專利名稱：利拉魯肽的固相合成方法
技術領域：
本發明涉及多肽的合成方法，尤其涉及一種利拉魯肽的固相合成方法。
背景技術：
利拉魯肽，英文名稱為liraglutide，其肽序為H-His-Ala-Glu-Gly-Thr_Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε -(N-α -Palmit y -glutamyl)) -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OHo 利拉魯肽由丹麥諾和諾德公司研制，是胰高血糖素樣肽-1 (G LP-I)的受體激動劑，作為一種皮下注射制劑，能起到良好的降低血糖作用。諾和諾德的利拉魯肽主要是通過基因工程等生物學方法進行制備，技術難度大， 生產成本高，不利于利拉魯肽的大規模生產。US6^8343B1和US64589MB2報道了利拉魯肽的固液合成法，中間體GLP-I (7-37)-OH均需要反相HPLC純化，再在液相條件下與 Na-alkanoyl-Glu (ONSu) -OtBu反應，并且由于GLP-I (7-37) -OH N端未保護以及側鏈保護基全部脫除，會導致產生許多雜質，難以純化，操作繁瑣。利拉魯肽的現有合成方法存在操作繁瑣，需兩步純化，合成周期長，廢液多，不利于環保，需花費大量乙腈，成本高昂以及不利于大規模生產的缺點。
發明內容
為解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種利拉魯肽的固相合成方法。一種利拉魯肽的固相合成方法，包括如下步驟
A)在活化劑系統的存在下，由樹脂固相載體和N端Fmoc保護的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH) 偶聯得到Fmoc-Gly-樹脂；
B)通過固相合成法，按照利拉魯肽主鏈肽序依次偶聯具有N端Fmoc保護且側鏈保護的氨基酸，其中賴氨酸采用Fm0c-Lys(All0c)-OH ；
C)脫除賴氨酸側鏈保護基Alloc;
D)通過固相合成法，在賴氨酸側鏈偶聯I^almitoyl-Glu-OtBu；
E)裂解，脫除保護基和樹脂得到利拉魯肽粗肽；
F)純化，凍干，得到利拉魯肽。采用上述技術方案，通過固相合成法進行利拉魯肽的制備，操作簡單，合成周期短，成本不高，減少了廢液的產生，副產物少，產品收率高，利于利拉魯肽的大規模生產。作為本發明的進一步改進，所述步驟A)中，所述樹脂固相載體采用2-CTC樹脂，所述活化劑系統選自DIEA、TMP或NMM，所述Fmoc-Gly-樹脂為0. 15^0. 28 mmol/g替代度的 Fmoc-Gly-CTC 樹脂。作為本發明的進一步改進，所述步驟A)中，所述樹脂固相載體采用王樹脂，所述活化劑系統由DIC、HOBt和DMAP組成，所述Fmoc-Gly-樹脂為0. 12^0. 24 mmol/g替代度的
3Fmoc-Gly-王樹脂。作為本發明的進一步改進，所述步驟B)包括如下步驟
Bi)采用DBLK使所述Fmoc-Gly-樹脂脫除Fmoc保護基，得到H-Gly-樹脂，所述DBLK 由體積比為1 :4的哌啶和DMF組成；
B2)在偶聯劑系統的存在下，H-Gly-樹脂和Fmoc保護且側鏈保護的精氨酸偶聯得到 Fmoc-Arg (Pbf) -Gly-樹脂；
B3)重復步驟Bi、B2，按照利拉魯肽主鏈肽序依次進行氨基酸的偶聯。在進行氨基酸的偶聯時，色氨酸通過Boc保護基進行側鏈的保護；谷氨酸通過 OtBu保護基進行側鏈的保護；賴氨酸通過Alloc保護基進行側鏈的保護；谷氨酰胺通過 Trt保護基進行側鏈的保護；酪氨酸通過tBu保護基進行側鏈的保護；絲氨酸通過Trt或 tBu保護基進行側鏈的保護，絲氨酸采用不同的保護基Trt或tBu是為了保證樹脂的偶聯效果以及最終的產品收率；天冬氨酸通過OtBu保護基進行側鏈的保護；蘇氨酸通過tBu保護基進行側鏈的保護；組氨酸通過Trt保護基進行側鏈的保護，通過Boc保護基進行N端的保護。作為本發明的進一步改進，所述偶聯劑系統包括縮合劑和反應溶劑，所述縮合劑選自 DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA 或 HATU/HOAt/DIEA ；所述反應溶劑選自 DMF、DCM、NMP, DMSO或他們之間的任意組合。作為本發明的進一步改進，所述步驟C)中，脫除賴氨酸側鏈保護基Alloc采用 0. Γ0. 4倍合成規模用量的Pd(PWl3)4和1(Γ30倍合成規模用量的苯基硅烷在固相條件下脫除10 65分鐘。所述步驟D)中，在賴氨酸側鏈可以直接偶聯I^almitoyl-Glu-OtBu，也可以先偶聯 Fmoc-Glu-OtBu,脫除Fmoc后，再偶聯棕櫚酰氯。所述步驟E)中，裂解，通過本領域常用的“切肽反應”脫除保護基和樹脂得到利拉魯肽粗肽。作為本發明的進一步改進，所述步驟F)中，純化為反相高效液相色譜純化，色譜柱為反相C8柱，柱溫為4(T50°C。與現有技術相比，本發明的有益效果是提供了一種固相合成法進行利拉魯肽的制備方法，操作簡單，合成周期短，成本不高，減少了廢液的產生，后處理容易，副產物少，產品收率高，利于利拉魯肽的大規模生產。
