一種自組裝短肽及其在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法

專利名稱：一種自組裝短肽及其在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于自組裝短肽領域，特別涉及一種自組裝短肽及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
自組裝短肽是一種新型的納米生物材料，自20世紀90年代問世以來，受到了人們 的廣泛重視，得到了快速的發展，己合成出多種不同結構的自組裝短肽，并在細胞三維 培養及制備疏水藥物載體、止血藥物、燒傷治療藥物、抑菌藥物等方面應用。但是，制 備出更多的自組裝短肽、擴大自組裝短肽的應用范圍仍然是科技工作者關注的問題。癌癥是影響人類健康的主要疾病之一，每年約有七百萬患者死于癌癥，約占全世界 死亡人口的12.5%。專家預測，至2020年，每年癌癥患者將增至一千六百萬(見World Health Organization: Cancer, www.who.int/cancer/en/ Accessed February, 2007)。 因it匕，吸 引了不同領域的科技人員加入到癌癥治療相關的研究中。然而過去50年以來，盡管人 們付出了巨大努力，癌癥治療所取得的進展卻不盡人意。在癌癥治療的最早階段，人們普遍采用手術切除和放射性治療，但往往不能達到有 效根除腫瘤，同時在治療過程中所產生的副作用，使患者承受了巨大的生理和精神痛苦 (見Chabner BA & Roberts Jr. (2005) Nat Rev Cancer 5, 65-72.)。在此情況下，化療 逐步成為癌癥治療的主要手段。但是，絕大多數抗癌藥物在體內是處于自由擴散狀態， 這一方面導致藥物不能在病灶區達到治療所需濃度，致使療效減弱；另一方面，抗癌藥 物的自由擴散也勢必對機體的其它正常組織器官造成一定的副作用(見Sinha R， Kim GJ， Nie S, & Shin DM (2006) Mol Cancer Ther 5, 1909-1917. LerouxJ -C, Allemann E, De Jaeghere F, Duelker E & Gurny K(1996;) J Control Release30,"9-50.)。2001年，Shin S.Y.等人公開了一種短肽S18 (見Shin S, Lee S, Yang S， Park E， Lee D， Lee M, Eom S, Song W, Kim Y， Hahm K, W a/. (2001) J尸五iTi 五S 58， 504-514.即為該文 獻中的P18肽段)，根據文獻記載，S18短肽具有殺傷腫瘤細胞K562、 Jurkat、 MDA-MB-3 61的特性，且對正常細胞NIH 3T3的殺傷作用很弱。但文獻中僅報道了該肽段在體外 細胞水平上的抗腫瘤作用，沒有進行體內動物實驗。發明內容本發明的目的在于提供一種抗腫瘤自組裝短肽，此種短肽通過自組裝作用聚集在腫瘤病灶區，而不在體內自由擴散，從而提高其在腫瘤病灶區的濃度，增強對腫瘤細胞的 殺傷力。本發明所述自組裝短肽，命名為R418，由抗腫瘤活性肽段S18、自組裝肽段 RADA16-I和連接肽段組成，抗腫瘤活性肽段S18位于自組裝肽段RADA16-I的羧基端， 二者之間通過連接肽段連接，其分子模型如圖3A所示，其氨基酸序列為序列表中SEQ IDNO.l所述，其分子量為4344.9 (見圖2)。所述自組裝肽段RADA16-I是一種離子互 補肽，有16個氨基酸，分子長度大約為5nm，其組成出現極性和非極性氨基酸殘基交替； 側鏈分為兩部分， 一個為極性的，另一個為非極性的；內部的非極性殘基通過疏水作用 形成分子間的相互作用，帶正、負電荷的殘基通過離子互補鍵在分子間也形成相互作用， 從而最終自組裝形成納米纖維(見Zhang S. Fabrication of novel biomaterials through molecular self-assembly. Nature biotechnology. 2003, 21: 1171-1178.)。普遍而言，物質的結構決定物質的功能，首先采用原子力顯微鏡和透射電鏡觀察到 R418分子在溶液中通過自組裝形成納米纖維結構，而單獨合成的S18分子沒有相應的 納米結構，從而證明R418分子具備自組裝和分子聚集的能力，而S18分子則缺乏相應 的自組裝能力(見實施例4、實施例5)。體外細胞實驗表明，本發明所述自組裝短肽R418很明顯地引起腫瘤細胞K562、 Jurkat、 MDA-MB-435S的死亡，而對NIH 3T3細胞的細胞毒性較低(見實施例6)。針 對K562細胞的進一步研究，驗證了自組裝短肽R418對K562具有很強的殺傷力(見實 施例7、實施例8)。動物實驗表明，本發明所述自組裝短肽R418與短肽S18相比，抑制K562腫瘤細 胞的效果更好，對腫瘤細胞具有更強的殺傷力(見實施例9)。