專利名稱：絲氨酸和蘇氨酸位的天然化學連接的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用天然肽鍵端對端化學連接兩個肽片段的方法和縮醛中間體。更具體而言，本發明涉及用于化學連接的方法和縮醛中間體，其中第一初始肽的N端絲氨酸或蘇氨酸與具有C端芳基醛酯的第二初始肽迅速縮合從而形成縮醛中間體，所述縮醛中間體可以迅速轉化為在連接位具有Xaa-Ser/Thr形式的天然肽鍵的連接產物(Xaa表示任意氨基酸)。
背景技術：
除提供蛋白的重組DNA技術之外，蛋白的化學合成已明顯地有助于研究蛋白結構與功能的關系。此外，隨著作為治療劑的中等大小OO 100個氨基酸)的多肽類藥物的迅速出現，合成肽化學已經前所未有地活躍起來。梅里菲爾德的線性固相肽合成(SPPS)為制備多肽提供了通用工具。然而，利用線性固相肽合成來化學合成大的多肽(>50個氨基酸)成本非常高，有時還不能實現。因此，實現多肽的匯集合成的方法變得很關鍵。利用較少或者不利用保護基團以及偶聯步驟的效率是匯集合成開發中的關鍵問題。將未受保護的肽用于化學操作避開了經典肽偶聯反應因有限溶解性所造成的固有的困難，因此增加了偶聯收率，并使得易于純化和表征。開發使用未受保護的肽片段的肽偶聯方法的關鍵問題在于下述化學選擇性反應的可行性，所述反應可特異性地并明確地通過一種肽的C端和另一種肽的N端使這兩種肽結合。利用化學選擇性反應通過在連接位形成非天然(即，非肽) 骨架結構使兩個肽片段結合使得可以容易地制備各種各樣的骨架修飾的人造肽和蛋白。然而，為實現天然化學連接(通過天然肽鍵連接兩個肽片段)，化學方法是非常受限的。使用未受保護的肽、在連接位形成天然肽鍵和不導致或幾乎不導致所形成的肽鍵差向異構化是實際天然化學連接的特征。很明顯，由Kent及合作者開發的基于半胱氨酸的天然化學連接(NCL)滿足這些標準，并且其無疑已成為合成肽化學中的最有力的方法(Dawson P. Ε. ；Muir, Τ. R.； Clarklewis, I. ；Kent, S. B. H. Science, 1994, 266, 776-779, "synthesis of proteins by native chemical ligation”)。該方法使得能夠匯集合成較大尺寸的肽、甚至蛋白。NCL 的應用在過去15年間已被廣泛地擴展到化學和生物的各個方面。基于半胱氨酸的NCL的特征在于在N端半胱氨酸和C端硫酯之間的硫捕捉，作為轉硫酯化步驟其具有高度化學選擇性，隨后發生迅速的S — N酰基轉移，從而提供天然的Xaa-Cys肽鍵合(Xaa表示任意氨基酸)。其高效性、易操作性和化學選擇性(在任何未受保護的氨基酸的存在下)對于其用戶/實踐者非常富有吸引力，因此基于半胱氨酸的NCL已經廣泛用于化學合成許多蛋白 (> 100個氨基酸)。基于半胱氨酸的NCL實現了化學選擇性的原因在于，N端半胱氨酸可以將其自身的雙官能度(即，1，2_巰基-胺)和其他內部未受保護的氨基酸官能團區分開來。此外，捕捉-重排化學連接不涉及活化羧基，因此天然化學連接克服了常規片段縮合方法的外消旋化問題。然而，半胱氨酸殘基的極少存在(在蛋白中的豐度為1.4%)限制了上述NCL的效用。為解決此問題，人們廣泛地尋求著在其他氨基酸位的其他天然化學連接方法。到目前為止，近來開發的所有替代方法都遵循基于半胱氨酸的天然化學連接原理，其依賴硫-捕捉-重排策略。許多努力集中于將硫基引入天然氨基酸的β或Y-位。在類似半胱氨酸-天然化學連接之后，連接產物的硫基被除去，從而實現了在相應氨基酸處的連接。其他努力針對的是開發新的化學條件，以將半胱氨酸-NCL產物轉化為其他形式的氨基酸，如半胱氨酸的脫硫，以提供丙氨酸。