專利名稱：雷莫拉寧發酵液預處理的方法
技術領域：
本發明屬于藥物化學領域，具體涉及一種雷莫拉寧發酵液的預處理的方法。
背景技術：
隨著抗生素在抗感染治療上的大量應用，臨床耐藥問題日益突出。雷莫拉寧 (RAM0PLANIN)作為一類新型廣譜抗革蘭氏陽性菌抗生素，目前主要是作為外用和治療胃腸 道粘膜表面感染性疾病藥物進行研究開發。雷莫拉寧由一種游動放線菌屬菌種(美國標準菌庫保存，代碼ATCC33076)制得。 其傳統的預處理方法是將ATCC33076發酵菌株發酵出來的發酵液先調pH到3. 5，離心得 到菌絲體和發酵液，其中菌絲體用有機溶劑進行提取，提取后真空濃縮，再用正丁醇萃取多 次，合并萃取液后再反復用石油醚對其進行沉淀并分離出來，真空干燥得到粗品，而發酵液 用正丁醇萃取，同樣方法制得粗品。USP4328316中報道的雷莫拉寧的預處理方法是通過高速離心，使發酵液和菌絲體 分開，再分別處理發酵液和菌絲體。此法的缺點是必須使用價格昂貴的大型離心設備，且由 于雷莫拉寧發酵液的黏度很大，固液分離的效果不好，另外，由于必須對發酵液和菌絲體分 別處理，操作步驟繁瑣，溶劑使用量大，非常不利于工業化生產。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種步驟簡單、操作時間短，并同時保持高收 率的預處理雷莫拉寧發酵液的方法。本發明基于將絮凝作用應用到雷莫拉寧發酵液的預處理中，通過篩選各種絮凝 齊U、摸索其加入發酵液的比例而完成。絮凝作用的原理是在絮凝劑存在的條件下，在懸浮粒子之間產生架橋作用而使發 酵液中的膠粒物質形成粗大的絮凝團，從而使得發酵液易于過濾。對于雷莫拉寧發酵液，由 于其菌絲形態的特異性，粘度非常大，無論是抽濾還是離心都難以取得很好的效果，加入本 發明的絮凝劑后，由于產生的架橋作用，使得發酵液中粘度較大的蛋白質膠體物質聚集成 塊，因而能夠大大增加了過濾的速度。本發明通過篩選各種絮凝劑，找到兩種絮凝效果非常好的絮凝劑，并優選出最佳 的添加量。加入本發明絮凝劑后，原來非常粘稠的發酵液變得非常的容易過濾，直接通過布 氏漏斗即可快速的將固液分離開，從而避免了大型離心機處理過程煩瑣，離心時間長的問題。另外，本發明通過對發酵液pH的考察，發現將發酵液的pH調到8 10后，再加入絮凝劑，過濾后雷莫拉寧將完全在菌絲體中，濾液中幾乎沒有單位。對于菌絲體可以用有機 溶劑將雷莫拉寧提取出來。和已有專利相比，此工藝免去了從菌絲體和濾液分別提取雷莫 拉寧，只需對菌絲體進行處理，從而簡化了工藝。因此，本發明提供一種雷莫拉寧發酵液預處理的方法，該方法包括如下步驟
a)將雷莫拉寧發酵液的pH調節到8-10 ；b)向發酵液中加入絮凝劑；C)過濾；
d)提取濾餅中的雷莫拉寧。其中，a)步驟中雷莫拉寧發酵液的pH可用NaOH溶液進行調節；b)步驟中所述的 絮凝劑優選為亞鐵氰化鉀和硫酸鋅，所述亞鐵氰化鉀和硫酸鋅加入的量優選為所述雷莫拉 寧發酵液體積的0. 2 1%，這里絮凝劑的加入量最少要0. 2%，但并不限定最大用量，選擇
為上限是出于成本的考慮，已經完全能夠很好的過濾雷莫拉寧發酵液；c)步驟中的 過濾方式優選為抽濾；d)步驟中濾餅中的雷莫拉寧可用一定體積的有機溶劑例如甲醇、乙 醇或丙酮等提取。本發明的雷莫拉寧發酵液預處理的方法具體根據如下步驟進行操作1)將雷莫拉寧的發酵液放罐后用NaOH溶液調其pH到8-10，攪拌后靜置Ih左右；2)向發酵液中加入絮凝劑(優選亞鐵氰化鉀和硫酸鋅)，加入的量可以為0. 2 1% (體積百分比)，攪拌后靜置0. 5h ；3)用布氏漏斗進行抽濾，抽濾時間視發酵液的體積而定，對于幾升的發酵液來說， 二十分鐘內完全能夠抽濾好；4)抽濾完后棄去濾出液，將濾餅用一定體積的有機溶劑(優選甲醇、乙醇、丙酮 等)將其提取出來。本發明的雷莫拉寧發酵液預處理的方法具有步驟簡單、操作時間短以及收率高的 優點。
具體實施例方式本發明所述的雷莫拉寧發酵液由以下方法制得將保藏號為ATCC33076的發酵菌 株進行發酵，其中斜面培養條件斜面及平板培養基(g/L):牛肉膏3.0，酪蛋白10.0，可溶淀粉 24. 0，葡萄糖1.0，瓊脂22.0，滅菌前pH 7. 0，121°C滅菌30min。菌種接種于斜面培養基，于 30°C培養5-9天。種子培養條件二級發酵種子培養條件為牛肉膏3. 0，酪蛋白5. 0，酵母粉5. 0，燕 麥粉30.0，碳酸鈣4.0，自來水配制，用2mol/L的NaOH(或者HCl)調pH至7. 0，121°C滅菌 30min。種子培養基裝量為100ml/750ml，于28°C，250rpm的旋轉式搖床培養72h。發酵培養條件為淀粉50.0，葡萄糖20.0，黃豆粉30.0，碳酸鈣10.0，L-Leu5.0，自 來水配制，用2mol/L的NaOH(或者HCl)調pH至7. 0，121°C滅菌30min。接種量6%，裝量 100ml/750ml，于25°C，旋轉式搖床250rpm培養5天。本發明所用絮凝劑1亞鐵氰化鉀國藥集團化學試劑有限公司分析純2硫酸鋅(七水合硫酸鋅)國藥集團化學試劑有限公司分析純實施例1 3考察加入絮凝劑的比例對本發明方法的影響