小動物活體成像實驗表明，本發明所述自組裝短肽R418與短肽S18相比，R418自 組裝后，在體內腫瘤區域的局部濃度保持時間遠遠長于S18局部濃度保持時間(見實施 例10)。本發明所述自組裝短肽R418可以通過添加藥學上可接受的載體或賦形劑，制成適于臨床使用的抗腫瘤藥物。 本發明具有以下有益效果1、 實驗表明，本發明所述自組裝短肽R418很明顯地引起腫瘤細胞的死亡，而對 NIH 3T3細胞的細胞毒性較低。2、 實驗表明，本發明所述短肽R418具備自組裝和分子聚集的能力，能長時間在體 內腫瘤區域保持較高濃度，而不自由擴散。3、 本發明所述自組裝短肽R418不僅能在體內抑制腫瘤的生長，而且與短肽S18相比，抑制腫瘤的效果更好。4、 本發明為癌癥的治療提供了一種有效的新藥品，具有明顯的社會效益和經濟效顯。


圖1是本發明所述自組裝短肽R418的高壓液相色譜(HPLC)圖譜。 圖2是本發明所述自組裝短肽R418的質譜圖,。圖3是模型示意圖，圖中，A為本發明所述自組裝短肽R418的分子模型示意圖，B 為本發明所述自組裝短肽R418形成的自組裝納米纖維模型示意圖。圖4是原子力顯微鏡(AFM)圖譜，圖中，A、 C為本發明所述自組裝短肽R418 形成的納米纖維的AFM圖譜(其中，A為5X5um區域內R418的納米纖維AFM圖， C為2X2um區域內R418的納米纖維AFM圖)；E為C圖中黑色線段標注處的R418 納米纖維截面圖；B、 D為自組裝肽段RADA16-I形成的納米纖維的AFM圖譜(其中， B為5X5um區域內RADA16-I的納米纖維AFM圖，D為2X2"m區域內RADA16-I 的納米纖維AFM圖。)；F為D圖中黑色線段標注處的RADA16-I納米纖維截面圖； G、 H為抗腫瘤活性肽段S18的AFM圖譜(其中，G為5X5um區域內S18的AFM 圖，H為2X2um區域內S18的AFM圖)。圖5是本發明所述自組裝短肽R418的透射電鏡(TEM)圖像。圖6是R418、 S18及RADA16-I三種肽溶液對細胞的毒性實驗MTT測定圖，圖中， A是R418、 S18及RADA16-I三種肽溶液對K562的毒性實驗MTT測定圖，B是R418、 S18及RADA16-I三種肽溶液對Jurkat的毒性實驗MTT測定圖，C是R418、 S18及 RADA16-I三種肽溶液對MDA-MB-435S的毒性實驗MTT測定圖，D是R418、 S18 及RADA16-I三種肽溶液對MDA-MB-231的毒性實驗MTT測定圖，E是R418、 S18 及RADA16-I三種肽溶液對NIH 3T3的毒性實驗MTT測定圖。圖7是對照溶液(Control) H20及肽溶液(R418、 S18、 RADA16)作用K562細胞的 熒光顯微圖。圖8是對照溶液(Control) H20及肽溶液(R418、 S18及RADA16)作用K562細胞 的流式細胞分析圖,圖中，A為對照溶液(Control)流式細胞分析圖，B為R418肽溶液流 式細胞分析圖，C為RADA16-I肽溶液流式細胞分析圖，D為S18肽溶液流式細胞分析圖。 圖9是對照溶液(Control) H20及肽溶液(R418、 S18)對K562細胞裸鼠移植瘤的作 用效果圖，圖中，A為動物形貌對比圖，B為腫瘤大小對比圖，C為瘤重對比圖，D為腫瘤組織切片對比圖。圖10是短肽R418和S18分子的小動物體內活體成像圖，圖中，A為裸鼠成瘤圖， B為低濃度(0.4mM) R418和S18分子的體內活體成像對比圖，C為高濃度(4mM) R418和S18分子的體內活體成像對比圖。具體實施方^實施例l:自組裝短肽R418的制備1、 試劑PyBOP (六氟磷酸苯并三唑-l-基-氧基三吡咯烷基磷)、Boc-Phe-Merrifieldresin 樹脂、六氫吡啶、二甲基吡啶、TFA(三氟乙酸)、HPLC甲醇、保護氨基酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH 、 Fmoc-Ala-OH 、 Fmoc-Leu-OH 、 Fmoc-His(Trt)-OH 、 Fmoc-Phe陽OH、 Fmoc-Pro-OH 、 Fmoc-Ile-OH 、 Fmoc-Trp-OH 、 Fmoc誦Gly-OH 、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Arg(Pmc)隱OH.IPE)、 thioanisole (茴香硫醚)、EDT (乙 二硫醇)、TIS (甲乙硫醚)、HOBT (l-羥基苯并三唑)為Merck公司產品；DMF (二 甲基甲酰胺)為韓國三星公司產品；NMM (甲基瑪菲林)購自Sigma公司；DCM(二 氯甲烷)、苯酚、三乙胺為中國醫藥(集團)上海化學試劑公司產品；甲醇為上海 振興化工一廠產品；四氫呋喃為上海化學試劑站中心化工廠產品。2、 儀器431A型多肽合成儀為Applied biosystems產品；高效液相色譜為安捷倫1100色譜 儀，制備色譜儀為WATERS600E;冷凍干燥機(FREEZE DRYER 18)為LABCONCO 產品；質譜儀為FinniganLCQ。