專利名稱：磺胺甲噻唑人工抗原及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及磺胺甲噻唑人工抗原及其制備方法與應用。
背景技術：
磺胺甲噻唑(Sulfamethylthiazole)，又名甲噻磺胺，是一種人工合成的中 效磺胺藥，其性質穩定、抑菌譜廣、毒性小、口服吸收良好且價格低廉，對畜禽疾 病控制與治療起重要作用，廣泛應用于畜牧業。但是由于它在體內的作用時間和代 謝時間較長，易殘留在動物體內，通過任何途徑攝入都有可能在人體中蓄積。藥物 蓄積濃度超過一定值對人體機能是有害的，長期蓄積則會導致磺胺藥抗藥性的產 生，造成耐藥菌的流行性感染，從而失去了治療人類疾病的價值，對人類的身體健 康產生很大危害。所以，有必要對動物性食品中的磺胺類藥物殘留進行監測。我國 以及美國、歐盟等國家規定了動物性食品中總磺胺以及單個磺胺的最高殘留限量 (MRLs)為0.1 mg/kg。
目前，獸藥殘留檢測常用的方法有氣相色譜、高效液相色譜以及氣質聯用等理 化分析方法。雖然這些方法特異性強、靈敏度高，但是樣品前處理操作步驟繁瑣， 成本較高，也不適用于大批量樣品的篩選檢測。免疫化學分析由于在抗原抗體的定 性定量方面獨特的優勢和操作簡便快速、成本低、靈敏度較高、分析樣本量大的優 點彌補了理化分析的不足，在磺胺藥物的殘留檢測中起著越來越重要的作用。
影響免疫化學分析質量的根本因素是抗體的特異性與親和性，這些性質又決定 于免疫半抗原分子的結構，因此免疫半抗原的分子設計與合成就是產生特異性抗體 和建立小分子獸藥殘留快速檢測技術的最基礎和最關鍵的步驟。
發明內容
本發明的目的是提供一種磺胺甲噻唑人工抗原及其制備方法與應用。 本發明所提供的磺胺甲噻唑人工抗原，是將磺胺甲噻唑半抗原與載體蛋白偶聯 獲得的抗原。
磺胺甲噻唑半抗原是一種化合物，其結構為式I所示。
3式I
磺胺甲噻唑半抗原也是屬于本發明的保護范圍。
其中，所述的化合物與所述載體蛋白以酰胺鍵偶聯。所述載體蛋白為牛血清白 蛋白或卵清蛋白。
所述磺胺甲噻唑半抗原可按如下的方法制備
在乙醇中將磺胺甲噻唑與對醛基苯甲酸反應，獲得所述化合物。所述磺胺甲噻 唑與醛基苯甲酸的物質的量比為1: (1-3)。
本發明的磺胺甲噻唑半抗原在磺胺甲噻唑苯環的氨基上引入一個對醛基苯甲 酸結構，既最大程度保留了磺胺甲噻唑的特征結構，又具有可以與載體蛋白發生活 性偶聯的基團-C00H。磺胺甲噻唑半抗原經活性酯法與載體蛋白偶聯可制備磺胺甲 噻唑的人工抗原。磺胺甲噻唑的人工抗原在磺胺甲噻唑半抗原與載體蛋白間含有一 個對醛基苯甲酸間隔臂，包被原與免疫原結構上的差異可以進一步提高檢測的靈敏 度和特異性。用該磺胺甲噻唑人工抗原免疫動物，可獲得特性高的特異性抗體。該 磺胺甲噻唑人工抗原與其他已經報道的磺胺甲噻唑人工抗原聯合應用于免疫分析， 可提高檢測方法的靈敏度和特異性。本發明的磺胺甲噻唑半抗原和磺胺甲噻唑的人 工抗原可用于磺胺藥物的殘留檢測。
圖1為磺胺甲噻唑半抗原質譜圖。
圖2為磺胺甲噻唑人工抗原的紫外光譜圖。
具體實施例方式
下述實施例中如無特殊說明所用方法均為常規方法，所用試劑均可從商業途徑 獲得。
實施例l、制備磺胺甲噻唑半抗原 1.磺胺甲噻唑半抗原的制備
1) 稱取IOO mg磺胺甲噻唑，置于10mL三角燒瓶中，滴加2mL無水乙醇， 充分攪拌使其完全溶解；
2) 稱取100 mg對醛基苯甲酸，置于10mL三角燒瓶，滴加2mL無水乙醇，充分攪拌使其完全溶解；
3)將磺胺甲噻唑乙醇溶液和對醛基苯甲酸乙醇溶液混合，置于室溫磁力攪拌 過夜。過夜之后，離心，棄上清液，獲得淺黃色沉淀，60° C干燥，獲得磺胺甲噻 唑半抗原121 mg，產率為30%。
2.磺胺甲噻唑半抗原的鑒定
取磺胺甲噻唑半抗原進行ESI質譜鑒定。該物質的ESI分子離子峰為405(M-l) 和407 (M+l)，見圖1。
元素分析，結果(％，計算值)如下C， 50,36; H， 3.73; N， 10.36; 0， 19.73; S， 15.82。
磺胺甲噻唑半抗原的結構式如式I所示
式I
實施例2、制備磺胺甲噻唑人工抗原
1) 磺胺甲噻唑人工抗原的制備
10 mg實施例1的磺胺甲噻唑半抗原溶解于5 mLN，N-二甲基甲酰胺中，超聲使 之完全溶解，并以冷乙醇冷卻；加入IO mg的N，N， -二環己基碳化二亞胺(DCC) 和5 mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫反應過夜；最后逐滴加入牛血清白蛋白或 卵清蛋白的PBS溶液(50 mg牛血清白蛋白或卵清蛋白溶解于5 mL 0. 01 M的pH 7. 4 的PBS中)，繼續攪拌4小時；然后將反應液裝入透析袋，在4° C用PBS溶液透析 72小時，獲得磺胺甲噻唑人工抗原(SM2-BSA)或磺胺甲噻唑包被抗原(SM2-OVA)， 分裝于安培瓶中，-20° C保存。
