專利名稱：一種提取純化4-雄烯二酮的方法
技術領域：
本發明屬于植物化學技術領域。具體地說，涉及一種從植物留醇發酵液中提取純化4-雄烯二酮(4-AD)的方法。
背景技術：
4-雄烯二酮(AndrostenedioneJ-AD)是甾體類激素藥物的重要中間體，可用于生產性激素、孕激素、蛋白同化激素等100余種藥物。微生物轉化留醇產生4-AD的發酵系統很多，其中分枝桿菌油水兩相發酵系統可高效降解植物留醇側鏈產生4-AD，并具有較高的甾醇加入量和較低的底物及產物抑制性等優點。但微生物發酵系統目前普遍存在目標產物4-AD難于提取分離的問題，4-AD的純度較低。
發明內容
本發明要解決的技術問題是如何提取并純化得到高純度4-AD。為了解決上述技術問題，本發明提供一種提取純化4-雄烯二酮的方法。本發明的植物留醇發酵液的來源可以為采用本領域常用菌種對植物留醇進行常規發酵后所得的發酵液，例如采用分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)直接發酵植物甾醇原料，得到植物留醇發酵液。本發明提取純化4-雄烯二酮的方法為采用乙酸乙酯溶解植物留醇發酵液的油相以去除菌體，經減壓蒸餾后用甲醇萃取，經脫色重結晶后得到4-雄烯二酮純品。具體地，該方法包括如下步驟1)取植物留醇發酵液加熱，加入中性鹽使分層，收集上層，得第一油相；2)用乙酸乙酯萃取所述第一油相，收集上層，加熱減壓蒸餾，得第二油相；3)用甲醇萃取所述第二油相，收集上層，加熱減壓濃縮，降溫結晶，得4-雄烯二酮粗品；4)向4-雄烯二酮粗品中加入乙酸乙酯，加熱溶解，加水攪拌，靜置分層，取乙酸乙
酯層，降溫結晶；5)向步驟4)所得結晶中加入甲醇溶解，脫色，結晶，得到4-雄烯二酮純品。其中步驟1)所述加熱的溫度為70-90°C，優選78-85°C，更優選80°C ；所述中性鹽選自氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉或硫酸鉀等，優選氯化鈉，中性鹽的加入量為植物留醇發酵液的 l-5w/v %，優選 2-4w/v %，更優選 3w/v % ；步驟2)所述乙酸乙酯的加入體積為所述第一油相體積的1-5倍，優選2-4倍，更優選3倍；所述加熱的溫度為50-70°C，優選58-62°C，更優選60°C ；步驟3)所述甲醇的加入體積為所述第二油相體積的1-5倍，優選2-3倍；所述濃縮為濃縮至甲醇體積的1/8-1/5，優選1/7-1/6 ；所述加熱的溫度為50-70°C，優選58-62°C， 更優選60°C ；所述降溫為降至15-35°C，優選20-30°C，更優選25°C ；
步驟4)所述乙酸乙酯的加入量為4-雄烯二酮粗品的3-6倍，優選4-6倍，更優選 5倍；所述水的加入量為4-雄烯二酮粗品的1-4倍，優選1-3倍，更優選2倍；所述加熱溫度為55-70°C，優選60-65°C，更優選62°C ；所述降溫為降至15_35°C，優選20_30°C，更優選 25 0C ；步驟5)中，將步驟4)所得結晶用甲醇溶解后加熱至55-70°C，優選60_65°C，更優選62°C ；采用活性炭進行脫色，脫色后的溶液在50-70°C、優選58-62°C減壓濃縮至甲醇體積的1/3-2/3、優選濃縮至1/2 ；然后降溫至3-10°C、優選4-8°C結晶，更優選5°C結晶；離心，得到4-雄烯二酮純品；步驟5)中，所述甲醇的加入量為4-雄烯二酮粗品的6-12倍，優選8_12倍，所述活性炭的加入量為4-雄烯二酮粗品的0. 2-0. 6w/w%,優選0. 4-0. 6w/w%。