一種亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗的制作方法

專利名稱：：一種亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種用于口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗及它們的制備方法；具體涉及一種用于亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗及它們的制備方法。
背景技術：
：口蹄疫(footandmouthdisease,簡稱FMD)是一種發生于偶蹄動物的急性、高度接觸性、發熱性傳染病，在世界范圍內分布很廣，屬于國際間相互傳播的全J求性流行性傳染病。口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的，該病毒屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，呈球形，直徑為30nm,無嚢膜。口蹄疫病毒結構簡單，由單鏈核糖核酸和蛋白質組成，其在病畜水皰皮內以及淋巴液中含量最多，致病力強。口蹄疫病毒共有7種血清型(0、A、C、SAT1、SAT2、SAT3、AsiaI),每種血清型又分成多個亞型，不同亞型之間沒有交叉免疫性。近年來，亞洲一型口蹄疫病毒(FMDV)在東南亞和印度半島呈地方性流行，并且以這兩個地區為中心向中東及東南亞周邊地區擴散。目前對于該疾病的預防，大多數發展中國家采用病毒滅活疫苗進行免疫。在國際上，絕大多數生產企業生產口蹄疫疫苗時采取細胞懸浮或細胞轉瓶的培養方式，并通過二乙烯亞胺(BEI)將病毒滅活，釆用氫氧化鋁膠作為吸附劑、礦物油作為乳化佐劑來配制疫苗。雖然口蹄疫滅活疫苗具有較強的免疫效力，但由于其生物安全性差、產品的穩定性欠佳、容易產生過敏副反應等諸多不利因素，并且國際獸醫局(OIE)特別規定無口蹄疫的國家或地區禁用滅活疫苗，所以開發新型口蹄疫疫苗的研究就被提上了日程。隨著現代生物技術的快速發展，人們對口蹄疫病毒本身以及病毒與動物的免疫應答機制的研究越來越深入，為研制基因工程疫苗、化學合成肽疫苗等分子水平疫苗提供了技術保障。研究發現FMDV是由一條RNA核酸鏈和衣殼蛋白組成的，基因組RNA全長約8.5kb，可以直接作為信使RNA。FMDV基因組RNA由5'UTR、3'UTR和OFR組成。5，UTR長約1300nt,含有VPg、二級結構、P10基因、Poly(c)區段和內部核糖體進入位點等(IRES)。3，UTR由Poly(A)尾和大ORF3'末端與Poly(A)區段5，末端之間92個nt殘基組成，長172nt。大ORF由L基因(P20a)、Pl結構蛋白基因、P2和P3非結構蛋白基因以及起始密碼子和終止密碼子組成，并以L、Pl、P2和P3的順序依次排列，長約6.5Kb，其中基因組的3D區段是編碼FMDV的RNA聚合酶的，是病毒復制中不可缺少的成分，被稱為病毒感染相關抗原，它與非結構蛋白3A、3B、3C等常用來檢測動物是否接觸、感染過活的FMDV(龍永進等，2003)。Pl結構蛋白基因編碼4種主要的結構蛋白VP1、VP2、VP3和VP4(LoganD,Abu-GhazalehR,BlakemoreW等，1993),它們各60個組成了FMDV的外殼蛋白；VP1~VP3組成衣殼蛋白亞單位，1個蛋白亞單位構成病毒粒子20面體的一個面，VP4位于病毒顆粒的內部。衣殼蛋白VP1~VP4基因均參與抗原位點的形成。Bachrach等于1975年從口蹄疫病毒中分離出衣殼蛋白VP1，配以弗氏不完全佐劑制成一種蛋白亞單位疫苗，具有一定的免疫效果，為研制基因工程疫苗提供了依據。自此，許多科研工作者也將研究目標集中到對VP1蛋白的研究上。20世紀80年代后，國外許多學者將DNA重組技術和FMDV分子生物學的研究成果相結合，用埃希氏大腸桿菌、酵母、桿狀病毒、痘病毒、哺乳動物細胞甚至植物表達系統生產口蹄疫病毒的部分結構蛋白或全部結構蛋白，研制基因工程疫苗。