專利名稱：：一種抗肉毒毒素底物肽SubA的IgY抗體，其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種IgY抗體，具體說涉及一種抗肉毒毒素底物肽的IgY抗體，還涉及該抗體的制備方法及用途。
背景技術：
：肉毒毒素(botulinumneurotoxin,BoNT)是世界上已知毒性最強的物質，由肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbotulinum)在厭氧條件下產生，共有7種血清型(A-G)，其中引起人類致病的主要是A、B、E型。而A型肉毒毒素比其它型又能引起更為嚴重的中毒癥狀，導致更高的死亡率，人體的半數致死劑量LD50僅為0.1-lng/kg。中毒通常表現為眼部及喉部肌群的麻痹，然后發展為全身骨骼肌麻痹，最終由于呼吸衰竭而死。近幾年，肉毒中毒事件時有發生，雖然肉毒中毒主要以食物污染、傷口感染、嬰兒腸道中毒等方式出現，但由于肉毒毒素的毒性強烈，易于制備獲得，使得其成為潛在的生物恐怖劑之一。肉毒毒素由肉毒梭狀芽孢桿菌產生，最初是以無毒的單鏈多肽形式存在，約150kDa，之后經菌體蛋白酶或體外蛋白酶作用，將毒素前體消化成為由一個二硫鍵相連的雙鏈形式多肽存在才具有毒性，包括通過羧基端與靶細胞受體結合并通過氨基端介導細胞內吞將毒素轉運至細胞內部的重鏈部分(Heavychain,Hc)，約1OOkDa，以及具有鋅依賴內肽酶活性的輕鏈部分(Lightchain,Lc)，約50kDa，可以特異切割靶細胞內肉毒毒素的底物，而發揮神經毒力。其中，重鏈是毒素的非毒性部分，而輕鏈則是毒素的毒性部分。肉毒毒素的底物根據其血清型不同而不同，并且針對同一種底物的幾種不同血清型毒素各自的作用位點也不同。A、E、Cl型肉毒毒素作用的底物為突觸小體相關蛋白(Synaptosomalassociatedproteinofmolecularmass25kDa,SNAP-25)，作用位點分別為A型:Q197-R198;E型:R180-I181;Cl型:R198-A199;B、D、F、G型肉毒毒素作用的底物為囊泡相關膜蛋白(Vesicleassociatedmembraneprotein，VAMPorSynaptobrevin)，作用位點分別為B型Q76-F77;D型K59-L60;F型Q58-K59;G型A81-A82;Cl型肉毒毒素還可以切割可溶N2乙基馬來酰亞胺敏感因子胞膜整合蛋白(Syntaxin)，位點為K253-A254。這些底物共同被稱為SNARE蛋白，在介導小泡定向和融合方面起重根據現有文獻報道，肉毒毒素的致病分子機制主耍包括以下幾步(1)肉毒毒素通過重鏈羧基端特異識別并結合靶細胞表面的特異受體；(2)受體介導發生能量依賴性細胞內吞作用(exdocytodsis)，通過重鏈氨基端將肉毒毒素輕鏈內化進入胞漿；(3)肉毒毒素輕鏈部分發揮其鋅依賴的內肽酶活性，選擇性切割在祌經遞質釋放過程中起重要作用的SNARE蛋白，從而封閉乙酰膽堿的釋放，進而造成肉毒中毒。目前對于肉毒中毒主要使用肉毒多價抗毒素——馬血清進行臨床治療，但只有在中毒前及中毒后24小吋使用才能保證效果。因此，對于肉毒中毒的防治來說，及時、準確地采取措施才能最大限度地發揮效果。而實現對于微量肉毒毒素的快速、準確的檢測分析，無疑是及時準確采取防治措施、減少要作用其危害的前提和最重要的手段之一。迄今為止，對于肉毒毒素的檢測分析法中，唯一公認的金標準是小鼠分析法(mousebioassay)，這種分析方法主耍通過向小鼠腹腔注射待測樣品，進而觀察小鼠是否出現中毒癥狀，如出現蜂腰，皮毛倒立，呼吸微弱，四肢麻痹，甚至死亡等癥狀，從而分析待測樣品中毒素量的多少并用特異抗體確定型別如何，可以實現對皮克級(pg)毒素的分析。