一種含有糖鏈的白蛋白、其制備方法及其用途的制作方法

專利名稱：：一種含有糖鏈的白蛋白、其制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種在特定的氨基酸殘基上選擇性添加了糖鏈的新型含職連的白蛋白蛋白質，其制備方法及其用途。更具體地，本發明涉及包含可通過宿主細胞進行^l連修飾的部分氨基酸的變異型白蛋白的該部分氨基酸上選擇性地附加了糖鏈的、含糖鏈的白蛋白。編碼該變異型白蛋白的DNA，通過培養含有該DNA的真核細胞制備該含糖鏈的白蛋白蛋白質的方法，及該蛋白質作為藥物載體的用途。
背景技術：
：人血清白蛋白(以下稱為"HSA")廣泛分布于體內血液及細胞間液中。其一級結構是由585個氨基酸組成的，不具有結構，且分子量大約為66.5kDa的單純蛋白質。該蛋白質在肝臟中的作用主要是負責維持血流中的正常滲透壓、及維持血液中的液體含量。因此，在多種臨床狀況下，例如外科手術、休克、燒傷、浮腫引起的低蛋白血癥等，存在血管液體損失的狀態中，常用HSA進行治療。此外，HSA起到了作為多種血清分子載體的機能，由于安全性、生物適應性、生物分解性、血中滯留性強，因此在動態特性方面存在問題的藥物給藥系統(DDS)中可以作為伏選載體。目前存在艦HSA與藥物不可逆結合的DDS，禾傭HSA的較長半衰期來提高結合的藥物在血中滯留性的方法、以及使用HSA修飾體作為主動輸送系統的載體的方法等。在前者中，已經嘗試通過基因融合技術使半衰期較短的蛋白質及生理活性肽等作為雜合體表達。另一方面，在后者中，嘗試深入研究了陰離子化、陽離子化等調節HSA的物理化學性質的方法，以及通過導入糖結構、肽等存在于細胞表面的受體的識別元ft(裝置)，實現精密的動態控制及細胞特異鵬E定(非專利文獻1至6)。在肝臟中己知存在識別糖殘基及負電荷等的受體。利用這種性質，與琥珀酸及半乳糖、甘露糖等結合的白蛋白可用于對肝臟靶向。然而，在對HSA進行化學1斷布時，了解至lj其具有(1)劇隙合了非常多的糖殘基，否則無法識別肝臟；半孚L糖修飾的白蛋白除一瞎每個白蛋白分子上結合10個以上的半乳糖，否則無法識別肝臟(參見非專利文獻5)。(2)對肝臟非實質細胞群的細胞特異性劍氐甘露糖及巖藻糖修飾的白蛋白已知可被肝內皮細胞及肝巨噬細胞兩種細胞吸收(參見非專利文獻6)。(3)!艮難制備均一的結合體，必須找到適當的結合^f牛；等等的問題。因此，強烈希望開發出一種使用非化學手段修飾HSA的方法。非專利文獻l:LeeYC等人，Biochemisty15:3956-3963，1976非專禾U文獻2:OpanasopitP等人，Am.J.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol.280:879-889，2001非專利文獻3:TakakuraY等人，Int.J.Pharm.105:19-29，1994非專利文獻4:YamasakiY等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.301:467477，2002非專禾!j文獻5:NishikawaM等人，Am.J.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol.268:G849-G856,1995非專利文獻6:HiguchiY等人，Int.J.Pharm.287:147-154，2004本發明的目的是提供一種可在肝臟、尤其是肝巨噬細胞中特異性移動的、均一的含糖鏈的白蛋白，更具體是提供血清白蛋白，還提供一種適用于遞送至肝臟的DDS的藥物載體。本發明人為了達成上述目的，進行銳意研究，得到以下結果禾U用定點誘變法，將N結合型Hf連的共有序列(Asn-X-Thr/Ser)導Ali碼HSA的DNA中，il31培養經含有編碼所獲得的變異型HSA的DNA的表達載,化的巴斯德畢赤酵母(Pichiapastons)，成功制備了肝臟轉移性較高的、在該共有序列的Asn殘基上添加添加了高甘露糖型糖鏈的含糖鏈的HSA，由此完成了本發明。
發明內容艮P，本發明提供了(1)包含可通過宿主細胞進fi^l修飾的部分氨基酸的變異型白蛋白的該部分氨基酸Jl^擇性地附加了糖鏈的、含m連的白蛋白；(2)，(1)所述的蛋白質，其中糖鏈是高甘露糖型糖鏈；(3)上述(1)或(2)所述的蛋白質，其中該部分氨基酸序列至少一個是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser(Xaa是涉及遺傳編碼的任意氨基酸)；(4)上述(3)所述的蛋白質，該部分氨基酸序列全部是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser(Xaa是涉^it傳編碼的任EM基酸)；(5)上述(1)-(4)任一項所述的蛋白質，該白蛋白是人血清白蛋白。(6)上述(5)所述的蛋白質，具有與序列號2所示的氨基酸序列中序號1-585所示的氨基酸序列同一的或基本上同一的氨基酸序歹lj，氨基號63所示的氮基酸是Asn和/或氨基,號320所示的氨基酸是Thr或Ser禾口/或氮基lW號494所示的氨基酸是Asn;(7)上述(6)所述的蛋白質，至少氨基酸序號494所示的氨基酸是Asn;(8)—種編碼變異型白蛋白的DNA，其中所述的變異型白蛋白含有ffl31真核細胞進fi^ll連修飾的1個以上的部分氨基SW列；(9)一種表達載體，其含有位于宿主真核細胞的功能性啟動子的控制下的上述(8)所述的DNA;(10)—種轉化體，其通過在宿主真核細胞中導入上述(9)所述的表達載體而獲得；(11)上述(10)所述的轉化體，其中所述宿主真核細胞是酵母；(12)，(11)所述的轉化體，其中所述酵母是畢赤(f*7)屬酵母；(13)上述(1)所述的蛋白質的制備方法，包括在培養基中培養上述(10)-(12)任一項所述的轉化體，從得到的培養物回收含有的白蛋白；(14)藥物，其含有如上述(1)-(7)任一項所述的蛋白質；(15)藥物載體，其含有如上述(1)-(7)任一項所述的蛋白質的遞皿至肝臟；(16)上述(15)所述的載體，其中耙細胞是肝巨噬細胞；以及(17)藥物組合物，其含有能遞送至肝臟的醫藥化合物及上述(15)或(16)所述的載體。本發明的含有糖鏈的白蛋白可被肝臟、尤其是肝臟的非實質細胞，更具體的是肝巨噬細胞中特異性吸收，因此可用作針對該種細胞的藥物載體。例如，可以預見，如果針對肝虛血再灌流障礙的疾病給藥在本發明的含有糖f連的白蛋白上結合了抗氧化劑及氧化氮等的產品將具有良好的治療效果。此外，由于肝臟即使對一條糖鏈也有強烈的識別作用，因此可以在不對白蛋白本身的結構、機能產生影響的情況下使用。并且，由于是來自基因重組的蛋白質，因此無需擔心混入未知病毒等來自血液的制齊啲特有問題，故可安全地施用于人體等。圖1示出根據試驗例1的、本發明的含有糖鏈的人血清白蛋白遞送至血漿(上)及肝臟(下)的移動性時效變化圖。縱軸表示相對于給藥量的比例(％)，橫軸表示給藥后的時間(分)。圖2示出在給小鼠的靜脈內施用的、mIn標記的琥珀酸修飾(Suo)的牛血清白蛋白(BSA)向血衆(上)、肝臟(中)及腎臟(下)的移動性圖(參見非專利文獻3)。Suc。-BSA中的n表示在BSA上結合的琥珀酸的數目。參表示0.1mg/kg的BSA給藥量，〇表示lmg/kg的BSA給藥量，T表示10mg/kg的BSA給藥量，V表示20mg/kg的BSA給藥量。提示的數據是從非專利文獻3摘錄的必要內容，追加于縱軸所得。發明詳述本發明的白蛋白可列舉出血清白蛋白、卵清白蛋白等，血清白蛋白。白蛋白的來源沒有特別限制，可舉出例如來自人或其它恒溫動物(例如牛、猴、豬、馬、羊、山羊、狗、貓、兔、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、雞、鵪鶉等)的白蛋白，但是考慮到用作藥物或藥物化合物的載體，優選人白蛋白，更優選AJl清白蛋白(HSA)。以下，雖然是以HAS為例對本發明進行詳細描述，但是本領域技術人員基于本說明書所述的內容及公知的其它白蛋白序列信息，能夠同樣地制得含有糖鏈的其他白蛋白并加以利用。本發明的含有糖鏈的白蛋白是包含可ffiil宿主細M^WI修飾的部分氨基酸的變異型白蛋白的該部分氨基酸±^擇性地附加了糖鏈所得的。作為"通過真核細M行IH連修飾的部分氨基酸序列"(以下，也稱為"葡糖基化序列")例如N結合型糖鏈共有序列的Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser(Xaa是所示的遺傳編碼的氨基酸；在Asn殘基上添加糖鏈)(以下，全部簡稱為"Asn-Xaa-Thr/Ser")、O結合型內O結合型巖藻糖共有序列的Cys-Xaa-Xaa-Gly-Gly-TMSer(Xaa與如上的定義相同；在Thr/Ser殘基上添加糖鏈)、O結合型葡糖共有序列的Cys-Xaa-Ser-Xaa-Pro-Cys(Xaa與如上的定義相同；在Ser殘基上添加MI連添加)等，但是不限于戰物質。雌N結合型糖鏈共有序列Asn-Xaa-Thr/Ser。葡糖基化序列可以是1個也可以是2個以上。雖然糖^l數多的話可改善向肝臟、尤其是肝巨噬細胞的靶向效率，但是如果考慮到保持白蛋白自身的生理機旨扱抗原性問題，添加的擗連數較少時比較有利。正如以下描述的，肝臟的靶向機能并不是單純地取決于添加的糖鏈數，由于添加的位置同樣很重要，因此M31在大的部位導入葡糖基化序列，就能以較少的數獲得優異的耙向效率。由于天然(野生型)白蛋白是單純白蛋白，因此不具有由真核細胞產生的受到^l連修飾的部分氨基酸序列。