異戊酰螺旋霉素iii的分離制備及其應用的制作方法

專利名稱：：異戊酰螺旋霉素iii的分離制備及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及抗生素的分離及其在抗感染性疾病中的應用，特別涉及異戊酰螺旋霉素單組分。
背景技術：
：可利霉素是利用基因工程技術研制的新型螺旋霉素衍生物，原命名為必特霉素，曾用名為生技霉素[專利號ZL97104440.6]。根據"中國藥品通用名稱命名原則"，經國家藥典委員會技術審核及研究確定，必特霉素的中文通用名稱更改為可利霉素，英文名稱為Calimycin。可利霉素為基因工程菌發酵產物，其化學結構是以4"_異戊酰螺旋霉素為主成分，包括4"-異戊酰螺旋霉素1、n、III，其次還含有約6種4"-位羥基酰基化的螺旋霉素，故其化學名統稱為4"酰化螺旋霉素。可利霉素主成分的化學結構如式(1)所示(1)其中R=H，COCH3、COCH2CH3;R'=COCH2CH(CH3)2、COCH2CH(CH3)2、COCH2CH(CH3)2可利霉素為16元環大環內酯類抗生素，其作用機制是通過與細菌核糖體結合而抑制其蛋白質合成。體外試驗結果表明，可利霉素對革蘭陽性菌、尤其對某些耐藥菌(如耐13-內酰胺金葡菌、耐紅霉素金葡菌等)有效，與同類藥無明顯的交叉耐藥性。同時它對支原體、衣原體有很好的抗菌活性，對部分革蘭陰性菌也有抗菌活性，且對弓形體、軍團菌等有良好抗菌活性和組織滲透性，還有潛在的免疫調節作用。其體內抗菌活性明顯優于體外[專利號ZL200310122420.9]。臨床研究表明，每日服用可利霉素片劑0.2_0.4g5-7天，可適用于治療化膿性鏈球菌引起的急性細菌性咽炎、急性化膿性扁桃體炎；敏感細菌引起的細菌性鼻竇炎、急性支氣管炎；肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌以及肺炎支原體所致的輕癥肺炎；支原體、衣原體引起的非淋球菌性尿道炎；敏感細菌引起的皮膚軟組織感染、牙周炎、中耳炎等感染性疾病。其總有效率為87.76%，可利霉素的不良反應率低。臨床研究證明，可利霉素是一個口服安全有效的抗生素。然而，由于可利霉素本身是多組分藥物，經過發酵得到的產品，在發酵過程產生的多種雜質，給組分定量測定帶來一定困難。目前建立的高效液相色譜峰高計算法，能將可利霉素樣品中幾對難分離的物質如異戊酰螺旋霉素II與(異)丁酰螺旋霉素III、(異)丁酰螺旋霉素II與丙酰螺旋霉素ni、丙酰螺旋霉素in與其前面的小組分、丙酰螺旋霉素ii與乙酰螺旋霉素in的分離度，達到中國藥典規定的1.5以上；而乙酰螺旋霉素III與其前面的小組分的分離度為1.2。目前建立的可利霉素片劑質控標準，系采用高效液相分析峰高計算法，測定可利霉素9個酰化螺旋霉素組分，其中異戊酰螺旋霉素(I+II+III)總含量應不低于65%;酰化螺旋霉素總含量應不低于80%。盡管按照目前的片劑生產工藝，可以得到產品組分比例可控、質量穩定可靠的可利霉素，然而，為了改進提取純化工藝、簡化質量檢測過程、提高臨床治療效果，有必要研制異戊酰螺旋霉素主要單一組分的優良制劑。尤其對于臨床危重病人或不宜口服用藥的病人，注射給藥見效迅速，更易接受。對于發酵產生的多組分抗生素，按照化學藥品質控方法很難控制其質量，而且任何細小的變化，均有可能導致物質基礎的變化，增加終產品質控標準的難度，引發不可預測的用藥不良反應。所以通過發酵產生的多組分抗生素注射劑迄今尚不多見。藥代動力學研究結果表明，可利霉素中具活性的有效組分主要為異戊酰螺旋霉素I、II、III。可利霉素進入體內后很快代謝為螺旋霉素，以母體藥物異戊酰螺旋霉素I、II、III和活性代謝物螺旋霉素I、II、III的AUC。—t總和計算，其口服絕對生物利用度平均為91.6%。文獻報道，螺旋霉素人體口服絕對生物利用度為30-40%[FrydmanAMetalJAntimicrobChemother.1988，22(supplB):93-103]。說明異戊酰螺旋霉素的結構明顯改善了活性成分螺旋霉素的生物利用度。單次服藥可利霉素消除較慢，T力e在23-27小時之間。本發明人驚訝的發現，可利霉素的主要組分異戊酰螺旋霉素III具有更加優良的抗感染活性，為此本發明提供異戊酰螺旋霉素III在制備抗感染藥物中的應用。