所有這些方法提供了肽/蛋白連接的新方法，并已用于制備結構非常復雜的各種(糖)肽 / 蛋白(Offer, J. ；Boddy，C. N. C. ；Dawson, P. Ε. J. Am. Chem. Soc.， 2002,124,4642-4646, "Extending synthetic access to proteins with a removable acyl transfer auxiliary”)。然而，這些方法的實施需要復雜的化學或者非天然氨基酸的合成，因此，它們不像基于半胱氨酸的NCL那樣普遍使用。此外，這些方法除了對連接位處的半胱氨酸殘基之外還會影響其它未受保護的半胱氨酸殘基。尚未發現利用在其他氨基酸位用戶友好條件的化學選擇性連接。
發明內容
本發明涉及作為另一種天然化學連接(NCL)的通過產生天然肽連接來連接兩個肽的方法。公知的基于半胱氨酸的NCL依賴于使用在肽片段的N端的半胱氨酸殘基和作為另一肽片段的C端的硫酯來產生Xaa-Cys連接的肽。不同的是，本發明的方法使用在肽片段的N端的絲氨酸或蘇氨酸和作為另一肽片段的C端的芳基醛酯(例如水楊醛酯)來產生 Xaa-Ser或Xaa-Thr連接產物(Xaa表示任意氨基酸)，從而實現基于絲氨酸和蘇氨酸的天然化學連接。本發明的一個實施方式提供一種基于絲氨酸和蘇氨酸的天然化學連接的方法，所述方法的特征在于其使用未受保護的肽片段，不導致差向異構化、易于操作、轉化迅速和在連接位形成Xaa-Ser和Xaa-Thr形式的天然肽鍵。圖1說明的是通過使用C端水楊醛酯所示例的該kr/Thr天然化學連接的原理。第一步是在C端具有水楊醛酯的肽與具有N端絲氨酸或蘇氨酸殘基的另一肽片段的化學選擇性反應，以提供在連接位具有N，0-亞芐基縮醛部分的可分離中間體。無需純化，N，0-亞芐基縮醛中間體可以轉化為在連接位具有天然肽鍵的目標全長多肽產物。這兩步在同一燒瓶中進行，無需純化中間體。除水楊醛酯之外， 在C端的芳基酯可以擴展至其他芳香族或雜芳族系統，其中雜芳族系統中的雜原子是選自 N、0和S的至少一種原子。例如，水楊醛的苯環也可以由選自吡啶、嘧啶、噠嗪、吡咯、呋喃、 噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、異噁唑和噻唑的六元或五元(雜)芳環替換。當這些芳基酯被用在 C端時，偶聯產物在連接位具有相應的縮醛基團。本發明提供了一種將第一寡肽末端與第二寡肽末端或者將同一寡肽的兩端連接的適當方法，用于合成在連接位具有天然肽鍵的寡肽產物或環肽。第一寡肽包含C端水楊醛酯。第二寡肽包含N端絲氨酸或蘇氨酸。將第一和第二寡肽在反應溶液中混合，而不使用任何外部催化劑/試劑。在完成反應(在任何測試情況下為2 10小時)之后，除去溶齊U，并處理殘基以進行最后的轉化(少于10分鐘)，從而提供天然目標全長多肽。本發明的另一個方面針對的是一種寡肽中間體，所述寡肽中間體包含具有C端水楊醛酯的第一初始肽片段、具有絲氨酸或蘇氨酸的第二初始肽片段，和具有連接C片段和N 片段的N，0-亞芐基縮醛單元的加合物。N，0-亞芐基縮醛加合物迅速轉化為端對端連接第一和第二初始肽片段的肽鍵。此處所述的本發明具有高化學選擇性，無需保護用于偶聯兩個肽片段的任何氨基酸。本發明的另一個特征在于迅速偶聯兩個肽片段，甚至對于在C端位阻較大的氨基酸， 如纈氨酸、脯氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸而言亦如此，如圖3所示。這些β-支化的氨基酸在 C端使用時顯著地妨礙了偶聯過程，因此大部分已知的連接方法在這些氨基酸位點反應需要較長時間(>48小時)或者限于在C端位阻較小的氨基酸。在本發明的條件下，涉及這些受阻氨基酸的連接仍然有效而迅速，對于非常受阻的氨基酸也可以在小于5小時內獲得 100%的轉化。