專利名稱：15-氧代繡線菊內酯，其藥物組合物和其制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于藥物領域，具體地，涉及式(1)的二萜 化合物15-氧代繡線菊內酯、其為藥物活性成分的藥物組合物，其制 備方法與抗腫瘤作用，以及在抗腫瘤藥物研制中的應用。
背景技術：
粉花繡線菊復合群在我國有7個變種，資源十分豐富。該植物中富含二萜生物堿，其中主要化學成分為繡線菊堿A、 B、 C 和D，最高可達總堿的90%以上。上述4個生物堿及其混合物在強堿 作用下，經水解和分子內歧化反應可轉化為二萜類化合物繡線菊內酯(spiramilactone)和繡線菊內酯C (spiramilactone C)，繡線菊內酯可 經氧化生成15-氧代繡線菊內酯(1)。現有技術中未見有15-氧代繡 線菊內酯(1)化合物及其藥用作用的報道。
發明內容
本發明的目的在于提供式(1)的二萜化合物15-氧代 繡線菊內酯，該化合物為藥物活性成分的藥物組合物，其制備方法與 抗腫瘤作用，以及在抗腫瘤藥物研制中的應用。結構式(1 )所示的化合物15-氧代繡線菊內酯(15-oxospiramilactone )。15-oxospiramilactone(1)抗腫瘤藥物組合物，含有式(1)所示的藥物有效成分15-氧代繡線菊內酯及可藥用載體和/或賦形劑。本發明還提供了式(1)化合物的制備方法，由植物橢圓葉粉花繡線菊中分離得到的繡線菊堿A(spiramine A)和堿B (spiramine B)，在強堿存在下，經水解和分子內歧化反應生成繡線菊內酯 (spiramilactone)和繡線菊內酯C (spiramilactone C)，繡線菊內酯再 經氧化得到15-氧代繡線菊內酯。R = Ac spiramine A/B R = H spiramine C/Dspiramilactone15-oxospiramilactoneScheme 1. (a) 15% KOH, MeOH reflux, 72 hr, (b) Mn02, CH2C12, r.t., 72 hr本發明同時提供了式(1)化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用； 在制備抗多種化療藥物有抗性的腫瘤細胞的抗腫瘤藥物中的應用。進一步的，本發明還提供了式(1)化合物為藥藥有效成分的藥 物組合物在制備抗腫瘤藥物中的應用；在制備抗多種化療藥物有抗性 的腫瘤細胞的抗腫瘤藥物中的應用。本發明化合物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的 形式使用。該藥物組合物含有0.1—99%，優選為0.5-90%的本發明化 合物，其余為藥物學上可接受的，對人和動物無毒和惰性的可藥用載 體和/或賦形劑。所述的藥用載體或賦形劑是一種或多種固體、半固體和液體稀釋 劑、填料以及藥物制品輔劑。將本發明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。苔黑酚-1-氧-6-D-葡萄糖吡喃苷、苔黑酚及其衍生物的組合物采用制藥和食品領域公認的方法制備成各種劑型、如液體制劑(注射劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑等)、固體制劑(片劑、膠囊劑、顆粒劑，沖劑等)、噴劑、氣霧劑等。本發明的藥物可經注射(靜脈注射、靜脈滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)和口服、舌下給藥、粘膜透析等給藥途徑進行抑郁癥的治療。
具體實施例方式下面結合本發明實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但不以此來限定本發明。 實施例1:結構式(1)所示15-氧代繡線菊內酯(15-oxospiramilactone)的制備方法1、繡線菊堿A、 B、 C和D (spiramine A,B,CandD)的提取分離橢圓葉教、花繡線菊全株干粉(5^/raea7"po"/ca var. ova/i/b//<2) 30 kg，用95%乙醇加熱回流提取三次(3x4h)，合并提取液，減壓回 收乙醇，得浸膏4.6kg。將其用3%鹽酸捏溶、過濾，酸液分別用石 油醚-苯萃取三次以脫脂，再以NaOH水溶液堿化至pH41，氯仿萃 取三次，氯仿層水洗至中性，無水Na2S04干燥，過濾，回收氯仿， 即得繡線菊總生物堿。