發明內容本發明的目的是提供一種異戊酰螺旋霉素III化合物及其藥物組合物，以及其在抗感染治療中的應用。本發明將異戊酰螺旋霉素III化合物制備成一種生產工藝簡化、質量標準易控，藥物效果優良的單組分抗生素。本發明的異戊酰螺旋霉素III化合物，具有以下結構(1)其中R=C0CH2CH3;R'=C0CH2CH(CH3)2本發明提供了異戊酰螺旋霉素III的結構確定；本發明還提供了異戊酰螺旋霉素III的制備方法，其包括以下步驟按照專利[ZL97104440.6]制備可利霉素，樣品粗分離，高效純化，樣品后處理等，優選采用高效液相色譜對可利霉素樣品進行分離，獲得異戊酰螺旋霉素III化合物純品。本發明提還提供了異戊酰螺旋霉素III抗細菌、抗支原體及衣原體活性測定。本發明還提供了用本發明的異戊酰螺旋霉素III作為藥物活性物質制備的藥物組合物，異戊酰螺旋霉素III在藥物組合物中所占重量百分比可以是0.01-99.99%，其余為藥學上可接受的載體。本發明的藥物組合物，以單位劑量形式存在，所述單位劑量形式是指制劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒，口服液的每瓶，注射劑的每支等。本發明的藥物組合物可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴齊U、貼劑。本發明的制劑，優選的是注射劑型，如水針，粉針，輸液等劑型。本發明的藥物組合物，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調味劑和濕潤劑，必要時可對片劑進行包衣。適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二烷基硫酸鈉。可通過混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進行反復混合可使活性物質分布在整個使用大量填充劑的那些組合物中。口服液體制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑，或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復配的干燥產品。這種液體制劑可含有常規的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常規的香味劑或著色劑。對于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發明的活性物質和無菌載體。根據載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過將活性物質溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然后密封。輔料例如一種局部麻醉齊U、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩定性，可在裝入小瓶以后將這種組合物冰凍，并在真空下將水除去。本發明的藥物組合物，在制備成藥劑時可選擇性的加入適合的藥學上可接受的載體，所述藥學上可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環糊精、e-環糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發明的藥物組合物在使用時根據病人的情況確定劑型和用法用量。本發明的優點和積極效果是，為制藥企業提供了生產工藝簡化、質量標準易控的異戊酰螺旋霉素III單一組分制品；為臨床危重病人或不宜口服給藥的病人提供了見效迅5速，易于接受的用藥劑型的可能性。