因此，本發明的含有糖鏈的白蛋白由含有上述葡糖基化序列的變異型氨基酸序列構成。本發明的變異型的白蛋白多肽雖然無論由任何方法得到的都可以，但是為了在該多肽中的葡糖基化序列Jl^擇性添加糖鏈，優選ffiil培養含有其編碼DNA的真核細胞來提供。雖然含有編碼變異型白蛋白的DNA的真核細胞可根據，例如對內在產生白蛋白的細胞(例如肝細胞等)進行自然或人為地(例如EMS等變異誘導劑處理、UV處理等)誘導變異，然后篩選產生含有葡糖基化序列的變異型白蛋白的細胞來獲得，但是，可以通過克隆編碼白蛋白的DNA，通過基因操作在該DNA內部導入編碼葡糖基化序列的MS序列，將得到的變異DNA插入至晗有在適當的宿主真核細胞中能行使功能的啟動子的載體中，使之位于該啟動子的控制下，利用得到的變異白蛋白表達載^^專化該宿主真核細胞而制得。編碼白蛋白的DNA可舉出來自人或其它其它恒溫動物的基因組DNA、來自的白蛋白產生細胞(例如肝細胞等)的cDNA、合成DNA等。編碼白蛋白的基因組DNA及cDNA可從以其產生細胞或組織(例如肝臟等)制備的基因組DNA組分及總RNA或mRNA組分作為模板的聚合,式反應(以下簡稱為"PCR法")及逆轉錄膝PCR(以下簡稱為"RT-PCR法")直接擴增獲得。此外，編碼白蛋白的基因組DNA和cDNA也可這樣克隆，艮P，將上i^人細胞、組織制備的基因組DNA和總RNA或者mRNA的片段插入到適當的載體中制備成基因組DNA文庫禾口cDNA文庫，通過菌落或者噬斑雜交法或者PCR法，分別進行克隆。文庫中使用的載體，可使用噬菌體、質粒、粘粒、噬菌粒等中的任一種。作為編碼白蛋白的DNA，可以列舉出例如含有編碼與序列號4所示的氨基酸序列中氨基酸序號1-585所示的氨基酸序列(野生型成熟HSA)同一或基本上同一的氨基酸序列的《序列的DNA等。"與序列號4所示的氨基酸序列中氨基酸序號1-585所示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列"可歹U舉出與序列號4所示的氨基酸序列中氨基酸序號1-585所示的氨基酸序歹懼有約80%以上，優選約90%以上，更優選約95%以上，特別伏選約98%以上的同源性的氨基酸序列等。"同源性"是指，應用該
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中公知的數學算法對比2個氨基酸序列時，最適的排列(優選，為了得到最適的排列，該算法在序列的一方或兩方導入間隔(gap))中，針對重疊區的所有氨基酸殘基的同一氨基酸及其類似氨基酸殘基的比率(％)。"對以氨基酸"是指物理化學性質類似的氨基酸，例如芳香族氨基酸(Phe、Trp、Tyr)、月旨肪族氨基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、極性氨基酸(Gln、Asn)、堿性氨基酸(Lys、Arg、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、具有羥基的氨基酸(Ser、Thr)、側鏈小的氨基酸(Gly、Ala、Ser、Thr、Met)等屬于同一類的氨基酸。預領贓這些類似的氨基酸間進行置換不會改變蛋白質的表型(即，保守的氨基酸置換)。保守氨基酸置換的具體例在該
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是眾所周知的，各種文獻中已有記載(例如，參照Bowie等，Science,247:1306-1310(1990))。本說明書中氨基酸序列的同源性，可應用同源性計算算法NCBIBLAST(NationalCenterforBiotechnologyInformationBasicLocalAlignmentSearchTool),按以下條件(期待值=10;允許間隔；陣列(7卜y夕"=BLOSUM62;過濾(7O夕U>夕"))OFF)進行計算。用于確定氨基酸序列同源性的其它算跑括，例如Karlin等，Proc.Natl.AcadSci.US入90:5873-5877(1993)中描述的算法[該算法納入到NBLAST及XBLAST程序中(2.0版)(Altschul等,NucleicAcidsRes.，25:3389-3402(1997))]、Needleman等,J.Mol.Biol.,48:444-453(1970)中描述的算法[該算法納入到GCG軟件包中的GAP程序中]、Myers和Miller,CABIOS,4:11-17(1988)中描述的算法[該算法納入到屬于CGC序列對比軟件包一部分的ALIGN禾辨中(2.0版)]、Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444-2448(1988)中描述的算法[該算法納入到GCG軟件包中的FASTA禾聘，它們同樣雌j細。更tti^地是，與序列號4所示的氨基li^列中氨基酸序號1-585所示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列是與序列號4所示的氨基酸序列中氨基,號1-585所示的氨基酸序列具有約80%以上、優選約90%以上，更優選約95%以上、特另iJ鶴約98。/。以上的同一性的氨基,列。所謂含有與序列號4所示的氨基酸序列中氨基酸序號1-585所示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列的蛋白質，指的是含有與，序列號4所示的氨基,列中氨基,號L585所示的氨基,列基本上同一的氨基鵬列，并且與含有序列號4所示的氨基酸序列中氮基酸序號1-585所示的氨基酸序列的蛋白質及具有實質上相同活性的蛋白質。對于實質上相同的活性例如白蛋白(尤其是血清白蛋白)的生理機能，例如作為血清分子的載體的機能、維持血漿膠質滲透壓的機能等。"實質上同質"指的是這些機能定性地相同。因此，雖然作為血清舒載體的機能等是同等的，但是其程度、蛋白質分子量等量的要素可以是不同的。此外，在編碼白蛋白的DNA中，含有例如，(1)序列號4所示的氨基酸序列中氨基酸序號1-585所示的氨基酸序列內缺失了1或2個以上(優選1-30個左右，更4繼1-10左右，特別4腿l-fHX2、3、4或5)個)的氨基酸的氨基列；(2)在序列號4所示的氨基,列中氨基辦號1-585所示的氨基列中添加了1或2個以上(ite1-30個左右，更雌1-10個左右，特別優選1-數^(2、3、4或5)個)的氨基酸是的氨基酸序列；(3)在序列號4所示的氨基酸序列中氨基酸序號1-585所示的氨基酸序列中插入了1或2個以上(優選1-30個左右，更iM1-10個左右，特別4腿l-數啊2、3、4或5)個)的氨基酸的氨基,列；(4)游列號4所示的氨基列中氨基號1-585所示的氨基列中1或2個以上(優選1-30個左右，更優選1-10個左右，特另||1-數啊2、3、4或5)個)的氨基酸被其它氨基酸取代了的氨基,列；或者(5)編碼含有這些氮基酸序列的組合的蛋白質的DNA等。上述氨基酸序列發生插入、缺失或者置換時，其發生插入、缺失或者置換的位置無特殊限定，只要保持蛋白質的活性即可。到m地是，編碼白蛋白(尤其是HSA)的DNA，可以列舉含有序列號3所示的堿基序列中MS序號73-1827所示的MS序列的DNA、或含有與序列號3表示的堿基序列在嚴緊條件下雜交的m序列，且編碼與含有J^序列號4所示的氨基酸序列中氨基酸序列號1-585所示的氨基酸序列的蛋白質具有實質上同質活性(例如血清肝的載體機能等)的蛋白質的DNA等。作為與序列號3所示的堿基序列可以在嚴緊條件下雜交的DNA，可以使用例如與是含有序列號3所示的m序列中堿基序號73-1827所示的堿基序列，在重合領域中具有約80%以上、優選90%以上、更優選95。/。以上同源性的堿基序列的DNA等。本說明書中堿基序列的同源性，可應用同源性計算算法NCBIBLAST(NationalCenterforBiotechnologyInformationBasicLocalAlignmentSearchToo1)，按以下條件(期待值=10;允許間隔；過濾(7O夕U>夕')=ON;匹配值(77f"義-7)=1;錯配值($義77*7-7)=國3)進行計算。用于確定氨基酸序列同源性的其它算法，上述氨基酸序列同源性的算法同樣適用。雜交可按照公知的方法或基于公知方法的方法，例如，分子克隆MdecularCloning)第2版(J.Sambrooketal.,ColdSpringHarborLab.Press,1989)中描述的方法進行。使用商品化的文庫時，雜交可按照使用說明中描述的方法進行。雜交雌在嚴格餅下進行。高度嚴格^j牛包括，例如，6XSSC(氯化鍬檸檬酸鈉)中于45。C進行雜交反應后，在0.2XSSC/0.1%SDS中65。C洗滌一次以上等。本領域技術人員可3131適當改交溶液的鹽濃度、雜交反應的溫度、探針濃度、探針長度、錯配數目、雜交反應的時間、洗滌液的鹽濃度、洗滌的溫度等，很容易地達到預期的嚴格程度。編碼白蛋白的DNA，可應用具有編碼白蛋白(尤其是HSA)的堿基序列的一部分的合成DNA引物，MPCR法進行擴增，或者^l繊入到適當的表達載體中的DNA，與標記的編碼白蛋白的一部分或者整個區域的DNA片段或者合成DNA進行雜交，進行克隆。在作為向編碼如上所述得到的白蛋白(尤其是HSA)的DNA中，導入編碼葡糖基化序列的序列的方法，可以列舉例如公知的位點特異性誘變誘導法(例如參見下述實施例的)等。