專利名稱：富硒靈芝中硒蛋白的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質的制備方法。
背景技術：
硒具有許多生物學功能，人體的低硒狀態及硒的營養狀況與關節炎、癌癥、心血管 病、白內障、膽汁郁積、克羅恩氏病、嬰兒猝死綜合癥、囊腫性纖維化、糖尿病、甲狀腺腫、免 疫缺陷、大骨節病、克山病、淋巴細胞性貧血、肌肉萎縮癥、中風和潰瘍性結腸炎等40余種 疾病的發病率密切相關。而靈芝自古被譽為延年益壽之佳品，具有多種生物學功能(黃偉 光等，1993)，然而正常靈芝菌中有機硒含量較低，如果在富含無機硒的培養基中接入靈芝 菌種，利用靈芝菌的富硒能力將無機硒轉化為有機硒，并使其富集較高含量的有機硒(控 制在人體安全吸收范圍內)，這種靈芝即為富硒靈芝，富硒靈芝融靈芝和有機硒之長，其藥 用價值更高。因此開發富硒靈芝將具有廣闊的應用前景和極高的社會、經濟效益，其中富硒 靈芝中硒蛋白作為有效成分，被作為主要的研究對象，現有富硒靈芝中硒蛋白的制備方法 多是以富硒靈芝為原料，用堿提的方法得到堿溶性蛋白，然后對堿溶性蛋白進行純化來制 備硒蛋白，但是該方法所得到的硒蛋白中硒含量僅為3mg/g左右，且采用SDS-PAGE檢驗硒 蛋白的純度，所得到的電泳圖不是單一條帶，純度較低，極大的限制了硒蛋白的應用。
發明內容
本發明的目的是為了解決現有方法得到的硒蛋白純度低的問題，而提供了富硒靈 芝中硒蛋白的制備方法。本發明富硒靈芝中硒蛋白的制備方法按照以下步驟進行一、l(Tl5g的富硒靈芝 子實體浸泡于去離子水中，在(Tl0°c的條件下攪拌7 10小時，然后抽濾得到濾液A，用去離 子水清洗抽濾后的殘渣得到濾液B，將濾液A和濾液B混合得到混合液，再向混合液中加入 醋酸至PH為4. (T4. 5，而后加入占混合液質量百分比為20% 30%的硫酸銨，在3飛。C的條件 下靜置10 14小時，而后在450(T5500r/min的條件下離心15 25min去沉淀，然后向離心上 清液中加入占離心上清液質量百分比為70% 90%的硫酸銨，在3飛。C的條件下靜置1(T14小 時，而后在450(T5500r/min的條件下離心15 25min，將離心后的沉淀加入10(T200mL濃度 為0. 05mol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液混合，再經過孔徑為0. 22 y m的微孔濾膜過濾 后，濾液用截留分子量為3000的膜進行超濾過濾，重復超濾過濾4飛次得到蛋白質溶液，蛋 白質溶液再經真空冷凍干燥，即得到富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白；二、廣10mg的富硒靈 芝子實體水溶性粗蛋白和lmL的濃度為0. 05mol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液混合，然 后在1100(Tl300(k的條件下離心2(T30min，離心后的上清液經孔徑為0. 22 y m的膜過濾 得到濾液；三、將2mL步驟二得到的濾液放入到葡聚糖凝膠柱中，在流速為lmL/min、檢測波 長為280nm的條件下進行洗脫，洗脫液是濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液， 收集抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白I ；四、將2mL富硒靈 芝子實體水溶性粗蛋白I加入到陰離子交換層析柱中，然后在流速為lmL/min、檢測波長為280nm的條件下進行線形梯度洗脫，收集抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝子實體 水溶性粗蛋白II ；五、將2mL富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白II加入到疏水層析柱中，在流速 為0. 5^1. 5mL/min、檢測波長為280nm的條件下進行線性梯度洗脫，收集抗氧化活性的蛋白 洗脫液，即得到富硒靈芝中的硒蛋白。本發明以富硒靈芝子實體為原料，首先制備水溶性粗蛋白，并進一步通過硫酸銨 沉淀蛋白、葡聚糖凝膠層析、陰離子交換層析、疏水層析對水溶性粗蛋白進行純化，即制備 得到硒含量為6mg/g左右的硒蛋白，與現有方法制備得到的硒蛋白相比較，本發明方法制 備得到的硒蛋白中硒含量高，同時采用凝膠過濾法檢驗本發明制備得到的硒蛋白的純度， 洗脫曲線呈現單一蛋白峰，本發明制備得到的硒蛋白純度好。
圖1為具體實施方式
十一得到的硒蛋白凝膠過濾層析圖，圖2中為具體實施方式