圖1異戊酰螺旋霉素III的HPLC圖譜圖2異戊酰螺旋霉素III的高分辨質譜圖圖3異戊酰螺旋霉素III的核磁共振氫譜圖圖4異戊酰螺旋霉素III的核磁共振13C譜圖圖5化合物及對照藥對7株紅霉素耐藥肺炎鏈球菌的累積抑菌百分率其中_4_系列1可利毒素系列2異戊酰螺旋霉素III^_系列3紅霉素_^_系列4阿奇霉素_^_系歹1」5克拉毒素圖6化合物及對照藥對6株紅霉素耐藥化膿性鏈球菌的累積抑菌百分率其中_^_系列1可利霉素系列2異戊酰螺旋霉素III_^_系列3紅霉素-^~系列4阿奇霉素_^_系列5克拉霉素實施方案以下所列實施例只是為了幫助本領域技術人員更好地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。〈實施例1〉、異戊酰螺旋霉素III的分離制備可利霉素原料按照"一種利用基因工程技術制造生技霉素的方法"專利(專利號ZL97104440.6)制備得到。采用制備型高效液相色譜對可利霉素樣品進行分離，獲得異戊酰螺旋霉素III化合物純品。具體包括樣品粗分離，高效純化，樣品后處理等步驟。1)、粗分離首先從可利霉素樣品中對異戊酰螺旋霉素III組分進行粗分離，采用硅膠柱層析方法，以乙酸乙酯和甲醇作為洗脫劑，分別采用三倍柱體積乙酸乙酯甲醇(3:i)和三至五倍柱體積乙酸乙酯甲醇(i:i)進行洗脫，收集乙酸乙酯甲醇(i:i)部分，將收集液濃縮至干，獲得異戊酰螺旋霉素i、n、iii組分，用于進一步純化分離。2)、高效純化采用制備型高效液相色譜對粗分離樣品進行純化，以0DS作為色譜填料，用乙腈和醋酸氨緩沖液進行梯度洗脫，通過紫外檢測，記錄分離的紫外譜圖，并對異戊酰螺旋霉素III目標峰進行收集。具體色譜條件如下儀器工業級制備色譜。主要部件包括二元梯度泵，紫外檢測器和色譜工作站；色譜柱0DS制備色譜柱(70i.d.X380mm，10y);流動相:乙腈25%(A)，100mMMVVc水溶液75X(B)。流速260mL/min;進樣量10mL;進樣濃度0.5g/mL;檢測波長231nm;收集方式紫外觸發收集；按照異戊酰螺旋霉素III的保留時間(RT48.009)，收集樣品。異戊酰螺旋霉素III高壓液相色譜圖見(圖1)。3)、樣品后處理收集的異戊酰螺旋霉素III樣品，采用旋轉蒸發除去乙腈，然后用l倍量乙酸乙酯萃取，用旋轉蒸發除去萃取液中乙酸乙酯，得膏狀樣品。用石油醚重溶所得樣品，再用旋轉蒸發除去石油醚，獲得異戊酰螺旋霉素III白色粉末狀固體。〈實施例2>異戊酰螺旋霉素III的鑒定通過高分辨質譜(BrukerAPEXII，HR-SI-MS)確證所分離的化合物的分子量為982。異戊酰螺旋霉素IIi高分辨質譜圖見(圖2)，經核磁共振^和13C譜[BrukerAM500，溶劑CDC13，內標TMS(四甲基硅烷)]等分析確證，所分離的化合物的結構為異戊酰螺旋霉素III。異戊酰螺旋霉素III核磁共振^和"C譜見(圖3，4)，核磁共振^和"C譜數據見(表1，2)。表1異戊酰螺旋霉素111的核磁共振^譜數據(500MHz，CDC13)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>〈實施例3>異戊酰螺旋霉素111的抗菌活性測定64)化合物樣品化合物1可利霉素批號0812512，效價92.8%，沈陽同聯集團有限公司提供；化合物2異戊酰螺旋霉素III:批號0811153，效價91.9%，沈陽同聯集團有限公司提供紅霉素批號0706392，效價91.6%，中國藥品生物制品檢定所；阿奇霉素批號0421-9603，效價99.3%，中國藥品生物制品檢定所；克拉霉素批號0482-9901，效價90.4%，中國藥品生物制品檢定所。2)試驗菌株標準菌株肺炎鏈球菌ATCC49619;臨床分離革蘭陽性菌；紅霉素耐藥肺炎鏈球菌Str印tococcuspneumoniae(7株)；紅霉素耐藥化膿性鏈球菌Str印tococcuspyogenes(6株)。每株細菌在試驗前均經過平板轉活分純，以新鮮菌體用于試驗。每次實驗均用標準菌株作為敏感實驗質控菌；用不含抗菌藥物的平皿做為試驗菌株生長對照。3)培養基與孵育條件M-H(Mueller-Hinton)培養基(g/L):酸水解酪素17.5、牛肉浸骨粉2、淀粉1.5、瓊脂12。肺炎鏈球菌在血培養基(M-H培養基中加入5%脫纖維羊血制成)上，35t:5%C02環境((A培養箱)中孵育20-24h。化膿性鏈球菌在血培養基(M-H培養基中加入5X脫纖維羊血制成)上，35。C孵育20-24h。4)最低抑菌濃度(MIC)測定采用標準平皿二倍稀釋法。