我國也對口蹄疫基因工程疫苗進行了深入的研究，并取得了階段性的成果。2000年，楊志軍等用大腸桿菌制備了表達含T細胞和B細胞表位抗O型FMDV的VP1基因工程疫苗。試驗表明，該疫苗能誘導豚鼠和豬產生中和抗體，具有一定的免疫效果。但是由于基因表達產物的量很有限，并且無法獲得抗原的立體結構，因此難以提高免疫效力。2003年，鄭兆鑫等將VP1和VP4上的T細胞表位和B細胞表位的基因串連起來研制出了針對Asia1型口蹄疫的基因工程疫苗，但是試驗結果表明在強毒攻擊下并不能達到100%的保護，同時作為疫苗，基因工程疫苗后期處理過于復雜，成本高，效價低。目前為止，國際上還沒有一種商業化生產的基因工程多肽疫苗。化學合成多肽疫苗(syntheticpeptidevaccine)就是采用化學合成抗原疫苗。這種疫苗不含核酸，是最為理想的安全性疫苗，也是目前研制預防和控制感染性疾病的疫苗的主要方向之一。研制口蹄疫合成肽疫苗的關鍵之處是在病毒粒子的衣殼蛋白上找到最主要的抗原決定簇，理想的合成肽的疫苗一4i應包括抗原的B細胞位點和輔助T細胞位點。目前，亞洲一型口蹄疫病毒正是我國主要流行的口蹄疫病毒之一，其口蹄疫毒抹的抗原性還在不斷發生變化，隨著時間的推移，原有疫苗的效力減弱甚至消失，因此給口蹄疫的防治工作帶來了很大的困難。而且，在同一種血清型中抗原差異的程度也很大，以至于能夠有效地抵抗一種亞型的口蹄疫疫苗可能針對同一血清型中的另一種亞型沒有保護性。因此，研制一種抗變異、效力好、安全性高、生產工藝穩定、成本低的亞洲一型口蹄疫病毒的合成肽疫苗已成為一項緊迫而重要的任務。
發明內容因此，本發明的目的在于克服上述現有技術的缺點與不足，提供一種能夠有效應對抗原變異，且具有優于已有疫苗的效力，安全性好、生產工藝穩定、成本低的基于合成肽的亞洲一型口蹄疫病毒疫苗。本發明的另一目的在于提供一種制備上述亞洲一型口蹄疫病毒疫苗的方法。實現本發明上述目的的技術方案如下一種用于亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗的多肽，該多肽的氨基酸序列為SEQIDNO:l所示的氨基酸序列。上述氨基酸序列中的一個或者多個纈氨酸可以被正纈氨酸替代；和/或一個或者多個亮氨酸可以被正亮氨酸替代。優選地，上述氨基酸序列中的全部纈氨酸被正纈氨酸替代；和/或全部亮氨酸被正亮氨酸替代。上述氨基酸序列中的兩個半胱氨酸的巰基可以經氧化連接在一起形成二硫鍵。上述氨基酸序列的首尾氨基酸殘基之間可以反應形成共價連接。具體來說，上述氨基酸序列的首尾氨基酸殘基的羧基與氨基、或者羧基與羥基之間反應形成共價連接。本發明還提供一種亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗，該疫苗包括上述多肽或其多肽聚合物。該疫苗還可以包含佐劑，例如白油，優選為白油50V。本發明還提供了上述多肽的制備方法，其中包括以下步驟(1)去保護反應在體積百分比為15%-30%的六氫吡啶的N-甲基他咯烷酮溶液中在20-28。C條件下反應25-40分鐘，脫除氨基樹脂或肽樹脂上的9-藥曱氧羰基(Fmoc)保護基團，氮氣吹干，N-曱基吡咯烷酮洗滌；(2)氨基酸的活化將合成用的帶有9-芴曱氧羰基保護基團的各個氨基酸與l-羥基苯丙三唑反應合成氨基酸-l-羥基苯丙三唑酯；(3)合成反應使用多肽合成儀將上述各種氨基酸和樹脂以及二異丙基碳二亞胺自動加至反應器中，在20-28。C條件下反應0.5-2.5小時，氮氣吹干，N-曱基吡咯烷酮洗滌樹脂；(4)乙酰化反應使用重量體積百分比為1.5%-4%的乙酰咪唑的N隱曱基吡咯烷酮溶液與步驟(3)中獲得的樹脂在20-28。C條件下反應20-40分鐘，氮氣吹干，曱醇洗滌樹脂；(5)合成過程由C端至N端，依照氨基酸序列不斷的重復步驟(1)~(4),反應完成后，用N-曱基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽樹脂；(6)多肽與樹脂的分離向干燥的多肽樹脂中加入裂解試劑，勻速攪拌1-4小時后置于0。