雖然傳統金標準對絕大部分樣品分析的結果都是真實可靠的，但也存在許多缺點，主要表現在成本高(對動物飼養條件要求高，對操作人員專業技能要求高)；耗時長(需要4天);樣品需要量大，不易推廣等。因此傳統金標準無法滿足突發公共衛生事件中樣本應急分析的耍求，亟需簡便、快速、靈敏的新技術方法實現對傳統金標準的有效替代。近幾年，國內外許多學者在肉毒毒素的分析方法方面開展了相關研究，也己經有一些新型的分析方法問世，除了上面提到過的傳統金標準外，主要包括(1)內肽酶活性分析法(endopeptidaseactivityassay),可以使用人工合成的含有酶切位點的肽段作為底物，利用檢測標記的熒光信號等方法對待測樣品中毒素進行分析；(2)質譜分析法，對毒素酶解底物產物直接進行檢測，可以達到小鼠分析法的靈敏度甚至更高，但依賴特殊設備，且其結果容易被待測樣品中其他物質所干擾；(3)細胞分析法，可以體外模擬肉毒中毒的過程，解決了小鼠分析法使用大量動物的問題，但操作較復雜，耗時長。根據文獻報道，在正確折疊的SNAP-25蛋白上，A型肉毒毒素特異切割位點之前的數個氨基酸殘基包埋于(x螺旋之中，經過毒素切割后便會失去空間構象(見圖8)。依據底物的這一構象變化，可以針對底物酶解產物的線性肽設計特異抗體，應用其對內肽酶切割前后底物識別的差異，進行肉毒毒素的到目前為止，尚未見到利用SNAP-25蛋白制備雞卵黃免疫球蛋白(IgY抗體)進行肉毒毒素的檢測分析的報道。
發明內容針對快速、靈敏、便捷的肉毒毒素檢測和毒力甄別方法的需求，本發明提供了一種IgY抗體，該抗體特異抗肉毒毒素底物肽SubA，并能高效檢測A型肉毒毒素及其毒力。該抗體所針對的底物肽SubA的氨基酸序列為NKTRIDEANQ，如序列表中序列1所示。本發明還公開了上述抗肉毒毒素的IgY抗體的衍生物，是IgY抗體的蛋白酶消化產物，它保留了IgY抗體的抗原結合活性。本發明的抗肉毒毒素的IgY抗體分子量為180,000，制備純度大于85%，具有較好的穩定性且易于保存、運輸。本發明還公開了上述抗肉毒毒素的IgY抗體的制備方法。首先選擇A型肉毒毒素切割SNAP25位點前10個氨基酸殘基，即189N-198Q(命名SubA)，通過化學合成的方法進行合成，并在肽N'端進行KLP修飾。合成制備KLP-SubA做為免疫抗原，選用產蛋雞，通過動物定向免疫方法，在動物體內誘導產生特異抗肉毒毒素底物肽SubA的IgY抗體。收集產蛋，采用水稀釋法、鹽析或PEG法等提取卵黃免疫球蛋白，可以進一步采用DEAE色譜、凝膠過濾或親和層析分離純化方法等進行純化。本發明的IgY抗體可以通過本領域己知的生物化學的方法進行大量制備。在IgY抗體全分子基礎上，可以應用蛋白酶消化方法制備F(ab)'等衍生物，以優化改善其理化性質、提高或增加其應用性和應用范圍。通過試驗測定本發明IgY抗體可特異識別底物肽SubA，并具有良好結合活性，而與完整底物SNAP25不結合，顯示其結合特異性，這種結合特異性可能是非構象依賴的，與抗體識別位點在線性底物肽SubA暴露而在完整底物SNAP25中不暴露或包埋有關。本發明同時公開了特異抗肉毒毒素底物肽SubA的IgY抗體在A型肉毒毒素檢測分析中的應用以及相關試劑的制備。具體包括(1)重組SNAP25蛋白的制備。基因工程技術和分子生物學方法，設計一對引物，通過RT-PCR從小鼠全腦組織總RNA中克隆得到SNAP25編碼基因，并通過基因亞克隆手段構建重組表達SNAP25的原核基因工程菌一重組大腸桿菌，然后誘導表達并通過一系列純化步驟，制備高純度具有生物學活性的重組SNAP25蛋白。鑒定結果證明重組SNAP25蛋白具有能被A型肉毒毒素特異切割的活性，可以作為肉毒毒素底物制劑應用于祌經毒的檢測。