專利名稱：去除多殺菌素發酵液中色素的方法
技術領域：
本發明屬于生物農藥生產技術領域，具體涉及一種去除多殺菌素發酵液 中色素的方法。
背景技術：
多殺菌素(Spinosad)是1982年美國禮萊公司科研人員從維爾京群島土 壤中分離的刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa)發酵液中提取得到的一 種新穎的大環內酯類超高效生物源殺蟲劑。該類化合物不僅有很高的生物 活性，而且對非靶標生物的毒性很低，對人和其他哺乳動物非常安全。在 天然多殺菌素分離提取物中，兩個最高活性組份A和D的混和物被稱為 spinosad，中文通用名為多殺菌素，它是商業化產品的主要成分。多殺菌 素主要應用于對棉鈴蟲、煙青蟲、小菜蛾、果蠅、甜菜夜蛾、薊馬等的防 治，適用于棉花、茶、蔬菜和蘋果、梨、桃等落葉果樹。到1999年多殺 菌素已經在24個國家、100多種作物上進行了注冊登記。多殺菌素具有高 殺蟲活性的同時，對捕食性昆蟲還表現出較低毒性，對鱗翅目害蟲而言， 多殺菌素是已發現的殺蟲劑中選擇性最高的化合物之一。多殺菌素的另一 個優點是對哺乳動物和鳥類相對低毒，對水生動物也只是輕微的中等毒 性，此外，哺乳動物的慢性毒性試驗表明，多殺菌素無致癌、致畸、致突 變性或神經毒性。目前，多殺菌素商業化的品種有用于棉花的Tmcer，用 于蔬菜類的菜喜(Success)，以及Conerve和SpinTor。我國目前使用的有用 于蔬菜的菜喜。在美國，多殺菌素產品標簽上標明可應用于100多種作物， 同時它還在其他24個國家進行了注冊登記，并在全世界范圍內為廣大種 植者所接受。
對于多殺菌素的分離純化工藝，國內外的研究并不多，其主要方法是 利用溶媒萃取法，此法雖然也能取得一定的效果，但有機溶媒使用量大， 環境污染嚴重，利用樹脂吸附法則能克服這一缺點，但目前樹脂吸附的工
3藝并不成熟，尤其是發酵液必須經過一定的預處理后樹脂才能發揮其作 用。
發表于2005年5月的華中農業大學的碩士學位論文"多殺菌素分離 純化工藝的研究"披露了一種多殺菌素的樹脂吸附法提取多殺菌素的工 藝，文獻中先對發酵液進行預處理，然后采用XAD-4大孔吸附樹脂對多 殺菌素進行粗提。此樹脂在PH5-11對多殺菌素進行吸附時均有泄露，不 能達到完全吸附的效果，并且對吸附速率也有較高的要求，不利于工藝的 放大生產。
多殺菌素的發酵液由于雜質較多，濾液混濁，目前現有技術中還沒有 一種簡單的方法能夠將發酵液的色素有效去除，并將多殺菌素的純度提到 較高的水平。
發明內容
為解決該技術問題，本發明通過動態實驗，篩選了各種吸附劑，選取 了一種效果較好的吸附劑，并對吸附條件進行了探索，使得能夠基本除去 多殺菌素發酵液中的色素，且減少了很多雜質，使多殺菌素的純度得到提 高，減輕了后面的樹脂分離的壓力，整個工藝簡單，操作十分方便。
因此，本發明提供一種去除多殺菌素發酵液中色素的方法，該方法包 括將預處理后的多殺菌素發酵液上氧化鋁柱吸附并用溶劑系統洗脫的步 驟。
所述預處理后的多殺菌素發酵液按照下列步驟得到取多殺菌素發酵 液，離心得菌絲體，用丙酮浸泡過夜，再次離心，所得上清液即為預處理 后的發酵液。
具體處理方法取多殺菌素發酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲 體，用3L的丙酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預
處理后的多殺菌素發酵液。
本發明所述氧化鋁柱選自酸性氧化鋁柱、中性氧化鋁柱或堿性氧化鋁 柱，考慮到多殺菌素在堿性氧化鋁和中性氧化鋁中的穩定性問題，優選酸 性氧化鋁柱。
本發明所述溶劑系統可以選自丙酮、甲醇或乙醇等，但比較下來，丙酮能夠更好的溶解多殺菌素，且所含的雜質最少。因此所述溶劑系統優選
為丙酮水溶液，且優選丙酮濃度為80%-100%的丙酮水溶液。
本發明方法中，多殺菌素的發酵液pH—般比較穩定，基本上在2 11， 優選3 10之間。
本發明方法中，所述處理后的多殺菌素發酵液可以配成丙酮水溶液后 上柱，也可以直接上柱。但由于多殺菌素在水溶液中的溶解性不好，含水 量超過一定比例后多殺菌素會沉淀析出，不利于過氧化鋁柱，所以丙酮水 溶液的含水比例不能超過30%。同樣，洗脫用的丙酮水溶液中的含水量也 不能超過30%。
本發明去除多殺菌素發酵液中色素的方法的具體步驟如下