葡糖基化序列編碼序列雖然可在編碼白蛋白的DNA任意部分中導入，但是在〗OTPCR法的位點特異性誘變誘導情況中，例如當導入編碼N結合型HI連的共有序列Asn-Xaa-Thr/Ser的堿基序列時，優選在編碼白蛋白的DNA的Asn殘基的編碼部分或Thr或Ser殘基編碼部分導入。也就是說，以編碼白蛋白的DNA作為模板，以(1)與包括編碼白蛋白中任意的Asn-Xaal-Xaa2部分的堿基序列的區域互補的寡核苷酸(但是，對應于Xaa2的密碼子被編碼Thr或Ser的密碼子密碼子取代)，或者(2)與包括編碼白蛋白中任意的Xaal-Xaa2-Thr/Ser部分的堿基序列的區域互補的寡核苷酸(但是，對應于Xaal的密碼子被編碼Asn的密碼子取代)中任意一種作為引物，通過實施PCR，能導Ai扁碼N結合型糖鏈的共有序列的堿基序列。不僅可以ilil如上所述的氨基酸取代，而且也可以通過利用相同的方法，在編碼白蛋白的DNA中插入編碼氨基酸(或氨基酸序列)的m序列或使編碼氨基酸(或氨基酸序列)的堿基序列從該DNA上缺失，使葡糖基化序列存在于該DNA中。例如，在HSA的情況中，更^m的是，ffl31將序列號4所示的氨基,列中氨基酸序號494所示的Asp殘代為Asn(Asn^)殘基來導入N結合型^連的共有序列(參見序列號2)。在Asn^上添加了糖鏈的含有辦連的HSA，盡管舒內IH連數是1個，但可以與根據之前公知的化學修飾得至啲含有辦連的白蛋白(具有多個糖鏈)以相同或以上的效率靶向肝臟。在其它優選的方式中，可通過將序列號4所示的氨基列中氨基號63所示的Asp殘代為Asn殘基(Asn63)或者M將氨基酸序號320所示的Ala殘代為Thr或Ser殘基(Thr/Se嚴)來導入N結合型糖連的共有序列(參見序列號2)。特別優選的實施方式中，本發明的含有^l連的HSA可含有添加在Asn^上的1個以上的葡糖基化序列，優選是N結合型糖鏈共有序列Asn-Xaa-Thr/Ser。此夕卜，作為IH連添加部位，可舉出Jl^的Asn63禾口/^述Thr/Se嚴的取代結果所產生的Asn318。將由上述克隆獲得的、編碼含有能通過真核細Wt行職連修飾的一個以上的部分氨基鵬列的變異型白蛋白的DNA，禾鵬限制酶或DNA連接酶連接到適當的表達載體中的啟動子下游，由此制備含有，DNA的表達載體。表達載體可以使用來自大腸菌的質粒(例如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、來自枯草桿菌的質粒(例如pUB110、pTP5、pC194)、來自酵母的質粒(例如pSH19、pSH15)、入噬菌體等噬菌體、逆轉錄病毒、痘病毒、桿)l滿毒等動物(昆蟲)病毒、pAl-ll、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。所述的啟動子可以是適用于表達基因的宿主的任意啟動子。在本發明中可用作宿主細胞的細胞，只要是具有可以在本發明的變異型白蛋白中的葡糖基化序列上添加糖鏈的辦連修飾機制的細胞，貝殿有特別柳蹄ij，可以列舉以哺乳動物為代表的動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母細胞、真菌細胞等各種真核細胞、或者轉基因動植物或昆蟲等。例如，在宿主是酵母的情況中，優選PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子等。在宿主是動物細胞的情況中，可使用來自巨細胞病毒(CMV)的啟動子(例如CMV前期啟動子)、來自人免疫缺陷病毒(fflV)的啟動子(例如HIVLTR)、來自Rous肉瘤病毒(RSV)的啟動子(例如RSVLTR)、來自小鼠乳癌病毒(MMTV)的啟動子(例如MMTVLTR)、來自猴子小鼠白血病病毒(MoMLV)的啟動子(例如MMTVLTR)、來自單純皰疹病毒(HSV)的啟動子(例如HSV胸苷激斷TK)啟動子)、來自SV40的啟動子(例如SV40初期啟動子)、來自EB病毒(EBV)的啟動子、來自腺伴隨病毒(AAV)的啟動子(例如AAVp5啟動子)、來自腺病毒(AdV)的啟動子(Ad2或Ad5主要后期啟動子)等。在宿主是昆蟲細胞時，優選多角體蛋白啟動子、pl0啟動子。作為表達載體，除上述之外，根據需要，還可以使用含有增強子、剪切信號、PdyA添加信號、選擇標記、SV40復制起點等的載體。選擇標記例如二氫葉酸還原酶(dhfr)基因[氮甲蝶呤(MTX)抗性抗性]、氨節青霉素抗性(AmpO基因、新霉素抗性(NeoO基因(G418抗性)等。特別是，在使用缺失dhfr基因的中國倉鼠(CHO-dhfr)細胞并使用dhfr基因作為選擇標記的情況中，還可1不含有胸腺嘧啶核苷的培養基:擇目的基因。此外，在插入的DNA不含有起始密碼子及終止密碼子的情況中，使用在啟動子區域的下游及終止子的上游區域上分別含有起始密碼子(ATG或GTG)及終止密碼子(TAG、TGA、TAA)的載體。此外，必要的話，可在編碼變異型白蛋白的DNA的5'末端側添加編碼適合宿主的信號序列的堿基序列(信號密碼子)。例如，在宿主是酵母時，可使用MFot信號序列、SUC2信號序列等，但是在宿主是動物細胞時，貝何分別使用胰島素信號序列、a-干擾素信號序列、抗體分子信號序列等。然而，由于已知5HSA的天然prepro序列(序列號4所示的氨基|列中氨基|號-24至-1所示的氨基酸序列)在大部分異種真核細胞中具有分泌信號的機能，因此，可在表達載體中直SI菌/i扁碼preproHSA的DNA。如上所述，宿主可以使用例如酵母、昆蟲細胞、昆蟲、動物細胞、動物等。酵母可以4頓例如釀i鵬母(Saccharomycescerevisiae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B曙12、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)NCYC1913、NCYC2036等。例如在病毒是AcNPV的情況中，昆蟲細胞可以是來自夜盜蛾幼蟲的株化細胞(spodopterafrugiperdacell;Sf細胞)、來自粉紋夜蛾(Trichoplusiani)中腸的MG1細胞、來自粉紋夜蛾卵的HighFive，細胞、來自甘藍燈蛾(Mamestrabrassicae)的細胞、來自Estigmenaacrea的細胞等。在病毒是BmNPV的情況中，昆蟲細胞可以使用來自蠶的株化細胞(BombyxmonN細胞；BmN細胞)等。該Sf細胞可以使用例如Sf9細胞(ATCCCRL1711)、Sf21細胞(以上，Vaughn,J.L.等，InVivo，13，213-217(1977))等。昆蟲可以使用例如蠶幼蟲等。動物細胞可以使用例如來自猴的細胞(例如COS-l、COS-7、CV-1、Vero)、來自倉鼠的細胞(例如BHK、CHO、CH0-K1、CHO-dhfr)、來自小鼠的細胞(例如:N1H3T3、L、L929、CTLL-2、AtT腸20)、來自大鼠的細胞(例如:H4HE、PC-12、3Y1、NBT-II)、來自人的細胞(例如HEK293、A549、HeLa、HepG2、HL-60、Jurkat、U937)等。可根據宿主的種類，按照公知方法進行轉化。可根據例如MethodsinEnzymology,194,182-187(1991)、Proc.Natl.Acad.Sci.US入75,1929(1978)等記載的方法進行酵母的轉化。可根據例如BioATechnology,6,47-55(1988)等記載的方法進行昆蟲細胞及昆蟲的轉化。可根據例如細胞工學別冊8新細胞工學實驗操作手冊，263-267(1995)(秀潤社發行)、Virology,52，456(1973)中記載的方法進行動物細胞的轉化。可根據宿主的種類按照公知方法進行轉化體的培養。培養S^，是液體培養基。此外，培養基tt^含有對轉化體繁殖所必需的碳源、氮源、無機物等。其中，碳源，可以列剩列如葡糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等；氮源，可以列舉例如銨鹽類、硝酸鹽類、玉米漿、蛋白胨、酪蛋白、肉提取物、大豆餅、馬鈴薯提取液等有機或有機物；無機物，例如氯化藥、磷酸二氫鈉、氯化鎂等。此外，還可在培養基中添加酵母提取物、維生素類、生長艦因子等。培養基的pHl腿是約5-8。作為培養宿主是酵母的轉化體時的培養基例如Burkholder基本培養基、含有0.5%酪蛋白氨基酸的SD培養基等。培養基的pH^i^約5-8。培養通常在約2(TC-35t:的溫度中進行約24-72小時。必要的話，還可通氣拌。作為培養宿主是昆蟲細胞或昆蟲的轉化體時的培養基，可以使用例如在Grace'sInsectMedium中適當地加入失活的、10%牛血清等添加物的培養基等。培養基的pH優選是約6.2-6.4。i咅養通常在約27。C的溫度中進行約3-5天。必要的話，還可通氣并攪拌等。作為培養宿主是動物細胞轉化體時的培養基，可以使用例如含有約5-20%的胎兒牛血清的極限必須培養S(MEM)、Dullbecco極限必需培養基(DMEM)、RPMI1640培養基、199培養基等。培養基的pH，是約6-8。培養通常在30tM(TC的溫度中進行約15-60小時。必要的話，還可通氣拌等。如上所述可以使含有糖鏈的白蛋白在轉化體的細胞內或細胞外生成。本發明的含有糖鏈的白蛋白由于優選用作向肝臟、尤其是肝巨噬細胞特異性移動的載體分子，因此更優選添加了與該細胞表面的受體親和性高的高甘露糖型糖鏈白蛋白。其中，"高甘露糖型"指的是在核心糖鏈(含有3分子的甘露糖)上添加了l個以上、4腿2個以上、更j繼3個以上、特別5個以上甘露糖分子的糖鏈。