十一得到的硒蛋白對羥自由基(H0* )和超氧自由基(02-* )的清除活性的回歸方程曲線 圖，圖中■表示羥自由基的回歸方程曲線表亍超氧自由基的回歸方程曲。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的 任意組合。
具體實施方式
一本實施方式富硒靈芝中硒蛋白的制備方法按照以下步驟進行 一、l(Tl5g的富硒靈芝子實體浸泡于去離子水中，在(T10°C的條件下攪拌7 10小時，然后 抽濾得到濾液A，用去離子水清洗抽濾后的殘渣得到濾液B，將濾液A和濾液B混合得到混 合液，再向混合液中加入醋酸至PH為4. (T4. 5，而后加入占混合液質量百分比為209^30% 的硫酸銨，在3 5°C的條件下靜置10 14小時，而后在450(T5500r/min的條件下離心 15 25min去沉淀，然后向離心上清液中加入占離心上清液質量百分比為70% 90%的硫酸 銨，在3 5°C的條件下靜置10 14小時，而后在450(T5500r/min的條件下離心15 25min，將 離心后的沉淀加入10(T200mL濃度為0. 05mol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液混合，再經 過孔徑為0. 22 y m的微孔濾膜過濾后，濾液用截留分子量為3000的膜進行超濾過濾，重復 超濾過濾4飛次得到蛋白質溶液，蛋白質溶液再經真空冷凍干燥，即得到富硒靈芝子實體 水溶性粗蛋白；二、廣10mg的富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白和lmL的濃度為0. 05mol/L、pH 為8. 0的Tris - HC1緩沖液混合，然后在11000 13000穿的條件下離心2(T30min，離心后的 上清液經孔徑為0. 22 pm的膜過濾得到濾液；三、將2mL步驟二得到的濾液放入到葡聚糖凝 膠柱中，在流速為lmL/min、檢測波長為280nm的條件下進行洗脫，洗脫液是濃度為50mmol/ L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，收集抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝子實體 水溶性粗蛋白I ；四、將2mL富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白I加入到陰離子交換層析柱中， 然后在流速為lmL/min、檢測波長為280nm的條件下進行線形梯度洗脫，收集抗氧化活性的 蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白II ；五、將2mL富硒靈芝子實體水溶性粗 蛋白II加入到疏水層析柱中，在流速為0. 5^1. 5mL/min、檢測波長為280nm的條件下進行線 性梯度洗脫，收集抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝中的硒蛋白。本實施方式步驟一中富硒靈芝子實體由菌種培育得到，具體步驟如下在栽培料中，添加亞硒酸鈉，通過靈芝菌在生長過程中對無機硒的吸收，富集，然后轉化為含有機態 硒的生物富硒靈芝子實體。采集的富硒靈芝子實體，測定其含硒量為72. 44y g/g，用自來水 洗凈，雙重蒸餾水沖淋，切片，冷凍干燥粉碎制成實驗樣品，冷凍保藏備用。本實施方式步驟一中攪拌采用電動攪拌機進行。本實施方式步驟三中葡聚糖凝膠柱在使用前用濃度為50mmol/L、pH為8. 0的 Tris - HC1緩沖液平衡后再使用，其中葡聚糖凝膠柱采用的是S印hadexG-75葡聚糖凝膠。本實施方式步驟四中陰離子交換層析柱在使用前用濃度為50mmol/L、pH為8. 0的 Tris-HCl緩沖液平衡后再使用，其中陰離子交換層析柱采用的是Mono-Q強陰離子交換樹 脂。本實施方式步驟五中疏水層析柱在使用前用濃度為50mmol/L的硫酸銨-Tris -HC1溶液平衡后使用，其中硫酸銨-Tris - HC1溶液中溶質是濃度為0. 5mol/L硫酸銨，溶劑 是濃度為0. 05mol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，疏水層析柱采用的是PhenylSuperose 樹脂。本實施方式步驟三、步驟四、步驟五中收集含有抗氧化活性的蛋白洗脫液方法均 為用洗脫液洗脫時，每個試管3飛mL的洗脫液(含有蛋白的洗脫液)，測定每個蛋白峰在相 同濃度下的抗氧化活性，收集具有最高抗氧化活性的洗脫液，即得到了具有抗氧化活性的 硒蛋白。本實施方式步驟五中收集抗氧化活性的蛋白洗脫液可經過進一步濃縮或者干燥 得到硒蛋白固形物。