專利名稱：一種人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物制備方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，公開一種融合表達且可酸水解釋放單體肽的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物基因串聯體及其工程菌的構建、串聯體的融合表達、單體肽的制備方法及促小腸絨毛生長活性檢測。
背景技術：
人胰高血糖素樣肽-2(Glucag0n-like P印tide-2，GLP-2)屬于腸道產生的胰高血糖素原衍生肽(Proglucagon-derived Peptide, P⑶P)家族成員之一，是一條由33個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，多肽的羧基末端為天冬氨酸。GLP-2是腸上皮特異性生長因子，具有腸道特異性及更強的促生長作用，促進腸黏膜生長、抑制腸上皮細胞和隱窩細胞凋亡等生物活性，研究發現其可以治療或改善胃腸外營養依賴性短腸炎、炎性腸病、骨質疏松、腸粘膜損傷等炎癥。由于天然的GLP-2易被二酰肽肽酶IV (Depiptidyl Peptidase IV，DPP- IV )降解而失去活性，所以近年來GLP-2的類似物的研究層出不窮，如NPS公司研發的一種耐DPP IV降解的GLP-2類似物Teduglutide 能促進短腸綜合癥患者營養的吸收，且安全性、耐受性良好。人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物已經實驗證實具有明顯體內促小腸絨毛生長的作用，并且其體內促腸生長活性與藥物劑量呈正相關性。然而，大量制備較為困難，由于肽鏈較長使化學合成法步驟較多、成本高、率較低；基因工程法生產同樣存在很多困難， 如長度在20 80氨基酸之間的肽類mRNA和表達的蛋白質在宿主細胞內不穩定，導致表達效率很低；用融合方式雖能獲得高效表達，但從融合蛋白上釋放出目標多肽相當困難，同時目的肽在融合蛋白中比率較小，最終造成產率低，制備不經濟等問題，雖已有將部分線性肽目的基因串聯起來，使目的基因在宿主菌中以串聯體方式表達，雖可提高目標蛋白的表達效率，但表達的串聯體產物通常經酶或化學試劑裂解獲得目的肽單體，其中所用的酶一般成本較高；化學試劑如溴化氫存在毒性強等問題，使相關肽的生產和研究受到限制。融合蛋白的表達形式直接影響到下游工藝路線和最終產品的產率，已有的下游工藝路線為重組質粒pED-Pro-Pro-h Wly2]GLP-2 (1-35)表達的融合蛋白溶解后，經多次乙醇沉淀、等電點沉淀等獲得融合蛋白粗品；酸水解后，通過離子交換獲得目的肽粗品；HPLC 柱進一步去除因粗品融合蛋白帶來的雜質。目的肽占融合蛋白的比例僅為22%，且過程繁瑣直接影響終產品的產率。因此需要一種目的肽表達量高、純化過程方便、可進行大規模生產的制備方法來獲得該產品。
發明內容
本發明的目的是公開一種融合表達且可酸水解釋放單體肽的人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物基因串聯體。本發明的另一個目的是公開一種人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物不同拷貝數的基因串聯體構建方法。本發明的再一個目的是公開一種用于制備該類型的人胰高血糖素樣肽-2(1-35 肽)類似物的方法。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的本發明第一方面，提供了一種融合表達且可酸水解釋放單體肽的人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物基因串聯體，其特征在于胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物的C 端天冬氨酸(Asp)和N端脯氨酸(ftx))可以重復串聯形成串聯體，即一個類似物C端的Asp 和先一個類似物N端的Pro形成酸水解位點，在鹽酸作用下可水解為單體肽，該基因串聯體氨基酸序列為Met-HP-Asp-(Pro-Pro-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asn-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp)n其中HP為一段氨基酸殘基的肽鏈，分子量為3237Da，HP肽鏈序列為Asp-His-His-His-His-His-His—Gln—Thr—Cys-Pro—Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Lys—A rg-Lys-Arg-Lys-Lys-Ser-Arg-Ala ；η = 6。本發明第二方面，提供了一種人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物不同拷貝數的基因串聯體構建方法，包括以下步驟(a)含融合伙伴 AnsB-C 的 Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)基因串聯體構建一組同尾酶BamH I和Bcl I分別位于插入目的肽片段的兩端，以質粒 pED-Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)為模板構建重組質粒 pED-2Pro-Pro_h [Gly2] GLP-2 (1-35)，再以 pED-2Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)為模板逐步構建重組質粒 pED-4Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2 (1-35)、pED-6Pro-Pro_h [Gly2] GLP-2 (1-35)、 pED-8Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)。(b)含截短型融合伙伴HP的Pro-Pro-h Wly2] GLP-2 (1-35)基因串聯體構建在重組質粒pED-6Pro-Pro-h [Gly2]GLP-2 (1-3 基礎上，通過 PCR 將其 396bp 的融合伙伴AnsB-C縮短為Slbp的新融合伙伴HP，構建重組質粒pET-HP-6Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)禾口 pET-HP-8Pro-Pro_h [Gly2] GLP-2 (1-35)。將各質粒轉化coli BL21，得6種多拷貝基因串聯體工程菌。