3、 制備方法 (1)肽鏈的合成接肽前樹脂處理① 稱取200毫克Boc-Phe-Merrifield resin到砂芯過濾反應器中；② 加入二氯甲垸浸泡洗滌6次，每次5毫升，過濾除去洗滌的二氯甲烷；③ 加入10。/。的TFA (二氯甲烷作溶劑)5毫升，室溫反應2小時，以除去樹脂上氨 基酸N端的BOC保護基④ 加入二氯甲垸浸泡洗滌3次，每次5毫升，然后加入5%的三乙胺(二氯甲烷作 溶劑)5毫升，2次中和PH值后再用二氯甲垸洗滌6次，DMF洗滌5次即可放入儀器 反應器中進行接肽反應。接肽在431A自動合成儀上進行，稱取30mg Phe-MerrifieW resin放入反應器中，然后按照多肽的序列順序從羧基端逐漸加入保護氨基酸(反應過程中加入的保護氨基酸并 不是一次全部加入反應容器，而是按照多肽的序列順序從羧基端逐漸加入，在加入氨基酸的同時要加入相同摩爾的PyBOP試劑和HOBT試劑)。具體而言，首先加入保護氨基 酸Fmoc-Lys(Boc)-OH、 PyBop、 HOBT、 NMM，反應20分鐘后，經DMF洗滌5遍， 然后加入配制好的六氫吡啶，此步用來脫除樹脂上的FMOC保護基團，大約10分鐘， 在脫除FMOC后，用DMF洗滌樹脂5次，把六氫吡啶清洗干凈，以確保下一步反應的 順利進行(參見以下簡要步驟)(a) Fmoc-Lys(Boc)-OH 29.52mg(b) PyBOP 123.63mg(c) HOBt+H20 475.20^1(d) NMM 365単(e) 30%六氫吡啶 900W x 2次(f) DMF 900^1 x 5次按照以上接肽實驗步驟，重復循環反應以加長肽鏈，不同之處在于需變換(a)原料，(a)原料的變換順序與多肽羧基端至氨基端的序列相應，具體而言(a)原料應分別依 次變換為Fmoc-Lys(Boc)隱OH (29.52mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Leu-OH (22.27mg)、 Fmoc-His(Trt)-OH G9.05mg)、 Fmoc-Leu國OH (22.27mg)、 Fmoc-Phe-OH (24,41mg)、 Fmoc-Lys(Boc)-OH (29.52mg)、 Fmoc隱Pro陽OH (21.26mg)、 Fmoc-Ile-OH (22.27mg)、 Fmoc-Lys(Boc)-OH (29.52mg)、 Fmoc國Lys(Boc)隱OH (29.52mg)、 Emoc-Phe-OH (24.41mg)、 Fmoc-Leu-OH (22.27mg)、 Fmoc-Lys(Boc)-OH (29.52mg)、 Fmoc-Trp-OH (26.87mg)、 Fmoc-Lys(Boc)-OH (29.52mg)、 Fmoc-Pro-OH (21.26mg)、 Fmoc-Pro-OH (21.26mg)、 Fmoc-Pro-OH (21.26mg)、 Fmoc-Gly陽OH (18.74mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH (25.93mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Arg(Pmc)-OH.IPE (48.20mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH(25.93mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Arg(Pmc)-OH.IPE (48.20mg)、 Fmoc陽Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH (25.93mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Arg(Pmc)-OH.IPE (48.20mg)、 Fmoc-Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Asp(OtBu)陽OH(25.93mg)、 Fmoc陽Ala-OH (19.62mg)、 Fmoc-Arg(Pmc)陽OH.IPE (48.20mg)、乙酰化 試劑(3ml)。接完多肽的樹脂經過甲醇清洗后干燥。然后全部轉移至玻璃茄形瓶中，加入60毫升無水甲醇并冰浴到-20度時緩慢的通入氨氣，使其溫度保持在O度以下，通入氨氣時 間為90分鐘，然后密封振搖24小時取出，過濾收其濾液并濃縮抽干(這一步是將多肽 從樹脂上切下并酰胺化)，再加入事先配好并預冷的切肽試劑5ml (81.5%TFA、 5%thioanisole、 5%phenol、 5%water、 2.5%EDT、 1%TIS)。 25。C下攪拌反應3小時。取 出過濾，收集濾液；樹脂用少量三氟乙酸洗3次，將洗滌液與濾液合并，濃縮后冷卻， 然后加入10ml冷乙醚使多肽沉淀，離心收集沉淀，真空干燥。