實施例1雷莫拉寧的發酵液3000ml，單位為1062ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調其pH到
8.5，攪拌后靜置lh，向發酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各0. 2%，攪拌后靜置0. 5h，靜置 后用布氏漏斗進行抽濾，抽率時間約為18min，抽濾完后用HPLC進行檢測，發現濾液中沒有 單位，棄去濾出液，將濾餅用1500ml的甲醇將其提取出來，測其單位為882ug/ml。
實施例2雷莫拉寧的發酵液3000ml，單位為967ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調其pH到8. 5， 攪拌后靜置lh，向發酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各1%，攪拌后靜置0. 5h，靜置后用布 氏漏斗進行抽濾，抽濾時間約為12min，抽濾完后用HPLC進行檢測，發現濾液中沒有單位， 棄去濾出液，將濾餅用1500ml的甲醇將其提取出來，測其單位為891ug/ml。實施例31雷莫拉寧的發酵液3000ml，單位為1096ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調其pH到
9.0，攪拌后靜置lh，向發酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各0. 5%，攪拌后靜置0. 5h，靜置 后用布氏漏斗進行抽濾，抽濾時間約為15min，抽濾完后用HPLC進行檢測，發現濾液中幾乎 沒有單位，棄去濾出液，將濾餅用1500ml的甲醇將其提取出來，測其單位為877ug/ml。實施例4 6考察pH值范圍對本發明方法的影響實施例4雷莫拉寧的發酵液3000ml，單位為957ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調其pH到8. 0， 攪拌后靜置lh，向發酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各0. 5%，攪拌后靜置0. 5h，靜置后用 布氏漏斗進行抽濾，抽濾時間約為15min，抽濾完后用HPLC進行檢測，發現濾液中有少量的 雷莫拉寧，單位為12ug/ml，棄去濾出液，將濾餅用1500ml的甲醇將其提取出來，測其單位 為 882ug/ml。實施例5雷莫拉寧的發酵液3000ml，單位為855ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調其pH到
10.0，攪拌后靜置lh，向發酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各0. 5%，攪拌后靜置0. 5h，靜 置后用布氏漏斗進行抽濾，抽濾時間約為15min，抽濾完后用HPLC進行檢測，發現濾液中幾 乎沒有單位，棄去濾出液，將濾餅用1500ml的甲醇將其提取出來，測其單位為796ug/ml。實施例6雷莫拉寧的發酵液3000ml，單位為952ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調其pH到9. 0， 攪拌后靜lh，向發酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各0. 5%，攪拌后靜置0. 5h，靜置后用布 氏漏斗進行抽濾，抽濾時間約為15min，抽濾完后用HPLC進行檢測，發現濾液中幾乎沒有單 位，棄去濾出液，將濾餅用1500ml的甲醇將其提取出來，測其單位為844ug/ml。實施例7 8考察不同溶劑對本發明方法的影響實施例71雷莫拉寧的發酵液3000ml，單位為1120ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調其pH到 9. 0，攪拌后靜置lh，向發酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各0. 5%，攪拌后靜置0. 5h，靜置 后用布氏漏斗進行抽濾，抽濾時間約為15min，抽濾完后用HPLC進行檢測，發現濾液中幾乎 沒有單位，棄去濾出液，將濾餅用1500ml的乙醇將其提取出來，測其單位為921ug/ml。實施例8