對本實施方式制備得到的硒蛋白的結合離子進行測定，具體內容為用電感偶 合等離子體發射光譜法(ICP-AES)(莫定琪等，1999年)測定了該硒蛋白中的硒(Se)、鉻 (Cr)、錳(Mn)、鐵(Fe)、銅(Cu)、鋅(Zn)、鉀(K)、鈣(Ca)、鎂(Mg)、鈷(Co)、鎳(Ni)、鋇(Ba)、 鍶(Sr)、鉬(Mo)、鍺(Ge)、砷(As)等16種元素的含量；檢測結果為在所測定的16種金屬元 素中，該硒蛋白只與硒元素(Se )結合，結合量為6mg/g左右。對本實施方式制備得到的硒蛋白進行羥自由基(H0 )和超氧自由基(02_ ) 的清除活性測定，具體內容如下采用順磁共振自旋捕集技術(EPR)檢測本實施方式 制備得到的硒蛋白的羥自由基和超氧自由基的清除活性，研究結果顯示，該硒蛋白具 有很強的H0*和02-*清除活性，清除率與硒蛋白之間存在劑量依賴關系。而且對 02_ 和的清除率與其濃度之間存在一定的對數回歸關系。對于H0 而言，該回 歸方程為Y=-0. 0001X2+0. 2187X - 1. 0420，R2=0. 9970 ；對于02- 而言，該回歸方程為 Y=-0. 0001X2+0. 2417X+0. 7317，R2=0. 9981。即，清除反應體系產生的 50% 的 H0 和 02_ 需 要的該硒蛋白的濃度分別為264. 15 u g/mL和218. 03 u g/mL。本實施方式以富硒靈芝子實體為原料，首先制備水溶性粗蛋白，并進一步通過硫 酸銨沉淀蛋白、葡聚糖凝膠層析、陰離子交換層析、疏水層析對水溶性粗進行純化，即制備 得到硒含量為6mg/g左右的硒蛋白，現有方法制備得到的硒蛋白相比較，本實施方式制備 得到的硒蛋白中硒含量高，同時采用凝膠過濾層析檢驗本實施方式制備得到的硒蛋白的純 度，洗脫曲線呈現單一蛋白峰，本實施方式制備得到的硒蛋白純度好。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中12 14g的富 硒靈芝子實體浸泡于去離子水中，在2 8°C的條件下攪拌8、小時。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中13g的富硒 靈芝子實體浸泡于去離子水中，在5°C的條件下攪拌8. 5小時。其它步驟及參數與具體實施 方式一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是步驟一中占 混合液質量百分比為25%的硫酸銨，在4°C的條件下靜置12小時。其它步驟及參數與具體 實施方式一至三之一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同的是步驟一中向 離心上清液中加入占離心上清液質量百分比為80%的硫酸銨，在4°C的條件下靜置12小時。 其它步驟及參數與具體實施方式
一至四之一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同的是步驟一中重 復超濾過濾5次。其它步驟及參數與具體實施方式
一至五之一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一至六之一不同的是步驟一中冷 凍干燥條件為絕對氣壓為20Pa，冷阱溫度為_55°C，樣品厚度為l(T24mm。其它步驟及參 數與具體實施方式
一六之一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一至七之一不同的是步驟二中在 12000g的條件下離心25min。其它步驟及參數與具體實施方式
一至七之一相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一至八之一不同的是步驟四中線 性梯度洗脫時間為40min，洗脫液A是濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，洗 脫液B是濃度為Imol/LNaCl-Tris - HC1溶液，線性梯度洗脫設定的程序為09Tl00%B，其中 洗脫液B中NaCl為溶質，濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液為溶液。其它步 驟及參數與具體實施方式
一至八之一相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
一至九之一不同的是步驟五中線 性梯度洗脫時間為40min，洗脫液C是濃度為0. 5mol/L的硫酸銨Tris - HC1溶液，洗脫液D 是濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，線性梯度設定的程序為1009T0%D，其 中洗脫液C中硫酸銨為溶質，Tris - HC1緩沖液為溶液。其它步驟及參數與具體實施方式
一至九之一相同。
具體實施方式