總堿經硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯-二乙 胺)，得到spiramineA (500 mg) 禾卩spimmine B (450 mg),以 及它們的、混合物10.2 g; spiramine C (210 mg)禾口 spiramine D (195 mg)，以及它們的混合物7.5g。spiramine A的光譜數據:EIMS m/z (%): 399 [M]+(99), 382 (22), 371 (31), 356 (59), 340 (35), 329 (37), 286 (23), 268 (52), 239 (67), 149 (100), 109 (21), 83 (82), 72 (31), 57 (37)。丄HNMR (C6D6 , 400 MHz) & 1.18 (3H, s, H-18), 1.65 (3H, s, -COCH3 ), 1.80 (IH, dd, /= 13, 15 Hz, H-6a), 2.23 (IH, m, H-12), 2.63 (1H， ddd, J= 5, 15, 4 Hz, H-6p), 3.24, 3.01 (each IH, m, H2-21), 3.81, 3.37 (each IH, m, Hr22), 3.54 (IH, d, J =5 Hz, H-7), 3.87 (IH, s, H-19), 4.47 (lh, d, J = 2 Hz, H-20), 5,30, 5.04 (each IH, brs, H2-17), 5.46 (IH, brs, H-15); 13C NMR (C6D6， 100.6 MHz)& 41.0 (C-1, t), 22.9 (C-2, t), 29.8 (C-3, t), 35,4 (C-4, s), 45.2 (C-5, d), 25.3 (C-6, t), 69.2 (C-7, d), 40.8 (C-8, s), 43.0 (C-9, d), 34.2 (C國IO, s), 23,5 (C-ll, t), 36.7 (C-12, d), 21.1 (C-13, t), 20.9 (C-14, t), 74.2 (C國15, d): 150.1 (C-16, s)， 114.3 (C-17, t), 25.9 (C-18, q), 95.3 (C-19, d), 85.8 (C-20: d), 51'0 (C-21, t), 63.1 (C-22, t), 171.0(C-23, s),.20.4 (C-24, q)。spiramine B的光譜數據& NMR (C6D6 , 400 MHz) & 0.97 (3H, s, H-18), 1.66 (3H, s, -COCH3 ), 2.59 (IH, ddd, /= 5， 15, 4 Hz, H鄰), 3.02, 2.70 (each IH, m, H2-21), 3.73, 3.65 (each IH, m, H2-22), 3.61 (IH, d, J = 5 Hz, H-7), 4.27 (IH, s, H-19), 4.69 (lh, d, J = 2 Hz, H-20), 5.30, 5.04 (each IH, brs, H2-17), 5.46 (IH, brs, H-15); 13C NMR (C6D6， 100.6 MHz)& 33.9 (C-1, t), 22.9 (C-2， t), 29.8 (C-3, t), 35.4 (C-4, s), 47.4 (C-5, d), 25.3 (C-6, t), 69.7 (C畫7， d), 41.0 (C-8, s), 43.9 (C-9， d), 34.9 (C畫IO, s), 23.1 (C-ll, t), 36.4 (C-12, d), 21.2 (C-13, t), 20.8 (C-14, t), 74.3 (C-15, d): 150.1 (C-16, s), 114.3 (C-17, t), 25.9 (C-18, q), 91.3 (C-19, d), 83.5 (C-20: d), 45.7 (C-21, t), 64.9 (C-22, t), 171.1 (C-23, s),.20.8 (C-24, q)。