本發明第三方面，提供了一種用于制備該類型的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽) 類似物的方法，包括以下步驟(a)最佳目的肽串聯體篩選將各重組菌乳糖誘導表達產物進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測并分析，發現BL21/ pET-HP-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2 (1-35)的目的肽表達量為 9%且最高。(b)人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的串聯體的制備將重組基因工程菌BL21/pET-HP-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2 (1-35)經發酵-離心-洗滌沉淀-超聲破碎-1. 2% Trition X-100提取-Ni瓊脂糖凝膠層析純化得串聯體。(c)人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的獲得將串聯體經酸水解-沉淀-S^hadex G_25葡聚糖凝膠層析純化得到人胰高糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物。
本發明的一種人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物制備方法能帶來如下有益效果所表達的融合蛋白中，融合伙伴HP分子量較低使人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的比率為 90 %，BL21/pET-HP-6Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)的目的肽表達量是原 BL21/ pED-Pro-Pro-h [Gly2]GLP-2 (1-35)的2. 7倍實現了目的肽的高表達；融合伙伴中含有六個組氨酸組成的標簽便于使用M瓊脂糖凝膠層析純化使純化操作簡便；單體肽水解過程不需使用CNBr或水解酶，適合于大規模生產。
圖1各PCR產物凝膠電泳檢測結果。圖中M. DNA分子量標準，自下而上依次為100bp、250bp、500bp、750bp、 1000bp、2000bp ;1. 526bp 的 AnsB-C 和 Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)片段；2. 631bp 的 AnsB-C 和 2Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)片段；3. 92bp 的 HP 片段；4 :316bp 的 HP 和 2Pro-Pro-h [Gly2]GLP-2 (1-35)片段。圖2含不同拷貝數的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物基因串聯體構建關系。圖3人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的串聯體基因序列測序結果圖4各重組菌乳糖誘導表達情況。圖中1. Escherichia coli BL21空白對照；2 8分別為含pED-Pro-Pro-h [Gly2] GLP—2 (1-35)、pED-2Pro-Pro-h [Gly2] GLP—2 (1-35)、pED-4Pro-Pro-h [Gly2] GLP—2 (1-35)、pED-6Pro-Pro-h [Gly2] GLP—2 (1-35)、pED-8Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)、pET-HP-6Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)、pET-HP-8Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2 (1-35)重組菌乳糖誘導蛋白表達；Μ.標準分子量蛋白自上而下依次為97. 4KDa、66. 2KDa、43. 0KDa、31. OKDa, 20.lKDa、14. 4KDa。圖5含不同拷貝數的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物基因串聯體目的肽表達量情況。圖6人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的串聯體經酸水解得到人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物的單體示意圖。圖7人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的串聯體的酸水解以及純化單體的電泳圖。圖中l.Ni瓊脂糖凝膠層析純化得人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的串聯體；2.人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物酸水解后等電點沉淀所得產物；3.kphadex G-25聚糖凝膠層析柱純化得人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物；4. 5800bp未經ME處理的標準重組胰島素。圖8人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的電噴霧質譜圖。圖9小腸組織切片圖中A. PBS對照組，B.給藥組。