取預處理后的多殺菌素發酵液500ml，將pH調為3 10，選用一根高 為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，均勻填入氧化鋁約10cm，往預處理后 的多殺菌素發酵液加入一定量的去離子水，配成丙酮水溶液后上柱，或將 預處理后的多殺菌素發酵液直接上柱，控制其流速為15ml/min，將500ml 浸取液過完柱后，繼續用一定濃度的丙酮500ml將柱上的多殺菌素洗下來， 收集所有的洗脫液。
結果發現洗脫液已經變得澄清，幾乎沒有顏色，除去了絕大部分的色 素，且純度大大提高，除去了很多極性的雜質，收率為77%以上。
多殺菌素是刺糖多孢菌在培養介質中經有氧發酵而得的次級代謝產 物，其生產菌種單一，但由于發酵培養基的配方不同，其最終發酵液的成 分也會不同，本實驗室通過對比不同培養基配方的發酵液，發現其中的色 素成分比較固定，因此都可以用本發明方法除去。
本發明通過實驗得到吸附力強，吸附速度快的氧化鋁柱，并通過洗脫 條件的摸索，使得其用于去除多殺菌素發酵液中色素時優點突出。此方法 比文獻報道的方法有以下優點
1. 色素去除較為徹底，與文獻中報道的方法相比，可省去脫色步驟。
2. 所得產物純度可達66%以上。
3. 可節省有機溶劑，且在泄露率相同的條件下，洗脫體積較小，從而 提高了回收率。
圖1為本發明實施例1的處理后的多殺菌素發酵液過氧化鋁柱前的 HPLC圖譜；
圖2為本發明實施例2的處理后的多殺菌素發酵液過氧化鋁柱后的 HPLC圖譜；
其中多殺菌素A和D的保留時間都在5 6分鐘。
具體實施例方式
本發明多殺菌素發酵條件如下
菌種NRRL18395
斜面培養
培養基全脂奶粉2.0%、葡萄糖0.5%、進口酵母粉0.3%、硫酸鎂 0.2%、自來水
條件28°C， 6天
種子培養
培養基葡萄糖3.0%、可溶性淀粉1.0%、棉籽粉2.0%、魚粉1.0%、 熱黃豆粉0.2%、玉米漿0.2。/。、碳酸l丐0.5%、自來水
條件25°C， 3天，搖床轉速250rpm 發酵培養
培養基葡萄糖8.0%、葵花油2.0%、棉籽粉3.0%、魚粉1.0%、賴 氨酸0.2%、 KH2PO4 0.1%、檸檬酸三鈉0.1%、自來水
12rC滅菌20min，接種量10%，搖瓶裝量100ml/750ml，置于25T恒溫 室中旋轉式搖床250rpm搖瓶發酵9天后，得到多殺菌素發酵液。
實施例1
培養基配方碳源-葡萄糖氮源-棉籽粉
取多殺菌素發酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲體，用3L的丙 酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預處理后的多殺 菌素發酵液。
取預處理后的多殺菌素發酵液500ml，單位為823ug/ml， pH為6.0，選用一根高為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，均勻填入酸性氧化鋁約 10cm，將丙酮浸取液加入一定量的去離子水，配成9: 1的丙酮水溶液后 上柱，控制其流速為15ml/min，將500ml浸取液過完柱后，繼續用9: 1 的丙酮水500ml將柱上的多殺菌素洗下來，收集所有的洗脫液。
結果發現洗脫液己經變得澄清，幾乎沒有顏色，除去了絕大部分的色 素，且純度由19.8%提高到68%，除去了很多極性的雜質，收率為95%。
實施例2
培養基配方碳源-葡萄糖氮源-棉籽粉
取多殺菌素發酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲體，用3L的丙 酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預處理后的多殺 菌素發酵液。
取預處理后的多殺菌素發酵液500ml，單位為823ug/ml， pH為6.4， 選用一根高為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，均勻填入酸性氧化鋁約 10cm，將丙酮浸取液直接上柱，流速控制為15ml/min，過柱后繼續用丙酮 將柱上的多殺菌素洗下來，收集所有的洗脫液。
結果發現洗脫液已經變得澄清，幾乎沒有顏色，除去了絕大部分的色 素，純度由19.4%提高到66%，收率為89%。
實施例3
培養基配方碳源-葡萄糖氮源-棉籽粉