本發明的又一個方面針對的是一種使兩個肽片段結合從而以無差向異構化的方式在連接位產生天然肽鍵的方法。在常規肽偶聯條件下避免差向異構化是一項很大的挑戰。利用由絲氨酸和蘇氨酸的1，2-羥基-胺雙官能度形成酰胺鍵的亞胺-捕捉-酰基轉移不涉及活化C端末端的羧基，因此使外消旋化的傾向降至最低。本發明的一個突出方面在于提供一種天然化學連接方法，所述方法使用用戶友好的條件，無需任何復雜的化學反應條件和特別化學操作。本發明的方法易于操作，并且反應條件非常適于肽化學。Tam等公開了一種用于將C端乙醇醛肽與在N端含有半胱氨酸、蘇氨酸或絲氨酸殘基的另一肽連接以修飾假脯氨酸結構的方法(Liu，C. F. ；Tam, J. P. J. Am. Chem. Soc.， 1994,116,4149-4153, "Chemical ligation approach to form a peptide-bond between unprotected segments-concept and model studies，，)。利用該方法，通過連接兩個肽片段可制備具有假脯氨酸結構(噻唑烷或噁唑烷)的人造蛋白，以模仿在相應位置的含脯氨酸蛋白結構。然而，Tam法的局限性在于反應速率。該方法的確實現了很強的化學選擇性， 但是當在N端使用蘇氨酸或絲氨酸時連接極其緩慢(對于甘氨酸與絲氨酸之間的模型系統，45小時時的轉化率低于84% )。更重要的是，Tam法的局限性在于，由假脯氨酸向天然肽鍵的轉化尚未實現。這樣，連接產物含有非天然肽鍵。因此，Tam法不是天然化學連接， 不適合用來合成純天然肽序列的蛋白或多肽。本發明的方法促進了蛋白和長肽的化學合成。絲氨酸和蘇氨酸在蛋白中豐度共占據12. 7%的含量，幾乎是半胱氨酸的10倍，因此，基于絲氨酸和蘇氨酸的化學選擇性連接方法應該在合成肽化學和生物共軛化學中發現更多應用。其可以顯著降低中等大小(20 100個氨基酸)的多肽藥物的生產成本。許多肽藥物含有內部絲氨酸和蘇氨酸殘基。使用線性SPPS制備小肽片段(< 20個氨基酸)，然后將本發明的基于絲氨酸和蘇氨酸的化學連接應用于匯集合成一起，將潛在地促進這些肽藥物以較低成本的方式大規模生產。通過在同一初始肽上引入C端芳基醛酯和N端絲氨酸或蘇氨酸，本發明的方法也可用于制備環肽。 另外，本申請中所開發的方法將使N-連接糖蛋白易于用于化學合成，因為所有N-連接糖蛋白都具有絲氨酸或蘇氨酸殘基。此外，N端絲氨酸或蘇氨酸殘基可以通過標準recDNA手段表達為所關注的蛋白。利用此處所述的天然化學連接，其可與含有水楊醛酯的合成小分子或肽反應，以達到標記所關注的蛋白的目的，或產生“雜”蛋白絡合物。
圖1 (A)說明的是基于kr/Thr的天然化學連接的總體原理。
圖1⑶是本發明的方法的酰基轉移反應步驟的機理的化學式表達。圖2(A)說明的是本發明的方法的化學選擇性。圖2⑶是說明圖2 (A)所示的化學選擇性的LCMS譜圖。圖3說明的是使用位阻較大的氨基酸的基于絲氨酸/蘇氨酸的化學連接的范圍。圖4說明的是無差向異構化的連接進程。圖5是絲氨酸連接過程的LCMS圖。圖6是蘇氨酸連接過程的LCMS圖。圖7說明的是在一個燒瓶中的三組分連接，其用于由C至N端組裝多個片段。