C下反應IO分鐘，恢復至室溫，揮去三氟乙酸，將叔丁基曱醚及二乙醚加入多肽溶液中，攪拌洗滌，過濾得多肽溶液；(7)環化反應將多肽溶液在室溫下放置42-47小時，每小時攪拌一次；(8)超濾純化多肽及無菌處理使用膜包在20-28°C條件下超濾多肽，使用0.2微米在線濾器除菌保存。在上述制備方法中，所述裂解試劑的組分體積比具體為三氟乙酸三異丙基硅烷乙二硫醇苯酚水=85:8:3:3:1。此外，本發明還提供一種上述疫苗的制備方法，其中包括以下步驟(1)用注射用水將上述多肽或其多肽聚合物稀釋至50pg/ml;(2)在20-28。C條件下，按照多肽或其多肽聚合物溶液佐劑=1:l的體積比，先將佐劑加入乳化罐內，90-150轉/分鐘慢速攪拌1.5-3分鐘；(3)緩慢加入多肽或其多肽聚合物溶液，攪拌20-30分鐘；(4)高速攪拌15-30分鐘后靜置5分鐘，分裝后即得。在上述制備方法中，所述高速攪拌為8000-10000轉/分鐘。本發明還提供了上述多肽或其多肽聚合物、疫苗在制備治療和/或預防亞洲一型口蹄疫的藥物中的用途。本發明通過對口蹄疫流行毒林的序列測定，研究口蹄疫主要抗原位點的變異情況。針對主要變異的氨基酸位點，統計其變異的頻率，同時結合計算機輔助方法進行口蹄疫抗原位點的分析預測，對可能的抗原位點肽段進行化學合成，即根據統計的變異頻率，在易變異位點上使用不同的氨基酸，得到涵蓋當前所有可能變異位點的多種候選多肽抗原。進而經過大量的動物試驗對這些候選多肽抗原進行篩選，得到能夠引起動物的免疫反應，而且免疫反應水平高，可以^艮好地保護動物免受口蹄疫流行毒林的攻擊的多肽抗原。本發明在此篩選結果的基礎上，對口蹄疫病毒抗原位點進行了優化組合，并有效組合了T細胞表位和B細胞表位，制備了亞洲一型口蹄疫病毒的合成肽疫苗。該疫苗可以有效應對口蹄疫病毒的抗原變異，也不存在生物安全性問題，易于大規模合成，具有良好的應用前景。具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發明，其不以任何方式限制本發明的范圍。實施例1:合成肽疫苗多肽抗原的固相合成本發明的多肽抗原可以通過ABI433A全自動多肽合成儀，利用Merrifield固相合成法制備，其中采用了Fmoc修飾的氨基酸，固相載體為RinkAmideMBHA樹脂。生產過程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原純化與除菌保存。1、合成原料的準備合成肽疫苗多肽抗原序列如SEQIDNO:l所示。此外還包括如下的多肽氨基酸序列為將SEQIDNO:l序列中的亮氨酸和纈氨酸全部由正亮氨酸和正纈氨酸取代后的氨基酸序列的肽。氨基酸序列為SEQIDNO:l所示氨基酸序列的多肽的二聚體。依據上述多肽抗原序列以及lmmol的合成規模準備合適的Fmoc修飾的氨基酸，加入相應的Cartridge(裝氨基酸的小瓶)中。同樣按要求稱量RinkAmideMBHA樹脂，放入反應腔中，將上下蓋子擰緊，貼標簽，記錄所合成的肽的名稱，批號，反應腔的皮重以及所稱取樹脂的重量。將反應腔裝入合成儀。配制合成試劑包括N-曱基吡咯烷酮(NMP)、已酰咪唑(AIM)、哌啶(PIP)、曱醇等并放置到對應的試劑瓶中。2、合成儀狀態的檢測檢查433A多肽合成儀器是否正常運行，開機后，運行RunSelfTest程序，儀器自檢各項指標是否正常。另外檢查N2是否充足，系統表壓是否正常。合成前應對儀器的性能有所了解，所以要對每種合成試劑的流速進行測定。433A合成儀發送FlowRatel-18到合成儀，選擇MainMenu—ModuleTest—按Prer或next找ModuleA、ModuleD、Modulel、Modulel、ModuleA—按Start—按more進行測量或觀察，若流量不合適，則調節下閥門壓力，直至達到要求。3、合成肽疫苗多肽抗原的制備(1)去保護反應在體積百分比為20%的六氫吡啶的N-曱基吡咯烷酮(NMP)溶液中在22。C條件下反應30分鐘，脫除氨基樹脂或肽樹脂上的Fmoc保護基團，氮氣吹干，NMP洗滌樹脂；(2)氨基酸的活化將合成用的帶有Fmoc的各個氨基酸與l-羥基苯丙三唑(HOBT)反應合成氨基酸-HOBT酯；(3)合成反應啟動多肽合成儀自動合成程序，使用合成儀自動將上述氨基酸、樹脂和二異丙基碳二亞胺加至反應器中，在22。