得粗品約60mg。 (2)肽鏈的純化先采用安捷倫1100分析系統確定目標肽，使用C18反相柱子，條件為A相為95% 的水(甲醇配比)，B相為95%的甲醇(甲醇配比)，然后各加O.l 。/。的TFA ，常規條件 在上樣品之前先用A相平衡柱子15分鐘，然后上樣，從A相到B相為25分鐘梯度洗 脫。檢測波長220nm，流速:lmL/min。收集目標肽，然后做質譜鑒定。再根據目標多 肽的出峰時間來確定本條多肽的最佳洗脫梯度。確定目標肽后，釆用Waters600E純化系統進行多肽制備使用C18反相制備柱子， 條件為八相為95%的水(乙腈配比)，B相為95。/。的甲醇(乙腈配比)，然后各加0.1% 的TFA ，常規條件從A相到B相為70分鐘梯度。檢測波長220nm,流速36mL/min， 先用A溶液平衡柱子，上樣后，從A到B溶液梯度洗脫，收集多肽洗脫峰，然后與分 析儀器配合確定樣品的目標峰，所獲產物經冷凍干燥即得本發明所述自組裝短肽R418, 其氨基酸序列為序列表中SEQ IDNO.l所述。實施例2:自組裝短肽R418的高效液相色譜和質譜檢測將實施例1制備的自組裝短肽R418采用高效液相色譜(HPLC)檢測(檢測條件A 相為5%的乙腈+O. 1%的三氟乙酸；8相為95%的乙腈+O. 1%的三氟乙酸；直線梯度為20 分鐘)，檢測結果見圖l，根據圖1中的譜峰面積確定其純度達到了95%。將實施例1制備的自組裝短肽R418采用質譜(質譜儀為Finnigan LCQ)檢測，檢 測結果見圖2，根據圖2可確定其分子量為4344.9(理論分子量為4344.11)，表明所合成 短肽確為所設計肽。實施例3: R418抗腫瘤自組裝短肽的三維分子模型及自組裝模型繪制 對實施例1制備的自組裝短肽R418采用專業Molsoft. ICM畫圖軟件基于能量最小 化原理繪制三維分子模型示意圖，所繪制的三維分子模型示意圖見圖3A，通過該示意圖， 可清楚的知道其氨基酸的空間分布，該示意圖顯示，抗腫瘤活性肽段S18位于自組裝肽段RADA16-I的C端，二者之間通過連接區連接。實施例'l制備的自組裝短肽R418在水中可形成自組裝納米纖維，對所述自組裝短 肽R418形成的自組裝納米纖維采用專業Molsoft. ICM畫圖軟件基于能量最小化原理繪 制三維分子模型示意圖，所繪制的三維分子模型示意圖見圖3B。該示意圖顯示，眾多 R418分子自組裝形成一段納米纖維。 '實施例4:原子力顯微鏡檢測三種短肽分子的自組裝性能1、 實驗材料短肽樣品R418 (實施例1制備，下同)、S18 (購自上海波泰生物科技有限公司，下同)、 RADA16-I (購自BD Bioscience, Bedford, MA.下同)。主要溶液無菌去離子水H20: 18 Millipore Milli-Q system,高壓滅菌后4'C保存備用。(下同)。2、 主要實驗儀器原子力顯微鏡AFM (SPA400, SIINanotechnology， Inc.)3、 實驗方法(1) 用去離子水配置RADA16-I、 R418及S18的工作液，其終濃度為100pM。(2) 分別將配置的RADA16-I、 R418及S18工作液5微升均勻涂于新剝光的三片云母片表面。(3) 針對RADA16-I，當涂片完成后約30s，以1000ul去離子水沖洗除去未附著 的短肽。(4) 將上述各短肽工作液涂片在室溫中空氣干燥。(5) 在氣相中對云母片進行AFM掃描，用SPI4000的記錄模式收集AFM圖像。 使用20um掃描器(400)、 Olympus Si-DF20微懸臂，及彈簧常量為12.00N/m的針(Si，半徑10nm，矩形基底200.00um)。懸臂的自由共振頻率為127.00kHz。相位圖以 512X512像素的解析度記錄。為顯示自組裝短肽的細微納米結構，對每個樣本均采用5 X5um、 2X2um的范圍進行掃描。4、 實驗結果短肽ADA16-I、 R418及S18工作液的原子力顯微(AFM)圖像見圖4，圖4顯示， 在短肽RADA16-I和R418溶液中可以觀察到納米纖維(見圖4A—D)，而且R418中的納米纖維比RADA16-I中的納米纖維寬(圖4E、 F);在短肽S18溶液中未觀察到納 米纖維(見圖4G、 H)。實驗結果表明短肽ADA16-I 、 R418分子具備自組裝和分子 聚集的能力，短肽S18分子則缺乏相應的自組裝能力。實施例5:透射電子顯微鏡檢測短肽R418分子的自組裝性能 1、實驗材料短肽樣品R418主要溶液去離子水H20PBS溶液(pH7.4): 8.0g/L NaCl + 0.2g/L KC1 + 1.56g/L Na2HP04 -H20 + 0.20g/L KH2P04,用HC1調節溶液的pH值至7.4。 ？BS高壓滅菌后4'C保存備用。2、 主要實驗儀器透射電子顯微鏡(TEM,H-600, Hitachi)3、 實驗方法(1) 以去離子水或PBS (pH7.4)配制R418至終濃度為100pM的工作液，用于透 射電子顯微鏡的觀察。