具體實施例方式本發明提供一種將第一初始肽片段化學連接至第二初始肽片段的方法。該方法使用作為C端配偶體的芳基醛酯(例如水楊醛酯)和作為N端配偶體的絲氨酸或蘇氨酸以產生在連接位具有Xaa-Ser/Thr肽連接的較大的肽(Xaa表示任意氨基酸)。在該方法中，C端肽的芳基醛酯(例如水楊醛酯)在基于絲氨酸和蘇氨酸的天然化學連接的開發中至關重要。已有報道可使用C端乙醇醛酯肽與絲氨酸或蘇氨酸肽反應，但是反應速率極低(如，對于甘氨酸與絲氨酸之間的模型系統在45小時后轉化率低于 84% )。然而，在C端的如水楊醛酯等芳基醛酯顯著促進了偶聯步驟的反應速率，例如對于所有測試的氨基酸在少于5小時內實現了定量轉化。更重要的是，偶聯后生成的N，0-亞芐基縮醛在溫和條件(即，酸性條件)下很容易除去，從而在連接位提供天然肽鍵，如天然化學連接所實現的那樣。芳基醛酯可為0-酯、S-酯或Se-酯。偶聯步驟和除去步驟的反應性可以通過在水楊醛酯的苯環上引入如鹵素、烷基、烷氧基、酰胺、疊氮基和硝基等取代基而進一步調節。硝基的引入使得能夠在紫外光下除去N，0-亞芐基縮醛基團。C端水楊醛酯的苯環也可以被其他(雜)芳族系統替代，其中雜芳族系統中的雜原子是選自N、0和S 中的至少一種原子，所述雜芳族系統如為吡啶、嘧啶、噠嗪、批咯、呋喃、噻吩、咪唑、批唑、噁唑、異噁唑和噻唑等。在該方法中，N端肽具有絲氨酸或蘇氨酸殘基。它們可以以鹽的形式使用。絲氨酸和蘇氨酸在蛋白中的豐度一共占據12. 7 %，因此很容易在所關注的合成目標蛋白或肽中發現它們。本發明的方法實際上具有兩步。第一步涉及將具有絲氨酸和蘇氨酸的N端肽和具有水楊醛酯的C端肽在反應溶劑中混合。吡啶和乙酸(1 1，摩爾/摩爾)的混合物會提供最高收率。此處，N端絲氨酸或蘇氨酸的氨基與水楊醛酯的醛基可逆地反應從而形成亞胺，之后發生來自N端絲氨酸或蘇氨酸的α-羥基的環化。接下來，1，5 0 —N酰基轉移提供了穩定的N，0-亞芐基縮醛中間體(當在C端使用其他類型的芳基酯時，生成相應的縮醛中間體)。第二步涉及使用酸條件除去N，0-亞芐基縮醛基以形成天然肽鍵。此處，在通過凍干除去溶劑(吡啶/乙酸)之后，使用TFA/H20/iPr3SiH溶液混合物處理未經純化的N， 0-亞芐基縮醛中間體，以在少于5分鐘內提供天然肽鍵。該酸性條件常用在肽化學中。將如硝基等光反應性基團引至水楊醛酯的苯環上可以潛在地實現在紫外光下N，0-亞芐基縮醛的除去。該方法具有高度化學選擇性。連接反應在任何未受保護的氨基酸和如苯硫酚酯等其他反應性酰基供體的存在下進行。該方法具有兩步(圖1)。第一步涉及N端絲氨酸或蘇氨酸的氨基與C端水楊醛酯的醛基反應。如賴氨酸等其他親核試劑也可以與醛基反應，但是該反應是可逆的并無法提供穩定產物。該方法的偶聯步驟是經濟的，并且易于操作，而不使用任何外部試劑，并且在短時間內導致完全轉化。第二步的特征在于反應迅速、操作簡單并使用用戶友好的條件。這兩種反應條件都在肽化學中常用，因此與多肽和糖肽的大多數官能度是非常相容的。本發明的方法的特征在于，盡管是需要兩步反應序列，兩個肽片段的偶聯仍迅速并且有效，甚至對于在C端非常受阻的氨基酸，如纈氨酸、脯氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸而言亦如此，如圖3所示。這些β-支化的氨基酸在C端使用時可顯著地妨礙其他已知連接條件下的偶聯過程(例如，基于半胱氨酸的NCL需要48小時)，而在本發明的條件下，涉及這些受阻氨基酸的連接可以在少于5小時內完成。本發明的方法的另一特征在于基于義！·/!!!!·的天然化學連接與基于Cys的天然化學連接之間的正交性。用于基于半胱氨酸的天然化學連接法(Cys-NCL)的硫酯在本發明的條件下是穩定的。因此，可以將kr/Thr-NCL與Cys-NCL —起使用，以由N至C端的方向實現一罐三片段連接。實施例1作為模型研究，通過在標準酯形成條件下使用二環己基碳二亞胺將FmocAla-OH 與水楊醛偶聯來制備在C端具有水楊醛酯的FmocAla。用于kr/Thr NCL的典型程序如下 將 FmocAla-水楊酸酯(3. 8mg, 9. 15 μ mol)和絲氨酸芐基酉旨(2. 5mg, 10. 8 μ mol)以 0. 