專利名稱：一種制備香蘭素的方法
技術領域：
本發明涉及生物工程和化學領域，具體為制備香蘭素的方法，特別是以異丁香酚為底物，用血紅蛋白制備香蘭素的方法。
背景技術：
香蘭素是香子蘭花莢中的典型香味物質，廣泛存在于自然界中，如在香莢蘭豆、秘魯香膏、丁香花蕾油中均有發現。作為一種廣譜型高檔香料，香蘭素廣泛應用于食品、香料及醫藥領域，具有很大的市場發展潛力。目前市場上的香蘭素主要有兩種來源(1)以愈創木酚和木質素為原料，運用化學法進行合成；( 從植物材料中運用蒸餾、萃取等方法獲得天然香蘭素。化學合成法得到的香蘭素價格便宜，但是隨著生活水平的提高和對健康的日益關注，人們對化學合成的香蘭素的安全性始終存在懷疑，各國對化學食品添加劑使用的限制規定越來越嚴格，因此市場上對天然香蘭素的需求量呈上升趨勢。由于香莢蘭等植物來源有限，受產地和自然因素的影響比較大，產量少，培育和處理過程復雜，造成天然香蘭素的價格高昂。美國和歐洲的立法機構認為采用生物細胞或其中的組成部分(如生物酶)等生物資源所生產的物質均屬于天然產物。為了解決天然香蘭素來源有限、價格高昂的問題，近年來人們發展了運用生物技術制備香蘭素的方法。生物技術方法可以利用微生物細胞或酶， 通過生物轉化或生物合成來制備香蘭素。1977年日本學者首次分離得到能夠將丁香酚轉化為香蘭素的微生物菌株，開辟了生物法制備香蘭素新途徑。目前生物法制備香蘭素共有三條路線第一條是以阿魏酸為底物，運用惡臭假單胞菌等微生物直接轉化制備香蘭素，或者采用兩步轉化工藝，首先由黑曲霉將阿魏酸轉化為香蘭酸，再由朱紅密孔菌將香蘭酸轉化為香蘭素。這條路線底物轉化濃度較高，是有發展潛力的一條路線。但是微生物轉化法生產香草醛一般情況下香草醛只是代謝中間產物，會繼續降解而不易積累。另外由于阿魏酸的價格較高，利用這種方法生產出來的香蘭素價格也相對較高。第二條是以丁香酚或異丁香酚為底物，運用微生物轉化制備香蘭素的方法，這一路線所需時間長，產量很低，還不具備競爭力。第三條路線是以丁香酚或異丁香酚為底物，直接運用酶催化的方法制備香蘭素， 這也是近年來的熱點發展方向之一。目前人們已經研究發現香草醇氧化酶、脂肪酶、苯乙烯雙氧酶、脂氧合酶能夠催化丁香酚或異丁香酚制備香蘭素。從研究情況來看，雖然這些酶催化制備香蘭素的轉化率相對較低，但底物價格低廉，且可以回收再利用，因此有良好的工業應用前景。為進一步拓寬生物催化制備香蘭素的方法，有必要對其他生物酶轉化丁香酚或異丁香酚生產香蘭素的方法進行深入研究。
發明內容
本發明的目的是提供一種以異丁香酚為底物，利用血紅蛋白催化制備香蘭素的方法。本發明的目的是這樣實現的采用血紅蛋白制備香蘭素的方法，包括下列步驟取血紅蛋白置于PH值為7 10 的磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液中，加入異丁香酚后，加入過氧化氫，在20 50°C 條件下恒溫振蕩反應，反應時間3 96小時；磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液濃度為 0. 05 0. 2mol/L ；血紅蛋白與異丁香酚、過氧化氫的用量比為Ig 10 500mmol 0 IOmmol ； 優選為 Ig 20 160mmol 0. 1 Immol ；反應體系中血紅蛋白濃度為0. 01 50g/L，優選為0. 04 5g/L ；異丁香酚的濃度為1 200mmol/L，優選為10 160mmol/L ；；過氧化氫含量為0 50mmol/L，優選為0. 1 lmmol/L ；振蕩反應的速度為50 300轉/分，反應時間優選為M 96小時。反應液經乙酸乙酯萃取、蒸干后得到目標產物香蘭素。本發明的有益效果和優點在于，采用血紅蛋白作為催化劑對異丁香酚進行氧化反應制備出香蘭素，香蘭素的產率可達45 %，遠高于其他生物酶催化制備香蘭素的產率。催化劑來源廣泛，易于制備，價格低廉。反應步驟簡單，反應條件溫和，反應所需時間短，催化效果好。并且制備香蘭素過程無污染物排放，有利于保護環境，因此具有一定的工業應用開發前景。