(2) 取少量工作液用1%磷鎢酸負染用潔凈的吸頭吸取一滴(約10-30pL)樣品 滴于潔凈的載玻片表面，用鑷子小心地夾取一塊由Formvar膜覆蓋的TEM銅網，在樣 品滴上輕輕蘸取少量樣品溶液，靜置數秒，待樣品與銅網充分結合后，再用銅網蘸取少 量1%的磷鴨酸，對已吸附的肽溶液進行負染色。(3) 用濾紙吸干銅網上多余的溶液，在空氣中靜置數分鐘待銅網干燥。(4) 以TEM (H-600, Hitachi)掃描銅網，直接觀察銅網上的短肽自組裝結構。4、 實驗結果短肽R418溶液的透射電子顯微鏡(TEM)圖像見圖5，圖5顯示，在短肽R418 溶液中可以觀察到納米纖維。實驗結果表明R418分子可以在水溶液中自組裝成納米纖維。實施例6: MTT細胞毒性實驗1、實驗材料(1)短肽樣品R418水溶液(無菌去離子水H20配置，下同)；S18水溶液(無菌去離子水H20配置，下同)；RADA16-I水溶液(無菌去離子水H20配置，下同)。(2) 細胞株白血病細胞株，K562 (ATCC序號CCL-243 ,下同)和Jurkat (ATCC序號 TIB-152 ,下同)；乳腺癌細胞株，MDA-MB-435S (ATCC序號HTB-129 ,下同) 及MDA-MB-231 (ATCC序號HTB-26 ,下同)；對照細胞，NIH 3T3 (ATCC序號 CRL-1658TM，下同)。(3) 主要溶液PBS(pH7.4): 8.0g/L NaCl + 0.2g/L KCl + 1.56g/L Na2HP04 .H20 + 0.20g/L KH2P04, 用HC1調節溶液的pH值至7.4。 PBS高壓滅菌后4'C保存備用。MTT溶液稱取250mgMTT，放入小燒杯中，加50ml PBS在電磁力攪拌機上攪拌 30min，用0.22um的微孔濾器除菌，分裝，4'C保存備用，兩周內有效。溶解液含有0.01M HC1的10%的SDS溶液。2、 主要實驗儀器(1) 細胞操作用生物安全柜(NUAIRE， CLASS II )(2) 離心機(BECKMAN COULTER, AllegraTMX-22R Centriflige)(3) 倒置相差顯微鏡(OLYMPUS, 1X71)(4) C02培養箱(Thermo，HEPACLASS 100)(5) 酶聯免疫檢測儀(Gene Company limited, P Quant)3、 實驗方法(1) K562細胞培養條件(下同)完全培養基的配制RPMI 1640培養基+抗生素(100 units/mL penicillin G ，100 u g/mL streptomycin), 90%;胎牛血清，10%。(上述試劑購自Invitrogen公司) 培養溫度37°C。空氣要求5%C02。(2) Jurkat細胞培養條件(下同)完全培養基的配制RPMI 1640培養基+抗生素(100 units/mL penicillin G ,100" g/mL streptomycin), 90%;胎牛血清，10%。(上述試劑購自Invitrogen公司) 培養溫度37°C。空氣要求5%C02。(3) MDA-MB-231細胞培養條件(下同)完全培養基的配制Leibovitz's L-15培養基+抗生素(100 units/mLpenicillin G ，100 y g/mL streptomycin), 90%;胎牛血清，10%。(上述試劑購自Invitrogen公司) 培養溫度37°C。空氣要求無<302。(4) MDA-MB-435S細胞培養條件(下同)完全培養基的配制Leibovitz's L-15培養基+抗生素(100 units/mL penicillin G ,100 yg/mLstreptomycin)十胰島素(0.01 mg/ml)， 90%;胎牛血清，10%。(上述試劑購自 Invitrogen公司)培養溫度37°C。空氣要求無C02。(5) NIH3T3細胞培養條件(下同)完全培養基的配制RPMI 1640培養基(Invitrogen)十抗生素(100 units/mL penicillin G, 100 ug/mL streptomycin), 90%;胎牛血清，10%。(上述試劑購自Invitrogen公司) 培養溫度37'C。空氣要求5%C02。(6) MTT細胞毒性實驗步驟a. 接種細胞向96孔板的微孔中加入含有新鮮完全培養基(見上述各細胞培養條 件)的細胞懸濁液lOOpl，其中K562細胞接種量為5xl0S個/ L, Jurkat細胞接種量為2 X 104個/孔，NIH 3T3、 MDA-MB-435S及MDA-MB-231細胞接種量均為1X 104個/孔。b. 在相應細胞的培養條件下孵育24小時。c. 加藥(短肽溶液)分別添加10pl不同濃度的R418, S18,RADA16-I溶液至不同 的已接種細胞的微孔中(最終體系的肽濃度梯度為20^M、 10pM、5nM、2.5pM、 1.25pM)， 實驗在相同條件下進行三個復孔的測量。在相應細胞的培養條件下孵育48小時。d. 加MTT溶液向每孔添加20pMTT反應液(5mg/mlMTT溶于PBS)， 37'C孵育 4小時。e. 