05M 的濃度在溶液(183 μ 1，吡啶/乙酸，1 1，摩爾/1摩爾)中混合。將該反應混合物在室溫攪拌并通過LCMS監控。30分鐘后，觀察到轉化率為80%的單一新產物，其對應于N，0-亞芐基縮醛加合物。反應在2小時內完成，提供了中間具有Ν，0-亞芐基縮醛的偶聯產物。N， 0-亞芐基縮醛加合物可以被分離。N，0-亞芐基加合物的NMR譜顯示為兩種化合物，其來自新生成的手性中心。(Fmoc =芴基甲氧基羰基，LCMS =液相色譜-質譜，NMR =核磁共振)在另一條路徑上，使來自以上偶聯的粗反應產物在通過凍干除去溶劑(吡啶/ 乙酸)之后直接進行下一步。在酸性條件(TFA/H20/ft~3SiH，94/5/1，體積/體積/體積， 1. Oml)下的處理于4分鐘內以定量轉化的方式平穩地將N，0-亞芐基縮醛加合物轉化為 “天然” Ala-Ser 二肽。通過 HPLC(C18，50-90%，MeCN(具有 0. 04% TFA)/H2O(具有 0. 05% TFA)，30 分鐘，流速為 16ml/ 分鐘)純化獲得 Fmoc-Ala-Ser-OBn 二肽(4. 2mg, 95% )0 該酸性條件在糖肽/糖蛋白合成中常用。兩步都迅速且干凈地進行，未檢測到任何明顯的副產物或水解產物。(TFA=三氟乙酸)實施例2本方法的顯著特征在于其化學選擇性。為證明化學選擇性，利用與上述相同的條件，將Ala-水楊醛酯與絲氨酸衍生物和未受保護的β-丙氨酸同時反應。此外，將Ala-水楊醛酯與絲氨酸衍生物和Ala-苯硫酚酯同時反應。反應通過LCMS監控并且反應產物通過 ESI (電噴霧質譜)確定。在這兩種情況中，都觀察到了作為N，0-亞芐基加合物的預期的單一產物(圖幻。苯硫醇酯是具有高反應性的酰基的供體。據報道其可直接與胺縮合從而提供酰胺鍵，并且苯硫醇酯易于水解。在本發明的條件下，苯硫醇酯在反應時間內是穩定的，并且不直接酰化氨基。這些結果也證明了親核的胺不妨礙連接過程。
β -支化氨基酸，如纈氨酸、脯氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸等，在化學連接中用在C端時被認作是很難處理的位點。本發明的基于絲氨酸的連接的范圍用偶聯有絲氨酸芐基酯衍生物的Fmoc-Val-水楊醛酯、Fmoc-Pro-水楊醛酯、Fmoc-Ile-水楊醛酯、Fmoc-Val-Thr-水楊醛酯進行研究。所有連接反應都以0. 05Μ的濃度進行，如實施例1中所述。反應在室溫攪拌并通過LCMS監控。所有連接都迅速、有效地進行，結果對于纈氨酸、脯氨酸和蘇氨酸，在少于5小時內實現了完全的定量轉化。例外的是，異亮氨酸與絲氨酸之間的連接非常緩慢 (圖5)。在除去上述反應中的溶劑后，接下來使殘余物經受TFA/H20/ift~3SiH條件處理。在 5分鐘內，獲得天然肽形式的連接產物(即，Val-Ser、Pro-Ser和Val-Thrler) (>95%)0實施例4使用與H-Thr-Phe-OEt 二肽偶聯的Fmoc-Val-水楊醛酯、Fmoc-Pro-水楊醛酯、 Fmoc-Ile-水楊醛酯、Fmoc-Val-Thr-水楊醛酯在基于蘇氨酸的化學連接中測試所有β-支化氨基酸(纈氨酸、脯氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸)。所有連接反應都通過兩步順序迅速、有效地進行，從而以高收率(> 92% )提供了天然肽形式的三肽或四肽(圖6)。實施例5利用二肽Fmoc-Val-Thr-水楊醛酯和HIer-OBn之間偶聯生成三肽 Fmoc-Val-Thr-Ser-O&i來研究外消旋化問題。利用常規肽偶聯程序單獨制備標準差向異構體Fmoc-Val-Thr (D)Ier-OBn作為參比化合物。