十一本實施方式富硒靈芝中硒蛋白的制備方法按照以下步驟進 行一、10. 36g的富硒靈芝子實體浸泡于去離子水中，在5°C的條件下攪拌8小時，然后抽 濾得到濾液A，用去離子水清洗抽濾后的殘渣得到濾液B，將濾液A和濾液B混合得到混合 液，再向混合液中加入醋酸至PH為4. 3，而后加入占混合液質量百分比為25%的硫酸銨，在 3 5°C的條件下靜置13小時，而后在5000r/min的條件下離心20min去沉淀，然后向離心 上清液中加入占離心上清液質量百分比為80%的硫酸銨，在4°C的條件下靜置12小時，而 后在5000r/min的條件下離心20min，將離心后的沉淀加入150mL濃度為0. 05mol/L、pH為 8. 0的Tris - HC1緩沖液混合，再經過孔徑為0. 22 y m的微孔濾膜過濾后，濾液用截留分子 量為3000的膜進行超濾過濾，重復超濾過濾5次得到蛋白質溶液，蛋白質溶液再經真空冷 凍干燥，即得到富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白；二、8mg的富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白和 lmL的濃度為0. 05mol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液混合，然后在1200Q§"的條件下離 心25min，離心后的上清液經孔徑為0. 22 y m的膜過濾得到濾液；三、將2mL步驟二得到的濾液放入到葡聚糖凝膠柱中，在流速為lmL/min、檢測波長為280nm的條件下進行洗脫，洗 脫液是濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，收集含有抗氧化活性的蛋白洗脫 液，即得到富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白I ；四、將2mL富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白I加 入到陰離子交換層析柱中，然后在流速為lmL/min、檢測波長為280nm的條件下進行線形梯 度洗脫，收集含有抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白II ’五、 將2mL富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白II加入到疏水層析柱中，在流速為lml/min、檢測波長 為280nm的條件下進行線性梯度洗脫，收集含有抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈 芝中的硒蛋白。本實施方式步驟一中攪拌采用電動攪拌機進行。本實施方式步驟三中葡聚糖凝膠柱在使用前用濃度為50mmol/L、pH為8. 0的 Tris - HC1緩沖液平衡后再使用，其中葡聚糖凝膠柱采用的是S印hadexG-75葡聚糖凝膠。本實施方式步驟四中陰離子交換層析柱在使用前用濃度為50mmol/L、pH為8. 0的 Tris-HCl緩沖液平衡后再使用，其中陰離子交換層析柱采用的是Mono-Q強陰離子交換樹 脂。本實施方式步驟五中疏水層析柱在使用前用濃度為50mmol/L的硫酸銨-Tris -HC1溶液平衡后使用，其中硫酸銨-Tris - HC1溶液中溶質是濃度為0. 5mol/L硫酸銨，溶劑 是濃度為0. 05mol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，疏水層析柱采用的是PhenylSuperose 樹脂。本實施方式步驟三、步驟四、步驟五中收集含有抗氧化活性的蛋白洗脫液方法均 為用洗脫液洗脫時，每個試管5mL的洗脫液(含有蛋白的洗脫液)，測定每個蛋白峰在相同 濃度下的抗氧化活性，收集具有最高抗氧化活性的洗脫液，即得到了含有抗氧化活性的洗 脫液。本實施方式步驟四中線性梯度洗脫時間為40min，洗脫液A是濃度為50mmol/L、 pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，洗脫液B是濃度為Imol/LNaCl-Tris - HC1溶液，線性梯度 洗脫設定的程序為09Tl00%B，其中洗脫液B中NaCl為溶質，濃度為50mmol/L、pH為8. 0的 Tris-HCl緩沖液為溶液。本實施方式步驟五中線性梯度洗脫時間為40min，洗脫液C是濃度為0. 5mol/L的 硫酸銨Tris - HC1溶液，洗脫液D是濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，線性 梯度設定的程序為1009T0%D，其中洗脫液C中硫酸銨為溶質，Tris - HC1緩沖液為溶液。采用凝膠過濾層析檢驗本實施方式制備得到的硒蛋白的純度，檢測結果如圖1所 示，圖1中為單一蛋白峰，由此可知，本實施方式制備得到的硒蛋白純度好。對本實施方式制備得到的硒蛋白進行結合離子測定和抗氧化活性測定，具體內容 如下