在一個實施方案中，提取純化4-雄烯二酮的方法包括如下步驟1)將植物留醇發酵液加熱至80°C，加入3w/v%的氯化鈉，攪拌溶解30min，靜置分層后，使發酵液中的水相與油相分離，收集上層，得到第一油相(含大量4-AD、菌體、留醇及雜質)，備用；2)將上述得到的第一油相按1 3 (ν/ν)加入乙酸乙酯，攪拌，靜置分層，收集上層乙酸乙酯相(下層為菌體及少量水)；將上述得到的乙酸乙酯相在60°C減壓蒸餾，得到第二油相(含4-AD、留醇及少量雜質)，蒸出的乙酸乙酯可回收利用；3)將上述得到的第二油相按1 2(v/v)加入甲醇，常溫下經萃取塔萃取，得到上層輕相和下層重相，輕相為甲醇相，重相經60°C減壓蒸餾后得到澄清油(主要為植物油脂， 發酵時的原料，可重復利用發酵)；將上層甲醇相在60°C減壓濃縮，濃縮至原甲醇相體積的 1/6 ；將濃縮后的溶液進行降溫結晶，降溫至室溫，離心，加少量甲醇洗滌，得到4-AD粗品；4)將上述得到的4-AD粗品按1 5 (v/m)加入乙酸乙酯，攪拌，加熱至60°C完全溶解，按1 2(v/m)加水洗滌除雜，靜置30min分層，分去水相后，將乙酸乙酯層降溫結晶， 降溫至室溫，離心，加入少量乙酸乙酯洗滌，得到初精制4-AD結晶；5)將上述得到的初精制4-AD結晶按前述4_AD粗品1 10 (v/m)的比例加入甲醇溶解，加熱至62°C加入活性炭脫色，活性炭加量為前述4-AD粗品的0. 5% (m/m)，脫色 30min后，抽濾，濾液在60°C減壓濃縮至原體積的1/2，降溫至5°C結晶，離心，加少量甲醇洗滌后得到精制4-AD純品；將4-AD純品在45°C鼓風干燥8h，每一小時翻一次盤。本發明的方法采用乙酸乙酯溶解植物留醇發酵液的油相以去除菌體，經減壓蒸餾后用甲醇萃取，經脫色重結晶后得到4-雄烯二酮純品。與化學合成法相比，該方法至少具有工藝簡單、反應條件溫和、所需生產設備少，且提取收率高和產品純度高等優點之一，所用提取試劑乙酸乙酯、甲醇等經回收后，可循環使用，回收油也可重復利用，減少廢棄物排放，對環境污染小，符合循環經濟發展方向，適用于工業化大規模生產。所生產的4-雄烯二酮作為重要原料藥，社會需求量巨大，經濟效益十分明顯。具體實施方法以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1采用分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)直接發酵植物甾醇原料，得到植物甾醇發酵液(4-AD含量0. 76 %，留醇含量0.27%，總糖含量1.37%，還原糖含量0. 54 %，氨基氮含量0. 34%,溶磷63mg/L)。1.取50L植物留醇發酵液，加熱至80°C，加入1.5kg氯化鈉，攪拌溶解30min，靜置2h分層后，分去下層水相，收集上層油相①15L(4-AD含量2. 48%，留醇含量0. 86% )待用。2.將上述得到的15L油相①加入45L乙酸乙酯，攪拌lh，靜置2h后分層，收集上層乙酸乙酯相(4-AD含量0.82%，留醇含量0.28% )；將上述得到的乙酸乙酯相60°C減壓蒸餾，得到油相②12L(4-AD含量3. 04%，留醇含量1. 03% )。3.將上述得到的油相②加入25L甲醇常溫下經萃取塔萃取，得到輕相和重相，輕相為甲醇相26L(4-AD含量1. 49%，留醇含量0. 12% )，重相經60°C減壓蒸餾后得到澄清油可重復利用；將上述得到的26L甲醇相60°C減壓濃縮，濃縮至4L。將濃縮后的甲醇溶液進行降溫結晶，降溫至250C，離心，加IOOmL甲醇洗滌，得到350g 4-AD粗品(4-AD含量63%， 甾醇含量7. 64%)。4.將上述得到的350g 4-AD粗品加入1. 8L乙酸乙酯，攪拌，加熱至60°C完全溶解粗品后，加700mL水洗雜，攪拌30mim，靜置30min分層，分去水相后，乙酸乙酯相降溫結晶， 降溫至室溫，離心，加入50mL乙酸乙酯洗滌，得到初精制4-AD 245g(4_AD含量87. 5%，甾醇含量 3. 02% )。5.將上述得到的初精制4-AD加入3. 5L甲醇溶解后加熱至62°C加入1. 75g活性炭脫色，脫色30min后，抽濾，甲醇溶液60°C減壓濃縮至1. 5L，降溫至5°C結晶，離心，加50mL 甲醇洗滌后在45°C鼓風干燥8h，每一小時翻一次盤。得到精制4-AD 150g(4-AD含量99%， 甾醇未檢出)。