的配體2-氨基苯并咪唑，將媒介填充到層析柱HR5/5中，到1ml的柱體積。
來自實施例2的集中的洗出液，級分9-16用作這個純化步驟的起始材料。洗出液中的pH值通過添加10％乙酸調節到6。使用25mM磷酸鹽pH 6作為加載緩沖液將8ml調整了pH值的洗出液、相當于大約10mg IgG施加到柱238092上。選擇緩沖條件、pH值和傳導性，以成為對于IgG是非結合調節的。使用0.5ml/min的流速，在加樣和洗滌期間收集1ml級分。
來自流通物的集中的級分(3-10)的IgG純度通過分析性凝膠過濾進行分析。測定洗脫的蛋白的數量，計算回收率。在實施例2的材料和方法中描述了分析性凝膠過濾的方法和蛋白濃度的測定和回收率的計算。
結果在俘獲步驟中使用多式陽離子交換層析進行純化的洗脫的IgG級分進一步通過陰離子交換層析來純化。在這個精煉步驟中，使用非結合條件將IgG加載到柱上。通過分析性凝膠過濾估計在來自這個精煉步驟的流通物的集中的級分中IgG純度是非常高的。雖然使用了非結合條件，一些IgG結合到柱上，計算的回收率為80％。
在多式陰離子交換劑上進行的純化的層析譜在附圖4中可見，對流通級分進行分析性凝膠過濾的層析譜在附圖5中示出。
為了獲得附圖6，在調整pH值到6后將來自第一純化步驟(實例3)的洗出物的集中的級分(9-16)施加到柱上。通過分析性凝膠過濾估計的來自流通物、在集中的級分3-10中的IgG純度是非常高的(參見附圖5)。使用pH值6，預計IgG在流通物中停止。然而，層析譜的形狀表明，某些蛋白與柱結合。這也通過在這個層析操作之后計算回收率而確認了，回收率是80％。在用運動緩沖液洗滌開始時所見的額外的峰，可能是離開所述柱的松散結合的蛋白。
為了獲得附圖7，來自柱238092上的施加的流通物(級分3-10)的分析性凝膠過濾層析譜，在13處的峰是IgG，在10處的峰是聚集物。通過這種分析方法實際上不能檢測出污染宿主細胞蛋白。標度與附圖2和3不相同，而是更為放大的。
權利要求
1.從液體中俘獲一種或多種抗體的方法，所述方法包括使所述液體接觸包含支持物的層析樹脂，所述支持物上已經固定了多式配體，來將抗體吸附到所述樹脂上，其中每個多式配體包含至少一個陽離子交換基團和至少一個芳香族或雜芳香族環系統，在所述系統中成環原子選自由碳(C)、硫(S)和氧(O)原子構成的組。
2.根據權利要求1的方法，其中所述成環原子選自由碳(C)和硫(S)原子構成的組。
3.根據權利要求2的方法，其中所述成環原子是碳(C)原子。
4.根據權利要求1-3的任一項的方法，其繼之以一個或進一步的純化步驟。
5.從液體純化一種或多種抗體的工藝，所述工藝包括使所述液體與包含支持物的第一層析樹脂接觸，所述支持物上已經固定了多式配體，來將所述抗體吸附到所述樹脂上，其中每個多式配體包含至少一個陽離子交換基團和至少一個芳香族或雜芳香族環系統；添加洗脫液以從所述樹脂釋放抗體；和用第二層析樹脂接觸如此獲得的洗出液。
6.根據以上權利要求的任一項的工藝，其中與多式層析樹脂接觸的液體是細胞培養液或發酵肉湯。
7.根據權利要求5或6的工藝，其中所述多式配體的芳香族或雜芳香族環系統的成環原子選自由碳(C)、硫(S)和氧(O)原子構成的組。
8.根據以上權利要求的任一項的工藝，其中所述多式配體的陽離子交換基團是弱陽離子交換劑。
9.根據以上權利要求的任一項的工藝，其中所述第二層析步驟選自由離子交換層析；疏水性相互作用層析(HIC)；固定的金屬親和層析(IMAC)；和親和層析構成的組。