(2)應用特異抗肉毒毒素底物肽SubA的IgY抗體檢測A型肉毒毒素的主要步驟如下(ELISA):首先包被重組SNAP25蛋白于酶聯板上，0.4ug/孔，4。C過夜或37。C2h;3%BSA封閉37。Clh;加入待檢樣品，以A型肉毒毒素或其ALc片段為對照，37。C反應lh;洗板去除未反應物，再加入特異工gY抗體，37。C反應lh;加入HRP標記的抗IgY抗體，37'C反應30min，顯色處理并記錄結果。在對A型肉毒毒素標準品分析實驗中，獲得本分析系統的LOD為O.1LD50(小鼠)/ml(相當于O.4pg/ml)，L0Q為1.6LD50(小鼠)/ml(相當于6.4pg/ml);使用E型肉毒毒素對分析系統的特異性進行驗證，顯示特異性良好；將A型肉毒毒素混入牛奶、人血清作為模擬樣品對方法的精確性進行驗證，結果顯示在牛奶或人血清混合物中分析方法均具有良好的精確性(88%〈Recovery〈lll%，inter-assayandintra-assayCV〈20%)。基于特異抗肉毒毒素底物肽SubA的IgY抗體建立的檢測分析系統操作簡便，不依賴于特殊儀器設備，只需一般ELISA操作條件即可完成；分析效率高，能在3h內得到結果；結果靈敏度高，可以達到0.1LD50/ml(相當于0.4pg/ml)，且特異性、精確性良好。本發明利用A型肉毒毒素特異切割點，選擇A型肉毒毒素切割SNAP25位點N'端IO個氨基酸殘基，即189N-198Q(命名SubA)做為免疫抗原制備特異IgY抗體，并將其成功應用于A型肉毒毒素檢測和毒力分析。提供了快速、靈敏、便捷的肉毒毒素檢測試劑和毒力甄別方法，具有非常良好的市場前景，同時也具有重要的社會意義。圖1為重組大腸桿菌/^T-5崩尸i^/瓜i7誘導表達產物的SDS-PAGE圖譜，其中M.蛋白分子量標準；l.重組大腸桿菌誘導表達(箭頭所指處為目的蛋白SNAP25);2.重組菌未誘導對照。圖2為重組SNAP25純化產物的SDS-PAGE(A)和Western印跡(B)圖譜，其中l.純化后的SNAP25;M.蛋白分子量標準。圖3為A型肉毒毒素對重組底物SNAP25的內肽酶活性分析SDS-PAGE圖譜，其中M.蛋白分子量標準；1.10ulSNAP25;2.lOtxlSNAP25+5ul毒素；3.10ulSNAP25+10u1毒素；4.10ulSNAP25+15u1毒素c;5.10ulSNAP25+20ul毒素。圖4為anti-SubAIgY抗體純化產物的SDS-PAGE圖譜，其中箭頭所指處分別為IgY的重鏈和輕鏈。圖5為IgY抗體的特異性驗證(ELISA)，其中，包被抗原分別為SubA、SNAP25和BSA。圖6為應用anti-SubA工gY對A型肉毒毒素進行檢測分析(ELISA)及分析系統的特異性驗證，其中底物SNAP25包被量為0.4ttg/孔，毒素與底物反應條件37'C，1h。數據處理方法為A型肉毒毒素標準品的量(小鼠LD50)進行對數變換后作為X軸，OD，讀數作為Y軸作圖。使用E型肉毒毒素(BoNT/E)作為對照。具體實施例方式實施例1重組SNAP-25的表達與純化1.材料1.1菌株工程菌株/^r-5TV^P25/5i^7應用分子生物學方法構建(劉昊等，軍事醫學科學院院刊，2009)，根據GenBank中己報道的SNAP25編碼基因序列，設計特異引物，通過RT-PCR從小鼠全腦組織總RNA中得到5y^/^5基因，將全長基因克隆至原核表達載體pET22b中，獲得的重組質粒轉化入大腸桿菌￡coh'BL21構建工程菌株/五r-SA^尸Z5/B/J7，用于外源蛋白SNAP25表達。1.2試劑Ni親和層析柱HisTRAPFF購自GE公司。2.