加溶解液向每孔加入100^1包含0.01M HC1的10%的SDS溶液過夜，以溶解蘭紫色沉淀。f. 光吸收值(OD值)的測定用酶標儀于570nm處測定吸收光譜。g. 細胞存活率=(給藥組光吸收值一空白組光吸收值)/(對照組光吸收值一空白組光fl及收值)xiooy。。備注空白組指不含細胞和肽溶液，只含有相應細胞培養基的平行實驗組；對照組 指以無菌去離子水H20代替肽溶液進行實驗的平行實驗組。 4、實驗結果MTT分析顯示，48小時作用后，不同濃度的RADA16-I對腫瘤細胞和NIH 3T3細 胞的細胞毒性很低(見圖6 A-E)。與RADA16-I相對照，R418和S18很明顯地引起腫 瘤細胞K562、 Jurkat、 MDA-MB-435S的死亡(圖6 A-C)，而R418及S18對NIH 3T3細胞的細胞毒性較低(圖6E)。實施例7:熒光顯微鏡觀察1、 實驗材料(1) 短肽樣品R418 (無菌去離子水H20配置，下同)； S18 (無菌去離子水H20配置，下同)； RADA16-I (無菌去離子水H20配置，下同)。(2) 細胞株白血病細胞株K562 (ATCC序號CCL-243 ,下同)。(3) 主要溶液PBS溶液(pH7.4):配制同實施例6，高壓滅菌后4'C保存備用。Calcein AM : 4 mM in anhydrous DMSO (購自Molecular Probes )Ethidium homodimer-12 mM in DMSO/H20 1:4 (v/v)(購自Molecular Probes )2、 主要實驗儀器(1) 細胞操作用生物安全柜(NUAIRE, CLASS II)(2) 離心機(BECKMAN COULTER, AllegraTMX-22R Centrifoge)(3) 倒置相差顯微鏡(OLYMPUS, 1X71)(4) C02培養箱(Thermo, HEPACLASS 100)3、 實驗方法(1) 接種細胞向6孔板中加入含有新鮮完全培養基的K562細胞懸濁液4mL/孔， K562細胞接種量為5xl()4個/mL。(2) 在37'C、 5% C02的培養條件下孵育24小時。(3) 分別加入R418、 RADA16-I和S18短肽溶液400pL至不同的，已接種細胞的 微孔中，使肽溶液終濃度達到2(HiM，將6孔板在37'C、 5% C02的培養條件下繼續孵育12小時。
(4) 離心收獲K562細胞，用PBS溶液沖洗，去除培養基，最終將細胞混懸于2mL 的PBS溶液中。
(5) 加入calceinAM禾tl EthD-l熒光染料，.使calcein AM的終濃度為2|iM,使 EthD-l的終濃度為4nM，在室溫下將反應體系避光作用40分鐘。
(6) 將6孔板置于倒置熒光顯微鏡下觀察。
備注對照組(Control)指以無菌去離子水H20代替肽溶液進行實驗的平行實驗組。 4、實驗結果
對照組(Control)和各實驗組的熒光顯微圖像見圖7，圖7顯示，對照組(Control) 和用RADA16-I處理過的K562細胞死亡率很低，用R418和S18處理過的K562細胞死 亡率非常高。實驗結果表明R418和S18對腫瘤細胞K562具有很強的殺傷力。
實施例8:流式細胞術測定
1、 實驗材料
(1) 短肽樣品
R418 (無菌去離子水H20配置，下同)；
S18 (無菌去離子水H20配置，下同)；
RADA16-I (無菌去離子水H20配置，下同)。
(2) 細胞株
白血病細胞株K562 (ATCC序號CCL-243 ,下同)。
(3) 主要溶液
PBS(pH7.4):配制同實施例6，高壓滅菌后4'C保存備用。
Vybrant Apoptosis Assay試劑盒# 7 (購自Molecular Probes) <>
2、 主要實驗儀器
(1) 細胞操作用生物安全柜(NUAIRE, CLASSII)
(2) 離心機(BEC薩N COULTER, Allegra X-22R Centrifuge)
(3) 倒置相差顯微鏡(OLYMPUS, 1X71)
(4) C02培養箱(Thermo, HEPA CLASS 100)
(5) 流式細胞儀(FACSAria, BD)
3、 實驗方法
(1)在6孔板上每孔接種5X 1(^個/mLM密度的K562細胞懸液4mL。(2) 6孔板在37'C的C02培養箱中孵育24小時。
(3) 分別添加10pl不同濃度的R418, S18, RADA16-I溶液至不同的，己接種細胞 的微孔中，使其終濃度達到20uM。
(4) 繼續孵育，使短肽作用時間達到12小時。
(5) 收獲，沖洗細胞，將細胞混懸于pH7.4的冷PBS溶液中。
(6) 細胞計數，使細胞的濃度大約為1Xl(T個/mL。
(7) YO-PRO-1和PI避光染色30分鐘。
(8) 以流式細胞儀(FACSAria， BD)來分析正常、凋亡或壞死的細胞。
備注對照組(Control)指以無菌去離子水H20代替肽溶液進行實驗的平行實驗組。 4、實驗結果