C條件下反應2小時，氮氣吹干，NMP洗滌樹脂；(4)乙酰化反應使用2.5%重量的乙酰咪唑與步驟(3)中獲得的樹脂在22。C條件下反應30分鐘，氮氣吹干，曱醇洗滌樹脂；(5)合成過程由C端至N端，依照氨基酸序列不斷的重復(1)~(4)步，反應完成后，用NMP清洗，除去殘余的氨基酸，得到干燥的多肽樹脂；(6)多肽與樹脂的分離將干燥的多肽-樹脂放入玻璃容器內，將配制好的裂解試劑(三氟乙酸三異丙基硅烷乙二硫醇苯酚水=85:8:3:3:l)加入容器內，勻速攪拌3小時，將玻璃容器置于0。C下反應10分鐘，取出恢復至室溫，揮去三氟乙酸(TFA)，將叔丁基曱醚及二乙醚加到多肽溶液中，攪拌洗滌，過濾分離出多肽溶液；(7)環化反應將多肽溶液在室溫下放置45小時，每小時攪拌一次；(8)超濾純化多肽抗原后進行無菌處理使用膜包在22。C條件下超濾多肽抗原，使用0.2微米在線濾器除菌保存。實施例2:合成肽疫苗的配制用注射用水將實施例1制備的三種多肽抗原溶液分別稀釋到50嗎/ml，作為水相；將50V白油佐劑經121°C，30分鐘滅菌，備用作為油相。在22。C條件下，按照抗原水相與滅菌的50V為1:1的體積比，先將油相加入乳化罐內，100轉/分鐘慢速攪拌2分鐘，緩慢加入水相，加完后攪拌30分鐘，再高速9000轉/分鐘攪拌20分鐘，然后靜置5分鐘，分裝后即得亞洲一型口蹄疫病毒合成肽疫苗，即SEQIDN0:1多肽疫苗，SEQIDN0:1取代多肽疫苗和SEQIDN0:1聚合多肽疫苗。實施例3:合成肽疫苗對豚鼠的免疫效果研究將300500g健康豚鼠隨機分為五組，每組六只豚鼠，在后腿進行肌肉注射，各組注射試劑及劑量見表1。第一次免疫后四周進行第二次免疫，第二次免疫后第三周攻毒。表l:各試驗組免疫抗原及免疫劑量分組免疫抗原首免劑量二免劑量A組FMD滅活疫苗0.2ml0.4mlB組SEQIDN0:1多肽疫苗0.2ml0.4mlC組SEQIDN0:1取代多肽疫苗0.2ml0.4mlD組SEQIDN0:1聚合多肽疫苗0.2ml0.4mlE組佐劑0.2ml0.4ml1、FMDV特異性抗體的檢測以間接ELISA法測定血清抗體的OD492值，在96孔酶標板上以Asia1型FMDV江蘇毒為包被抗原(1:IO稀釋)，被^r豚鼠血清為一抗，過氧化物酶標記的兔抗豚鼠IgG為二抗，在波長492nm處測定每孔的OD值，以空白孔調零。每組隨機采血3只，以1:32稀釋豚鼠血清，取每組間接ELISA方法測定結果的平均值(見表2)。表2顯示，除E組外，各免疫組豚鼠的特異性抗體水平在第一次免疫后的第二周明顯提高，即亞洲一型口蹄疫病毒合成肽疫苗組的特異性抗體水平在第一次免疫豚鼠后的第二周明顯提高。同時，其特異性抗體水平高于滅活苗組。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表3:免疫豚鼠的中和抗體水平豚鼠號A組B組C組D組E組免疫前2<0.6<0.6<0.6<0.6<0.6(第o天)4<0.6<0.6<0.6<0.6<0.6首免31.41.61.82.1<0.6(第28天)61.31.71.91.9<0.6二免52.02.22.32.4<0.6(第49天)11.91.92.12.2<0.63、豚鼠T淋巴細胞增殖試驗將無菌采集的豚鼠脾臟細胞以RPMI1640培養液稀釋成2x10個/ml，置于96孔細胞培養板中，每孔加入50jul細胞懸液和50plPHA溶液(濃度50pg/ml)，設置三個重復孔作為平行，另設對照孔。培養板置于37。C、5%(:02飽和濕度條件下培養45小時后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)10|al,繼續培養3小時并以10。/。SDS-O.01mol/1.HC1溶液中止反應，待沉淀溶解后在波長570nm處測定每孔OD值，結果以三個孔的平均值表示。將第一次免疫后第四周(第28天)、第二次免疫后第三周(第49天)采集的豚鼠脾臟淋巴細胞用于增殖試驗。