從這種觀點出發，較之于可以進行高甘露糖型、復合型及混合型的不同的糖鏈修飾的動物細胞及昆蟲細胞、可以只添加高甘露糖型糖鏈，且與動物細胞等相比，添加含有多個甘露糖分子的超甘露糖型糖鏈的酵母作為宿主細胞更為優選。其中，畢赤酵母(Pichia)屬酵母可能以甲醇作為唯一碳源進行增殖、一旦使之在甲醇中繁殖，發現對甲醇及其代謝中間體的處理所必需的酶被解除抑制。已知如果利用這種甲醇同化途徑，異種蛋白質的分泌量大大超過酵母菌屬酵母。實際上，利用這種系統的HSA制備已經進入實用化階段(例如參照特開平6-22784號專利公報)，在lL的培養基中肖蹄幌10g量級的HSA。以下，作為本發明特別優選的實施方式中的1個，對使用畢赤屬酵母作為宿主細胞的本發明的含有糖鏈的白蛋白的制備方法進fiH兌明。所用的載體無特殊限制，只要能在畢赤酵母屬酵母菌體內進行自我復制，艦重組至鵬母基因組內能維持基因的穩定性即可。能進行自我復制的載體包括，例如YEp載體、YRp載體、YCp載體等。另外，能重組至lj酵母基因組內的的載體包括YIp載體、YRp載體。育^在畢赤酵母屬酵母中能夠發揮作用的啟動子包括，酵母來源的啟動子，例如，釀酒酵母來源的PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子等、巴斯德畢赤酵母來源的乙醇氧化酶(AOX)1啟動子、AOX2啟動子、二羥丙酮合酶啟動子、P40啟動子、ADH啟動子、葉酸脫氫酶啟動子等。另外，，酵母來源的啟動子，也可是為了提高基因表達效率而經過修飾的變異型啟動子，例如突變型AOX2(mAOX2)啟動子[Ohietal.,Mol.Gen.Genet.,243,489499(1994);特開平4-299984號公報]等。優選，該啟動子是為了利用畢赤酵母屬酵母的甲醇代謝體系、甲醇或者其代謝中間體的處理所必要的因的啟動子，例如、A0X1啟動子和mAOX2啟動子等、更優選AOXl啟動子。本發明的包含編碼變異型白蛋白的DNA的表達載體，tt^包含能在畢赤酵母屬酵母中發揮功能的轉錄終止序列(終止子)(例如、AOX1終止子等)、增強子序列、能用于酵母篩選的標記基因(營養缺陷型基因，例如，巴斯德畢赤酵母或者釀酒酵母來源的HIS4、LEU2、ARG4、URA3基因等、或者抗生素抗性基因、例如、針對放線菌酮、G—418、氯霉素、博萊霉素、潮霉素等的抗性基因等)等，還可包含預期的能在酵母中發揮作用的可復制單位。為了大量制備載體，更包含能在大腸桿菌中發揮功能的復制單位和用于大腸桿菌篩選的篩選標記基因(例如、氨節青霉素和四環素的抗性基因等)。當表達載體是重組到酵母基因組內的載體類型時，期望該載體還包含與有必要進行同源重組的酵母基因組同源的序歹i」。這些同源序列包括上述營養缺陷型基因的序列。因此，在的一個實施方式中，本發明的表達載體是在營養缺陷型基因內插入了，變異型白蛋白的表達盒(本說明書中"表達盒"是指可能進行基因表達的單位，是在啟動子的調控下配置了蛋白質編碼序列的最小單位，優選是由啟動子_蛋白質編石紫貢域一終止子構成的單位)。可應用公知的轉化技術，例如、感受態細胞法、原生質體法、磷酸鈣共沉淀法、聚乙二醇法、鋰法、電穿孔法、顯微注射法、月旨質體融合法、粒子槍法等、將如上所得表達載體導入到目的畢赤酵母屬酵母菌體內。本發明中應用的畢赤酵母屬酵母無特殊限定，包括例如、巴斯德畢赤酵母、金合歡畢赤酵母(尸;C/^)、安格斯畢赤酵母(尸/c/^朋gZ^to)、異常畢赤酵母(尸/c/zz'a""oma/")、尸/c/z/"ca/75^/a/a、西弗畢赤酵母(尸/c/zz'ac^/^rz7)、i矣切爾氏畢赤酵母(尸z'c/n'aefc/e〃w7)、尸/c/z/"y^//am7、^b、狀畢赤酵母(尸z'c/z/aT^f〃力cwa)、季也蒙氏畢赤酵母(尸/c/z/agwz'〃/ermowd//)、尸/c/n'(2z'wcwYovora、尸/c/z&7'(3(i/w7、甲酉享畢赤酵母(尸/c/z/ame/^awo/Zca)、擁P威畢赤酵母(尸/c/zz'(3won^ge"w^)、尸z'c/z/a(/wwae"w's、豐公畢赤氏酵母(尸/c/^'ap/"船)等。優選巴斯德畢赤酵母中的營養缺陷型突變巴斯德畢赤酵母株(例如、巴斯德畢赤酵母GTS115株(HIS4-)[NNRLY_15851]、巴斯德畢赤酵母GS190株(ARG4-)[NNRLY—18014]、巴斯德畢赤酵母PPF1(HIS4-，URA4-)[NNRLY—18017]等)。轉化后的畢赤屬酵母，通過使用本
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通常使用的方法培養，可產生含有糖f連的白蛋白。所應用的培養基必須至少包含宿主細胞生長必要的碳源和無機或者有機氮源。作為碳源，有甲醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖、可溶性淀粉等。另外，作為無機或者有機氮源，有銨鹽類、硝酸鹽類、氨基酸、玉米漿、蛋白胨、酪蛋白、肉提取物、酵母提取物、大豆粕、馬鈴薯("'^^)3)提取液等。還可包含預期的其它營養元素，例如，氯化辛丐、磷酸二氫鈉、氯化f美等無機鹽，生物素等維生素類以及抗生素等。所應用的培養基包括，例如，通常的天然培養基(例如，YPD培養基、YPM培養基、YPG培養基等)或者合成培養基。培養基的pH和培養、皿，可采用適于酵母增殖和人血紅蛋白產生的pH和溫度，但優選，例如、pH約5約8、培養纟鵬約20約3(TC。另外，必要時，可進4彌氣攪拌。通常進行大約48120小時的培養。例如、當畢赤酵母屬酵母菌體內發揮作用的啟動子使用AOX1啟動子、mAOX2啟動子等能通過甲醇誘導表達的啟動子時，最優選的示例是，應用含甘油作為菌體增殖的碳源、包含白蛋白的表達誘導因子甲醇、pH控制在大約6.0的天然培養基進行液體通氣攪拌培養的方法。當白蛋白的表達對菌體的生長不利時，更優選，首先用甲醇以外的碳源增加菌體量，然后添加甲醇誘導白蛋白的表達的培養方法。另外，用罐發麟的培養中，高密度培養法是適于人血紅蛋白產生的方法。培養可用分批培養、流加培養、連續培養任一種方式進行，但優選流加培養法。即，一定期間內，在含有適于宿主菌體增殖的碳能源(例如葡萄糖等)和/或者營養源的培養基(初期培養基)中培養宿主菌體，根據情況，從某個時間點向該培養基中追加供給支配白蛋白表達的基質(即甲醇)，一直到培養終了時也不將人血紅蛋白分離出體系外的方法(例如、參照特開平3—83595號公報)。可將培養終了后的培養物進行離心和/或者過濾，回收酵母菌體，接下來，按照公知的方法從菌體中進行分離純化培養物中產生的人血紅蛋白。這些方法，可應用鹽析和溶劑沉淀法等利用溶解度的方法；透析法、超濾法、凝膠過濾法、和SDS—聚丙烯,安凝膠電泳法等為主的禾,分子量差的方法；離子交換色譜等利用電荷差的方法；親和色譜等利用特異親和性的方法；逆相高速液體色譜等利用疏水性差異的方法；等電點電泳法等利用等電點差異的方法等。這些方法也可ia纟于適當組合使用。分離純化出的人血紅蛋白的驗證方法，包括公知WesternBlotting法和活性測定法等。此外，還可ilil氨基酸分析、N末端氨基酸測序、一級結構分析、^f連分析等方法分析純化的含有糖f連的白蛋白的結構。這樣獲得的含有糖鏈的白蛋白由于是向變異型白蛋白的糖基化序列選擇性添加了糖鏈，優選高甘露糖型糖鏈的均一的糖蛋白質，因此向肝臟的非實質細胞、尤其是肝巨噬細胞的移動性較高。因此，本發明還提供了一種含有如上所述的本發明的含有辦連的白蛋白的向肝臟超老的藥物載體。以本發明的含有糖鏈的白蛋白(尤其是HSA)為主要成分的本發明的藥物載體可以傳送至肝臟，肝臟的非實質細胞、尤其是肝巨噬細胞，可用于將預防和/或治療上有效的任意醫藥化合物耙向于娜器或細胞。這種醫藥化合物例如抗氧化物(例N-乙酰半胱氨酸、抗壞血酸等)、氧化氮等。使該藥物化合物結合到本發明的含有糖鏈的白蛋白上的制劑可用于肝虛血再灌流障礙的治療。此外，作為其它醫藥化合物，還可舉出肝纖維癥治療藥OK432等肝臟藥物等。并且，白蛋白這種物質由于其本身具有抗氧化作用，因此可用作抗氧化作用的醫藥品。含有擗連的白蛋白與醫藥化合物的結合形式沒有特別限制，但例如共價結合、氫結合、疏水結合等，優選共價結合。使白蛋白與醫藥化合物的結合方法是公知的，例如可參見《給藥系統》(1986年，CMC發行)。醫藥化合[含有糖鏈的白蛋白結合體可fflil公知方法(超濾、除菌過濾、分注、凍干等)制成制劑。具體以列舉，含有5-25%該結合物，pH在6.4-7.4左右的范圍，滲透壓為1左右的液狀制劑。該制齊咖果必要的話可加入作為穩定劑的乙酰色氨酸或其鹽(例如，鈉鹽)及辛酸鈉。穩定劑的、添加量，可以列舉例如是0.01-0.2M，優選0.02-0.5M左右。此外，鈉含量可以列舉3.7mg/ml以下。可在超濾、除菌過濾、分注、凍干等處理前添加該穩定劑。雖然上述方法得到的本發明的醫用制劑受到各種微生物污染的可能性很低，但是還可進行無菌填充后的加熱處理(巴氏滅菌法)來使夾雜的微生物失活作為積極地確保制劑無菌性的手段。力口熱處理是將與給藥單位相當的向容器中填充的制劑填充到任意的容器中的處理，例如約50-約7(TC(iM約60。C)的7]C浴中保J轉勺30併中以上，使夾雜的微生物徹底地失活。加熱時間，是約30分鐘-約2小時。該醫藥制齊,如可作為注射劑給藥給人或其它哺乳動物等。