實施例2采用分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)直接發酵植物甾醇原料，得到植物甾醇發酵液(4-AD含量1. 26 %，留醇含量0. 43 %，總糖含量1.27%，還原糖含量0. 47 %，氨基氮含量0.31%，溶磷57mg/L)。1.取500L植物留醇發酵液，加熱至85°C，加入18kg氯化鉀，攪拌溶解30min，靜置 2h分層后，分去下層水相，收集上層油相①200L(4-AD含量3. 13%，留醇含量1. 05% )待用。2.將上述得到的200L油相①加入800L乙酸乙酯，攪拌lh，靜置2h后分層，收集上層乙酸乙酯相(4-AD含量1.02%，留醇含量0.34%)；將上述得到的乙酸乙酯相62°C減壓蒸餾，得到油相②190L(4-AD含量3. 28%，甾醇含量0. 95% )03.將上述得到的油相②加入400L甲醇常溫下經萃取塔萃取，得到輕相和重相，輕相為甲醇相400L(4-AD含量1. 55%，留醇含量0. 09% )，重相經60°C減壓蒸餾后得到澄清油可重復利用；將上述得到的400L甲醇相62°C減壓濃縮，濃縮至65L。將濃縮后的甲醇溶液進行降溫結晶，降溫至30°C，離心，加1.5L甲醇洗滌，得到6. 25kg 4-AD粗品(4-AD含量 65%，甾醇含量5.5% )。4.將上述得到的6. 25kg 4-AD粗品加入32L乙酸乙酯，攪拌，加熱至65°C完全溶解粗品后，加1.3L水洗雜，攪拌30mim，靜置30min分層，分去水相后，乙酸乙酯相降溫結晶， 降溫至室溫，離心，加入800mL乙酸乙酯洗滌，得到初精制4-AD 4. lkg(4_AD含量87. 5%，甾醇含量2. 11% )0
5.將上述得到的初精制4-AD加入63L甲醇溶解后加熱至65°C加入313g活性炭脫色，脫色30min后，抽濾，甲醇溶液62°C減壓濃縮至30L，降溫至8°C結晶，離心，加500mL甲醇洗滌后在45°C鼓風干燥8h，每一小時翻一次盤。得到精制4-AD 2. 5kg(4_AD含量99. 1%, 甾醇未檢出)。實施例3采用分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)直接發酵植物甾醇原料，得到植物甾醇發酵液(4-AD含量1. 04%，留醇含量0. 36 %，總糖含量1.18%，還原糖含量0. 41 %，氨基氮含量0. 36 %，溶磷48mg/L)。1.取200L植物留醇發酵液，加熱至78°C，加入6. 8kg硫酸鈉，攪拌溶解30min，靜置2h分層后，分去下層水相，收集上層油相①70L(4-AD含量2. 94%，留醇含量0. 97% )待用。2.將上述得到的70L油相①加入240L乙酸乙酯，攪拌lh，靜置2h后分層，收集上層乙酸乙酯相(4-AD含量0.72%，留醇含量0.34%)；將上述得到的乙酸乙酯相58°C減壓蒸餾，得到油相②53L(4-AD含量3. 26%，留醇含量1. 17%).3.將上述得到的油相②加入93L甲醇常溫下經萃取塔萃取，得到輕相和重相，輕相為甲醇相115L(4-AD含量1. 54%，留醇含量0. 16% )，重相經60°C減壓蒸餾后得到澄清油可重復利用；將上述得到的115L甲醇相58°C減壓濃縮，濃縮至15L。將濃縮后的甲醇溶液進行降溫結晶，降溫至20°C，離心，加IOOmL甲醇洗滌，得到1.9kg 4-AD粗品(4-AD含量 68%，甾醇含量6.41% )。4.將上述得到的1. 9kg 4-AD粗品加入8. IL乙酸乙酯，攪拌，加熱至60°C完全溶解粗品后，加2. 5L水洗雜，攪拌30mim，靜置30min分層，分去水相后，乙酸乙酯相降溫結晶， 降溫至室溫，離心，加入150mL乙酸乙酯洗滌，得到初精制4-AD 1. 05kg(4-AD含量88. 1%， 甾醇含量2. 65% )05.將上述得到的初精制4-AD加入12. 8L甲醇溶解后加熱至60°C加入3. 95g活性炭脫色，脫色30min后，抽濾，甲醇溶液58°C減壓濃縮至3. 