流式細胞分析結果見圖8，圖8顯示，R418、 S18、 RADA16-I作用的K562細胞以 及對照組(Control) K562細胞都有極小比例(< 2 %)的凋亡細胞。但是，相對于對照組(圖 1A， 5.2 %)和RADA16-I組(圖8C， 3.2%)， R418作用的K562細胞的壞死比例(圖8B， 87.8%)以及S18作用的K562細胞壞死比例(圖8D, 80.5%)顯著增加。實驗結果表 明R418和S18對腫瘤細胞K562具有很強的殺傷力，并且主要是通過促使細胞壞死的 方式致死K562細胞死亡。
實施例9: R418對裸鼠體內K562腫瘤生長的影響
1、 實驗動物
4-6周齡的BALB/c裸鼠，平均體重約為20g，雌雄各半，由四川大學由四川大學實 驗動物中心獲得。詞養于無特定病原體(簡稱SPF)條件下，飲水、標準詞料及其他與 動物接觸的物品均經高壓滅菌處理。
2、 實驗材料
(1) 細胞株
白血病細胞株，K562 (ATCC序號CCL-243 ,下同)。
(2) 短肽樣品
R418 (無菌去離子水H20配置，下同)； S18 (無菌去離子水H20配置，下同)。
(3) 主要試劑
Matrigel: 購自BD Bioscience, Bedford, MA. RPMI 1640培養基購自Invitrogen公司。3、 主要實驗儀器
(1) 細胞操作用生物安全柜(NUAIRE， CLASS II)
(2) 離心機(BECKMAN COULTER, AllegraTMX-22R CentrifUge)
(3) 倒置相差顯微鏡(OLYMPUS, 1X71)
(4) C02培養箱(Thermo, HEPA CLASS 100)
4、 實驗方法
(1) 大量培養K562細胞。
(2) 細胞清洗及收集
A、 將K562細胞連同培養液一并轉移到15mL離心管內；
B、 離心1000rpm， 5min;
C、 棄去上清，加入較大體積新的無血清RPMI 1640培養基(15mL/離心管)到離 心管內，用吸管吹打形成細胞懸液；
D、 再次離心細胞懸液；
E、 棄去上清，加入較小體積新的無血清RPMI 1640培養基(0.2mL/離心管)到離 心管內，用吸管吹打形成細胞懸液；
(3) 細胞計數調整細胞密度約為lxl()8個/mL。
(4) 細胞接種取lxl()8個/mL的K562細胞懸液與Matrigel 1:1混合成混懸液， 每次取200pl，皮下注射入裸鼠的背部右側。
(5) 每天觀察裸鼠的成瘤情況。
(6) 在觀察到實體瘤形成后，將裸鼠隨機分成3組(每組七只裸鼠)對照組、R418 組和S18組。
(7) 每隔三天向R418組的各只裸鼠的腫瘤邊緣分別注射一次短肽R418溶液(4mM, O.lmL)、向S18組的各只裸鼠的腫瘤邊緣分別注射短肽S18溶液(4mM， O.lmL)。對于對 照組，則每次注射0.1mL無菌去離子水。
(8) 自第一次給藥12天后處死裸鼠，剝離腫瘤，進行腫瘤質量測量及腫瘤組織切 片HE染色分析。
5、 實驗結果
實驗結果見圖9，圖9顯示，用藥12天后，R418組裸鼠的腫瘤遠小于S18組和對 照組(見圖9A、 B)，比較實體瘤重量(見圖9C)， R418組瘤重為133.23 ± 27.58mg， S18組瘤重為549.06 ± 93.76mg克，對照組瘤重為576.63 ± 54.20mg;在腫瘤組織切片分 析中(見圖9D)，與對照組和S18組相比，R418組腫瘤的壞死水平顯著提高。實驗結果表明，R418不僅能在體內抑制K562腫瘤細胞的生長，而且與S18相比，對K562腫
瘤細胞的抑制效果更好。
實施例10: R418和S18分子的體內活體成像
活體動物體內成像技術是在活體動物體內檢測、記錄和分析特定細胞和分子的直觀 圖像，進而為研究者提供傳統影像學無法檢測到的體內細胞和分子水平的信息，為疾病 發病機理和藥物作用機制等研究提供新的技術手段。
1、 實驗動物
4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，平均體重約為20g，由四川大學實驗動物中心提供。 飼養條件為SPF級別。
2、 實驗材料
(1) 細胞株
白血病細胞株K562 ( ATCC序號CCL-243 )。
(2) 短肽樣品
熒光染料FITC標記的R418、 S18短肽(分別為FITC-R418和FITC-S18)。
(3) 主要試劑
Matrigel: 購自BD Bioscience, Bedford, MA。
培養基RPMI 1640。
麻醉劑15mg/mL戊巴比妥納。
3、 主要實驗儀器
(1) 細胞操作用生物安全柜(NUAIRE, CLASS II)
(2) 離心機(BECKMAN COULTER, AllegraTMX-22R Centrifoge)
(3) 倒置相差顯微鏡(OLYMPUS, IX")
(4) C02培養箱(Thermo，HEPACLASSlOO)
(5) 活體熒光成像系統(lightools, LT-99D2 Illumatool Dual Light System)
4、 實驗方法
(1) 大量培養K562細胞。
(2) 細胞清洗及收集.-
