專利名稱：青斑肌動蛋白的基因序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學中基因克隆領域，特別是關于青斑肌動蛋白基因序列。
背景技術：
肌動蛋白被定義成一種分子發動機，與細胞移動、細胞分裂以及傷口愈合有關；同時肌動蛋白還參與DNA轉錄，可以召集RNA聚合酶II，在RNA聚合酶II開始轉錄時充當一個分子發動機。如果肌動蛋白受到抑制，轉錄就無法開始。DNA轉錄這個過程對細胞的所有活動都非常重要。這些功能將使我們能夠在遺傳轉錄出錯時進行有效干預；肌動蛋白可以作為輔助因子，具有降解細胞骨架的病毒酶的功能。
目前隨著海水養殖業的發展，病害問題日趨嚴重，因此從魚體自身入手，克隆相關的功能基因，獲得純化的具活性的體外重組蛋白，提高魚體抗病能力是當今病害防治的趨勢。至今對青斑細胞方面的基因研究還較少，尤其對肌動蛋白基因的研究還屬空白。
發明內容
本發明的目的是通過以近源物種肌動蛋白的基因的CDS序列的保守區設計的兼并引物，并用PCR法擴增，克隆到青斑肌動蛋白的基因的表達序列。它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.2所述。
1、總RNA的提取解剖魚體取出脾臟，使用Trizol進行勻漿，按照使用說明提取青斑總RNA。
2、cDNA第一鏈的合成青斑總RNA與反轉錄引物(oligo-dT接頭引物)混合，進行反轉錄。
3、引物設計依據，引物合成的方法從GenBank中下載近源物種(如人、牛、虹鱒、牙鲆、鯉魚等)肌動蛋白同源基因CDS序列，利用Clustal W軟件進行多序列比對，確定保守區，根據保守區序列設計兼并引物，擴增片段大小約為1128bp。引物設計后采用β-乙睛亞磷酰胺化學法進行DNA合成。
引物序列為F5’ATg gA(A/T)g(A/g)(T/C)gAA ATC gCC gC 3’R5’TTA gAA gCA TTT(g/A)Cg gTg gA 3’4、肌動蛋白基因PCR擴增、克隆以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，用兼并引物進行PCR擴增，所擴增的PCR產物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從凝膠中純化回收目的產物。然后將純化的PCR產物克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌JM-109感受態細胞，挑取陽性克隆，提取質粒DNA。經簡并引物PCR檢測后，將具有插入片段的質粒DNA用M13通用引物進行雙向測序。測序所得序列再與兼并引物擴增所得的序列利用Clustal W軟件進行拼接。
5、對青斑肌動蛋白的基因的測定所得到的PCR產物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測后，將PCR產物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌JM-109感受態細胞，挑取陽性克隆，用3730測序儀對質粒DNA進行測序。測序結果用BLAST軟件進行同源性測定，來確定為青斑肌動蛋白基因同源序列。比對結果為
Score ESequences producing significant alignments(Bits) Valuegi|56554009|gb|AAV97945.1|beta actin 2[Rivulus marmoratus]...7550.0gi|52547951|gb|AAR97600.2|beta actin[Epinephelus coioides]...7530.0gi|40362701|gb|AAR84618.1|beta actin[Acanthopagrus schlegelii]7530.0gi|57977261|dbj|BAD88412.1|beta cytoplasmic actin[Pagrus major7520.0gi|19309743|emb|CAD27237.1|beta-actin[Oncorhynchus mykiss]...7520.0gi|45709360|gb|AAH67566.1|Bactin2[Danio rerio]＞gi|2822456|...7520.0本發明的青斑肌動蛋白基因序列不僅為研究魚類肌動蛋白在DNA轉錄中的作用奠定了基礎，而且通過該基因序列可獲得具有活性的體外重組蛋白，為研究新型的抗病免疫佐劑提供理論基礎。
具體實施例方式
1.總RNA的提取取鮮活健康青斑(體重約400g)在實驗室內暫養2d后(水溫約24℃，氣泵充氣)，從胸腔注射脂多糖(LPS，10μg/mL)200μL。刺激6h后，解剖魚體取出脾臟約100mg，分別放入1mL Trizol(Gibco，Japan)中進行勻漿，按照試劑盒使用說明提取總RNA。
2.cDNA第一鏈的合成取青斑總RNA 5μg與反轉錄引物(oligo-dT接頭引物)1μL(10pmol/L)混合，70℃加熱5min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5mmol/L dNTP混合液，Ribonuclease Inhibitor，M-MLV反轉錄酶，反應體系為25μL。反應過程為42℃60min，70℃15min，最后放入-80℃保存備用。
3.引物設計依據，引物合成的方法從GenBank中下載近源物種(如人、牛、虹鱒、牙鲆、鯉魚等)肌動蛋白同源基因CDS序列，利用Clustal W軟件進行多序列比對，確定保守區，根據保守區序列設計兼并引物，擴增片段大小約為260bp。引物設計后采用β-乙睛亞磷酰胺化學法進行DNA合成。
引物序列為F5’ATg gA(A/T)g(A/g)(T/C)gAA ATC gCC gC 3’R5’TTA gAA gCA TTT(g/A)Cg gTg gA 3’4.肌動蛋白基因cDNA序列的克隆以近源物種肌動蛋白基因CDS序列的保守區設計的兼并引物，擴增片段大小約為1128bp。