具體實施例方式實施例1取0.04g的血紅蛋白，懸浮于19.8ml磷酸鈉鹽緩沖溶液中(0. lmol/L，pH 9.0)，加入1. 22mmol異丁香酚和0. 07mol/L的過氧化氫溶液0. ^il，反應混合物在30°C、160r/min 的恒溫搖床上振搖反應，間歇取樣用氣相色譜(色譜柱為SE-M毛細管氣相色譜柱)分析香蘭素的含量，反應72小時后，香蘭素的分析產率為45%。反應液用乙酸乙酯萃取，得到香蘭素。實施例2取0. 03g的血紅蛋白，懸浮于18ml Tri s_HCl緩沖溶液中(0. lmol/L, pH 8. 0)， 加入1. 83mmol異丁香酚和0. 07mol/L的過氧化氫溶液^il，反應混合物在30°C、200r/min 的恒溫搖床上振搖反應，間歇取樣用氣相色譜(色譜柱為SE-M毛細管氣相色譜柱)分析香蘭素的含量，反應72小時后，香蘭素的分析產率為34%。反應液用乙酸乙酯萃取，得到香實施例3取0. 02g的血紅蛋白，懸浮于20ml Tri s_HCl緩沖溶液中(0. lmol/L, pH 8. 0)， 加入3. 05mmol異丁香酚和0. 07mol/L的過氧化氫溶液0. 02ml，反應混合物在45°C、120r/ min的恒溫搖床上振搖反應，間歇取樣用氣相色譜(色譜柱為SE-M毛細管氣相色譜柱)分析香蘭素的含量，反應60小時后，香蘭素的分析產率為23%。反應液用乙酸乙酯萃取，得到
香蘭素。實施例4
取0. 04g的血紅蛋白，懸浮于20ml磷酸鈉鹽緩沖溶液中(0. lmol/L, pH 9. 0)，加入3. 05mmol異丁香酚，反應混合物在30°C、160r/min的恒溫搖床上振搖反應，間歇取樣用氣相色譜(色譜柱為SE-M毛細管氣相色譜柱)分析香蘭素的含量，反應72小時后，香蘭素的分析產率為22%。反應液用乙酸乙酯萃取，得到香蘭素。實施例5取0. 03g的血紅蛋白，懸浮于20ml磷酸鈉鹽緩沖溶液中(0. lmol/L, pH 8. 0)，加入1. 22mmol異丁香酚，反應混合物在30°C、160r/min的恒溫搖床上振搖反應，間歇取樣用氣相色譜(色譜柱為SE-M毛細管氣相色譜柱)分析香蘭素的含量，反應72小時后，香蘭素的分析產率為19%。反應液用乙酸乙酯萃取，得到香蘭素。以上所述內容僅為本發明構思下的基本說明，而依據本發明的技術方案所作的任何等效變換，均應屬于本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種制備香蘭素的方法，其特征在于，包括以下步驟取血紅蛋白和異丁香酚置于PH值為7 10的磷酸鹽緩沖溶液或TriS-HCl緩沖溶液中，加入過氧化氫，在20 50°C條件下恒溫振蕩反應，反應時間3 96小時；血紅蛋白與異丁香酚、過氧化氫的用量比為Ig 10 500mmol 0 lOmmol。
2.權利要求1所述制備香蘭素的方法，其特征在于，血紅蛋白與異丁香酚、過氧化氫的用量比為 Ig 20 160mmol 0. 1 lmmol。
3.權利要求1所述制備香蘭素的方法，其特征在于，反應體系中血紅蛋白的濃度為 0. 01 50g/L，異丁香酚的濃度為1 200mmol/L，過氧化氫的含量為0 50mmol/L。
4.權利要求1所述制備香蘭素的方法，其特征在于，反應體系中血紅蛋白的濃度為 0. 04 5g/L，異丁香酚的濃度為10 160mmol/L，過氧化氫的濃度為0. 01 10mmol/L。
5.權利要求1所述制備香蘭素的方法，其特征在于，反應體系中血紅蛋白的濃度為 0. 04 5g/L，異丁香酚的濃度為10 160mmol/L，過氧化氫的濃度為0. 01 10mmol/L。
6.權利要求1所述制備香蘭素的方法，其特征在于，振蕩反應的速度為50 300轉/分。
7.權利要求1所述制備香蘭素的方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl 緩沖溶液濃度為0. 05 0. 2mol/L。
8.權利要求1所述制備香蘭素的方法，其特征在于，所述反應時間為M 96小時。
全文摘要
本發明公開了一種制備香蘭素的方法，是將血紅蛋白置于pH值為7～10的磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液中，加入異丁香酚后，滴加過氧化氫，在20～50℃條件下恒溫振蕩反應，反應時間3～96小時；血紅蛋白與異丁香酚、過氧化氫的用量比為1g∶10～500mmol∶0～10mmol。本方法的香蘭素產率可達45％，催化劑來源廣泛，易于制備，價格低廉。反應步驟簡單，條件溫和，時間短，催化效果好；并且無污染物排放，具有一定的工業應用開發前景。
文檔編號C07C47/58GK102367222SQ20111036394
公開日2012年3月7日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者徐毅, 白利杰, 陳建波 申請人:上海師范大學