具體實施方式
以下通過附圖及實施例對本發明作進一步說明。本說明書中所提到的材料中(1)宿主菌和質粒宿主菌hcherichia coli BL21是基因工程常用工具菌種，在與基因工程研究相關的實驗室一般都有保存。質粒pED-Pro-Pro-h Wly2]GLP-2 (1-35)為本實驗室構建并保存。(2)酶和試劑分子克隆工具酶為i^rmentas和Takara兩家公司；質粒抽提試劑盒為南京天為生物科有限公司；PCR膠回收試劑盒為Takara公司的產品。(3)培養基LB 培養基，配方見參考文獻 Sambrook J, FristshE F, Maniatis T. Molecular Cloning ；A Laboratory Manual 2nd ed. NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。(4)Ni瓊脂糖凝膠親和層析介質為南京金斯瑞生物科技有限公司產品。(5) Sephadex G-25葡聚糖凝膠為美國GE公司產品本說明書所提及的方法中質粒提取、PCR反應、內切酶酶切、DNA片段的回收、連接和轉化大腸桿菌，這些都是基因工程研究領域的常規操作方法，具體參見Sambrook J， FristshE F, Maniatis T. Molecular Cloning ；A Laboratory Manual 2nd ed. NY :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp.16—340。實施例1重組質粒及相應基因工程菌的構建1. 1 含融合伙伴 AnsB-C 的 Pro-Pro-h[Gly2]GLP_2 (1-35)基因串聯體構建在基因水平上，每個單體肽的兩端都預留編碼酸水解位點(Asp-Pro)的核苷酸序列，設計引物Nco I -up (含有Nco I酶切位點)和Bcl I Down (含有Bcl I酶切位點)， 以質粒pED-Pro-Pro-h [Gly2]GLP-2 (1-35)(該質粒的構建方法見授權公告號CN10041893C 發明專利審定授權說明書，質粒PED是在質粒pET-28a的兩個酶切位點Nco I和Hind III間引入已消除唯一酸水解位點L-天冬酰胺酶AnsB-C構建而成，AnsB-C分子量為13. 73KDa) 為模板，PCR擴增融合伙伴AnsB-C基因和Pr0-Pr0-t^Gly2]GLP-2 (1_35)的單基因序列， 反應總體積為50μ 1，經94°C預變性50min，進入如下32個循環94°C變性45s，57°C退火 45s，72°C延伸70s，最后在72°C下延伸lOmin。將PCR產物進行Nco I和Bcl I雙酶切，質粒 pED-Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)進行 Nco I 和 BamH I 雙酶切去除 AnsB-C 基因片段， 同尾酶BamH I和Bcl I的酶切產物的粘性末端相同，將兩者的酶切產物連接構建重組質粒 pED-2Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)。以質粒 pED-2Pro-Pro_h [Gly2] GLP-2 (1-35)為模板，Nco I Up 和 Bcl I Down 為引物，PCR擴增，反應條件同上。將PCR產物進行Nco I和Bcl I雙酶切，質粒 pED-2Pro-Pro-h [Gly2]GLP-2 (1-35)進行 Nco I 和 BamH I 雙酶切，兩者的酶切產物連接構建重組質粒pED-4Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)。按同樣方法構建重組質粒 pED-6Pro-Pro-h [Gly2] GLP—2 (1-35)及 pED-8Pro-Pro_h [Gly2] GLP—2 (1-35)。1. 2含截短型融合伙伴HP的Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2 (1-35)基因串聯體構建設計編碼Thr-HP-Asp 肽鏈(即 fusion partner)的序列，其中 HP 為Asp-His_His-His-His-His-His-Gln-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Ly s-Ser-Arg-Ala.以質粒 pED-Pro-Pro-h [Gly2]GLP-2 (1-35)為模板，Nco I His Up 和 BamH I Down 為引物，PCR擴增，反應條件同上。將PCR產物進行Nco I和BamH I雙酶切，質粒 pED-6Pro-Pro-h [Gly2]GLP-2 (1-35)進行 Nco I 和 BamH I 雙酶切去除 AnsB-C 基因片段，將兩者的酶切產物連接構建重組質粒pET-HP-6Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)。以質粒 pED-2Pro-Pro_h [Gly2]GLP-2 (1-35)為模板，Nco I His Up 和 Bcl I Down 為引物，PCR擴增，反應條件同上。將PCR產物進行Nco I和Bcl I雙酶切，質粒 pED-6Pro-Pro-h [Gly2]GLP-2 (1-35)進行Nco I和BamH I雙酶切，將兩者的酶切產物連接構建重組質粒pET-HP-8Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2 (1-35)，上述各PCR產物凝膠電泳檢測結果見附圖1，各串聯體構建關系見附圖2。