被試菌懸液用多點接種儀接種，每點接種量為104CFU。測定各抗菌藥物對各種致病菌的最低抑菌濃度。結果在所測定的紅霉素耐藥鏈球菌中，本發明的單組分化合物異戊酰螺旋霉素III對鏈球菌的可利霉素更加優越，MICs。和MIC9。分別為0.5和2mg/L，可利霉素為2和4mg/L，同時明顯強于對照藥紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素(表3)。對于7株紅霉素高耐藥肺炎鏈球菌(紅霉素MIC64->256mg/L)，阿奇霉素與克拉霉素也同樣表現為高度耐藥，而本發明化合物的MIC值在0.25-32mg/L，低于可利霉素2_4倍，低于對照藥64-1024倍(表4，圖5)。對于6株紅霉素低耐藥化膿性鏈球菌(紅霉素MIC=l-8mg/L)，本發明化合物的MIC5。值在0.5mg/L，低于可利霉素，優于對照藥紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素2-32倍(表3，5圖6)。表3.化合物及對照藥MIC結果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表4.化合物及對照藥對7株紅霉素耐藥肺炎鏈球菌MIC(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表5化合物及對照藥對6株紅霉素耐藥化膿性鏈球菌MlC(mg/]<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>B抗肺炎支原體和肺炎衣原體活性1.化合物化合物1可利霉素批號0812512，效價92.8%，沈陽同聯集團有限公司提供化合物2異戊酰螺旋霉素III:批號0811214，效價93.7%，沈陽同聯集團有限公司提供紅霉素批號0706392，效價91.6%，中國藥品生物制品檢定所阿奇霉素批號0421-9603，效價99.3%，中國藥品生物制品檢定所2.肺炎支原體菌種肺炎支原體菌種(ATCC-FH)。3.肺炎支原體培養基1.支原體瓊脂培養基支原體瓊脂基礎培養基(Oxoid公司，CM0401)2.84g，加入超純水80ml，12rC高壓15min滅菌，放置在50°C的水浴中，加入肺炎支原體添加劑(Oxoid，SR0059C)1瓶(20ml)，制備瓊脂培養皿。2.支原體PPLO肉湯培養基支原體PPLO肉湯基礎培養基(BD公司)2.lg，去離子純凈水70ml，12rC、15min高壓滅菌。冷卻至室溫后加入凍干肺炎支原體培養添加物(Oxoid添加物)1瓶(20ml無菌去離子水溶解)、無菌50%葡萄糖溶液2.Oml和0.4%的酚紅0.5ml。4.肺炎支原體培養肺炎支原體FH株接種于含20mlPPLO肉湯培養基，72h收獲用玻璃珠刮下，12000rpm，10min離心沉淀，棄上清液，沉淀用8ml新鮮PPLO肉湯培養基再懸，分裝8管凍存-8(TC冰箱。肺炎支原體FH接種物滴定上述制備肺炎支原體FH接種物培養使用PPLO肉湯培養基進行1:10、1:100和1:1000稀釋后涂布于肺炎支原體瓊脂平皿，37t:5%C02培養7天，在X40倍顯微鏡下計數。計算肺炎支原體滴度。5.肺炎支原體MIC的測定化合物以16mg/ml溶解于無水乙醇，用支原體PPLO肉湯培養基以IO倍比稀釋。肺炎支原體接種物加入上述系列稀釋的藥物管內，肺炎支原體FH最終接種濃度為8.25X105CFU/ml，接種后的培養管(包括對照管)于37。C培養并每天觀察顏色的變化。試驗設立(1)陽性對照稀釋后的肺炎支原體FH接種物(1.65X106CFU/ml)0.5ml+PPL0肉湯培養基0.5ml;(2)陰性對照PPLO肉湯培養基lml;(3)無水乙醇殺滅干擾對照稀釋后的肺炎支原體FH接種物(1.65X106CFU/ml)O.5ml，PPLO肉湯培養基O.5ml，最終濃度0.05%無水乙醇。當陽性對照管發生明顯的顏色改變(由紅色變黃色)時，而此時沒有發生顏色改變管的抗生素濃度為最低抑菌濃即MIC濃度。7.肺炎衣原體菌種肺炎衣原體菌種CWL-029(ATCCVR1310)。8.肺炎衣原體培養(1)細胞培養液10%胎牛血清(HyClone公司)Dulbecco，sMEM(Sigma公司)培養液。