如圖4所示，將獲自粗兩步連接反應混合物的產物(即，Fmoc-Val-Thr-Ser-OBn)與 Rnoc-Val-Thr(D)Ier-OBn 比較。如 LCMS (圖 4)所示，粗偶聯反應不含可檢測到的Fmoc-Val-Thr (D)Ier-Cffin的形成。因此，基于絲氨酸的化學連接不導致在連接位的差向異構化。實施例6該化學連接的能力還通過在單燒瓶同時進行kr-NCL和Cys-NCL的有次序的反應來證實。該方案涉及利用含水楊醛酯的未受保護的肽、具有在N端的絲氨酸和在C端的苯硫酚酯的未受保護的肽，和具有N端半胱氨酸的未受保護的肽。如下制備具有C端水楊醛酯的模型未受保護的肽使用Fmoc-Gly-NovaSyn TGT 樹脂和標準Fmoc氨基酸，利用自動固相肽合成器制備Fmoc-Arg (Phf) -Ala-Ser (t-Bu)-IIe-Thr (t-Bu)-Thr (t-Bu)-Ala-Asp (t-Bu)-Gly-OH。在完成該合成后，使用 TFE/CH2C12/ AcOH (1/8/1，體積/體積/體積)的混合物處理該樹脂，以獲得側鏈保護的肽的粗品。將該肽粗品(12mg,7. 5ymol)和水楊醛(3. 9 μ 1，37 μ mol)和 DCC (3. lmg, 15ymol)在無水氯仿 (1.0ml)中混合。在室溫攪拌該反應混合物2小時，并通過空氣氣流吹除溶劑。然后使用去保護混合物(TFA/H20/Ph0H，3. 3ml/136l·! l/160mg)處理殘余物。在室溫攪拌2小時后，通過空氣氣流吹除溶劑，然后通過乙醚沉淀出肽，之后通過HPLC純化獲得產物Fmoc-Arg-Ala -Ser-Ile-Thr-Thr-Ala-Asp-Gly-O-水楊醛酯(5.0mg，54% )。如下制備具有在N端的絲氨酸和在C端的苯硫酚酯的模型未受保護的肽利用 Fmoc-Gly-NovaSyn TGT樹脂和標準Fmoc氨基酸，使用自動固相肽合成器制備Bode r-Ala-Gln (Trt) -Lys (Boc) -Arg(Pbf) -His (Trt) -Phe-Gly-COOH。在完成該合成后，使用 TFE/CH2C12/ACOH(1/8/1，體積/體積/體積)的混合物處理該樹脂，以獲得側鏈保護的肽的粗品。將肽的粗品(2;3mg，12ymol)、丙氨酸苯硫酚酯(3. 9mg, 18 μ mol), EDC(3. 4 μ 1,19 μ mol)和 HOOBt (1. Omg, 6. 1 μ mol)在無水 TFE/ 氯仿(0. 3ml/0. 6ml)中混合。在室溫攪拌該反應混合物2小時，并通過空氣氣流吹除溶劑。然后使用去保護混合物(TFA/H20/W!0H/ IPr3SiH, 3. 3ml/136y l/160mg/60y 1)處理殘余物。在室溫攪拌2小時后，通過空氣氣流吹除溶劑，然后通過乙醚沉淀出肽，之后通過HPLC純化獲得產物H-kr-Ala-Gln-Lys-Arg-Hi s-Phe-Gly-Ala-SPh (7. Omg, 53% )。如下制備具有N端半胱氨酸的模型未受保護的肽利用Fm0C-Ser(fflU)-N0vaSyn
TGT樹脂和標準Fmoc氨基酸，使用自動固相肽合成器制備Boc-Cys (S-t-Bu) -His (Trt) -Cys (Acm)-Ser(t_Bu)-Thr-(t_Bu)-Cys(Acm)-Tyr(t_Bu)-Tyr (t_Bu)-His (Trt)-Lys (Boc)-Ser-OH0完成合成后，使用TFA/H20(3. 3ml/136yl)的混合物處理該樹脂。