取多殺菌素發酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲體，用3L的丙 酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預處理后的多殺 菌素發酵液。
取預處理后的多殺菌素發酵液500ml，單位為823ug/ml， pH為6.5， 選用一根高為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，均勻填入酸性氧化鋁約 10cm，配成4: 1的丙酮水溶液后上柱，控制其流速為15ml/min，將500ml 浸取液過完柱后，繼續用4: 1的丙酮水500ml將柱上的多殺菌素洗下來，
收集所有的洗脫液。
結果發現洗脫液己經變得澄清，幾乎沒有顏色，除去了絕大部分的色素，純度由19.4%提高到68%，但收率為降為77%。 實施例4
培養基配方碳源-葡萄糖，淀粉氮源-花生柏粉
取多殺菌素發酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲體，用3L的丙 酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預處理后的多殺 菌素發酵液。
取預處理后的多殺菌素發酵液500ml，單位為756ug/ml， pH為6.6， 選用一根高為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，均勻填入中性氧化鋁約 10cm，將丙酮浸取液直接上柱，流速控制為15ml/min,過柱后繼續用丙酮 將柱上的多殺菌素洗下來，收集所有的洗脫液。
結果發現洗脫液變得澄清，顏色很淡，除去了絕大部分的色素，純度 由18.9%提高到65.4%，收率為87。％。
實施例5
培養基配方碳源-葡萄糖，淀粉氮源-花生柏粉
取多殺菌素發酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲體，用3L的丙 酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預處理后的多殺 菌素發酵液。
取預處理后的多殺菌素發酵液500ml，單位為756ug/ml,pH為6.6，選 用一根高為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，均勻填入堿性氧化鋁約10cm， 將丙酮浸取液直接上柱，流速控制為15ml/min，過柱后繼續用丙酮將柱上 的多殺菌素洗下來，收集所有的洗脫液。
結果發現洗脫液變得澄清，顏色不深，除去了大部分的色素，純度由 18.9。％提高到60.2%，收率為84Q/^。
實施例6
培養基配方碳源-葡萄糖，糊精氮源-玉米漿，棉籽粉
取多殺菌素發酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲體，用3L的丙 酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預處理后的多殺菌素發酵液。
取預處理后的多殺菌素發酵液500ml，單位為655ug/ml， pH為4.9， 選用一根高為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，均勻填入酸性氧化鋁約 10cm，將丙酮浸取液直接上柱，流速控制為15ml/min，過柱后繼續用丙酮 將柱上的多殺菌素洗下來，收集所有的洗脫液。
結果發現洗脫液變得澄清，幾乎沒有顏色，除去了大部分的色素，純 度由18.9%提高到67.2%，收率為88%。
實施例7
培養基配方碳源-葡萄糖，糊精氮源-玉米漿，棉籽粉 取多殺菌素發酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲體，用3L的丙
酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預處理后的多殺
菌素發酵液。
取預處理后的多殺菌素發酵液500ml，單位為655ug/ml， pH為9.5， 選用一根高為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，均勻填入酸性氧化鋁約 10cm，將丙酮浸取液直接上柱，流速控制為15ml/min，過柱后繼續用丙酮 將柱上的多殺菌素洗下來，收集所有的洗脫液。
