一種提高液態果糖氨基酸氧化酶熱穩定性的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及液體酶穩定性技術領域，尤其涉及一種提高液態果糖氨基酸氧化酶熱 穩定性的方法。
【背景技術】
[0002] 糖化血清白蛋白（GA)是血清白蛋白被葡萄糖糖化之后的產物，即血清白蛋白的 賴氨酸殘基上的ε-氨基基團被糖化。糖化白蛋白半衰期較短，測定糖化白蛋白的濃度可 有效反映患者過去2?3周內平均血糖的水平，并不受臨時血糖濃度波動的影響。目前，臨 床廣泛采用清除游離糖化氨基酸的果糖氨基酸氧化酶（FAOD)法（下稱FAOD清除法）測 定GA含量，果糖氨基酸氧化酶是該方法中的關鍵工具酶，用于催化由糖化白蛋白酶解而來 的果糖氨基酸發生氧化反應生成氨基酸、葡萄糖醛酮和過氧化氫。由于液態果糖氨基酸氧 化酶在保存、運輸過程中易失活，因此提高其熱穩定性是該酶大量應用的基礎。提高酶穩 定性的主要方法有蛋白質工程、固定化、化學修飾、添加酶保護劑等。添加酶保護劑是提高 液態酶熱穩定性的主要方法，常見的酶保護劑有牛血清白蛋白等蛋白質類、L-天門冬氨酸 等氨基酸類、蔗糖等二元糖類、甘油等多元醇等物質。這些保護劑對單獨存在的液態果糖氨 基酸氧化酶有一定的穩定作用，但并不適合采用FAOD清除法的GA測定試劑中果糖氨基酸 氧化酶的保存。采用FAOD清除法的GA測定試劑由試劑1和試劑2組成，試劑1的主要成 分為一種堿性緩沖液，含有一定濃度的果糖氨基酸氧化酶、過氧化物酶、抗壞血酸氧化酶、 Trinder' S反應組分、防腐劑，試劑2的主要成分也是一種堿性緩沖液，含有一定濃度的堿 性蛋白酶、金屬離子、Trinder' S反應組分、防腐劑。該試劑在測定GA時，先用堿性蛋白酶 將糖化白蛋白酶解為糖化氨基酸，然后用果糖氨基酸氧化酶進行氧化，再偶聯Trinder' s 反應進行顯色定量。在試劑1中添加高濃度的牛血清白蛋白等蛋白質、L-天門冬氨酸等氨 基酸雖然都可以在一定程度上提高果糖氨基酸氧化酶的熱穩定性，但牛血清白蛋白等蛋白 質本身也可被堿性蛋白酶所酶解，在檢測時會降低堿性蛋白酶對血清糖化白蛋白的酶解作 用，高濃度的L-天門冬氨酸等氨基酸則會阻礙堿性蛋白酶對血清糖化白蛋白的酶解反應， 這兩者均使酶解反應不到終點，降低檢測的靈敏度和準確性；蔗糖、麥芽糖、果糖等二元糖 在堿性緩沖液中長時間存儲時，會逐漸水解釋放出葡萄糖，葡萄糖具有較強的還原性，可明 顯降低檢測的靈敏度；高濃度的甘油等多元醇對果糖氨基酸氧化酶有良好的穩定作用，但 多元醇的還原性同樣降低了檢測靈敏度。現有的技術為提高FAOD清除法測定試劑中果糖 氨基酸氧化酶的熱穩定性，多數情況下都是加入大量的對GA檢測無干擾的非專一性保護 齊U，未能解決液態糖化氨基酸氧化酶熱穩定性不佳的缺點，另一方面，大量保護劑的加入導 致測定試劑粘度較高，不利于在全自動生化分析儀上應用。
[0003] 因此，需求一種不對FAOD清除法測定GA含量產生干擾、可顯著提高液態氨基酸氧 化酶熱穩定性的方法，對于實現FAOD清除法測定GA含量的測定試劑開發顯得尤為重要。
【發明內容】
[0004] 本發明針對現有技術的不足，建立一種對FAOD清除法測定GA含量無干擾、可顯 著提高液態氨基酸氧化酶熱穩定性的方法，該方法通過在含有果糖氨基酸氧化酶、過氧 化物酶、抗壞血酸氧化酶、Trinder' S反應組分、防腐劑的堿性緩沖液中添加一定濃度的 離子液體1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸鹽（[BSMIM]0Tf)，聯合非離子型表面活性劑 TritonX-IOO和海藻糖的協同穩定作用，使液態果糖氨基酸氧化酶置4°C保存12個月仍保 留足夠的活性，特別適合FAOD清除法測定糖化白蛋白的測定試劑開發。