其中，4條引物序列如下Nco I Up 5' -ACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3‘Nco I His Up :5，-TATACCATGGATCATCATCATCATCATCATCAGACCTGCCCGCCGTGCCCTGC AC-3'Bcl I Down 5' -AAAATGATCAGTGATTTTGGTCTG-3‘BamH I down 5' -TTTCGGATCCGCACGGCTTTTT-3‘1.3相應基因工程菌構建將上述各重組質粒轉入大腸桿菌hcherichia coli BL21感受態細胞中，涂布含100 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C培養過夜，挑取部分單菌落培養并誘導表達，經 SDS-PAGE電泳檢測選取表達融合蛋白相對分子質量與預期結果相符且表達量較高的陽性重組菌測序，進一步驗證人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物的多聯體基因序列的正確性，其中 pET-HP-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2 (1-35)測序結果見附圖 3。實施例2目的肽表達量最佳串聯體篩選將各重組菌乳糖誘導表達產物進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測并分析，發現BL21/ pET-HP-6Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)的目的肽表達量為 9 % 且最高，是 BL21/ pED-Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)的 2. 7 倍，結果見附圖 5。實施例3人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物串聯體的制備3. 1人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的串聯體的制備將重組基因工程菌BL21/pET-HP-6Pro-P-h [Gly2]GLP-2 (1-3 以的接種量于 LB培養基中，37°C恒溫培養到對數中期，按4%的接種量轉接到玉米漿培養基中，37°C培養 4小時后加入終濃度為5mmol/L的乳糖誘導，繼續培養。離心收集菌體按10倍重量體積加入菌體洗滌液(lOmmol/L Tris-HCl pH 8.0)洗滌兩次，離心收集菌體按5倍重量體積加入 PBS 溶液(20mmol/L Na2PHO4, 500mmol/L NaCl，pH 7. 4)，混勻，凍融，超聲破碎。離心收集沉淀并按 20 倍重量體積加入提取液(1.2% Triton X-100, 5mmol/L imidazole, 500mmol/L NaCl,20mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0)，得人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物串聯體的粗品溶液。將人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物串聯體的粗品溶液上清上樣于以 Binding Buffer (1. 2 % TritonX-100,5mmol/L imidazole,500mmol/L NaCl,20mmol/LTris-HCl,pH 8. 0)平衡的Ni瓊脂糖凝膠親和層析柱，以10倍柱體積的Wash Buffer (1. 2% TritonX-100,20mmol/L imidazole, 500mmol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)洗脫雜蛋白，最后以 Elute Buffer (1. 2% TritonX-100, lOOmmol/L imidazole, 500mmol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)收集目的蛋白，得人胰高血糖素樣肽_2 (1_35肽)類似物串聯體。3. 2人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的制備將含有人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物串聯體的Elute Buffer透析，凍干， 每克串聯體加入IOml 40 50mmol/L HCl溶解，置于48°C水浴48h，進行酸水解，理論效果圖見附圖6。酸水解后，用NaOH調節pH值至3. 9，有大量沉淀生成，12000rpm離心20min， 去除上清，沉淀凍干后溶解于少量lOmmol/L的pH為7. 0磷酸鹽緩沖液中，上樣于kphadex G-25葡聚糖凝膠層析柱，收集樣品峰，透析除鹽，凍干收集目的肽。SDS-PAGE電泳檢測，結果見附圖7。實施例4質譜分析通過基質輔助激光解吸電離/飛行時間質譜(MALDI-T0F-MS)法，測得重組制備的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的相對分子質量為3卯4. 038Da，與理論推算值一致， 見附圖8。實施例5人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物生物活性的檢測選取正常雄性SD大鼠(160-200g)，隨機分為2組，6只/組，1組為PBS對照組； 另一組組為給藥組，劑量分別為0. 5mg/Kg/day, 1天2次，腹部皮下注射給藥14天后，晚上禁食，第二天處死，取小腸，用生理鹽水清洗，進行小腸組織切片分析，結果顯示給藥組的體內促小腸絨毛生長活性明顯高于PBS組，結果見附圖9。除上述事實外，本發明還可以有其他實施方式，凡采用等同替換或等效變換性的技術方案，均落于本發明要求的保護范圍。
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權利要求