(2)肺炎衣原體培養液10%胎牛血清Dulbecco'sMEM培養液，含2yg/ml的放線菌酮(Sigma公司)。(3)BGMK(綠猴腎細胞，DiagnosticHYBRIDS公司)種植在96孔細胞培養板內，37°C，5%C02培養48小時成為單層細胞。9.肺炎衣原體MIC的測定化合物以16mg/ml溶解于無水乙醇，首先用衣原體培養液以10倍比稀釋，將濃度為3.3Xl(fcfu(包涵體形成單位)/lml肺炎衣原體接種物1:200稀釋，最終濃度為1.65X105cfu/lml，吸去96孔培養板內的細胞培養液，然后按0.lml/孔進行接種。菌種接種完畢離心96孔細胞培養板，使用Beckman-Coulter公司的J-6MC離心機，離心力X1500g，離心溫度35°C，離心時間60min。設立對照(1)陽性對照BGMK細胞，稀釋的肺炎衣原體CWL-029菌種。(2)陰性對照BGMK細胞，肺炎衣原體培養液。(3)藥物對照BGMK細胞，最高稀釋濃度(8yg/ml)的化合物，最終濃度0.05%無水乙醇。離心完畢后，吸去肺炎衣原體接種物，分別加入系列稀釋的化合物0.lml/孑L。37°C，5%C02培養72min。培養完畢，吸取抗生素藥物溶液，PBS(0.OIM，pH7.4)洗滌2次，100%無水乙醇固定15min。間接免疫熒光染色鑒定肺炎衣原體單克隆抗體，50iil/孔，37t:濕盒內溫育30min，然后洗板機洗板4次，再加入兔抗鼠熒光抗體(Sigma公司)，50y1/孔，同樣方法及12條件溫育及洗板。加入封片甘油，100iU/孔，在01ympusX71倒置熒光顯微鏡下觀察MIC的定義96孔試驗板中肺炎衣原體包涵體生長完全被抑制孔(全孔未發現熒光染色的包涵體)的最小抗生素稀釋濃度。10.結果在所測定的抗肺炎支原體活性中的異戊酰螺旋霉素III活性明顯強于可利霉素，并明顯優于對照藥。對肺炎衣原體的活性，異戊酰螺旋霉素III與可利霉素相當，優于紅霉素。表6化合物對肺炎支原體/衣原體活性(Pg/ml)菌號化合物l化合物2紅霉素阿奇霉素肺炎支原體0.1250.032>50.25肺炎衣原體0.0640.0640.50.064〈實施例四>異戊酰螺旋霉素III藥物制劑的制備本發明可以將異戊酰螺旋霉素III單組分作為活性成分，與藥學上可接收的載體制備成臨床可用的各種劑型。如注射劑分別將異戊酰螺旋霉素III(簡稱原料)100-500mg與溶劑己二酸18-90mg或枸櫞酸26-130mg或馬來酸14_70mg等摩爾混合均勻后溶解于l-5ml水中，可得到淡黃色澄明溶液，pH在4.6-5.6之間。再加入甘露醇30_150mg作為凍干支撐劑，低溫快速冷凍9h后，冷凍干燥，獲得淡黃色疏松塊狀物，使用前用2-10ml無菌水溶解。權利要求含有異戊酰螺旋霉素III化合物的藥物組合物，所述異戊酰螺旋霉素III化合物具有以下結構其中R＝COCH2CH3，R′＝COCH2CH(CH3)2FSA00000027723900011.tif2.權利要求1所述藥物組合物的制備方法，包括將異戊酰螺旋霉素III化合物和藥學上可接受的載體混合的步驟。3.權利要求2所述的制備方法，其中異戊酰螺旋霉素III化合物的分離包括樣品粗分離，高效純化，樣品后處理等步驟。4.權利要求2所述的制備方法，其中分離采用高效液相色譜對可利霉素樣品進行分離，獲得異戊酰螺旋霉素III化合物純品的步驟。5.權利要求1所述藥物組合物及其藥物活性物質異戊酰螺旋霉素III化合物在制備抗感染藥物中的應用。全文摘要本發明涉及抗生素的分離及其在抗感染性疾病中的應用，特別涉及異戊酰螺旋霉素III單組分化合物；經樣品粗分離、高效純化、樣品后處理等，采用高效液相色譜對可利霉素樣品進行分離，獲得異戊酰螺旋霉素III化合物純品；生物學試驗結果表明，所說組分III化合物的抗菌活性優于可利霉素，明顯優于對照組，其為研制臨床有效的異戊酰螺旋霉素III單組分抗生素奠定了基礎。文檔編號C07H1/06GK101773510SQ20101011976公開日2010年7月14日申請日期2010年3月9日優先權日2010年3月9日發明者姜洋,張海平,徐霈名,梁鑫淼,郝玉有,金郁申請人:沈陽同聯集團有限公司