方法與結果2.1重組SNAP-25在大腸桿菌中的誘導表達將工程菌株p五r-57V/LP25/e丄"接種至含100Pg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基，37"C振蕩過夜，次日以l:IOO接種至LB液體培養基，繼續在37。C振蕩培養，至菌液濃度達到OD600為0.40.6，加入IPTG至終濃度為lmM，25°C，120r/min水浴搖床振蕩培養過夜。誘導培養產物4。C，6000r/min離心20min收集菌體。SDS-PAGE分析收集經過誘導的重組菌體進行SDS-PAGE電泳，結果顯示重組菌體樣品中出現分子量為28kDa的蛋白條帶，與SNAP-25預期分子量相符(附圖1)。2.2重組SNAP25的純化將離心收集的菌體用緩沖液A(0.02M磷酸鈉、0.5M氯化鈉、0.04M咪唑，pH7.4)懸浮，置于冰浴中超聲波破碎菌體，每次300W超聲波處理20s，間隙10s，90個循環。破碎后的菌體懸液4。C10000g離心10min收集上清樣品。以緩沖液A平衡親和柱HisTRAPFF，樣品以2mL/min速度上樣后仍以緩沖液A平衡，以緩沖液B(0.02M磷酸鈉、0.5M氯化鈉、0.4M咪唑，pH7.4)線性梯度洗脫，60min內緩沖液B升至100。/。濃度，收集280nm洗脫峰。純化產物經SDS-PAGE及Westem-blot分析(附圖2)，結果顯示重組目的蛋白純度大于85%，可以被特異抗體所識別。2.3重組SNAP-25蛋白可以被A型肉毒毒素特異切割將A型肉毒毒素與反應緩沖液(50mmol/LHEPES，2mmol/LDTT，10umol/LZnC12，pH7.5)按2:1的比例37。C孵育15min后，分別取0，0.5，1，2，4，8(il與10|ilSNAP-25純化產物在37。C下共孵育lh，經SDS-PAGE分析肉毒毒素與SNAP-25蛋白的反應結果。結果顯示，隨著毒素量的增加，SNAP-25的量逐漸減少，而在預期位置出現的切割后產物量逐漸增加(附圖3)，說明重組蛋白SNAP-25具有能被A型肉毒毒素特異切割的活性，可以應用于肉毒毒素內肽酶活性的檢測分析。實施例2特異抗肉毒毒素底物肽SiibA的IgY抗體制備1.材料產蛋來航雞由北京實驗動物中心提供，完全和不完全佐劑均購自Sigma公司。底物肽SubA序列為188NKTRIDEANQ197,如序列表中序列1所示，SubA及其修飾多肽KLP-SubA由上海波泰生物技術有限公司合成，純度90%。2.方法與結果2.1動物免疫使用合成短肽KLP-SubA抗原免疫SPF來航蛋雞，首次免疫使用福氏完全佐劑與短肽按照1:1的比例混勻，乳化后以1.0mg/kg的劑量進行注射，使用福氏不完全佐劑分別于3w，6w，11w進行第2、3、4次免疫。收集免疫后的雞蛋。2.2IgY抗體的提取將免疫來航雞所產雞蛋于消毒液中浸泡15分鐘，滅菌紗布拭凈。去蛋青留取蛋黃，按l:8的體積比加入滅菌蒸餾水(pH4.2-4.4)，充分攪拌混勻，4"C靜置過夜。移液管小心吸取上清液，滴加飽和硫酸銨溶液至終濃度20%并攪拌均勻，4'C靜置4小吋以上。10000g離心IO分鐘后吸取上清液，向其中繼續滴加飽和硫酸銨溶液至終濃度40%并攪拌均勻，4t:靜置過夜。10000g離心15分爭l'，去盡上清，沉淀重溶于10mMPBS(pH7.4)溶液中，經10mMPBS(pH7.4)透析后，即為提取的IgY。對提取的IgY進行SDS-PAGE分析，結果顯示提取的抗體純度大于85%(附圖4)。2.3anti-subAIgY抗體效價的動態檢測(ELISA)以SubA為抗原包被酶聯板，每孔100ng，ELISA方法檢測IgY效價，二抗為HRP標記兔抗雞抗體(SIGMA公司)。結果顯示，隨著免疫次數增加，抗體效價呈明顯上升趨勢，經四次免疫后，抗體效價可達5.12X105，在免疫結束后一年效價保持穩定。