專利名稱：一種豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法
技術領域：
一種豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法，具體說是采用豌豆研磨成粉，用水浸提，高速離心，熱處理，上清液通過DEAE-52離子交換層析，獲得較純的天冬氨酸蛋白酶抑制劑制品，屬于植物提取生物活性產品技術領域。
背景技術：
生物活性物質是指有些食物含有多種具有生物活性的化合物，能與機體作用后引起各種生物效應。它們種類繁多，有糖類、脂類、蛋白質多肽類、留醇類、生物堿、甙類等等。 它們主要存在于植物性食物中，有的對人有利，有的有害。在預防和治療疾病，食品等領域， 生物活性物質仍是一個值得研究的課題，如何開發利用生物活性物質對人體有利的一面， 避免或消除其有害的一面值得我們進一步去探討。目前國內外已從豌豆中分離出多種活性物質。蛋白酶抑制劑是一類具有結合并使蛋白質失活從而對生物體內的某些酶起抑制作用的活性物質。天然蛋白酶抑制劑是一種能夠抑制蛋白水解酶活性的小分子蛋白或多肽，它的來源十分廣泛，在很多的動植物的組織器官及某些微生物中都有存在。按照其抑制的目標蛋白酶的活性中心的不同，大致可以分為以下幾種絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin) 如胰蛋白酶抑制劑(Trypsin inhibitor IT)；半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Cys-C)如木瓜蛋白酶抑制劑；天冬氨酸蛋白酶抑制劑如HIV蛋白酶抑制劑，胃蛋白酶抑制劑、蛋白酶A抑制劑和血管緊張肽原酶抑制劑；金屬蛋白酶抑制劑如羧肽酶抑制劑、血管緊張素轉化酶抑制劑(ACE)等。蛋白酶抑制劑在食品、醫藥和農業等領域有非常廣泛的應用前景。例如蛋白酶抑制劑具有抑制昆蟲腸道中蛋白酶的活性，可作為生物農藥或利用基因工程提高植物的抗蟲性。天冬氨酸蛋白酶是一類重要的蛋白水解酶，它的活性中心由兩個天冬氨酸殘基組成。天冬氨酸蛋白酶具有消化食物蛋白、降解抗原、病毒蛋白及酶的成熟、調整血壓等方面的活性功能，這些蛋白酶是導致艾滋病、惡性腫瘤、高血壓等世界上幾種難治疾病的發病因素之一。深入了解天冬氨酸蛋白酶抑制劑，對治療這些頑固性疾病將有一定的幫助。目前國內外報道的天冬氨酸蛋白酶抑制劑大多數都是通過化學法合成的，往往因其藥理毒性和安全性得不到保證限制了其應用，天冬氨酸蛋白酶抑制劑廣泛存在于動植物的組織器官及某些微生物中，因此從天然產物中開發此類蛋白酶抑制劑日益受到人們的關注。豌豆屬豆科植物，學名為Pisum sativum L.。我國是世界上最大的豌豆種植國，年產豌豆500萬噸，占世界總產量的40. 7%。豌豆所含營養極為豐富，它不僅能提供大部分的碳水化合物(淀粉含量約為50%)，而且是供人們食用和動物飼用的重要蛋白質資源之一， 豌豆含有20% M%的蛋白質，氨基酸的比例比較平衡。目前，市場上一大部分豌豆被用來制作粉絲。粉絲主要是利用豌豆中的淀粉，豌豆中的蛋白質就隨著污水被排放掉了，不僅污染環境，同時也造成了蛋白資源的浪費。因此，開展豌豆資源的深度加工和全面綜合利用方面的研究意義重大。
發明內容
本發明目的是提供一種豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法，采用豌豆研磨成粉，用水浸提，高速離心，熱處理，高速離心獲得粗天冬氨酸蛋白酶抑制劑，再經DEAE-52離子交換層析，獲得較純的天冬氨酸蛋白酶抑制劑，對胃蛋白酶的最佳抑制反應時間為1小時；熱穩定性較好，100°C保溫1小時后抑制活性幾乎沒有任何損失；pH穩定范圍為2. 0 7. 0。對其進行底物特異性分析，知該抑制劑對同為天冬氨酸族蛋白酶的胃蛋白酶和凝乳酶有較高的抑制活性，對幾種屬于其它族的蛋白酶(木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶等)幾乎沒有抑制活性。本發明的技術方案一種豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法，采用豌豆研磨成粉，用水浸提，高速離心，上清液進行熱處理，再高速離心，上清液通過DEAE-52離子交換層析得純化的天冬氨酸蛋白酶抑制劑，再經過真空冷凍干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制劑干粉；其工藝為
A豌豆上清液的制備
(1)豌豆市售；
(2)水浸提豌豆研磨成粉后，與水按g/mL計1:4 (w/v)在4°C下進行浸提2 h，期間每隔半小時攪拌一次。浸提后以8000 r/min、4°C下離心30 min，取上清液；
(3)熱處理將上清液進行60°C下水浴20min,8000 r/min、4°C下離心30 min，取上清；上清中蛋白質與糖的濃度比約為0.98 1. 12，對胃蛋白酶抑制單位約為0.97 ^1.03 IU/ mL,回收率 86. 59Γ 89. 4% ；