圖1為本發明利拉魯肽的固相合成工藝流程圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明做進一步詳細說明。王樹脂和CTC樹脂購自天津南開和成有限公司，各種保護氨基酸購自吉爾生化有限公司。說明書和權利要求書中所使用英文縮寫的含義列于下表中。
權利要求
1.一種利拉魯肽的固相合成方法，其特征在于包括如下步驟A)在活化劑系統的存在下，由樹脂固相載體和N端Fmoc保護的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH) 偶聯得到Fmoc-Gly-樹脂；B)通過固相合成法，按照利拉魯肽主鏈肽序依次偶聯具有N端Fmoc保護且側鏈保護的氨基酸，其中賴氨酸采用Fm0c-Lys(All0c)-OH ；C)脫除賴氨酸側鏈保護基Alloc；D)通過固相合成法，在賴氨酸側鏈偶聯I^almitoyl-Glu-OtBu；E)裂解，脫除保護基和樹脂得到利拉魯肽粗肽；F)純化，凍干，得到利拉魯肽。
2.根據權利要求1所述的利拉魯肽的固相合成方法，其特征在于所述步驟A)中，所述樹脂固相載體采用2-CTC樹脂，所述活化劑系統選自DIEA、TMP或NMM，所述Fmoc-Gly-樹脂為0. 15 0. 28 mmol/g替代度的Fmoc-Gly-CTC樹脂。
3.根據權利要求1所述的利拉魯肽的固相合成方法，其特征在于所述步驟A)中，所述樹脂固相載體采用王樹脂，所述活化劑系統由DIC、H0Bt和DMAP組成，所述Fmoc-Gly-樹脂為0. 12^0. 24 mmol/g替代度的Fmoc-Gly-王樹脂。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的利拉魯肽的固相合成方法，其特征在于所述步驟B)包括如下步驟Bi)采用DBLK使所述Fmoc-Gly-樹脂脫除Fmoc保護基，得到H-Gly-樹脂，所述DBLK 由體積比為1 :4的哌啶和DMF組成；B2)在偶聯劑系統的存在下，H-Gly-樹脂和Fmoc保護且側鏈保護的精氨酸偶聯得到 Fmoc-Arg (Pbf) -Gly-樹脂；B3)重復步驟Bi、B2，按照利拉魯肽主鏈肽序依次進行氨基酸的偶聯。
5.根據權利要求4所述的利拉魯肽的固相合成方法，其特征在于所述偶聯劑系統包括縮合劑和反應溶劑，所述縮合劑選自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOAt/DIEA ；所述反應溶劑選自DMF、DCM、NMP, DMSO或他們之間的任意組合。
6.根據權利要求1所述的利拉魯肽的固相合成方法，其特征在于所述步驟C)中，脫除賴氨酸側鏈保護基Alloc采用0.廣0.4倍合成規模用量的Pd (PWi3) 4和1(Γ30倍合成規模用量的苯基硅烷在固相條件下脫除10飛5分鐘。
7.根據權利要求1所述的利拉魯肽的固相合成方法，其特征在于所述步驟F)中，純化為反相高效液相色譜純化，色譜柱為反相C8柱，柱溫為4(T50°C。
全文摘要
本發明提供一種利拉魯肽的固相合成方法，包括如下步驟A)在活化劑系統的存在下，由樹脂固相載體和N端Fmoc保護的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)偶聯得到Fmoc-Gly-樹脂；B)通過固相合成法，按照利拉魯肽主鏈肽序依次偶聯具有N端Fmoc保護且側鏈保護的氨基酸，其中賴氨酸采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH；C)脫除賴氨酸側鏈保護基Alloc；D)通過固相合成法，在賴氨酸側鏈偶聯Palmitoyl-Glu-OtBu；E)裂解，脫除保護基和樹脂得到利拉魯肽粗肽；F)純化，凍干，得到利拉魯肽。本發明提供的固相合成方法操作簡單，合成周期短，生產成本低，減少了廢液的產生，后處理容易，副產物少，產品收率高，利于利拉魯肽的大規模生產。
文檔編號C07K14/605GK102286092SQ20111027134
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月14日 優先權日2011年9月14日
發明者劉建, 潘俊鋒, 袁建成, 馬亞平 申請人:深圳翰宇藥業股份有限公司