[0005] 本發明采用如下技術方案：
[0006] 本發明的提高液態果糖氨基酸氧化酶熱穩定性的方法的具體步驟如下：
[0007] (1)配制含有果糖氨基酸氧化酶（來源于recombinant E. coli)、疊氮鈉的 pH7. 5-8. 5三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCL)緩沖液；
[0008] (2)在低溫攪拌條件下向步驟⑴所述的緩沖液中添加1-丁基磺酸-3-甲基三氟 甲磺酸鹽（[BSMIM]0Tf)、海藻糖、TritonX-100。
[0009] 步驟⑴中的pH7. 5-8. 5三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCL)緩沖液的Tris-HCL 濃度為30-100mm〇l/L，含有的果糖氨基酸氧化酶濃度為1-10KU/L，疊氮鈉的濃度為lg/L。
[0010] 步驟（2)中的低溫攪拌條件是轉速為200rpm的低速攪拌，溫度為2-8°C。
[0011] 步驟⑵中的[BSMM]0Tf與Tris-HCL緩沖液的質量體積比為2?10g/L(即IL Tris-HCL 緩沖液中加入 2-10g 的[BSMIM] OTf)。
[0012] 步驟⑵中的海藻糖與Tris-HCL緩沖液的質量體積比為10?50g/L(即IL Tris-HCL緩沖液中加入10?50g的海藻糖）。
[0013] 步驟⑵中的TritonX-IOO與Tris-HCL緩沖液的體積比為0· 5?5ml/L(即IL Tris-HCL 緩沖液中加入 0· 5 ?5ml 的 TritonX-100)。
[0014] 本發明提高液體果糖氨基酸氧化酶熱穩定性的方法，是在下述基礎上獲得的：首 選篩選出對FAOD清除法測定GA含量無干擾、能延長recombinant E. coli來源的果糖氨 基酸氧化酶熱穩定性的保護劑，并對得到的復合保護劑進行優化，最終獲得了能顯著提高 recombinant E. coli來源的果糖氨基酸氧化酶穩定性的最佳保護劑配比。采用本發明的方 法，使得recombinant E. coli來源的果糖氨基酸氧化酶熱穩定性顯著提高，可很好地應用 于FAOD清除法測定GA的測定試劑開發。
[0015] 本發明的積極效果如下：
[0016] 本發明的提高液態果糖氨基酸氧化酶熱穩定性的方法具有方法簡單、方便快捷、 易于操作的優點，采用本發明的方法，使得果糖氨基酸氧化酶熱穩定性顯著提高，可很好地 應用于FAOD清除法測定GA的測定試劑開發。
[0017] 本發明的提高液態果糖氨基酸氧化酶熱穩定性的方法對FAOD清除法測定GA含量 無干擾、可顯著提高液態氨基酸氧化酶熱穩定性，使液態果糖氨基酸氧化酶置4°C保存12 個月仍保留足夠的活性。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合實施例對本發明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發明的較佳實施 例而已，并非對本發明做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示 的技術內容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發明方案內容，依據本發明 的技術實質對以下實施例所做的任何簡