結果顯示除E組外，各免疫組的脾臟T淋巴細胞均出現增殖反應。4、合成肽疫苗豚鼠攻毒試驗每組取4只豚鼠，連同陰性對照組(F組)豚鼠4只，在每只豚鼠左后腳掌皮下穿刺及皮內接種0.2mlIOO倍半數感染量(ID5())的Asial型FMDV江蘇毒，接種后1周內觀察發病情況。病變的嚴重程度分別表示為"無"，即兩只后腳掌均無病變(水泡)；"輕微"，即病變(水泡)僅發生于注射的單只后腳掌；"嚴重，，，即兩只后腳掌均出現病變(水泡)。以病變出現的嚴重程度作為保護效果的判定完全保護為不出現任何病變(水泡)；部分保護為病變(水泡)僅發生于注射的單只腳。保護率(％)=完全保護的豚鼠數/每組豚鼠總數x100。表4:豚鼠抗病毒能力檢測動物編號A組B組C組D組E組F組1保護保護保護保護發病發病2保護保護保護保護發病發病保護效果發病發病3發病保護保護保護4保護發病保護保護發病發病保護率75%75%100%100%00結果顯示(表4)，免疫組豚鼠的抗病毒攻擊能力遠大于E組和F組，其中B組、C組、D組豚鼠在攻毒后均未發病，其保護率分別達到75%、100%和100%。這說明亞洲一型口蹄疫病毒合成肽疫苗對于豚鼠具有很好的保護效果，同時聚合和替換后的疫苗具有更良好的免疫效果。實施例4:合成肽疫苗的豚鼠和小鼠安全性試驗用體重350450g的豚鼠60只，每批疫苗注射10只，每只皮下注射2ml;用體重18~22g的小鼠60只，每批疫苗注射10只，疫苗每只皮下注射0.5ml。連續觀察7日，判定是否出現因注射疫苗引起的死亡或明顯的局部不良反應或全身反應。觀察結果見表5。表5:疫苗對豚鼠與小鼠的安全性試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>從本試驗結果可以看出，本發明的亞洲一型口蹄疫病毒合成肽疫苗免疫豚鼠和小鼠后連續觀察7日，均沒有出現因注射疫苗引起的死亡或明顯的局部不良反應或全身反應。在整個試驗過程中，豚鼠和小鼠均沒有出現死亡現象。這說明本發明的亞洲一型口蹄疫病毒合成肽疫苗對于豚鼠和小鼠是安全的。序列表<110〉中牧實業股份有限公司<120〉一種亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗<130>DIC09110033<160>1<170〉Patentlnversion3.3<210>1<211>47<212>PRT<213〉人工序列<400>1AspLysLysThrGluGluThrThrLeuLeuGluAspArglieLeuThr151015ThrArgAsnGlyHisThrThrSerThrThrGinSerSerValGlyVal202530ThrLysPheAspTrpThrProAspLeuSerPheGlyHisCysHis35404權利要求1.一種用于亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗的多肽，該多肽的氨基酸序列為SEQIDNO1所示的氨基酸序列。2.根據權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列中的一個或者多個纈氨酸被正纈氨酸替代；和/或一個或者多個亮氨酸被正亮氨酸替代。3.根據權利要求2所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列中的全部纈氨酸被正纈氨酸替代；和/或全部亮氨酸一皮正亮氨酸替代。4.根據權利要求1至3中任一項所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列中的兩個半胱氨酸的巰基經氧化連接在一起形成二碌u鍵。5.根據權利要求1至4中任一項所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列的首尾氨基酸殘基之間反應形成共價連接。6.根據權利要求5所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列的首尾氨基酸殘基的羧基與氨基、或者羧基與羥基之間反應形成共價連接。