spiramine C的光譜數據EIMS m/z (%): 357 [M〗+(95)， 340 (100), 328 (54), 286 (33), 268 (10), 239 (28), 229 (50), 72 (38)。力NMR(C6D6 , 400 MHz) & 0.67 (IH, m, H-5), 1.22 (3H, s, H-18), 2.22 (IH, m, H-12),3.25, 3.00 (each 1H, m, H2-21), 3.79 (IH, brs, H-15), 3.80 (IH, d, J = 5 Hz, H-7), 3.83, 3.36 (each IH, m, H2-22), 3.88 (IH, s, H-19), 4.49 (lh, d, J= 2 Hz, H-20), 4.93, 4.90 (each IH, brs, H2-17); 13CNMR(C6D6， 100.6 MHz)& 40.8 (C-1, t), 23.0 (C誦2， t), 29.9 (C-3, t), 35.4 (C-4, s), 45.5 (C-5, d), 25.2 (C-6, t), 69.0 (C-7, d), 41,5 (C-8, s), 43.1 (C-9, d), 34.1 (C國IO, s),23.5 (C-11, t), 37.0 (C-12, d), 19.9 (C-13, t), 20.4 (C-14, t), 74.3 (C-15, d): 155.3 (C-16, s), 112.0 (C-17, t), 26.4 (C-18, q), 95.3 (C-19, d), 85.9 (C-20 d), 51.0 (C-21,t), 63.1 (C-22,t)。spiramine D的光譜數據^NMR (C6D6 , 400 MHz) & 0.77 (IH， m, H-5), 0.99 (3H, s, H-18), 2.61 (IH, m, H-12), 3.04, 2.71 (each IH, m, H2-21)， 3.74, 3.66 (each IH, m, H2-22), 3.79 (IH, brs, H-15), 3.86 (IH, d, J = 5 Hz, H畫7), 4.29 (IH, s, H-19)， 4.72 (lh, d, / = 2 Hz, H-20), 4.94, 4.91 (each IH, brs, H2-17); 13C NMR (C6D6， 100.6 MHz) & 34.2 (C-1, t), 23.0 (C-2, t), 30.0 (C-3, t), 35,6 (C-4, s), 47,3 (C-5, d), 25.5 (C-6, t),69.6 (C-7, d), 41.9 (C-8， s), 44.3 (C-9, d), 34.2 (C國IO, s), 23.1 (C-11, t), 37.6 (C-12, d), 23.1 (C-13, t), 20.4 (C-14, t), 75.4 (C-15, d), 156.2 (C-16, s)， 111.6 (C-17, t), 26.9 (C-18, q), 91,5 (C-19, d), 83.6 (C-20, d), 45.7 (C誦21,t), 64.9 (C-22,t)。2、繡線菊內酯(spiramilactone)和繡線菊內酯C (spiramilactoneC)的制備取spiramine A， B的混合物(8.0 g, 20.1 mmol)[或者是spiramine C， D的混合物]溶于300 mL甲醇中，加入慢慢45gKOH，加熱回 流72h， TLC跟蹤，直至生物堿試劑不顯色，原料消耗完畢，反應產 物點不變。減壓回收MeOH，鹽酸中和至弱酸性，CHCl3萃取三次， 水洗至中性，無水Na2S04干燥，過濾，減壓回收CHCl3，經硅膠柱層析(洗脫劑:CHCl3-Me2CO 10:1)，得到1.980 g spiramilactone C， 得率29.7%; 1.020 g spiramilactone,得率15.3%。