10.根據權利要求9的工藝，其中所述第二層析步驟是離子交換層析。
11.根據以上權利要求的任一項的工藝，其中所述第二層析步驟是陰離子交換層析。
12.根據以上權利要求的任一項的工藝，其中所述第二層析步驟是多式陰離子交換層析。
13.根據前述權利要求的任一項的工藝，其中從所述第二層析樹脂的流通物中回收抗體。
14.根據權利要求1-12的任一項的工藝，其中抗體和/或混雜物從第二層析樹脂上洗脫。
15.根據以上權利要求的任一項的工藝，其中所述抗體是單克隆抗體。
16.根據權利要求1-14的任一項的工藝，其中所述抗體是多克隆抗體。
17.從液體中俘獲一種或多種抗體的方法，該工藝包括使所述液體接觸層析樹脂來將抗體吸附在配體上，所述樹脂是多式的，并包含已經固定了配體的支持物，其中所述樹脂包含在相同或不同配體上呈現的陽離子交換基團和芳香族或雜芳香族環系統，在所述系統中成環原子選自由碳(C)、硫(S)和氧(O)原子構成的組。
18.從液體純化一種或多種抗體的工藝，所述工藝包括使所述液體與第一層析樹脂接觸以將所述抗體吸附到配體上，所述樹脂是多式的，并包含已經固定了配體的支持物，其中所述樹脂包含在相同或不同配體上呈現的陽離子交換基團和芳香族或雜芳香族環系統；添加洗脫液以從所述樹脂釋放抗體；和用第二層析樹脂接觸如此獲得的洗出液。
19.用于純化液體中的一種或多種抗體的試劑盒，所述試劑盒在獨立的區室中包含填有層析樹脂的第一層析柱，所述樹脂是多式的并包含已經固定了配體的支持物，其中在相同或不同的配體上存在陽離子交換基團和芳香族或雜芳香族環系統；填有層析樹脂的第二層析柱；用于吸附和/或洗脫抗體的一種或多種緩沖液；和教導以兩步工藝純化抗體的書面指導。
20.根據權利要求19的試劑盒，其中所述多式配體的芳香族或雜芳香族環系統的成環原子選自由碳(C)、硫(S)和氧(O)原子構成的組。
21.根據權利要求19或20的試劑盒，其中所述第一層析柱是無菌的柱。
22.根據權利要求19-21的任一項的試劑盒，其中所述第一層析柱是一次性的柱。
23.用于純化抗體的一次性的層析柱，所述柱包含多式層析樹脂，所述多式層析樹脂包含在相同或不同配體上的陽離子交換基團和芳香族和/或雜芳香族環系統。
24.用于純化抗體的一次性的層析柱，所述柱包含多式層析樹脂，其中每個配體包含至少一個陽離子交換基團和至少一個芳香族或雜芳香族環系統。
25.根據權利要求23或24的一次性的柱，其中所述多式配體的芳香族或雜芳香族環系統的成環原子選自由碳(C)、硫(S)和氧(O)原子構成的組。
全文摘要
本發明涉及在液體中從一種或多種混雜物純化抗體的工藝，該工藝包括使所述液體與包含支持物的第一層析樹脂接觸，所述支持物上已經固定了多式配體，來將所述抗體吸附到所述樹脂上，其中每個多式配體包含至少一個陽離子交換基團和至少一個芳香族或雜芳香族環系統；添加洗脫液以從所述樹脂釋放抗體；用第二層析樹脂接觸如此獲得的洗出液。在一個實施方式中，所述芳香族或雜芳香環實體的成環原子選自由C、S或O構成的組，和所述陽離子交換基團是弱陽離子交換劑。
文檔編號C07K16/00GK1925898SQ200580006276
公開日2007年3月7日 申請日期2005年2月25日 優先權日2004年2月27日
發明者A·格倫貝里, B·-L·約翰松, H·J·約翰松, J·-L·馬盧瓦塞爾, N·泰弗南 申請人:通用電氣健康護理生物科學股份公司