雷莫拉寧的發酵液3000ml，單位為1120ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調其pH到 9. 0，攪拌后靜置lh，向發酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各0. 5%，攪拌后靜置0. 5h，靜置 后用布氏漏斗進行抽濾，抽濾時間約為15min，抽濾完后用HPLC進行檢測，發現濾液中幾乎 沒有單位，棄去濾出液，將濾餅用1500ml的甲醇將其提取出來，測其單位為1033ug/ml。對比例1雷莫拉寧的發酵液3000ml，單位為1096ug/ml，放罐后，用鹽酸溶液調其pH到3. 5， 攪拌后靜置lh，用BECKMAN離心機高速離心，轉速為4000轉/分鐘，離心0. 5h后，將上清液 用HPLC進行檢測，其單位為233ug/ml，將固體收集好用1500ml甲醇提取出來，測其單位為 564ug/ml。由對比例1可以看出，雷莫拉寧在上清液和沉淀中都有單位，必須分別進行進一 步的處理，因此增加了分離的步驟。
對比例2雷莫拉寧的發酵液3000ml，單位為896ug/ml，放罐后，用鹽酸溶液調其pH到4. 0， 攪拌后靜置lh，向發酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各0. 5%，攪拌后靜置0. 5h，靜置后用 布氏漏斗進行抽濾，抽濾時間約為15min，抽濾完后用HPLC進行檢測，發現濾液中雷莫拉寧 單位為426ug/ml，將濾餅用1500ml的甲醇將其提取出來，測其單位為451ug/ml。由對比例2可以看出，濾液和菌絲體中都含有雷莫拉寧，必須分別進行進一步的 處理，因此增加了分離的步驟。對比例3雷莫拉寧的發酵液3000ml，單位為952ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調其pH到9. 0， 攪拌后靜置lh，向發酵液中加入亞鐵氰化鉀1%，攪拌后靜置0. 5h，發現發酵液仍然呈膠 狀，用布氏漏斗過濾時難以過濾，2h后濾液收集約400ml。對比例4雷莫拉寧的發酵液3000ml，單位為952ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調其pH到9. 0， 攪拌后靜置lh，向發酵液中加入硫酸鋅1%，攪拌后靜置0. 5h，發現發酵液呈膠狀，用布氏 漏斗過濾時難以過濾，2h后濾液收集約350ml。由對比例3和4可以看出，只加一種絮凝劑獲得的分離效果不佳。
權利要求
雷莫拉寧發酵液預處理的方法，其特征在于，包括如下步驟a)將雷莫拉寧發酵液的pH調節到8-10；b)向發酵液中加入絮凝劑；c)過濾；d)提取濾餅中的雷莫拉寧。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，用NaOH溶液調節雷莫拉寧發酵液的pH。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，b)步驟中所述的絮凝劑為亞鐵氰化鉀和 硫酸鋅。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述亞鐵氰化鉀和硫酸鋅加入的量為所 述雷莫拉寧發酵液體積的0. 2 1%。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，c)步驟中所述的過濾為抽濾。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，用有機溶劑提取濾餅中的雷莫拉寧。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述有機溶劑為甲醇、乙醇或丙酮。
全文摘要
本發明提供一種雷莫拉寧發酵液預處理的方法，其特征在于，包括如下步驟a)將雷莫拉寧發酵液的pH調節到8-10；b)向發酵液中加入絮凝劑；c)過濾；d)提取濾餅中的雷莫拉寧。本發明的雷莫拉寧發酵液預處理的方法具有步驟簡單、操作時間短以及收率高的優點。
文檔編號C07K9/00GK101838316SQ20091004772
公開日2010年9月22日 申請日期2009年3月17日 優先權日2009年3月17日
發明者盧亮, 尹培軍, 張宏宇, 李繼安 申請人:上海醫藥工業研究院