spiramilactone C的光譜數據EIMS w/z (%): 332 [M]+(53)， 314 [M-H20]+ (66), 296 (6) [M-2 x H20]+, 286 (42), 269 (28), 255 (15)， 241 (30), 227 (21)， 213 (22), 199 (28)， 171 (29)， 145 (29)， 121 (45)， 105 (70), 91 (100), 79 (78), 67 (43), 55 (66); ^NMR (CDC13, 400 MHz) & 1.18 (3H, s, H-18), 3.61 (IH, dd， J= 1.8, 11,6 Hz, H-7), 3.64 (IH, brs, H-15), 4.07 (IH, d,= 11.4 Hz, H-20a), 4.42 (IH, dd, J= 2.2, 11.6 Hz, H-20b), 4.55 (IH, d, / = 2,2 Hz, H-17a), 4.72 (IH, d, J = 2.2 Hz, H墨17b); 13C NMR (CDC13， 100.6 MHz) & 42.8 (C國l, t), 20.6 (C-2, t), 37.8 (C-3, t), 46.4 (C-4, s), 52.1 (C-5, d)， 20.6 (C-6, t), 82.1 (C-7, d), 38.2 (C-8, s), 48.5 (C-9, d), 34.0 (C-10, s), 42.4 (C-ll, t), 36.4 (C-12, d), 27.8 (C-13, t), 24.4 (C-14, t), 70.5 (C-15, d), 151.5 (C-16, s), 104.4 (C-17, t), 26.3 (C-18, q), 174.4 (C-19, s), 76.7 (C-20, t)。
spiramilactone的光譜數據EIMS m/z (%): 332 [M]+(60), 314+ (100), 296 (21) [M-2 x H20]+, 286 (85), 255 (27), 241 (38), 213 (30), 199 (41), 171 (45), 145 (43), 105 (65), 91 (99), 79 (77), 67 (54), 55 (83); 'HNMR (CDC13,400 MHz) & 0.85 (3H, s， H-18), 3.60 (IH, dd, J= 4.1, 10.5 Hz, H曙7)， 3.82 (1H, d, J二1.8Hz, H-15), 3.98 (IH, d, 11.8 Hz, H誦19a), 4.14 (IH, dd, J= 2.2, 11.8 Hz, H-19b), 4.88 (1H, d, J= 1,8 Hz, H隱17a), 4.96 (IH, d, /= 1.8 Hz, H-17b); 13C NMR (CDC13, 100.6 MHz)& 40.5 (C-1, t), 20.2 (C-2, t), 37.3 (C-3, t), 32.5 (C-4, s), 46.6 (C-5, d), 12.9 (C-6, t), 80.1 (C-7, d), 41.2 (C-8, s), 46.4 (C-9, d), 45.6 (C-10, s), 28.1 (C-ll, t), 35.7 (C-12, d), 26.5 (C-13, t), 24.2 (C-14, t), 76.7 (C-15, d): 155.9 (C-16, s), 107.6 (C-17, t), 23.3 (C-18, q), 76.3 (C-19, t), 174.6 (C-20, s)。3、 15-氧代繡線菊內酯(15-oxospiramilactone)的制備 200 mg (0.60 mmol) spiramilactone溶于25 mL CH2C12中，分批 加入活性MnO2共900 mg (6.34mmol)，常溫攪拌3天后，TLC檢 測，原料點消失，過濾，濾渣反復用CHCl3洗脫，減壓濃縮除去溶劑 后得氧化產物，經硅膠柱層析(洗脫劑CHCl3-Me2C0 12:l)，得產物 120 mg，得率60.4%。
化合物15—oxospiramilactone的結構式如(1):
15-oxospiramilactone
(1)
15-oxospiramilactone的光譜數據EMS w/z (%): 330 [M]+(56), 312 [M-H20]+ (100), 284 (55), 238 (15), 210 (17), 197 (22), 171 (10), 145 (14), 95 (5), 69 (3), 55 (3); ^NMR (CDC13, 400 MHz) 0.92 (3H, s, H曙IS)， 4.07 (1H, (1,7= 11.6 Hz, H-19a), 4.10 (1H， dd, / = 4.2, 11.9 Hz, H-7), 4.23 (1H， dd, J = 2.3, 11.6 Hz, H-19b), 5.23 (1H, d, / = 1.5 Hz, H-17a), 5.93 (lH,d, J= 1.5 Hz, H-17b); 13C NMR (CDC13, 100.6 MHz)