1、結合離子測定用電感偶合等離子體發射光譜法(ICP-AES)(莫定琪等，1999年)測 定了該硒蛋白中的硒(Se)、鉻(Cr)、錳(Mn)、鐵(Fe)、銅(Cu)、鋅(Zn)、鉀(K)、鈣(Ca)、鎂 (Mg)、鈷(Co)、鎳(Ni)、鋇(Ba)、鍶(Sr)、鉬(Mo)、鍺(Ge)、砷(As)等16種元素的含量；檢測 結果為在所測定的16種金屬元素中，該硒蛋白只與硒元素(Se)結合，結合量為5. 98mg/g。2、羥自由基(H0 )和超氧自由基(02- )的清除活性
具體操作為用Fenton體系產生H0 ，分別取5 u L0. 5mol/LDMP0,5 u L試樣或PBS (磷酸緩沖液)、5 y L4mmol/LDETAPAC(二乙三胺五乙酸)、5 y L0. lmmol/LFeS04混合均勻后，加 A 5 u L0. 0125%H202，120s后即刻采用EPR測量，中心磁場強度336. 5mT,響應時間0. ls，調 制幅度0. 2mT,掃場寬度10. OmT,掃描時間2min，微波功率10. Omff,調制頻率9. 44GHz，試樣 對HO 的清除率如公式(2-3)所示 其中&-體系中加入試樣前EPR圖譜中第二個峰的峰高；
hx-體系中加入試樣后EPR圖譜中第二個峰的峰高。超氧陰離子(02_ )的產生和清除用次黃嘌呤(HPX)-黃嘌呤氧化酶(X0D)體 系產生(V (Finkelsteinete7.，1980；Gradyete7.，1989)，分別取 5ii LI. Omol/LDMPO、 5 u L6mmol/LHPX,5 u L4mmol/LDETAPAC 禾口 5 ii L i式樣或 PBS 混合均勾后，力口入 5 ii L50mU/ mLXOD, 80s后即刻采用EPR測量，中心磁場強度336. 3mT,響應時間0. ls，調制幅度 0. 079mT,掃場寬度5. OmT,掃描時間2min,微波功率10. Omff,調制頻率9. 44GHz，試樣對 02_ 的清除率計算方法同上對H0 的清除率，不同的是和hx分別為體系加入試樣前后 EPR圖譜中第一個峰的峰高。檢測結果顯示，該硒蛋白具有很強的H0 和02_ 清除活性，清除率與硒蛋白之間 存在劑量依賴關系。而且對02_的清除率與其濃度之間存在一定的對數回歸關 系。對于H0 而言，該回歸方程為Y=-0. 0001X2+0. 2187X- 1. 0420，R2=0. 9970，如圖2所示； 對于02- 而言，該回歸方程為Y=-0. 0001X2+0. 2417X+0. 7317，R2=0. 9981，如圖2所示。即 清除反應體系產生的50%的H0 和02_ 需要的該硒蛋白的濃度分別為264. 15 u g/mL和 218. 03y g/mL。
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權利要求
富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于富硒靈芝中硒蛋白的制備方法按照以下步驟進行一、10~15g的富硒靈芝子實體浸泡于去離子水中，在0~10℃的條件下攪拌7~10小時，然后抽濾得到濾液A，用去離子水清洗抽濾后的殘渣得到濾液B，將濾液A和濾液B混合得到混合液，再向混合液中加入醋酸至pH為4.0~4.5，而后加入占混合液質量百分比為20%~30%的硫酸銨，在3~5℃的條件下靜置10~14小時，而后在4500~5500r/min的條件下離心15~25min去沉淀，然后向離心上清液中加入占離心上清液質量百分比為70%~90%的硫酸銨，在3~5℃的條件下靜置10~14小時，而后在4500~5500r/min的條件下離心15~25min，將離心后的沉淀加入100~200 mL濃度為0.05mol/L、pH 為8.0的 Tris–HCl緩沖液混合，再經過孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾后，濾液用截留分子量為3000的膜進行超濾過濾，重復超濾過濾4~6次得到蛋白質溶液，蛋白質溶液再經真空冷凍干燥，即得到富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白；二、1~10mg的富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白和1mL的濃度為0.05mol/L、pH 為8.0的 Tris–HCl緩沖液混合，然后在11000~13000g的條件下離心20~30min，離心后的上清液經孔徑為0.22μm的膜過濾得到濾液；三、將2mL步驟二得到的濾液放入到葡聚糖凝膠柱中，在流速為1 