然后通過空氣氣流吹除溶劑，并通過乙醚沉淀出肽，之后通過HPLC純化以70%的收率獲得產物H-Cys (S-t-Bu)-His-Cys (Acm)-Ser-Thr-Cys(Acm)-Tyr-Tyr-His-Lys-Ser-OH0為實現單罐三片段連接，首先將Riioc-Arg-Ala-Ser-Ile-Thr-Thr-Ala-Asp-Gly-0-水楊酸酯(0. 6mg,0. 50 μ mol)和 H-Ser-Ala-Gln-Lys-Arg-His-Phe-Gly-Ala-SWi (0. 5m β，0.45μπιΟ1)在吡啶/乙酸(50μ 1，1 1，摩爾/摩爾)中混合。反應在室溫攪拌4小時。然后通過凍干除去溶劑。接下來，在室溫使用(TFA/H20/ft~3SiH，94/5/1，體積/體積/ 體積，0. 5ml)處理殘余物4分鐘。在通過凍干除去溶劑后，將H-Cys (S-t-Bu) -His-Cys (Ac m) -Ser-Thr-Cys (Acm) -Tyr-Tyr-His-Lys-Ser-OH (1. lmg,0. 70 μ mol)添加至容納有來自以 Ikr-NCL反應的粗產物的同一燒瓶中，然后添加Cys-NCL緩沖劑(pH = 7. 02，50 μ 1)。將反應混合物在室溫攪拌2小時。通過HPLC (C4，20-30%，MeCN(具有0. 04% TFA)/H2O (具有 0. 05% TFA)，30分鐘，流速為16ml/分鐘)純化粗反應混合物，以獲得三片段偶聯產物Fmo C-Arg-Ala-Ser-Ile-Thr-Thr-Ala-Asp-Gly-Ser-Ala-Gln-Lys-Arg-His-Phe-Gly-Ala-Cys -His-Cys (Acm) -Ser-Thr-Cys (Acm) -Tyr-Tyr-His-Lys-Ser-OH (1. Omg, 60% )(圖 7)。未受保護的賴氨酸、羧酸、精氨酸、組氨酸與芳基苯硫酚酯在kr-NCL條件下的相容性為該連接方案增加了很高的價值。Ser/Thr-NCL與Cys-NCL之間的正交性提供了一種指向由N至C端的多片段連接的新合成策略。實施例7本連接的方法也可以用于制備環肽。以與上述相似的方式由Boc-Ser-Ala-Gln( Trt) -Lys (Boc) -Arg (Pbf) -His (Trt) -Phe-Gly-COOH 和丙氨酸水楊醛酯制備模型肽 Hler-Ala-Gln-Lys-Arg-His-Phe-Gly-Ala-O- /K楊酸酯。將 H-Ser-Ala-Gln-Lys-Arg-His-Phe-Gly-Ala-O-水楊醛酯(0. 5mg,0. 45 μ mol)溶解在吡啶/乙酸(5. 0ml, 1 1，摩爾/摩爾) 中。將反應在室溫攪拌10小時。然后通過凍干除去溶劑。接下來，在室溫使用(TFA/H20/ Pr3SiH, 94/5/1，體積/體積/體積，0. 5ml, 4分鐘)處理殘余物4分鐘。然后通過HPLC純化粗反應混合物，以獲得環化的肽(0. 3mg,67% )。實施例8評價在C端的芳基酯的其他形式。在標準酯形成條件下使用二環己基碳二亞胺將 Fmoc-Ala-OH與4-羥基吡啶-3-甲醛、2-羥基-3-苯并呋喃甲醛、2-甲酰-3-羥基噻吩或 3-羥基-IH-吲哚-2-甲醛反應，以獲得相應的芳基酯。在與實施例1所述的相同條件下， 這些Fmoc-Ala-芳基酯與絲氨酸芐基酯和蘇氨酸甲基酯反應，以較高產率(75% 90% ) 獲得相應的在連接位具有縮醛基團的偶聯產物。
實施例9除了在C端使用水楊醛酯外，還在絲氨酸/蘇氨酸天然化學連接的條件下研究了 Fmoc-Ala-水楊醛硫酯和Fmoc-Ala-水楊醛硒酯。它們與絲氨酸芐基酯反應，分別以50% 和60%的收率獲得相應的偶聯N，S-亞芐基縮醛產物(50%)和N，Se-亞芐基縮醛產物。
權利要求