B分離天冬氨酸蛋白酶抑制劑
(4)離子交換層析DEAE-52離子交換色譜柱規格為30cmX2. 2 cm，平衡緩沖液為10 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(pH6. 8)。洗脫模式以平衡緩沖液洗脫2倍柱體積后，再以平衡緩沖液依次加含不同濃度0.2，0.4，0.6，0.8 mol/L NaCl的磷酸緩沖液進行階段洗脫，流速為1. 5 mL/min，進樣量20 mL，280 nm波長紫外檢測，結果如圖1顯示0. 2 mol/L NaCl 的磷酸緩沖液梯度下收集的峰液對天冬氨酸蛋白酶具有較強的抑制活性，其它梯度下收集的峰則無抑制活性，收集對胃蛋白酶具有較高抑制活性的峰1 ；
峰1收集液中蛋白質與糖的濃度比約為2. 16 2. 45，對胃蛋白酶(2800U)的半抑制濃度 IC5tl值約為1.56 1.87 1^/!^，對胃蛋白酶抑制單位約為8.93 9. 42 IU/mL，回收率70. Γ 73. 8 %。(5)干燥成粉采用真空冷凍干燥的方法將DEAE-52離子交換層析以含0. 2 mol/ L NaCl的磷酸緩沖液梯度洗脫下收集的峰1進行冷凍干燥，即為天冬氨酸蛋白酶抑制劑干粉。抑制劑底物特異性分析用上述(5)中得到的抑制劑冷凍粉配成5 mg/mL的溶液， 測定其對不同蛋白酶的抑制活性，結果如圖2。由圖2知，從豌豆中所產的天冬氨酸蛋白酶族中的胃蛋白酶和凝乳酶均有較強的抑制活性，抑制單位分別為9.13 IU/mL和8. 57 IU/mL，對屬于半胱氨酸族蛋白酶的木瓜蛋白酶，絲氨酸族的胰蛋白酶及屬于金屬蛋白酶族的中性蛋白酶等幾乎都沒有抑制活性。
酶活測定方法胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶活力測定采用常規蛋白酶活力測定法；凝乳酶活力測定采用Arima法。酶活定義40°C時，每分鐘分解血紅蛋白產1 ymol酪氨酸所需酶量即為一個酶活單位，單位用U表示。抑制單位定義依上述方法測定酶活，按抑制率=(抑制前酶活-抑制后酶活)/抑制前酶活X100%計算抑制率，規定在上述條件下，對胃蛋白酶抑制率達10%的抑制劑活性為一個抑制單位，單位用IU表示。IC50值定義在最適條件下，對一定量蛋白酶抑制率達50%時的抑制劑添加量。本發明的有益的效果本發明原料豌豆可以用豌豆加工廢料代替，這樣可以消除豌豆加工廠對周邊環境的污染，防止資源浪費，變廢為寶。本發明所制備的抑制劑專一性抑制天冬氨酸蛋白酶的活性，直接從豌豆中提取具有取材容易，成本低，雜質相對較少，應用廣泛，不影響食品的安全性等眾多優點。采用熱處理提取天冬氨酸蛋白酶抑制劑不僅簡便、 易操作、成本低，而且易于工業化生產，在醫藥、食品添加劑及病蟲害防治等領域有很好的應用前景。
圖1豌豆浸提液的DEAE-52離子交換色譜圖。圖2豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制劑對不同蛋白酶抑制效果比較。圖3 —種豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備工藝流程圖。具體實例方式實施例1
將50 g豌豆洗凈立即烘后，研磨成粉，按1: 4 (w/v)的比例加入超純水200 mL，放入冰箱，在4°C下進行浸提2 h，期間每隔半小時攪拌一次。浸提完后，將浸提液以8000 r/ min、4°C下離心30 min，得上清液175 mL，將上清液在60°C下進行水浴20 min，冷卻至室溫， 8000 r/min、4°C下離心30 min，得上清液160 mL，測得蛋白質與糖的濃度比約為0. 98，對胃蛋白酶抑制單位約為0.97 IU/mL，回收率87. 6% ；將上清液進行離子交換層析，每次取20 mL粗抑制劑進行DEAE-52離子交換層析，為30 cmX2. 2 cm，平衡緩沖液為10 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(PH 6.8)。洗脫模式以平衡緩沖液洗脫2倍柱體積后，再以平衡緩沖液依次加0.2，0.4，0.6，0.8 mol/L不同濃度的NaCl的磷酸緩沖液進行階段洗脫，流速為1.5 mL/ min, 280 nm波長紫外檢測。收集0. 2 mol/L NaCl的磷酸緩沖液梯度下的峰1，測得蛋白質與糖的濃度比約為2. 35，對胃蛋白酶(2800U)的半抑制濃度IC5tl值約為1. 56 mg/mL，對胃蛋白酶抑制單位約為9. 42 IU/mL，回收率72.8 %。實施例2