2) 磺胺甲噻唑人工抗原的鑒定
磺胺甲噻唑人工抗原用PBS配成溶液進行紫外(200-400 nm)光譜掃描，以l mg/mL的BSA作為對照。
紫外(200-400 nm)光譜掃描結果見圖2，磺胺甲噻唑人工抗原的紫外圖譜與 BSA相比發生了明顯變化，說明磺胺甲噻唑半抗原與載體蛋白BSA成功偶聯，經計 算實施例1的磺胺甲噻唑半抗原與載體蛋白的結合比為11: 1。
3) 磺胺甲噻唑人工抗原免疫動物及ELISA競爭抑制實驗
5新西蘭大白兔10只，隨機分成兩組，實驗組和對照組，實驗組以2)制備的磺 胺甲噻唑人工抗原進行免疫，對照組以牛血清蛋白(BSA)進行免疫。每只兔子每 次免疫l mg/mL (以BSA量計)，每兩周免疫一次，共免疫7次，第三次免疫之后7 天，耳緣靜脈采血，進行間接競爭ELISA分析，具體步驟如下
1. 包被用包被緩沖液將磺胺甲噻唑包被抗原稀釋為系列濃度，每一濃度包被 一行，100uL/孔，4"C過夜；
2. 洗滌與封閉傾去孔內液體，用洗滌液洗滌3次，每次3分鐘；每孔加入
150 UL封閉液，37"C恒溫封閉lh，然后洗滌3次，每次3分鐘；
3. 加樣將50 PL抗血清與等體積倍比稀釋的磺胺甲噻唑標準液加到酶標板 上反應，每孔IOO uL， 37。C反應l小時，洗滌同步驟2;然后每孔加入100 uLHRP-羊抗兔IgG， 37"C反應1小時，洗滌同步驟2;
4. 顯色測定每孔加入TMB溶液100 ixL， 37X:顯色20min，然后每孔加入50 UL 2 mol L—1 H2S04以終止反應，最后用酶標儀測定各孔的0045。 值。
間接競爭ELISA結果表明，第6次免疫之后獲得了特異性抗體，效價高達l: 102400。
建立間接ELISA方法，在倍比稀釋的實驗組(磺胺甲噻唑人工抗原免疫)兔血 清中加入100 ng/mL的磺胺甲噻唑標準品進行抑制檢測，將其獲得的OD值與未加 磺胺甲噻唑的OD值相比較。
分析結果表明，與陰性對照(未加磺胺甲噻唑標準品)相比，吸光值明顯下降， 隨著血清稀釋倍數的增加，吸光值呈明顯的遞減梯度。說明獲得的兔血清能夠特異 性地識別磺胺甲噻唑。
權利要求
1、一種化合物，其結構為式I所示。式I
2、 磺胺甲噻唑抗原，是將權利要求l所述的化合物與載體蛋白偶聯獲得的抗原。
3、 根據權利要求2所述的磺胺甲噻唑抗原，其特征在于權利要求l所述的化合物與所述載體蛋白以酰胺鍵偶聯。
4、 根據權利要求2或3所述的磺胺甲噻唑抗原，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。
5、 權利要求1所述化合物在磺胺藥物的殘留檢測中的應用。
6、 權利要求2或3所述磺胺甲噻唑抗原在磺胺藥物的殘留檢測中的應用。
7、 制備權利要求1所述化合物的方法，在乙醇中將磺胺甲噻唑與醛基苯甲酸反 應，獲得所述化合物。
8、 根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述磺胺甲噻唑與對醛基苯甲酸 的物質的量比為1:(1-3)。
9、 制備權利要求2-4中任一所述磺胺甲噻唑抗原的方法，是先制備權利要求l 所述化合物，然后將所述的化合物與載體蛋白偶聯獲得所述抗原。
全文摘要
本發明公開了一種磺胺甲噻唑人工抗原及其制備方法與應用。該磺胺甲噻唑人工抗原，是將磺胺甲噻唑半抗原與載體蛋白偶聯獲得的抗原。磺胺甲噻唑半抗原是一種化合物，其結構為式I所示。磺胺甲噻唑的人工抗原在磺胺甲噻唑半抗原與載體蛋白間含有一個對醛基苯甲酸間隔臂，包被原與免疫原結構上的差異可以進一步提高檢測的靈敏度和特異性。用該磺胺甲噻唑人工抗原免疫動物，可獲得特性高的特異性抗體。該磺胺甲噻唑人工抗原與其他已經報道的磺胺甲噻唑人工抗原聯合應用于免疫分析，可提高檢測方法的靈敏度和特異性。本發明的磺胺甲噻唑的人工抗原可用于磺胺藥物的殘留檢測。
文檔編號C07D277/18GK101643457SQ20091008564
公開日2010年2月10日 申請日期2009年5月27日 優先權日2009年5月27日
發明者吳小平, 靜 張, 娜 李, 江海洋, 王亞輝, 王戰輝, 米鐵軍 申請人:北京維德維康生物技術有限公司