8L，降溫至4°C結晶，離心，加 50mL甲醇洗滌后在45°C鼓風干燥8h，每一小時翻一次盤。得到精制4_AD 780g(4_AD含量 99%，甾醇未檢出)。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種從植物留醇發酵液中提取純化4-雄烯二酮的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1)取植物留醇發酵液加熱，加入中性鹽使分層，收集上層，得第一油相；2)用乙酸乙酯萃取所述第一油相，收集上層，加熱減壓蒸餾，得第二油相；3)用甲醇萃取所述第二油相，收集上層，加熱減壓濃縮，降溫結晶，得4-雄烯二酮粗Pm ；4)向4-雄烯二酮粗品中加入乙酸乙酯，加熱溶解，加水攪拌，靜置分層，取乙酸乙酯層，降溫結晶；5)向步驟4)所得結晶中加入甲醇溶解，脫色，結晶，得到4-雄烯二酮純品。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述加熱的溫度為70-90°C，優選 78-85 "C。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述中性鹽選自氯化鈉、氯化鉀、 硫酸鈉或硫酸鉀，其加入量為植物留醇發酵液的l-5w/v%，優選2-4w/v%。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述乙酸乙酯的加入體積為所述第一油相體積的1-5倍，優選2-4倍；所述加熱的溫度為50-70°C，優選58_62°C。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述甲醇的加入體積為所述第二油相體積的1-5倍，優選2-3倍；所述濃縮為濃縮至甲醇體積的1/8-1/5，優選1/7-1/6。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述加熱的溫度為50-70°C，優選 58-620C ；所述降溫為降至15-35°C，優選20_30°C。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述乙酸乙酯的加入量為4-雄烯二酮粗品的3-6倍，優選4-6倍，所述水的加入量為4-雄烯二酮粗品的1-4倍，優選1-3 倍。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述加熱溫度為55-70°C，優選 60-65°C，所述降溫為降至15-35°C，優選20_30°C。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)中將步驟4)所得結晶用甲醇溶解后加熱至55-70°C，優選60-65°C ；采用活性炭進行脫色，脫色后的溶液在50-70°C減壓濃縮至甲醇體積的1/3-2/3，降溫至3-10°C結晶，離心，得到4-雄烯二酮純品。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述甲醇的加入量為4-雄烯二酮粗品的6-12倍，優選8-12倍；所述活性炭的加入量為4-雄烯二酮粗品的0. 2-0.，優選 0. 4-0. 6w/w%。
全文摘要
本發明涉及一種從植物甾醇發酵液中提取純化4-雄烯二酮的方法。該方法采用乙酸乙酯溶解植物甾醇發酵液的油相以去除菌體，經減壓蒸餾后用甲醇萃取，經脫色重結晶后得到4-雄烯二酮純品。該方法具有提取率高、產品純度高等優點，回收的油可重復利用，對環境污染小，適用于工業化大規模生產。
文檔編號C07J1/00GK102432657SQ20111034489
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者張雪鋒, 李倩, 李榮杰 申請人:安徽豐原發酵技術工程研究有限公司