A、 將K562細胞連同培養液一并轉移到15mL離心管內；
B、 離心1000rpm， 5min;
C、 棄去上清，加入較大體積新的無血清RPMI 1640培養基(15mL/離心管)到離心管內，用吸管吹打形成細胞懸液；
D、 再次離心細胞懸液；
E、 棄去上清，加入較小體積新的無血清RPMI 1640培養基(0.2mL/離心管)到離 心管內，用吸管吹打形成細胞懸液； '
(3) 細胞計數調整K562細胞密度約為1x108個/mL。
(4) 細胞接種取lxl()8個/mL的K562細胞懸液與Matrigel 1:1混合成混懸液， 每次取100pl，分別皮下注射入裸鼠的背部左、右兩側。
(5) 每天觀察裸鼠的成瘤情況。
(6) 在觀察到實體瘤形成后，在裸鼠腹部注射麻醉劑戊巴比妥納0.1—0.2mL進行
動物麻醉。
(7) 待裸鼠麻醉后，將FITC-R418分子溶液(0.05mL, 0.4mM)皮下注射至裸鼠 右側背部腫瘤的瘤邊，同時將FITC-S18分子溶液(0.05mL， 0.4mM)皮下注射至同一 只裸鼠左側背部腫瘤的瘤邊。
(8) 將裸鼠放置于lightools活體熒光成像系統中(激發波長為470nm，發散波長 為515mn)，通過CCD照相采集R418和S18在不同時間段的體內熒光圖像，通過對比 兩種分子的體內熒光圖像，分析R418和S18在體內腫瘤區域的局部濃度保持情況的差 異°
(9) 平行將高濃度的FITC-R418分子溶液(0.05mL， 4mM)皮下注射至另外一 只裸鼠的右側背部腫瘤的瘤邊，同時將高濃度的FITC-S18分子溶液(0.05mL， 4mM) 皮下注射至該裸鼠左側背部腫瘤的瘤邊。同上步驟8的實驗操作，采集高濃度R418和 S18在不同時間段的體內熒光圖像，通過對比兩種分子的體內熒光圖像，分析高濃度 R418和S18在體內腫瘤區域的局部濃度保持情況的差異。
5、實驗結果
實驗結果見圖10 ，圖10顯示，在0.4mM FITC—R418溶液和0.4mM FITC — S18
溶液的活體熒光成像對比中，腫瘤區域的S18在60分鐘的時間點上幾乎已完全消失， 但R418則一直在腫瘤區域保持了較高濃度，在250分鐘的時間點上，仍然可以很清楚
地在腫瘤區域觀察到較高濃度的R418溶液；在4mM FITC—R418溶液和4mM FITC —
S18溶液的活體熒光成像對比中，發現在注射藥物后的l一3天內，FITC-S18的熒光減
弱速度快于FITC-R418，在第四天，FITC-S18在腫瘤區域完全消失，而FITC-R418仍
然保持了一定的熒光強度。實驗結果表明，R418在體內腫瘤區域的局部濃度保持時間
遠遠長于S18局部濃度保持時間，進一步闡明了為什么在體內實驗中，R418比S18具有更強的殺傷腫瘤細胞的功能。
SEQUENCE LISTING
<iio>四川大學
<120> —種自組裝短肽及其在制備抗腫瘤藥物中的應用 <160> 1
<170> Patentln Version 3.2
<210>1
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<222> (1)(38) <223>端基保護
<400> 1
CH3CO-ArgAla Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala
5 10 Arg Ala Asp Ala Gly Pro Pro Pro Lys Trp Lys Leu Phe Lys
15 20 25
Lys lie Pro Lys Phe Leu His Leu Ala Lys Lys Phe- NH2 30 3權利要求
1、一種自組裝短肽，其特征在于它的氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO.1所述。
2、 權利要求1所述自組裝短肽在制備治療或預防白血病的藥物中的應用。
3、 權利要求1所述自組裝短肽在制備治療或預防乳腺癌的藥物中的應用。
全文摘要
一種自組裝短肽R418，由抗腫瘤活性肽段S18、自組裝肽段RADA16-I和連接肽段組成，其氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO.1所述。通過原子力顯微鏡和透射電鏡的表征，證明R418分子具有在溶液狀態下自組裝形成納米纖維的特性。體外細胞實驗表明，自組裝短肽R418顯著地引起腫瘤細胞K562、Jurkat、MDA-MB-435S的死亡，而對NIH3T3細胞的細胞毒性較低。小動物活體成像實驗表明，R418自組裝后，在體內腫瘤區域的局部濃度保持時間遠遠長于S18局部濃度保持時間。與小動物活體成像實驗相一致，動物腫瘤抑制實驗表明，自組裝短肽R418與短肽S18相比，抑制腫瘤的效果更好。
文檔編號C07K14/00GK101302249SQ20081004477
公開日2008年11月12日 申請日期2008年6月24日 優先權日2008年6月24日
發明者唐成康, 趙曉軍 申請人:四川大學