該制劑的給藥量根據醫藥化合物的種類、給藥途徑、病情的嚴重程度、給藥對象的物種、給藥對象的藥物接受性、體重、年齡等而不同，例如在含有氧化氮作為有效成分的肝虛血再灌流障礙治療劑的情況中，通常，成人每天，在約5-約10ml溶液中含有0.1-30ug/kg氧化氮量、優選0.5-3ug/kg，含有約0.1-30mg/kg糖鏈的白蛋白量、優選0.5-3mg/kg的范圍，緩慢地靜脈內注射或點滴靜脈內給藥。白蛋白(尤其是HSA)本身作為醫藥可適用于例如主要是休克時的急速血漿增量、補充循環血流量、改善低蛋白血癥、維持膠質滲透壓等目的。具體的效育扱效果是對白蛋白損失(熱傷、腎病癥候群等)及白蛋白合成低下(肝硬化等)的低白蛋白血癥、出血性休克等有效。因此，本發明的含有糖鏈的白蛋白還可用作改善這些疾病和狀態的醫藥。這種情況與，相同可將其制成注射劑的劑型。白蛋白制齊啲給藥量根據給藥途徑、病情嚴重度、給藥對象及物種、給藥對象的藥物受容性、體重、年齡等不同而不同，通常成人一次給藥HSA25。/o溶液20-25ml(HSA5-12.5g)，緩慢地靜脈內注射或點滴靜脈內給藥。雖然根據以下實施例將更具體地說明本發明，但是本發明不受到這些實施例的限制。(1)白蛋白基因的變異在質粒pPIC9中導入人血清白蛋白基因所得的質粒作為(以下為pPIC9-HSA)模板，用序歹ij號5(5，-GAGTCAGCTGAAAATTGTAACAAATCACTTCATACCC-3，)的D63N有義引物，列號6(5'-GGGTArGAAGTGATTTGTTACAATTTTCAGCTGACTC-3')的D63N反義弓卿作為合成弓l物制備含有Asi^結合型辦連的白蛋白；用序列號7(5'-GGATGTTTGCAAAAACTATACTGAGGCAAAGG-3')的A320T有義引物及序列號8(5'-CCTTTGCCTCAGTATAGTTTTTGCAAACATCC-3')的A320T反義弓嫩作為合成弓胸制備含有Asn318結合型擗連的白蛋白；用序列號9(5，-GCTCTGGAAGTCAATGAAACATACGTTCCC-3')的D494N有義引物及序列號10(5'-GGGAACGTATGTTTCATTGACTTCCAGAGC-3，)的D494N反義弓胸作為合成弓吻制備含有Asn，結合型^f連的白蛋白，由ltbiS行N結合型糖鏈的共有序列的變異(QuikChangeXLSite-DirectedMutagenesisKit、Stratagene)。作為變異的反應條件，是將DNA在95'C時處理30秒后，變性(95。C、30秒)、退火(55°C、1么H中)及延伸(68°C、10分鐘)的反應循環進行12次。反應后，用DpnI消化了的模板的質粒，將得到的pPIC9-HSA(D63N)、pPIC9-HSA(A320T)、及pPIC9-HSA(D494N)分別導入XL-10-Goldultracompetentcell中進行轉化。導入了目的質粒pPIC9-HSA(D63N)、pPIC9-HSA(A320T)、及pPIC9-HSA(D494N)的轉化體在添加了氨芐青霉素的培養基中進行篩選，從得到轉化體中純化質粒(QIAprepSpinMiniprepKit、QIAGEN制)。采用ABIPnsm310基因分析儀(AppliedBiosystems)，用序列號11(5'-GAAAATTTCGACGCCTTGGTGTTGATTGCC-3，)的D63N測序引物對pPIC9-HSA(D63N)進行變異確認；用序列號12(5'-GGCGGACCTTGCCGACTATATCTGTGA-3')的A320T測序引物對pPIC9-HSA實施例(A320T)進行變異確認；以及用序列號13(5'-GGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGG-3')的D494N測序引物對pPIC9-HSA(D494N)進行變異確認。此外，將以上制得的pPIC9-HSA(D63N)作為模板、將序列號7的A320T有義引物及序列號8的A320T反義引物作為合成引物，同樣地，進行N結合型IB連的共有序列的變異(QuikChangeXLSite-DirectedMutagenesisKit、Stratagene)制備Asn63、Asn318、Asn柳的三部位上全部結合糖鏈的人血清白蛋白。將這樣制得的pPIC9-HSA(D63N/A320T)作為模板，將序列號9的D494N有義引物及序列號10的D494N反義引物作為合成引物，與上相同:ttt行變異(QuikChangeXLSite-DirectedMutagenesisKit、Stratagene)，制得pPIC9-HSA(D63N/A320T/D494N)。(2)含有糖鏈的AiftL清白蛋白的表達pPIC9-HSA(D63N)、pPIC9-HSA(A320T)、pPIC9-HSA(D494N)及pPIC9-HSA(D63N/A320T/D494N)分別用限制酶SalI消化、苯酚提取、乙醇沉淀純化后，用電穿孔裝置(GenePulsernElectroporationSystem、BIO-RAD制)M與畢赤酵母酵母(GS115株)的HIS4基因座同源重組而進行的轉化。得至啲轉化條BMMY液體培養基中培養，確認表達白蛋白后，用甘油儲存。(3)含有^f連的白蛋白的純化轉化的畢赤酵母酵母在BMGY液體培養基中培養48小時，隨后在BMMY士咅養基中在每隔12小時添加1%甲醇的同時培養96小時。離心分離(6000X106H中)分離酵母后，用200mM醋酸緩沖M"培養的上清、Mfi^析。隨后，使白蛋白結合到BlueSepharoseCL-6B柱(77、>氣厶"<才寸工>;^社制)上，用0—3MNaCl濃度梯度洗脫白蛋白。然后，在0.65M硫酸銨/100mM磷勝內緩沖液(pH7.0)中透析洗脫液后，JI)lHiTrapPhenylHP柱(77、>氣厶"1才廿4工>》社制)，回收未吸附部分。進行活性炭脫脂。對照例l不含有糖鏈的(野生型)人血清白蛋白的制備除了不進行N結合型糖鏈的共有序列的變異之外進行與實施例相同的步驟，在畢赤酵母酵母中表達不含有糖鏈的人血清白蛋白，得到人血清白蛋白(HSA)。(4)微例l將以與實施例同樣方式制備的含有糖鏈的白蛋白，用放射性同位素銦(mIn)標記，制得含有mIn糖鏈的白蛋白(D63N、A320T、D494N及D63N/A320T/D494N)。將含有'"In糖鏈的白蛋白經小鼠的尾靜脈給藥(給藥量lmg/kg)，給藥后每隔一段時間取血及肝臟，用放射線量測定儀器測定白蛋白濃度及肝臟移動性。將作為對照的對照例1得到的AJl清白蛋白用mIn標記，將minAl&清白蛋白給藥小鼠，進行相同測定。圖l示出了血漿及肝臟中含有糖f連的白蛋白相對于給藥后經過的時間與給藥量的濃度比例，也就是向肝臟的移動性(肝積累(Hepaticaccumulation)(%劑量))。根據圖1的結果可以看出，含有糖鏈的白蛋白，尤其是D494N及D63N/A320T/D494N從血中迅速消失，活躍地被吸收到肝臟內。此外由于D63N、A320T及D494N之間在體內動態顯著不同，因此，示出含有糖鏈的白蛋白的向肝臟移動性除了依賴于分子表面的糖密度，還很大程度依賴于糖鏈的結合部位。(5)微例2用laserelectrophoresis-zatapotentialanalyzer(LEZA-500T)來評j介實施例的含有川In^!連的白蛋白(D63N、A320T、D494N及D63N/A320T/D494N)及對照例1的人血清白蛋白的電荷狀態。如表1所示與不含有糖鏈的白蛋白(HSA)相比，本次制得的變異體在電荷上未見有明顯的差別。因此，S31真核細胞受至賺鏈修飾的白蛋白相較于沒有受到糖鏈修飾的白蛋白來說，在蛋白質電荷上的區別很小，完全保持了原本蛋白質盼性質。另一方面，從圖1讀取60併中時的向肝臟的移動性(肝積累(％劑量))的情況中(表1)，與不含有糖鏈的白蛋白(HSA)相比，含有糖鏈的白蛋白是其6-65倍。也就是說，在保持了白蛋白蛋白質性質的同時還很大地提高了向肝臟的移動性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>序列表<110〉NiproCorporation<120>含^H鏈的白蛋白、其諱恪方扱其用途<130〉A7649<160>13<170〉Pat,entlnversion3.3<210〉<211><212><213〉11827DNA人工的<220><223〉編碼具有糖基化位點的突變HSA的DNA<220><221><222>CDS(1)..(1827)<220〉<221><222>sig—肽(l)..(54)<220><221><222>ma.tj太(73)..