7.—種亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗，該疫苗包括一種或多種權利要求1至6中任一項所述的多肽或其多肽聚合物。8.根據權利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含佐劑。9.根據權利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述佐劑為白油，優選為白油50V。10.—種根據權利要求1至6中任一項所述的多肽的制備方法，其中包括以下步驟(1)去保護反應在體積百分比為15%-30%的六氫吡啶的N-曱基吡咯烷酮溶液中在20-28。C條件下反應25-40分鐘，脫除氨基樹脂上的9-芴曱氧羰基保護基團，氮氣吹干，N-甲基吡咯烷酮洗滌；(2)氨基酸的活化將合成用的帶有9-芴曱氧羰基保護基團的各個氨基酸與l-羥基苯丙三唑反應合成氨基酸-l-羥基苯丙三唑酯；(3)合成反應使用多肽合成儀將上述各種氨基酸和樹脂以及二異丙基碳二亞胺自動加至反應器中，在20-28。C條件下反應0.5-2.5小時，氮氣吹干，N-曱基吡咯烷酮洗滌樹脂；(4)乙酰化反應使用重量體積百分比為1.5%-4%的乙酰咪唑的N-曱基吡咯烷酮溶液與步驟(3)中獲得的樹脂在20-28。C條件下反應20-40分鐘，氮氣吹干，曱醇洗滌樹脂；(5)合成過程由C端至N端，依照氨基酸序列不斷的重復步驟(1)(4),反應完成后，用N-曱基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽樹脂；(6)多肽與樹脂的分離向干燥的多肽樹脂中加入裂解試劑，勻速攪拌1-4小時后置于0。C下反應IO分鐘，恢復至室溫，揮去三氟乙酸，將叔丁基曱醚及二乙醚加入多肽溶液，攪拌洗滌，過濾得多肽溶液；(7)環化反應將多肽溶液在室溫下放置42-47小時，每小時攪拌一次；(8)超濾純化多肽及無菌處理使用膜包在20-28。C條件下超濾多肽，使用0.2微米在線濾器除菌保存。11.根據權利要求IO所述的制備方法，其特征在于，所述裂解試劑的組分體積比為三氟乙酸三異丙基硅烷乙二硫醇苯酚水=85:8:3:3:1。12.—種根據權利要求7至9中任一項所述的疫苗的制備方法，其中包括以下步驟(1)用注射用水將多肽或其多肽聚合物稀釋至50嗎/ml;(2)在20-28。C條件下，按照多肽或其多肽聚合物溶液佐劑=1:l的體積比，先將佐劑加入乳化罐內，90-150轉/分鐘慢速攪拌1.5-3分鐘；(3)緩慢加入多肽或其多肽聚合物溶液，攪拌20-30分鐘；(4)高速攪拌15-30分鐘后靜置5分鐘，分裝后即得。13.根據權利要求12所述的疫苗的制備方法，其特征在于，所述高速攪拌為8000-10000轉/分鐘。14.根據權利要求1至6中任一項所述的多肽或其多肽聚合物、權利要求7至9中任一項所述的疫苗在制備治療和/或預防亞洲一型口^帝疫的藥物中的用途。全文摘要本發明提供一種亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗，具體涉及一種用于亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗及它們的制備方法。上述多肽的氨基酸序列為SEQIDNO1所示的氨基酸序列。本發明通過對口蹄疫流行毒株的序列測定，研究口蹄疫主要抗原位點的變異情況，同時結合計算機輔助方法進行口蹄疫抗原位點的分析預測，對可能的抗原位點肽段進行化學合成。經過大量的動物試驗對候選多肽抗原進行篩選，得到免疫反應水平高并且可以很好地保護動物免受口蹄疫流行毒株攻擊的多肽抗原。由其制成的疫苗可以有效應對口蹄疫病毒的抗原變異，也不存在生物安全性問題，易于大規模合成，具有良好的應用前景。文檔編號C07K14/09GK101643500SQ20091008432公開日2010年2月10日申請日期2009年5月19日優先權日2009年5月19日發明者巴利民,李丙首,進肖,郭麗清,鵬齊申請人:中牧實業股份有限公司