結果發現洗脫液變得澄清，幾乎沒有顏色，除去了大部分的色素，純 度由18.9%提高到66.9%,收率為84%。
對比例l:考察不同吸附劑對色素去除的比較 考察用活性炭、氧化鋁、大孔吸附樹脂對色素去除的比較。
培養基配方碳源-葡萄糖氮源-全脂奶粉
取多殺菌素發酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲體，用3L的丙 酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預處理后的多殺 菌素發酵液。
取預處理后的多殺菌素發酵液500ml，單位為742ug/ml， pH為6.1， 選用一根高為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，分別均勻填入氧化鋁、活 性炭、大孔吸附樹脂XAD-2約10cm，將丙酮浸取液加入一定量的去離子 水，配成9: 1的丙酮水溶液后分別上柱，三種吸附劑都控制其流速為
915ml/min，將500ml浸取液過完柱后，繼續用9: 1的丙酮水500ml將柱 上的多殺菌素洗下來，收集所有的洗脫液。
結果發現活性炭作為吸附劑時，多殺菌素大部分被吸附在活性炭上洗 不下來，損失很大。
XAD-2作為吸附劑時，很多色素都隨著多殺菌素一起洗下來，除色素 效果不好。
只有氧化鋁作為吸附劑時，洗脫液中幾乎沒有色素，顏色澄清。 對比例2:考察用絮凝劑除色素的效果
按照華中農大碩士學位論文"多殺菌素分離純化工藝的研究"的方法， 采用絮凝劑處理多殺菌素發酵液，結果表明該方法只能沉淀發酵液中的蛋 白等大分子物質，對于色素去除的效果不佳，絮凝后發酵液的透光度仍然 不高，除色素效果遠不如氧化鋁。
附吸附劑規格 100 200目酸性氧化鋁 技術條件
性狀白色無定形粉末 主要性能指標-
技術條件符合Q/CYDZ 1791-2005
顆粒度>75.0%
千燥失重《1.0%
水溶解物《0.5%
灼燒失重《8.0%
pH3.8 4.8
生產廠家國藥集團化學試劑有限公司 XAD-2大孔吸附樹脂
基質 苯乙烯 直徑20-60目密度1.08 g/ml
生產廠家美國羅門哈斯公司 。
權利要求
1.去除多殺菌素發酵液中色素的方法，該方法包括將預處理后的多殺菌素發酵液上氧化鋁柱吸附并用溶劑系統洗脫的步驟。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述預處理后的多殺菌 素發酵液按照下列步驟得到取多殺菌素發酵液，離心得菌絲體，用丙酮 浸泡過夜，再次離心，所得上清液即為預處理后的發酵液。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化鋁柱選自酸性 氧化鋁柱、中性氧化鋁柱或堿性氧化鋁柱。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述氧化鋁柱為酸性氧 化鋁柱。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶劑系統為丙酮水 溶液。
6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述丙酮水溶液中丙酮 的濃度為80%-100%。
7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述預處理后的多殺菌 素發酵液配成丙酮水溶液后上柱或直接上柱。
8. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述預處理后的多殺菌 素發酵液的pH值為2 11。
9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述預處理后的多殺菌 素發酵液的pH值為3 10。
全文摘要
本發明公開一種去除多殺菌素發酵液中色素的方法，該方法包括將預處理后的多殺菌素發酵液上氧化鋁柱吸附并洗脫的步驟。由該方法得到的多殺菌素洗脫液中的色素基本除去，純度和收率均得到提高。整個工藝簡單，操作方便。
文檔編號C07H17/08GK101659685SQ20091013311
公開日2010年3月3日 申請日期2009年4月1日 優先權日2008年8月27日
發明者亮 盧, 李繼安, 韓麗敏 申請人:上海醫藥工業研究院