5 40.7 (C陽l, t), 20.3 (C-2, t), 37.5 (C曙3， t), 32.8 (C-4, s), 47.1 (C-5, d), 16.7 (C-6, t), 69.8 (C-7, d), 50.8 (C-8, s), 43.7 (C-9, d), 46.0 (C畫IO, s), 27.3 (C-ll, t)， 36.0 (C-12, d), 23.5 (C-13, t), 27.1 (C-14, t), 205.1 (C-15, s), 147.9 (C-16, s), 117.2 (C-17， t), 23.6 (C-18, q), 76.5 (C-19, t), 174.2 (C-20, s)。
綜上，由繡線菊堿A (spi腿ine A)、 B (spiramine B)制備15-氧代繡線菊內酯(15-oxospiramilactone)的反應式如下<formula>formula see original document page 10</formula>實施例2:
15-氧代繡線菊內酯誘導細胞凋亡的生物學實驗結果
1、 15-氧代繡線菊內酯可以誘導腫瘤細胞的凋亡 流式細胞儀檢測細胞凋亡顯示20pM的15-氧代繡線菊內酯處 理人結腸癌HCT116細胞，36小時后有53%的細胞發生凋亡，處理 48小時后則有67%的細胞發生凋亡；20pM的15-氧代繡線菊內酯處 理人結腸癌SW480細胞48小時后有92%的細胞發生凋亡；20|iM的 15-氧代繡線菊內酯處理人神經瘤母細胞SH-SY5Y， 36小時后有45 %的細胞發生凋亡。
2、 15-氧代繡線菊內酯可以誘導Bax缺失的人結腸癌腫瘤細胞 HCT116發生凋亡
20pM的15-氧代繡線菊內酯處理HCT116Bax;細胞，36小時后 有46%的細胞發生凋亡，處理48小時后則有55%的細胞發生凋亡.
3、 15-氧代繡線菊內酯可以誘導Bcl-2高表達的人多發性骨髓瘤細 胞IM-9發生凋亡
20pM的15-氧代繡線菊內酯處理抑凋亡蛋白Bcl-2高表達的人多 發性骨髓瘤IM-9細胞，48小時后有42%的細胞發生凋亡。
4、 15-氧代繡線菊內酯可以誘導Bax和Bak雙缺失的小鼠胚胎上 皮細胞發生凋亡10jiM的15-氧代繡線菊內酯處理Bax; Bak 'A MEF細胞48小時， 有54%的細胞發生凋亡。
5、 15-氧代繡線菊內酯可以抑制HCT116 Bax—4多植裸鼠腫瘤生
長
3"06促凋亡蛋白Bax缺失的人結腸癌HCT116細胞注射入裸鼠 背部皮下，10天后腫瘤長至約20mm3，腹腔注射30mg/kg的15-氧代 繡線菊內酯或者是溶劑對照，每三天注射一次。21天后加藥組腫瘤 大小約是空白對照組的30%，加藥組腫瘤重量約是空白對照組的30 %。而加藥組和對照組裸鼠的體重沒有明顯差異。表明15-氧代繡線 菊內酯可以作為一個潛在的化療藥物，在殺傷對很多化療藥物有抗性 的腫瘤細胞時，對動物體沒有明顯損害。
Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡調控過程中起著重要作用，Bax是 Bcl-2家族中主要的促凋亡蛋白之一，Bax缺失的細胞對于多種凋亡 誘導劑不敏感，Bax在腫瘤細胞內的低表達或異常表達造成了很多腫 瘤細胞的抗藥性。本發明的研究結果表明15-氧代繡線菊內酯可以 克服因Bax缺失而引起的腫瘤細胞的抗藥性。
Bcl-2是Bcl-2家族中主要的抗凋亡蛋白之一，Bcl-2的高表達可 以抑制很多種化療藥物誘導的細胞凋亡。而在腫瘤細胞中尤其是人淋 巴瘤中Bcl-2普遍高表達，造成了對多種化療藥物的抗性。本發明的 研究結果表明15-氧代繡線菊內酯可以誘導Bd-2高表達的細胞發生 凋亡，克服了 Bcl-2高表達引起的腫瘤細胞對化療藥物的抗性。
Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡過程中起著重要作用，而除Bax之外， Bak也是一個主要的促凋亡蛋白，共同調節細胞凋亡和細胞色素C釋 放，如果同時缺失Bax和Bak，細胞將會對多種凋亡刺激產生很大 抗性。本發明的研究結果表明15-氧代繡線菊內酯可以誘導Bax和Bak雙缺失的小鼠胚胎上皮細胞發生凋亡，提示與以往的化療藥物不 同，該藥可以誘導對多種化療藥物有抗性的細胞發生凋亡。