1.一種融合表達且可酸水解釋放單體肽的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物基因串聯體，其中人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物氨基酸序列為Pro-Pro-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-L eu-Ala—Ala—Arg-Asn-Phe-IIe-Asn-Trp-Leu-IIe-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr—Aspο
2.根據權利要求1所述的一種融合表達且可酸水解釋放單體肽的人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物基因串聯體，其特征在于所述的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物C端天冬氨酸(Asp)與N端脯氨酸(ftx))可以重復串聯成串聯體，即一個類似物C端 Asp和下一個類似物N端的Pro形成酸水解位點，在鹽酸作用下可以斷開，串聯體氨基酸序列為Met-HP-Asp-(Pro-Pro-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asn-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp)n其中HP為含有a個氨基酸殘基的肽鏈(a為非負整數)；n > 1。
3.根據權利要求2所述的一種融合表達且可酸水解釋放單體肽的人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物基因串聯體，其特征在于，所述HP肽鏈序列為Asp-His-His-His-His-His-His-Gln-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Lys-Arg-L ys-Arg-Lys-Lys-Ser-Arg-Ala ；η = 60
4.根據權利要求1所述的一種人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物的制備方法，包括重組質粒以及相應的工程菌的構建步驟，人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物的串聯體的制備步驟，人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的獲取步驟，其特征在于在重組質粒以及相應的基因工程菌構建過程中，質粒pED-Pr0-Pr0-t^Gly2]GLP-2(l-30為模板，是通過PCR反應獲得含人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的DNA片段的擴增序列，引物的核酸序為Nco I Up 5' -ACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3‘Nco I His Up 5 ‘ -TATACCATGGATCATCATCATCATCATCATCAGACCTGCCCGCCGTGCCCTGCAC-3'Bcl I Down 5' -AAAATGATACGTGATTTTGGTCTG-3‘BamH I down 5' -TTTCGGATCCGCACGGCTTTTT-3‘
5.根據權利要求4所述的一種人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物的制備方法， 其特征在于在人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的串聯體的制備步驟中，將重組菌 BL21/pET-HP-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2 (1-35)經發酵-離心-洗滌沉淀-超聲破碎-1. 2% TritionX-IOO提取-Ni瓊脂糖凝膠層析純化得較純串聯體，其中，發酵溫度為36 38°C， ρΗ 6. 8 7. 2。
6.根據權利要求5所述的一種人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物的制備方法，其特征在于在人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的串聯體的獲得步驟中，將串聯體經酸水解-沉淀-S^hadex G-25葡聚糖凝膠柱層析純化得到人胰高血糖素樣肽_2 (1-35肽) 類似物，其中酸水解用40 60mmol/L濃度的鹽酸，Sephadex G-25聚糖凝膠柱層析純化， 獲得人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物。
7.根據權利要求1所述的一種能串聯表達和同步酸水解釋放的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的活性，其特征在于所述的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物具有促小腸絨毛生長活性，有望用于治療短腸綜合征、吸收障礙等胃腸道疾病。
全文摘要
本發明屬于基因工程領域，公開一種融合表達且可酸水解釋放單體肽的人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物基因串聯體及其工程菌的構建、串聯體的表達、目的肽的制備方法。通過同尾酶法構建出一系列該類似物基因串聯體，并將其融合伙伴進行改造同時引入His標簽，融合蛋白中目的肽的比率由22％提高到90％，目的肽的表達量提高了2.7倍，通過Ni瓊脂糖凝膠親和層析和Sephadex G-25葡聚糖凝膠層析獲得的目的肽具有明顯的促小腸絨毛生長活性。該制備方法具有目的肽表達量高、純化過程簡便、獲取單體肽過程不需使用CNBr或水解酶等優點。
文檔編號C07K14/605GK102190720SQ201010609740
公開日2011年9月21日 申請日期2010年12月28日 優先權日2010年12月28日
發明者劉景晶, 劉濤, 李泰明 申請人:中國藥科大學