取12周所產蛋，按照如前所述的方法使用硫酸銨沉淀法提取雞卵黃抗體，使用Bradford法進行蛋白含量測定，經計算可知其蛋白含量為35.51mg/ml;對其效價進行測定，結果如表l所示，抗體在l:32000時仍具有良好的結合活性。表lIgY-BoNT/A的效價測定<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.4雞卵黃抗體anti-subA工gY特異性的驗證通過ELISA法對anti-subAIgY的特異性進行驗證。使用anti-subAIgY，分別對其與重組SNAP-25、人工合成subA的結合活性進行檢測，方法如下(1)將SNAP-25、subA以50ng/100ul/孔，三復孔包被，以BSA為空白對照，4'C包被過夜；(2)0.1。/。PBST洗滌三次，每次3min，3%BSA37。C封閉30min;(3)0.P/。PBST洗滌三次，每次3min，加入l:40000稀釋的雞卵黃抗體，100u1/孔，37。Clh;(4)0.1%PBST洗滌三次，每次3min，加入HRP標記的兔抗雞二抗，100"1/孔，37。C30min;(5)加入A、B液顯色，使用2MH2S0〗終止，0045(}讀數。結果如附圖5所示，anti-subA工gY對subA有顯著結合活性，對未經A型肉毒毒素切割的完整重組底物SNAP-25不具有結合活性，表明anti-subAIgY具有底物切割產物線性肽特異識別活性，可以應用于A型肉毒毒素的檢測和內肽酶活性(神經毒力)分析。實施例3IgY抗體在A型肉毒毒素檢測中的應用1.材料SpectroPlus全自動酶聯免疫檢測儀為MD公司產品，抗lgY-HRP購自SIGMA公司，酶聯板及顯色試劑購自百奧康公司。2.方法與結果2.1對A型肉毒毒素標準品進行分析操作步驟為將溶解于Ni-NTA洗脫緩沖液(0.02M磷酸鈉、0.5M氯化鈉、0.4M咪唑，pH7.4)中的SNAP-25三復孔包被于酶聯板上，每孔0.4ug，4C過夜;拍掉包被液，使用0.WPBST洗滌三次，每孔200yl，每次3min;使用3。/。BSA封閉，每孔200"1，室溫2h;拍掉封閉液，將溶解于切割反應緩沖液(5Ommol/LHEPES，2mmol/LDTT,10umol/LZnCl2，pH7.5)中的A型肉毒毒素標準品按照梯度濃度加入到酶聯板中，使用切割反應緩沖液補齊每孔100yl，37。C反應lh;拍掉反應液，使用O.P/。PBST洗滌三次，每孔200ul，每次3min;加入anti-subAIgY(—抗)，1:40000稀釋使用，每孔100ul，37。Clh;拍掉一抗，使用0.P/。PBST洗滌三次，每孔200ii1，每次3min;加入HRP標記兔抗雞抗體(二抗)，1:2000稀釋使用，每孔100txl，37。C30min;加入AB液顯色10min，2MH2S(Xi終止，OD450讀數;根據分析結果確定分析系統對A型肉毒毒素的LOD(LimitofDetection)及L0Q(LimitofQuantitation)。結果顯示對毒素反應溫度37。C、反應時間lh，底物包被每孔0.4ug條件下使用分析系統對A型肉毒毒素標準品分析的結果進行處理(結果見表2)，將A型肉毒毒素標準品的量(小鼠LD50)進行對數變換后作為X軸，0D45Q讀數作為Y軸作圖(附圖6)，結果顯示，OD徹讀數隨加入的A型肉毒毒素標準品的量的增加而變大，呈現出量效關系。表2.