本發明的研究結果還表明5-氧代繡線菊內酯可以抑制HCT116 Bax一移植裸鼠腫瘤生長，而加藥組和對照組裸鼠的體重沒有明顯差 異。表明15-氧代繡線菊內酯可以作為一個潛在的化療藥物，在殺傷 對很多化療藥物有抗性的腫瘤細胞時，對動物體沒有明顯損害。
實施例3:
按實施例l的方法先制得15-氧代繡線菊內酯，按常規加注射用水， 精濾，灌封滅菌制成注射液。 實施例4:
按實施例1的方法先制得15-氧代繡線菊內酯，將其溶于無菌注射 用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于2安 瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉針劑。
實施例5:
將所分離得到的15-氧代繡線菊內酯與賦形劑重量比為9:1的比例 加入賦形劑，制成粉劑。 實施例6:
按實施例1的方法先制得15-氧代繡線菊內酯，按其與賦形劑重量 比為1:5-1:10的比例加入賦形劑，制粒壓片。 實施例7:
按實施例1的方法先制得15-氧代繡線菊內酯，按常規口服液制法 制成口服液。實施例8:
按實施例1的方法先制得15-氧代繡線菊內酯，按其與賦形劑重量
比為5:1的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑或沖劑。
實施例9:
按實施例1的方法先制得15-氧代繡線菊內酯，按其與賦形劑重量 比為3:1的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑或沖劑。
權利要求
1、結構式(1)所示化合物15-氧代繡線菊內酯(15-oxospiramilactone)。
2、抗腫瘤藥物組合物，含有式(1)所示的藥物有效成分15-氧代繡線菊內酯及可藥用載體和/或賦形劑。
3、權利要求1所述式(1)化合物的制備方法，由植物橢圓葉粉花繡線菊中分離得到的繡線菊堿A (spiramineA)和堿B (spiramineB)，在強堿存在下，經水解和分子內歧化反應生成繡線菊內酯(spiramilactone)和繡線菊內酯C (spiramilactone C)，繡線菊內酯再經氧化得到15-氧代繡線菊內酯，〇H只=Ac spiramine A/B R = Hspiramine C/Dsph'amilactoiie Cspiramilsicto股15-oxospiramilactoneScheme 1. (a) 15% KOH, MeOH reflux, 72 hr, (b) Mn02, CH2C12, r.t., 72 hr 。
4、 權利要求l式(1)化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
5、 權利要求1式(1)化合物在制備抗多種化療藥物有抗性的腫 瘤細胞的抗腫瘤藥物中的應用。
6、 權利要求2所述藥物組合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
7、 權利要求2所述藥物組合物在制備抗多種化療藥物有抗性的腫瘤細胞的抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
提供由結構式(1)所示的15-氧代繡線菊內酯(15-oxospiramilactone)化合物，其作為藥物活性成分的抗腫瘤藥物組合物，該化合物及其組合物可以克服因Bax缺失而引起的腫瘤細胞的抗藥性以及克服Bcl-2高表達引起的腫瘤細胞對化療藥物的抗性，誘導Bcl-2高表達的細胞發生凋亡；誘導Bax和Bak雙缺失的小鼠胚胎上皮細胞發生凋亡；抑制HCT116 Bax<sup>-/-</sup>移植裸鼠腫瘤生長，顯示15-氧代繡線菊內酯可以作為化療藥物，在殺傷對多種化療藥物有抗性的腫瘤細胞時，對動物體沒有明顯損害。
文檔編號C07D311/00GK101239964SQ200810058170
公開日2008年8月13日 申請日期2008年3月7日 優先權日2008年3月7日
發明者雯 樂, 何紅平, 劉海洋, 蕾 杜, 王曉慧, 趙麗霞, 邸迎彤, 郝小江, 金海京, 全 陳, 鎖 高 申請人:中國科學院昆明植物研究所;中國科學院動物研究所