以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，用兼并引物進行PCR擴增，反應體系為10x PCR反應緩沖液5μL，25mmol/L MgCl23μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，10nmol/L引物dTF和dTR各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水將反應體系補充至50μL。反應條件為1個循環，94℃變性5min；35個循環94℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s；1個循環，72℃延伸10min；4℃保溫。所擴增的PCR產物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從凝膠中純化回收目的產物。然后將純化的PCR產物克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌JM-109感受態細胞，挑取陽性克隆，提取質粒DNA。經簡并引物PCR檢測后，將具有插入片段的質粒DNA用M13通用引物進行雙向測序。測序所得序列再與兼并引物擴增所得的序列利用Clustal W軟件進行拼接。
5.對青斑肌動蛋白基因的測定所得到的PCR產物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測后，將PCR產物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌JM-109感受態細胞，挑取陽性克隆，用3730測序儀對質粒DNA進行測序。測序結果用BLAST軟件進行同源性測定，來確定為青斑肌動蛋白基因同源序列。比對結果
Score ESequences producing significant alignments (Bits) Valuegi|56554009|gb|AAV97945.1|beta actin 2[Rivulus marmoratus]...7550.0gi|52547951|gb|AAR97600.2|beta actin[Epinephelus coioides]...7530.0gi|40362701|gb|AAR84618.1|beta actin[Acanthopagrus schlegelii]7530.0gi|57977261|dbj|BAD88412.1|beta cytoplasmic actin[Pagrus major7520.0gi|19309743|emb|cAD27237.1|beta-actin[Oncorhynchus mykiss]...7520.0gi|45709360|gb|AAH67566.1|Bactin2[Danio rerio]＞gi|2822456|...7520.0
序列表<110>中國水產科學研究院南海水產研究所<120>青斑肌動蛋白的基因序列<160>2<210>1<211>1128<212>RNA<213>青斑(Epinephelus awoara)<220>
<221>CDS<222>(1)...(1128)<400>1atg gat ggt gaa atc gcc gca ctg gtt gtt gac aac gga tcc ggt atg48Met Asp Gly Glu Ile Ala Ala Leu Val Val Asp Asn Gly Ser Gly Met1 7 13tgc aaa gcc gga ttc gcc gga gac gac gcc cct cgt gct gtc ttt ccc96Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val Phe Pro17 23 29tcc atc gtc ggt cgc ccc agg cat cag gga gtg atg gtg ggt atg ggc144Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val Met Val Gly Met Gly33 39 45cag aag gac agc tac gtt agt gat gaa gcc cag agc aag agg ggt atc192Gln Lys Asp Ser Tyr Val Ser Asp Glu Ala Gln Ser Lys Arg Gly Ile49 55 61
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241 247 253Cys Pro Glu Ala Leu Phe Gln Pro Ser Phe Leu Gly Met Glu Ser Cys257 263 269Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp Val Asp273 279 285Ile Arg Lys Asp Leu Tyr Ala Asn Thr Val Leu Ser Gly Gly Thr Thr289 295 301Met Tyr Pro Gly Ile Ala Asp Arg Met Gln Lys Glu Ihr Thr Ala Leu305 311 317Ala Pro Ser Thr Met Lys Ile Lys Ile Ile Ala Pro Pro Glu Arg Lys321 327 333Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe337 343 349Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ser353 359 365Ile Val His Arg Lys Cys Phe369 37權利要求
1.一種青斑肌動蛋白基因，它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
2.一種青斑肌動蛋白基因，它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
全文摘要
本發明從近源物種肌動蛋白的基因的CDS序列的保守區設計的兼并引物，從青斑的脾臟中提取總RNA，并用PCR法擴增，克隆到青斑肌動蛋白的基因的表達序列。該基因序列不僅為研究魚類肌動蛋白在DNA轉錄中的作用奠定了基礎，而且通過該基因序列可獲得具有活性的體外重組蛋白，為研究新型的抗病免疫佐劑提供理論基礎。
文檔編號C07K14/435GK1884532SQ200610035879
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月9日 優先權日2006年6月9日
發明者張漢華, 江世貴, 邱麗華, 郭弈惠 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所