1.一種連接C端芳基醛酯和N端絲氨酸或蘇氨酸以產生天然肽鍵的方法，所述C端芳基醛酯和N端絲氨酸或蘇氨酸在同一初始肽上或者分別在不同的初始肽上，所述方法包括a)使初始肽反應以形成在連接位具有縮醛基團的縮醛中間體；b)將所述縮醛中間體轉化為具有所述天然肽鍵的所需肽或蛋白。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述初始肽是未受保護的初始肽。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述芳基醛酯具有六元或五元芳香環。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述芳基醛酯具有六元或五元雜芳環，所述雜芳環中的雜原子為選自N、0和S的至少一種原子。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述芳基醛酯是不具有取代基或具有至少一個取代基的水楊醛酯，所述縮醛基團是亞芐基縮醛基團。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述縮醛中間體是可分離的并且是穩定的。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述芳基醛酯是0-酯、S-酯或Se-酯。
8.一種縮醛中間體，所述縮醛中間體通過利用第一初始肽的C端芳基醛酯與第二初始肽的N端絲氨酸或蘇氨酸的反應形成縮醛基團而獲得，所述第一初始肽和所述第二初始肽為同一初始肽或不同初始肽。
9.如權利要求8所述的縮醛中間體，其中所述初始肽是未受保護的初始肽。
10.如權利要求8所述的縮醛中間體，其中所述芳基醛酯具有六元或五元芳香環。
11.如權利要求8所述的縮醛中間體，其中所述芳基醛酯具有六元或五元雜芳環，所述雜芳環中的雜原子為選自N、0和S的至少一種原子。
12.如權利要求8所述的縮醛中間體，其中所述芳基醛酯是不具有取代基或具有至少一個取代基的水楊醛酯，所述縮醛基團是亞芐基縮醛基團。
13.如權利要求8所述的縮醛中間體，其中所述縮醛中間體是可分離的并且是穩定的。
14.如權利要求8所述的縮醛中間體，其中所述芳基醛酯是0-酯、S-酯或Se-酯。
15.一種用于多片段肽連接的方法，其中第一初始肽、第二初始肽和第三初始肽在同一罐中依次反應以產生三片段偶聯肽，所述第一初始肽具有C端芳基醛酯，所述第二初始肽具有N端絲氨酸或蘇氨酸和C端硫酯，所述第三初始肽具有N端半胱氨酸。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述芳基醛酯具有六元或五元芳香環。
17.如權利要求15所述的方法，其中所述芳基醛酯具有六元或五元雜芳環，所述雜芳環中的雜原子為選自N、0和S的至少一種原子。
18.如權利要求15所述的方法，其中所述芳基醛酯是不具有取代基或具有至少一個取代基的水楊醛酯。
19.如權利要求15所述的方法，其中所述方法不具有中間純化步驟。
20.如權利要求15所述的方法，其中所述方法生成Xaa-Ser/Thr和Xaa-Cys形式的兩種內酰胺鍵，Xaa是任意氨基酸。
全文摘要
本發明公開了一種化學選擇性化學連接方法。該方法通過在連接位生成天然肽鍵(Xaa-Ser和Xaa-Thr)(Xaa表示任意氨基酸)而使兩個肽片段有效結合，以產生較大的多肽或蛋白。該方法需要兩步a)將一個或多個初始肽反應以形成在連接位具有縮醛基團的縮醛中間體；b)將所述縮醛中間體轉化為具有所述天然肽鍵的所需肽或蛋白。
文檔編號C07K1/107GK102482320SQ200980160726
公開日2012年5月30日 申請日期2009年8月12日 優先權日2009年8月12日
發明者李學臣 申請人:李學臣