mL/min、檢測波長為280 nm的條件下進行洗脫，洗脫液是濃度為50mmol/L、pH為8.0的Tris–HCl緩沖液，收集抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白Ⅰ；四、將2mL富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白Ⅰ加入到陰離子交換層析柱中，然后在流速為1mL/min、檢測波長為280nm的條件下進行線形梯度洗脫，收集抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白Ⅱ；五、將2mL富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白Ⅱ加入到疏水層析柱中，在流速為0.5~1.5mL/min、檢測波長為280 nm的條件下進行線性梯度洗脫，收集抗氧化活性的蛋白洗脫液，即得到富硒靈芝中的硒蛋白。
2.根據權利要求1所述的富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于步驟一中12 14g 的富硒靈芝子實體浸泡于去離子水中，在2 8°C的條件下攪拌8、小時。
3.根據權利要求1或2所述的富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于步驟一中占 混合液質量百分比為25%的硫酸銨，在4°C的條件下靜置12小時。
4.根據權利要求3所述的富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于步驟一中向離心 上清液中加入占離心上清液質量百分比為80%的硫酸銨，在4°C的條件下靜置12小時。
5.根據權利要求1、2或4所述的富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于步驟一中 重復超濾過濾5次。
6.根據權利要求5所述的富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于步驟一中冷凍干 燥條件為絕對氣壓為20Pa，冷阱溫度為_55°C，樣品厚度為l(T24mm。
7.根據權利要求1、2、4或6所述的富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于步驟二 中在12000g的條件下離心25min。
8.根據權利要求7所述的富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于步驟四中線性梯 度洗脫時間為40min，洗脫液A是濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，洗脫液 B是濃度為Imol/LNaCl-Tris - HC1溶液，線性梯度洗脫設定的程序為09Tl00%B，其中洗脫 液B中NaCl為溶質，濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液為溶液。
9.根據權利要求1、2、4、6或8所述的富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，其特征在于步 驟五中線性梯度洗脫時間為40min，洗脫液C是濃度為0. 5mol/L的硫酸銨Tris - HC1溶 液，洗脫液D是濃度為50mmol/L、pH為8. 0的Tris - HC1緩沖液，線性梯度設定的程序為1009T0%D，其中洗脫液C中硫酸銨為溶質，Tris - HC1緩沖液為溶液。
全文摘要
富硒靈芝中硒蛋白的制備方法，它涉及一種蛋白質的制備方法。本發明解決了現有方法得到的硒蛋白純度低的問題。方法一、超濾、硫酸銨沉淀制備富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白；二、富硒靈芝子實體水溶性粗蛋白和Tris–HCl緩沖液混合，過濾；三、用葡聚糖凝膠柱進行分離純化；四、用陰離子交換層析柱進行分離純化；五、用疏水層析柱進行分離純化即得到富硒靈芝中的硒蛋白。本發明制備得到硒蛋白中硒含量為6mg/g左右，與現有方法制備得到的硒蛋白相比較，本發明方法制備得到的硒蛋白中硒含量高，同時采用凝膠過濾法檢驗本實施方式制備得到的硒蛋白的純度，洗脫曲線呈現單一蛋白峰，本發明制備得到的硒蛋白純度好。
文檔編號C07K1/20GK101851269SQ20101017911
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月21日 優先權日2010年5月21日
發明者杜明, 胡小松, 趙廣華 申請人:哈爾濱工業大學