將50 g豌豆洗凈立即烘后，研磨成粉，按1: 4 (w/v)的比例加入超純水200 mL，放入冰箱，在4°C下進行浸提2 h，期間每隔半小時攪拌一次。浸提完后，將浸提液以8000 r/ min、4°C下離心30 min，得上清液175 mL，將上清液在60°C下進行水浴20 min，冷卻至室溫，8000 r/min、4°C下離心30 min，得上清液160 mL，測得蛋白質與糖的濃度比約為1.05， 對胃蛋白酶抑制單位約為0.99 IU/mL，回收率88. 4% ；將上清液進行離子交換層析，每次取 20 mL粗抑制劑進行DEAE-52離子交換層析，為30 cmX2. 2 cm，平衡緩沖液為10 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(PH 6.8)。洗脫模式以平衡緩沖液洗脫2倍柱體積后，再以平衡緩沖液依次加0. 2,0. 4,0. 6,0. 8 mol/L不同濃度的NaCl的磷酸緩沖液進行階段洗脫，流速為1. 5 mL/min, 280 nm波長紫外檢測。收集0. 2 mol/L NaCl的磷酸緩沖液梯度下的峰1，測得蛋白質與糖的濃度比約為2. 36，對胃蛋白酶(2800U)的半抑制濃度IC5tl值約為1. 74 mg/mL, 對胃蛋白酶抑制單位約為9. 16 IU/mL，回收率72.9 %。
實施例3
將50g豌豆洗凈立即烘后，研磨成粉，按1: 4 (w/v)的比例加入超純水200 mL，放入冰箱，在4°C下進行浸提2 h，期間每隔半小時攪拌一次。浸提完后，將浸提液以8000 r/ min、4°C下離心30 min，得上清液175 mL，將上清液在60°C下進行水浴20 min，冷卻至室溫， 8000 r/min、4°C下離心30 min，得上清液160 mL，測得蛋白質與糖的濃度比約為1. 06，對胃蛋白酶抑制單位約為0. 98IU/mL,回收率87. 4% ；將上清液進行離子交換層析，每次取20 mL粗抑制劑進行DEAE-52離子交換層析，為30 cmX2. 2 cm，平衡緩沖液為10 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(PH 6.8)。洗脫模式以平衡緩沖液洗脫2倍柱體積后，再以平衡緩沖液依次加0. 2,0. 4,0. 6,0. 8 mol/L不同濃度的NaCl的磷酸緩沖液進行階段洗脫，流速為1. 5 mL/ min, 280 nm波長紫外檢測。收集0. 2 mol/L NaCl的磷酸緩沖液梯度下的峰1，測得蛋白質與糖的濃度比約為2. 45，對胃蛋白酶(2800U)的半抑制濃度IC5tl值約為1.87 mg/mL，對胃蛋白酶抑制單位約為8. 93 IU/mL，回收率73.8 %。
權利要求
1. 一種豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法，其特征在于采用豌豆研磨成粉，用水浸提，高速離心，上清液進行熱處理，再高速離心，上清液通過DEAE-52離子交換層析得純化的天冬氨酸蛋白酶抑制劑，再經過真空冷凍干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制劑干粉；其工藝為A豌豆上清液的制備(1)豌豆市售；(2)水浸提豌豆研磨成粉后，與水按g/mL計1:4在4°C下進行浸提2 h，浸提后以 8000 r/min、4°C下離心30 min，取上清液；(3)熱處理將上清液進行60°C下水浴20min, 8000 r/min、4°C下離心30 min，取上清液；B分離天冬氨酸蛋白酶抑制劑(4)離子交換層析DEAE-52離子交換色譜柱規格為30cmX2. 2 cm，平衡緩沖液為pH 6. 8,10 mmol/L的磷酸鈉緩沖液；洗脫模式以平衡緩沖液洗脫2倍柱體積后，再以平衡緩沖液依次加含不同濃度0.2，0.4，0.6，0.8 mol/L NaCl的磷酸緩沖液進行階段洗脫，流速為1.5 mL/min，進樣量為20 mL，280 nm波長紫外檢測，收集含0.2 mol/L NaCl的磷酸緩沖液梯度下洗脫的峰液；(5)干燥成粉將DEAE-52離子交換層析中以含0.2mol/L NaCl的磷酸緩沖液梯度洗脫收集的峰液進行冷凍干燥，即得天冬氨酸蛋白酶抑制劑干粉。
全文摘要
一種豌豆天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法，屬于植物提取生物活性產品技術領域。本發明涉及采用直接將豌豆研磨成粉，水浸提，高速離心，上清液熱處理，再高速離心，上清液經DEAE-52離子交換層析得純化的天冬氨酸蛋白酶抑制劑，再經真空冷凍干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制劑干粉。本發明所制備的天冬氨酸蛋白酶抑制劑對天冬氨酸蛋白酶家族中胃蛋白酶、凝乳酶有較高的抑制活性，直接從豌豆中提取不僅成本低，且應用安全，在食品添加劑、醫藥和農業等領域有廣泛的應用前景。
文檔編號C07K1/18GK102408481SQ20111037351
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月22日 優先權日2011年11月22日
發明者張秋萍, 田亞平 申請人:江南大學