分析系統對BoNT/A的毒力分析數值LD5000.0150.030.060.120.240.480.961.927.6815.360.0220.0380.0430.060.0780.1230.1530.2180.2720.4010.627OD4500.030.0290.0560.0830.1270.1440.1190.210.2950.5040.70.0270.040.0630.0720.1150.1270.1620.2370.2660.5420.697MeanOD4500.0260.0360.0540.0720.1070.1310.1450.2220.2780.4820.675SD0.004040.005860.01010.01150.025540.011150.022680.013870.015310.072960.0413CV15.35%16.43%18.79%16.05%23.94%8.49%15.68%6.26%5.51%15.13%6.12%對BoNT/A加入量的值進行對數變換后得到公式y二0.219e。襲，R2=0.9931。根據背景平均值加兩倍標準差為cutoff值計算，0.01LD50/100ixl(相當于O.4pg/ml)為分析系統的L0D(LimitofDetection)，以CV〈16%為限，則0.16LD50/100iU(相當于6.4pg/ml)為分析系統的L0Q(LimitofQuantitation)。2.2分析系統的特異性驗證使用分析系統在反應溫度37。C，反應時間lh，底物包被量每孔0.4yg條件下，對E型肉毒毒素進行分析，操作方法同前。將結果與同樣條件下對A型肉毒毒素分析得到的結果進行對比。將毒素量(小鼠LD50)進行對數變換后作為X軸，以0D450讀數為Y軸作圖(見附圖6)，結果顯示BoNT/E的分析結果并未呈現量效關系，證明分析系統的特異性良好。2.2模擬樣品的檢測分析使用模擬樣品對分析系統的可靠性進行驗證，方法如下將待測的A型肉毒毒素分別使用反應緩沖液、人血清和牛奶對倍稀釋混勻，分別取出梯度濃度的樣品作為待測樣品。使用分析系統在反應溫度37"C，反應吋間lh，底物包被量每孔0.4iig條件下，對待測樣品進行分析，操作方法同前。對結果進行處理，根據OD,加讀數按照前述公式分別計算出模擬樣品中毒素的含量，并與模擬樣品中毒素的實際含量進行比較，計算出組內及組間CV、Recovery值(見表4)。結果顯示，使用分析系對反應緩沖液或人血清、牛奶中的模擬樣品進行分析的結果其Recovery均在88%-111%之間，證明分析系統具有良好的組內精確性(accuracy);對組內及組間CV值進行比較，其CV值均小于20%(inter-assayandintra-assayCV〈20%)，證明分析系統具有良好的精確性(precision)。表4.使用模擬樣品對分析系統的精確性進行驗證毒素實際值(LD5。)組別B組0.24LD50M組S組B組0.32LD50M組S組B組0.48LD50M組S組0.1200.1250.1240.1460.1380.1410.1590.1630.148OD4500.1290.1150.1230.1410.1280.1330.1570.1420.1640.1190.1320.1370.1390.1380.1300.1510.1610.152毒素計算0.22650.25050.24550.36750.31980.33720.45360.48230.3801值0.27070.20390.24070.33720.26560.29190.43970.34310.4897(LD50)0.22180.28650.31410.32550.31980.27590.39940.46790.4059Intra-M0.23970.24700.26680.34340.30170.30170.43090.43110.4252Intra-SD0.02700.04140.04100.02170.03130