(1827)<400〉1atga.agt,gggtaaccttta.ttteccttctttttetctttagetcggetMetLysTrpValThrPhelieSerLeuLeuPheLeuPheSerSerAla-20-15-1048tatteca,ggggt,gtgtttcgtcgagatgcacacaagagtgaggttgetTyrSerArgGlyValPheArgArgAspAlaHisLysSerGluValAla_5-l1596ca.teggttta.aagatttgggagaagaaaatttcaaagccttggtgttgHisArgPheLysAspLeuGlyGluGluAsnPheLysAlaLeuValLeu101520144attgcctttgetcagtatcttcagcagtgtccatttgaagatcatgtalieAlaPheAlaGinTyrLeuGinGinCysProPheGluAspHisVal25303540192aaattagtga,atLysLeuValAsngaagta,GluVal45actgaatttgcaThrGluPheAla50aaaacatgtLysThrCysgttgetValAla55gatAsp240gagteagetgaaaattgtGluSerAlaGluAsnCys60racaaateacttcataccctttttggagacXaaLysSerLeuHisThrLeuPheGlyAsp6570288a,aattat,gcLysLeuCys75a,ca,ThrgttValAlaactcttThrLeu80cgtg犯Glua_ccThrtatggtTyrGly85gaaatgGluMetgetAla336AsptgcCys90tgtCysgcaAlaaaaLyscaaGingaacctGluPro95gagGluagaArgAsng肌tgcGluCys100ttcPhettgLeucaaGin384cacHis105LysgatAspAsp肌cAsncca_Pro110aacetcAsnLeucccProttgLeu115gtgaga.ValArgccaProgagGlugttVal120432gat,AspgtgValMettgcCysactgetThrAla125tttcatPheHisga,cAspa,atAsn130gaaGlugagacaGluThrtttPhettgLeu135aaaLys480aaalyst￡lCTyrttaLeutatTyr140ga^attgccagaGlulieAlaArg卿145catHiscctProta,ctttTyrPhetatTyr150gCGAlaccgPro528gaaetccttttctttgetaaaaggtataaagetgettttacagaatgtGluLeuUuPhePheAlaLysArgTyrLysAlaAlaPheThrGluCys155160165576tgccaagetgetgataaagetgcctgcctgttgccaaagetcgatgaaCysGinAlaAlaAspLysAla.AlaCysLeuLeuProLysLeuAspGlu170175180624cttegggat,gaaggga,agget.tegt.ctgccaaacagagaetcaagtgtLeuArgAspGluGlyLysAlaSerSerAla,LysGinArgLeuLysCys185190195200672gccagtetccaaaaatttggagaaaga,getttcaaagcatgggcagta,AlaSerLeuGinLysPheGlyGluArgAlaPheLysAlaTrpAlaVal205210215720getAlacgcctgLeuageSer220cagagatttcccGinArgPheProaaaLys225getAlagagGlutttgcaPheAlaGlu230gttValtecSer768aagt.tagtgLysLeuVal235aca,gatThrAspcttaccLeuThr肌a,Lys240gtcValca.cacgHisThrgeta,GlutgcCys245tgcCyscatHisGly816gatctgcttAspLeuLeu250gaatgtGluCysgetgatAlaAsp255gacAspArggcggacAlaAspcttLeu260gccAlaaagLystatTyratelie864tgtgaaaatCysGluAsn265GinAsptegateSerlie270tecSerSeraaactgLysLeu275LysGlutgcCystgtCysgaaGlu280912aaacctLysProLeuttgLeugaaGlu285aaatecLysSerHistgcCyslie290gccAlag肌GlugtgValGluAsn295gatAsp960gagatgGluMetcctProgetAla300AspttgLeucctProteaSerLeu305getAlagetAlagatAsptttPhegttVal310GluagtSer1008aa,ggatLysAspgttVal315tgcCysa.aaLysAsntatTyrret320gagGlugcaAla鄉LysgatAspgtcVal325ttcPhectgLeuGly1056atgt,ttMet,Phe330ttgLeutat,TyrGlutat,丁yrgca.Ala335卿agg/Vrgcat,HiscctProgat,Asp340TyrtctSergtcValgtgVal1104ctgctgLeuLeu345ctgLeu卿ArgcttLeugccAla350LysThrtatTyrg肌GluaceThr355actThretaLeugagGluaagLystgcCys3601152tgtgccCysAlagetAlagcaAlagatAsp365cctProcatHisGlutgcCystatTyr370gccAlaLysgtgValttcPhegatAsp375g犯Glu12001.11aa.a.PheLyscctProctt.Leu380gtgValgaaGlugagGlucctProGin385AsnttaLeuatelieLysGin390aatAsntgtCys1248gagcttGluLeutttPhe395gagGlucagGincttLeuggaGlygagGlu400tacTyraa,aLysttcPheGinaat,Asn405gcgAlaetaLeuttaLeu1296gttcgtValArg410Tyra,ccThr呵LysLysgta.Val415cccProGingtgValteaSeract,Thr420CC3ProactThrcttLeuVal1344gaggtcteaagaaacetaggaaaagtgggcageaaatgttgtaaacat1392GluValSerArgAsnLeuGlyLysValGlySerLysCysCysLysHis425430435440cctProg肌gcaaaaGluAlaLysa.ga.atgArgMet445cccProtgtCysgca,AlagaagacGluAsp450ta,tTyretaLeutecSerVal455gtcVal1440ctgLeuAsncagttaGinLeu460tgtgtgCysValttgLeucatHisgagGlu465aaa,acgLysThrccaProgtaValagtSer470AspArg1488gtcValaccThraaatgcLysCys475tgcacaCysThrgaaGlutecSer480ttgLeugtgVal肌cAsnaggArgcga485ProtgcCystttPhe1536teaSergetAla490ctggaaLeuGlugtcratValXaag肌Glu495ThrtacTyrgttValcccProL>ys500gagGlutttPhe肌tAsngetAla1584gaaGlu505acaThrttcaccPheThrttccatgcaPheHisAla510gatAspatalietgcCysacaThr515cttLeutctSergagGlu肪ggagGlu5201632agaArgGinat,caa.glieLysaaacaaa.ct,LysGinThr525gca.AlacttLeugttVal530gagGluetcLeugtgValaaaLyscacHis535aagLys1680cccPro呵Lysgca,a,caAlaThr540aaagagcaaLysGluGinctgLeuLys545getAlagttValatgMetgatAspgatAsp550ttcgcaPheAla1728getAlatttPhegtagagValGlu555aagtgctgcLysCysCys肌gLys560getAlagacAspgatAspaagLysgagGlu565accThrtgctttCysPhe1776gccAlagagGlu570gagggtGluGlya.aa.aaacttLysLysLeu575gttValgetAlagcaAlaagtSercaaGin580getAlagccAlattaggcLeuGly1824ttaLeu5851827<210>2<211〉609<212>PRT<213>人工的<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula><image>imageseeoriginaldocumentpage28</image>GluMetProAlaAspLeuProSerLeuAlaAlaAspPheValGluSer300305310LysAspValCysLysAsnTyrXaaGluAlaLysAspValPheLeuGly315320325Met,PheLeuTyrGluTyrAla.ArgArgHisProAspTyrSerValVal330335340LeuLeuLeuArgLeuAlaLysThrTyrGluThrThrLeuGluLysCys345350355360CysAlaAlaAlaAspProHisGluCysTyrAlaLysValPheAspGlu365370375PheLysProLeuValGluGluProGinAsnLeulieLysGinAsnCys380385390GluLeuPheGluGinLeuGlyGluTyrLysPheGinAsnAlaLeuLeu395400405ValArgTyrThrLysLysValProGinValSerThrProThrLeuVal410415420GluValSerArgAsnLeuGlyLysValGlySerLysCysCysLysHis425430435440ProGluAlaLysArgMetProCysAlaGluAspTyrLeuSerValVal445450455LeuAsnGinLeuCysValLeuHisGluLysThrProValSerAspArg460465470ValThrLysCysCysThrGluSerLeuValAsnArgArgProCysPhe475480485SerAlaLeuGluValXaaGluThrTyrValProLysGluPheAsnAla490495500GluThrPheThrPheHisAlaAsplieCysThrLeuSerGluLysGlu505510515520ArgGinlieLysLysGinThrAlaLeuValGluLeuValLysHisLys525530535ProLysAla.ThrLysGluGinLeuLysAla.Va.lMetAspAspPheAla.540545550Ala,PheValGluLysCysCysLysAlaAspAspLysGluThrCysPhe555560565AlaGluGluGlyLysLysLeuValAlaAlaSerGinAlaAlaLeuGly570575580Leu585<210>3<211>1827<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220〉<221>CDS<222>(1)..(1827)<220><221>sigj太<222>(1)..(54)<220><221>mat—肽<222>(73)..(1827)<■>3atgaagtgggtaa.cct.tta,ttteccttctttttetctttagetegget48MetLysTrpValThrPhelieSerLeuLeuPheLeuPheSerSerAla-20—15—10tatTyrtecSeraggArgggtGly一5gtgVa.ltttPhecgtArgcgaArg—1gat,Asp1gcaAlacacHisaagLysagtSer5gagGlugttValgetAla96catHiseggArg10tttPheLysgatAspttgLeuggaGly15gaaGlugaaGluAsnttcPheLys20gccAlattgLeugtgValttgLeu144attlie25gccAlatttPhegetAla.cagGintatTyr30cttLeucagGincagGintgtCysccaPro35tttPhegaaGlugatAspcatHisgtaVal40192aaaLysttaLeugtgVa.lAsng朋.Glu45gtaValactThrga.a.GluPhegcaAla50LysacaThrtgtCysgttValgetAla55gatAsp240gagGluteaSergetAlagaaGlu60aa.tAsntgtCysgacAspaaa.LysteaSer65cttLeucat,HisaccThrcttLeutttPhe70ggaGlygacAsp288a,a.alysttaLeutgcCys75acaThrgttValgca.AlaactThrcttLeu80cgtgaaGluThrtatTyrggtGly85GluMetgetAla336ga,cAspt,gcCys90tgtCysAlaaaaLyscaaGingaaGlu95cctProgagGlu卿ArgAsnGlu100tgcCysttcPhettgLeucaaGin384cacHis105aaaLysgatAspga'cAspAsnPro110aa^cAsnetcLeucccProcgaArgttgLeu115gtgVal鄉ArgccaProgagGlugttVal120432gat,AspgtgValatgMetCysact丁hr125getAlatttPhecatHisAspAsn130gaaGlugagGlua.ca_ThrtttPhettgLeu135aB3Lys柳aaaLysTyrtta,LeutatTyr140g肌GluattliegccAla卿a,gaArg145cat.HiscctProtacTyrtttPhetatTyr150gccAlaccgPro528gaaGluetcLeucttLeu155ttcPhetttPhegetAlaaaaLysArg160tatTyraaaLysgetAlagetAlatt.tPhe165acaThrgaaGlutgtCys576tgccaagetgetgataaagetgcctgcctgttgccaaagetcgatgaaCysGinAla.AlaAspLysAlaAlaCysLeuLeuProLysLeuAspGlu624170175180ctteggLeuArg185gatAspgaaGlugggaagGlyLys190gettegAla,SertctgccaaaSerAlaLys195GinetcaagArgLeuLystgtCys200672gccagtAlaSeretcLeuca,a,GinaaatttLysPhe205ggagaaGlyGluagagetttcArgAlaPhe210aaaLysgcatgggcaAlaTrpAla215gtaVal720getcgcAla,ArgctgLeuageSer220cagGin卿tttPhecccProa'aagetgagLysAlaGlu225tttPhegca_gaagttAlaGluVal230tecSer768aagttaLysLeugtgVal235ThrgatAspcttLeuThraaaLys240gtcValca_cHisThrGlutgcCys245tgccatCysHisggaGly816gatctgAspLeu250cttLeuGlutgtCysgetAlagatAsp255gacAspArggcgAlaAspcttgccLeuAla260肌gtatLysTyratelie864tgtg肌CysGlu265a,a.t,Asnca,a.Gingat,AsptegSer270a_tclietecSer叫tSeraaaLysctgLeu275a,a,ggaaLysGlutgctgtCysCysgaaGlu280912aaacctLysProctgLeuttgLeuGlu285aaaLystecSercacHistgcCyslie290gccAlagaa,gtgGluValgaaaatGluAsn295gatAsp960gagatgGluMetcctProgetAla300gacAspttgLeucctProteaSerttaLeu305getAlagetAlagattttAspPhegttgaaValGlu310Ser1008aaggatLysAspgttVal315tgcCysaaaLysAsntatTyrgetAla320gagGluAla鄉LysgatgtcAspVal325ttcctgPheLeuggcGly1056atgtttMetPhe330ttgLeutatTyrGlutatTyrgca,Ala.335Argaggcat.HiscctProgattacAspTyr340tctgtcSerValgtgVal1104ctgctgLeuLeu345ctgLeua'ga,cttLeugccAla350aagLysThrtatTyrgaaGlua,ccThr355actetaThrLeugagaagGluLystgcCys3601152tgtgccCysAlagetAlagcaAlagatAsp365cctProcatHisg朋GlutgcCystatTyr370gccAlaaaagtgLysValttcgatPheAsp375Glu1200t,ttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaateaaacaaaattgt1248PheLysProLeuValGluGluProGinAsnLeulieLysGinAsnCys380385390gagctt,tttgagca,gcttggagagtacaaa.ttccaga,atgcgetatta1296GluLeuPheGluGinLeuGlyGluTyrLysPheGinAsnAlaLeuLeu395400405gttcgt,t,a,caccaa.gaaagta.cccca,agtgtea.actccaactcttgta1344ValArgTyrThrLysLysValProGinVa,lSerThrProThrLeuVal410415420gaggtcteaaga,aacetaggaaaagtgggcageaaatgttgtaaacat1392GluValSerArgAsnLeuGlyLysValGlySerLysCysCysLysHis425430435440cctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaagactatetatecgtggtc1440ProGluAlaLysArgMetProCysAlaGluAspTyrLeuSerValVal445450455ctgaacca.gttatgtgtgttgcatgaga,aa,acgccagtaagtgacaga1488LeuAsnGinLeuCysValLeuHisGluLysThrProValSerAspArg460465470gtcaccaaatgctgcacagaatecttggtgaacaggcgaccatgctt,t.1536ValThrLysCysCysThrGluSerLeuValAsnArgArgProCysPhe475480485teagetctggaagtcgatgaaa,catacgttcccaaagagtttaatget1584SerAlaLeuGluValAspGluThrTyrValProLysGluPheAsnAla490495500ga.aacattcaccttccatgcagatatatgcacactt,tctgagaaggag1632GluThrPheThrPheHisAlaAsplieCysThrLeuSerGluLysGlu505510515520agacaaateaaga.a.acaaactgcacttgttga,getcgtgaaacacaag1680ArgGinlieLysLysGinThrAlaLeuValGluLeuValLysHisLys525530535cccaaggcaacaaa.agagcaactgaa,agetgtt,a,tgga;tgat,ttcgca1728ProLysAlaThrLysGluGinLeuLysAlaValMetAspAspPheAla540545550getttt,gtagaga.agtgctgcaaggetgacgataaggagacctgcttt1776Ala.PheValGluLysCysCysLysAlaAspAspLysGluThrCysPhe555560565gccgaggagggtaaaaaacttgttgetgcaagtcaagetgccttaggc1824AlaGluGluGlyLysLysLeuValAlaAlaSerGinAlaAlaLeuGly570575580tta1827Leu585<210〉4<211>609<212>PRT<213>人<400>4MetLysTrpValThrPhelieSerLeuLeuPheLeuPheSerSerAla-20-15-IOTyrSerArgGlyValPheArgArgAspAlaHisLysSerGluValAla一5-l15HisArgPheLysAspLeuGlyGluGluAsnPheLysAlaLeuValLeu101520lieAlaPheAlaGinTyrLeuGinGinCysProPheGluAspHisVal25303540LysLeuValAsnGluValThrGluPheAlaLysThrCysValAlaAsp455055GluSerAla.GluAsnCysAspLysSerLeuHisThrLeuPheGlyAsp606570LysLeuCysThrValAlaThrLeuArgGluThrTyrGlyGluMetAla758085AspCysCysAlaLysGinGluProGluArgAsnGluCysPheLeuGin9095100HisLysAspAspAsnProAsnLeuProArgLeuValArgProGluVal105110115120AspValMetCysThrAlaPheHisAspAsnGluGluThrPheLeuLys125130135LysTyrLeuTyrGlulieAlaArgArgHisProTyrPheTyrAlaPro140145150GluLeuLeuPhePheAlaLysArgTyrLysAlaAlaPheThrGluCys155160165CysGinAlaAlaAspLysAlaAlaCysLeuLeuProLysLeuAspGlu170175180LeuArgAspGluGlyLysAlaSerSerAlaLysGinArgLeuLysCys185190195200AlaSerLeuGinLysPheGlyGluArgAlaPheLysAlaTrpAlaVal205210215AlaArgLeuSerGinArgPheProLysAlaGluPheAlaGluValSer220225230LysLeuValThrAspLeuThrLysValHisThrGluCysCysHisGly235240245AspLeuLeuGluCysAlaAspAspArgAlaAspLeuAlaLysTyrlie250255260CysGluAsnGinAspSerlieSerSerLysLeuLysGluCysCysGlu265270275280LysProLeuLeuGluLysSerHisCyslieAlaGluValGluAsnAsp285290295GluMetProAlaAspLeuProSerLeuAlaAlaAspPheValGluSer30030531035<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula><image>imageseeoriginaldocumentpage37</image><210>7<211>32<212〉DNA<213〉人工的<220><223>引物<■>7ggatgtttgca,a.a,aa.ct,at,actgaggcaaagg32<210〉8<211>32<212〉DNA<213>人工的<220><223>引物<400〉8ccttt,gcct,ca.gta.tagtt,t,ttgcaaacat,cc32<210>9<211>30<212〉DNA<213〉人工的<220><223>引物<400>9gctctgga鄰tcaatgaaacatacgttccc30<210>10<211>30<212>麗<213〉人工的<220><223>引物<400>10gggaa.cgta.tgt.ttcattga.cttccaga.gc30<210>11<211>30<212>DNA<213〉人工的<220><223>引物<400〉11gaaaatttcgacgccttggt,gt,tga.ttgcc30<210〉12<211〉27<212>DNA<213〉人工的<220><223>引物<■〉12ggcgga.ccttgccga.ctata.tctgtga27<210>13<211>27<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>13ggtctca鄰aaacctaggaaaagtggg2739權利要求1.含糖鏈的白蛋白，其是包含可通過宿主細胞進行糖鏈修飾的部分氨基酸的變異型白蛋白的該部分氨基酸上選擇性地附加了糖鏈的、含糖鏈的白蛋白。2.如權利要求l所述的蛋白質，其中，所述的糖鏈是高甘露糖型的糖鏈。3.如權禾腰求l或2所述的蛋白質，其中，所述的部分氨基,列的至少一個是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser(Xaa是用于ifi傳編碼的任意氨基酸)。4.如權利要求3所述的蛋白質，其中，所述的部分氨基酸序列全部是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser(Xaa是用于遺傳編碼的任皿基酸)。5.如權利要求l"4任一項所述的蛋白質，其中該白蛋白是人血清白蛋白。6.如權利要求5所述的蛋白質，其具有與序列號2所示的氨基,列中序列號1-585所示的氨基酸序列同一的或基本上同一的氨基酸序列，且氨基酸序號63所示的氨基酸是Asn，禾n/或氨基,號320所示的氨基酸是Thr或Ser和/或氨基,號494所示的氨基酸是Asn。7.如權利要求6所述的蛋白質，其中至少氨基,號494所示的氨基酸是Asn。8.—禾中DNA，其編碼含有可通過真核細胞進行^l連fi1:布的1個以上的部分氨基酸序列的變異型白蛋白。9.一種含有權利要求8所述的DNA的表達載體，所述DNA處于在宿主真核細胞中具有功能的啟動子的控制下。10.—種轉化體，其ffi)l向宿主真核細胞中導入豐又利要求9的表達載體而獲得。11.如權利要求10所述的轉化體，其中宿主真核細胞是酵母。12.如權利要求ll所述的轉化體，其中酵母是畢赤酵母屬酵母。13.如木又利要求1所述的蛋白質的制備方法，包括在培養基中培養權利要求10-12任一項所述的轉化體，從得至啲培養物回收含有糖連的白蛋白。14.藥物，其含有如權利要求l-7任一項所述的蛋白質。15.m至肝臟的藥物載體，其含有如權利要求l-7任一項所述的蛋白質。16.如權利要求15所述的載體，其中，所述的靶細胞是肝巨噬細胞。17.藥物組合物，其含有待鵬至岍臟的醫藥化合物及權禾腰求15或16所述的載體。全文摘要本發明提供了一種用作以肝臟(尤其是肝巨噬細胞)為靶的DDS的藥物載體的、含有糖鏈的白蛋白，其通過下述方式來提供變異編碼白蛋白的DNA，使其成為編碼包含可通過真核細胞進行糖鏈修飾的部分氨基酸序列，優選是編碼含有N結合型糖鏈的共有序列的變異型白蛋白；在宿主真核細胞、優選是可以添加高甘露糖型糖鏈的宿主細胞中導入含有該變異DNA的表達載體，從通過培養獲得的轉化體得到的培養物中回收含有糖鏈的白蛋白蛋白質。文檔編號C07K14/435GK101429240SQ20071030511公開日2009年5月13日申請日期2007年11月6日優先權日2007年11月6日發明者中城圭介,小田切優樹,片山直久,甲斐俊哉申請人:尼普洛株式會社