.03180.02810.07650.0573Intra-CV11.3%16.8%15.4%6.3%10.4%10.5%6.5%17.8%13.5%Rscovsry99.9%102.9%111.2%107.3%94.3%94.3%89.8%89.8%88.6%Inter-M0.25110.31560.4291Inter-SD0.03440.03240.0499Inter-CV13.7%10.3%11.6%(Intraandinter-assaypresicionpresentationasCV,accuracypresentationasRscovery.)(B組.將待測的A型肉毒毒素使用反應緩沖液對倍稀釋混勻；M組.將待測的A型肉毒毒素使用牛奶對倍稀釋混勻；S組.將待測的A型肉毒毒素使用人血清對倍稀釋混勻；M.mean計算值平均值；intra.組內；inter.組間)17抗肉繼底物肽抗體序列表<110〉中閨人民制'放軍軍￥阪學科學院微生物流行病研究所<120〉一種抗肉想母索底物肽SubA的IgY抗體，JL:制備方法和用途<130〉〈160〉1<170〉Patentlriversion3.2〈210〉1〈211〉10<212〉PRT〈213>〈柳>1AsnUsThrArglieAspGluAlaAsnGin1510權利要求1.一種抗肉毒毒素底物肽的IgY抗體，其特征在于特異識別肉毒毒素底物肽SubA，該底物肽SubA的氨基酸序列如序列表中序列1所示。2.權利要求1所述抗肉毒毒素底物肽的IgY抗體的衍生物，是IgY抗體的蛋白酶消化產物，其特征在于保留IgY抗體的抗原結合活性。3.權利要求1所述抗肉毒毒素底物肽的IgY抗體，其特征在于通過將肉毒毒素底物肽抗原免疫雞，然后從其蛋黃中提取卵黃免疫球蛋白，進一步純化或蛋白酶消化進行制備，該IgY抗體分子量為180,000，制備純度大于85%。4.權利耍求l所述抗肉毒毒素底物肽IgY抗體的制備方法，包括如下步驟(1)重組制備肉毒毒素底物肽抗原(底物肽SubA或其修飾體)；(2)應用肉毒毒素底物肽抗原多次加強免疫產蛋雞；(3)收集雞蛋，分離出蛋黃，提取卵黃免疫球蛋白；(4)純化IgY抗體或進一步蛋白酶消化加工。5.根據權利要求4所述的制備方法，其中制備肉毒毒素底物肽抗原采用化學合成或基因工程重組表達方法。6.根據權利要求4所述的制備方法，其中提取卵黃免疫球蛋白采用水稀釋法、鹽析或PEG法。7.根據權利要求4所述的制備方法，其中純化IgY抗體采用DEAE色譜、凝膠過濾或親和層析分離純化方法。8.權利要求1所述抗肉毒毒素底物肽的IgY抗體或權利要求2所述抗肉毒毒素底物肽的IgY抗體的衍生物在制備檢測A型肉毒毒素以及產A型肉毒毒素病原菌的診斷試劑中的用途。9.根據權利要求8所述用途，其中肉毒毒素來自產生肉毒毒素的微生物:肉毒梭菌。全文摘要本發明公開了一種抗肉毒毒素底物肽的IgY抗體，該抗體可以通過以下方法制備化學合成或基因重組表達的方法制備SNAP25短肽subA，通過subA免疫產蛋雞，收集雞蛋，應用生物化學方法提取和純化卵黃免疫球蛋白。該抗體具有高特異性的結合底物線性短肽subA，而不結合完整底物SNAP25的特點，具有特異識別A型肉毒毒素酶解SNAP25作用的能力，可以作為檢測試劑應用于A型肉毒毒素的檢測和神經毒力或內肽酶活性分析，以及臨床肉毒中毒診斷，具有良好的市場前景和重要的社會意義。文檔編號C07K16/12GK101648997SQ20091009228公開日2010年2月17日申請日期2009年9月9日優先權日2009年9月9日發明者侯曉軍,昊劉,晶史,濤李,慧王,琴王申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所